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13.4D: Wirkungen von Arzneimittelkombinationen - Biologie

13.4D: Wirkungen von Arzneimittelkombinationen - Biologie


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Antimikrobielle Medikamente können auf schädliche Weise mit anderen Medikamenten interagieren oder können in Kombination zur Bekämpfung mikrobieller Infektionen eingesetzt werden.

Lernziele

  • Nennen Sie Beispiele für Wechselwirkungen, die ein antimikrobielles Mittel unwirksam machen können

Wichtige Punkte

  • Die Interaktion zwischen einem antimikrobiellen Wirkstoff und einem anderen ist sehr komplex, ebenso wie die Art und Weise, wie sie auf Mikroben und den Organismus abzielen.
  • Es ist zwar nicht sicher, dass ein Medikament mit Antibiotika wechselwirken kann, es wird jedoch als klug erachtet, davon auszugehen, dass es potenziell unbekannte und schädliche Wechselwirkungen durch das Mischen von Medikamenten gibt.
  • Die Verwendung von mehr als einem antimikrobiellen Mittel ist eine wirksame und weit verbreitete Praxis, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Mikroben einer Behandlung widerstehen.

Schlüsselbegriffe

  • Kontraindikation: In der Medizin ist eine Kontraindikation ein Zustand oder ein Faktor, der dazu dient, eine bestimmte medizinische Behandlung zu verweigern.
  • Tuberkulose: Eine Infektionskrankheit von Mensch und Tier, die durch eine Mykobakterienart verursacht wird, die hauptsächlich die Lunge infiziert, wo sie Tuberkel verursacht, die durch Auswurf von Schleim und Auswurf, Fieber, Gewichtsverlust und Brustschmerzen gekennzeichnet sind und durch Einatmen oder Verschlucken von Bakterien übertragen werden.
  • Kombinationstherapie: Kombinationstherapie ist die Verwendung von mehr als einem Medikament oder einer anderen Therapie. Meistens beziehen sich diese Begriffe auf die gleichzeitige Verabreichung von zwei oder mehr Medikamenten zur Behandlung einer einzigen Krankheit.

Pharmakodynamik ist das Feld, das versucht, die unbeabsichtigten Auswirkungen der Verwendung von zwei oder mehr Arzneimitteln zu verstehen. Pharmakodynamik ist das Studium der biochemischen und physiologischen Wirkungen von Arzneimitteln auf den Körper oder auf Mikroorganismen oder Parasiten im oder auf den Körper. Es befasst sich auch mit den Mechanismen der Arzneimittelwirkung und dem Zusammenhang zwischen Arzneimittelkonzentration und Wirkung. Diese Veränderungen sind angesichts der Vielzahl der existierenden Wirkmechanismen und der Tatsache, dass viele Medikamente ihre Wirkung über verschiedene Mechanismen ausüben können, außerordentlich schwer einzuordnen. Diese große Vielfalt bedeutet auch, dass es in allen außer den offensichtlichsten Fällen wichtig ist, diese Mechanismen zu untersuchen und zu verstehen. Es besteht der begründete Verdacht, dass es mehr unbekannte als bekannte Wechselwirkungen gibt.

Zwei gut beschriebene Wechselwirkungen zwischen antimikrobiellen Arzneimitteln und anderen Arzneimitteln sind zwischen Antibiotika und Alkohol und Antibiotika und der Antibabypille. Wechselwirkungen zwischen Alkohol und bestimmten Antibiotika können auftreten, Nebenwirkungen verursachen und die Wirksamkeit der antibakteriellen Therapie verringern. Mögliche Risiken von Nebenwirkungen und Wirksamkeit hängen von der Art des verabreichten antibakteriellen Mittels ab. Trotz des Fehlens einer kategorischen Kontraindikation ist die Überzeugung weit verbreitet, dass Alkohol und Antibiotika niemals gemischt werden sollten. Einige Antibiotika können den Alkoholabbau hemmen, was zu alkoholbedingtem Erbrechen, Übelkeit und Kurzatmigkeit führen kann. Andere Wirkungen von Alkohol auf die antibakterielle Aktivität umfassen eine veränderte Aktivität der Leberenzyme, die die antibakterielle Verbindung abbauen. Darüber hinaus können die Serumspiegel bakteriostatischer Antibiotika durch Alkoholkonsum verringert werden, was zu einer verringerten Wirksamkeit und einer verminderten pharmakotherapeutischen Wirkung führt.

Eine weitere gut untersuchte Wechselwirkung besteht zwischen Antibiotika und der Antibabypille. Die Mehrheit der Studien zeigt, dass Antibiotika die Antibabypille nicht beeinträchtigen. In Fällen, in denen vermutet wird, dass antibakterielle Mittel die Wirksamkeit der Antibabypille beeinträchtigen, kann dies auf eine Erhöhung der Aktivität von Leberenzymen zurückzuführen sein, die zu einem erhöhten Abbau der Wirkstoffe der Pille führt. Auswirkungen auf die Darmflora, die zu einer verminderten Östrogenabsorption im Dickdarm führen könnten, wurden ebenfalls vorgeschlagen, aber solche Vorschläge waren nicht schlüssig und umstritten. Ärzte haben empfohlen, bei Therapien mit Antibiotika, bei denen eine Wechselwirkung mit oralen Kontrazeptiva vermutet wird, zusätzliche empfängnisverhütende Maßnahmen anzuwenden.

Darüber hinaus kann beim Umgang mit einer mikrobiellen Infektion manchmal die Verwendung von zwei oder mehr Antibiotika die Infektion wirksam bekämpfen, während jedes Medikament einzeln nur wenig oder keine Wirkung hat. Diese Methode wird als Kombinationstherapie bezeichnet und wird angewendet, wenn die Art einer mikrobiellen Infektion unbekannt ist, wie sie durch die Kombination der Antibiotika Ampicillin und Sulbactam typisch ist. Die Verwendung von zwei Antibiotika mit unterschiedlicher mikrobieller Hemmung erhöht die Chance, dass die Behandlung die mikrobielle Infektion bekämpft. Darüber hinaus wird Tuberkulose seit über fünfzig Jahren mit einer Kombinationstherapie behandelt. Dies ist auf das Phänomen der Resistenz zurückzuführen, bei dem ein Mikroorganismus die Fähigkeit erlangt, einem antimikrobiellen Arzneimittel zu widerstehen, während das Arzneimittel anfänglich das Wachstum des Zielmikroorganismus wirksam verlangsamte oder sogar abtötete. Die Behandlung von Tuberkulose oder anderen pathogenen Mikroben mit mehr als einem Antibiotikum verringert die Chance, dass sich die Mikrobe anpasst und die Behandlung überlebt, insbesondere wenn die beiden Medikamente unterschiedliche Methoden zur Verringerung der normalen Funktionen der Mikrobe haben.


KI-System kann Nebenwirkungen von Medikamentenkombinationen vorhersagen

10. Juli (UPI) -- Forscher haben ein künstliches Intelligenzsystem entwickelt, um mögliche Nebenwirkungen von Kombinationen von zwei Medikamenten vorherzusagen.

Mit dem Decagon-System glauben Forscher an der Stanford University, dass Ärzte bessere Entscheidungen über Kombinationen von zu verschreibenden Medikamenten treffen können, aber die richtige Kombination kann bestimmt werden, um komplexe Krankheiten zu behandeln. Die Ergebnisse wurden diese Woche beim Treffen der International Society for Computational Biology 2018 in Chicago vorgestellt und in der Fachzeitschrift Bioinformatics veröffentlicht.

Das Centers for Disease Control and Prevention schätzt, dass 23 Prozent der Amerikaner zwei oder mehr verschreibungspflichtige Medikamente einnehmen und 39 Prozent über 65 Jahre fünf oder mehr.

"Es ist praktisch unmöglich, ein neues Medikament in Kombination mit allen anderen Medikamenten zu testen, denn nur für ein Medikament wären das fünftausend neue Experimente", sagte Dr. Marinka Zitnik, Postdoktorandin für Informatik in Stanford, in einer Pressemitteilung . "Wir wissen wirklich nicht, was passieren wird."

Die Forscher sagten, dass es etwa 1.000 bekannte Nebenwirkungen von Medikamenten auf dem Markt gibt – was zu fast 125 Milliarden möglichen Nebenwirkungen zwischen allen möglichen Medikamentenpaaren führt.

Es ist bekannt, dass 53 % der Arzneimittelnebenwirkungen in weniger als 3 % der dokumentierten Arzneimittelkombinationen auftreten.

Die Forscher ermittelten, wie die mehr als 19.000 Proteine ​​in unserem Körper miteinander interagieren und wie verschiedene Medikamente diese Proteine ​​beeinflussen. Anschließend entwickelten sie einen Weg, um Muster zu identifizieren, wie Nebenwirkungen auftreten, basierend darauf, wie Medikamente auf verschiedene Proteine ​​in mehr als 4 Millionen bekannten Assoziationen abzielen.

Diese Aufgabe lösten sie mit Deep Learning, einer dem Gehirn nachempfundenen Form der künstlichen Intelligenz.

Um ihr System zu testen, prüften sie, ob sich die Vorhersagen bewahrheiten.

Bei der Suche in der medizinischen Literatur nach Hinweisen auf Nebenwirkungen, die von Decagon vorhergesagt wurden, fanden sie heraus, dass fünf von 10 kürzlich bestätigt wurden.

Decagon fand beispielsweise heraus, dass die Kombination von Atorvastatin, einem Cholesterin-Medikament, und Amlopidin, einem Blutdruckmedikament, zu Muskelentzündungen führen könnte. Und es war richtig – ein Fallbericht aus dem Jahr 2017 deutete darauf hin, dass die Medikamentenkombination zu einer gefährlichen Art von Muskelentzündung geführt hatte.

Die Forscher fanden einen Median von 159 Nebenwirkungen pro Medikament, wobei die häufigsten Nebenwirkungen Übelkeit, Erbrechen, Kopfschmerzen, Durchfall und Dermatitis waren.

"Es war überraschend, dass Protein-Interaktionsnetzwerke so viel über die Nebenwirkungen von Medikamenten verraten", sagte Dr. Jure Leskovec, außerordentlicher Professor für Informatik in Stanford.

Die Forscher hoffen, ihr System auf mehr als zwei Wirkstoffkombinationen auszudehnen und ein benutzerfreundlicheres Werkzeug für Ärzte zu schaffen.

"Heute werden Nebenwirkungen von Medikamenten im Wesentlichen zufällig entdeckt und unser Ansatz hat das Potenzial, zu einer effektiveren und sichereren Gesundheitsversorgung zu führen." sagte Leskovec.


Vorausschauen

Wir hoffen, dass pharmazeutische und akademische Forscher sowie Biologen dieses Open-Source-Tool nutzen werden, um den Prozess der Identifizierung optimaler Wirkstoffkombinationen für verschiedene Krankheiten zu beschleunigen. Die gebrauchsfertigen APIs und das Python-Paket wurden entwickelt, um Forschern das Einbinden von Datensätzen und das Ausführen von Vorhersagen ohne ML-Kenntnisse zu erleichtern.

Durch die Bereitstellung von KI-gestützten Werkzeugen für pharmazeutische Labore hoffen wir, den Prozess der Identifizierung optimaler Kombinationen von Medikamenten und anderen Interventionen, die letztendlich zu besseren Behandlungen komplexer Krankheiten wie Krebs und neuartiger Krankheiten wie COVID-19 führen könnten, dramatisch zu beschleunigen.

Mit Blick auf die Zukunft ebnet CPA den Weg für völlig neue Möglichkeiten bei der Entwicklung von Medikamenten. In Zukunft könnte es nicht nur die Forschung zur Wiederverwendung von Medikamenten beschleunigen, sondern eines Tages auch Behandlungen viel personalisierter und auf individuelle Zellreaktionen zugeschnitten machen, eine der derzeit aktivsten Herausforderungen in der Medizin der Zukunft.


Ergebnisse

Dosis-Wirkungs-Kurven auf Antibiotika und Antivirulenzmittel

In einem ersten Experiment haben wir die Dosis-Wirkungs-Kurve von P. aeruginosa PAO1 zu jedem der vier Antibiotika (Abb. 1) und den beiden Antivirulenz-Verbindungen (Abb. 2) in unseren experimentellen Medien. Wir fanden heraus, dass die Dosis-Wirkungs-Kurven für Antibiotika den Sigmafunktionen folgten (Abb. 1), gekennzeichnet durch (i) einen niedrigen Konzentrationsbereich des Antibiotikums, der das Bakterienwachstum nicht hemmte, (ii) einen mittleren Konzentrationsbereich des Antibiotikums, der das Bakterienwachstum signifikant reduzierte, und ( iii) ein hoher Konzentrationsbereich des Antibiotikums, der das Bakterienwachstum vollständig zum Stillstand brachte. Da Antibiotika das Wachstum bremsten, reduzierten sie deckungsgleich auch die Verfügbarkeit von Virulenzfaktoren auf Bevölkerungsebene (S1 Abb.).

Wir setzten PAO1 allen vier Antibiotika in zwei experimentellen Medien aus: CAA+Tf (Eisen-limitiertes Casaminosäuren-Medium mit Transferrin) und CAS (Casein-Medium). Mit Ausnahme von Meropenem waren höhere Antibiotikakonzentrationen erforderlich, um PAO1 in CAS im Vergleich zu CAA+Tf zu hemmen. Punkte zeigen Mittelwerte ± Standardfehler über sechs Wiederholungen. Alle Daten sind relativ zur medikamentenfreien Behandlung skaliert. Die Daten stammen aus zwei unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Verdünnungsreihen. Die roten Punkte zeigen die höchste verwendete Konzentration für die jeweiligen Experimente an, ab der 7 serielle Verdünnungsschritte getestet wurden. Kurven wurden entweder mit log-logistischen Funktionen (in CAA+Tf) oder mit dreiparametrigen Weibull-Funktionen (in CAS) angepasst. Die zugrunde liegenden Daten für diese Zahl finden Sie unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364.

Wir setzten PAO1 den Antivirulenz-Verbindungen Gallium (Hemmung der Pyoverdin-vermittelten Eisenaufnahme) und Furanon C-30 (Blockierung der QS-Reaktion, einschließlich Protease-Produktion) in Medien aus, in denen die angestrebten Virulenzfaktoren exprimiert und benötigt werden (eisenbegrenztes CAA+Tf Medium für Gallium und CAS-Medium für Furanon) und in Kontrollmedien, in denen die angestrebten Virulenzfaktoren nicht benötigt werden (eisenergänztes CAA+Fe-Medium für Gallium und proteinverdautes CAA für Furanon). (EIN) Dosis-Wirkungs-Kurven für das Wachstum zeigen, dass beide Antivirulenz-Verbindungen das Bakterienwachstum reduzierten, jedoch stärker in Medien, in denen der angestrebte Virulenzfaktor exprimiert wird. Dies zeigt, dass es ein Konzentrationsfenster gibt, in dem die Antivirulenzverbindungen keine toxischen Wirkungen auf Bakterienzellen haben und nur das Wachstum aufgrund des Löschens des Virulenzfaktors begrenzen. (B) Dosis-Wirkungs-Kurven für die Virulenzfaktor-Produktion zeigen, dass Gallium und Furanon C-30 die Pyoverdin- bzw. Protease-Produktion konzentrationsabhängig wirksam hemmen. Punkte zeigen Mittelwerte ± Standardfehler über sechs Wiederholungen. Alle Daten sind relativ zur medikamentenfreien Behandlung skaliert. Die Daten stammen aus zwei unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Verdünnungsreihen. Die roten Punkte zeigen die höchste verwendete Konzentration für die jeweiligen Experimente an, ab der 7 serielle Verdünnungsschritte getestet wurden. Kurven wurden entweder mit log-logistischen Funktionen (in CAA+Tf) oder mit dreiparametrigen Weibull-Funktionen (in CAS) angepasst. Die zugrunde liegenden Daten für diese Zahl finden Sie unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, Casaminosäure-Medium CAS, Casein-Medium QS, Quorum Sensing Tf, humanes Apo-Transferrin.

Ähnlich geformte Dosis-Wirkungs-Kurven für das Wachstum (Abb. 2A) und die Virulenzfaktor-Produktion (Abb. 2B) wurden für Gallium (Löschung von Pyoverdin) und Furanon C-30 (Hemmung der Protease-Produktion) in den jeweiligen Medien erhalten, in denen die beiden Virulenzfaktoren wichtig sind für das Wachstum. Unter solchen Bedingungen wirkt sich die reduzierte Verfügbarkeit von Virulenzfaktoren sofort auf das Wachstum aus, indem sie Eisenmangel (Gallium) oder die Unfähigkeit zum Abbau von Proteinen (Furanon) induziert. Entscheidend ist, dass sich die Dosis-Wirkungs-Kurven für das Wachstum nach rechts verschoben haben (Verlängerungsphase (i)), als wir das Experiment in Medien wiederholten, in denen die Virulenzfaktoren für das Wachstum nicht benötigt werden (dh eisenreiche Medien für Pyoverdin und Proteinverdauung). Medien für Proteasen). Dies zeigt, dass es ein Konzentrationsfenster gibt, in dem die Wachstumshemmung allein durch das Löschen des Virulenzfaktors verursacht wird. Umgekehrt scheinen hohe Konzentrationen von Antivirulenzverbindungen zusätzliche Off-Target-Effekte zu haben, die das Wachstum reduzieren.

Interaktionskarten von Antibiotika-Antivirulenz-Medikamentenkombinationen

Allgemeine Muster.

Aus den Dosis-Wirkungs-Kurven wählten wir 9 Konzentrationen für jedes Medikament aus, um die gesamte Trajektorie abzudecken, von keiner über eine mittlere bis hin zu einer starken Wachstumshemmung. Anschließend kombinierten wir Antibiotika mit Antivirulenz-Verbindungen in einer 9×9-Konzentrationsmatrix und maßen die Dosis-Wirkungs-Kurve für jede einzelne Wirkstoffkombination sowohl für die Wachstums- als auch für die Virulenzfaktorproduktion (Abb. 3). Auf qualitativer Ebene würden unabhängige Arzneimittelwirkungen eine symmetrische Abwärtsverschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve bewirken, wobei höhere Konzentrationen der Antivirulenz-Verbindung ergänzt würden. Wir haben tatsächlich bei vielen Dosis-Wirkungs-Kurven symmetrische Herunterverschiebungen festgestellt (Abb. 3), aber es gab auch klare Fälle von nichtsymmetrischen Verschiebungen, die auf Synergien oder Antagonismus zwischen Arzneimitteln hindeuten. Wir haben dann das Bliss-Modell verwendet, das das adäquate Modell für Medikamente mit unabhängigen Wirkmechanismen darstellt, um diese Effekte zu quantifizieren. Wir fanden Muster der Synergie und des Antagonismus sowohl für die Wachstums- als auch für die Virulenzfaktorhemmung über die Konzentrationsmatrizen für alle Arzneimittelkombinationen (Fig. 4), wobei viele dieser Wechselwirkungen signifikant waren (S2 Fig.).

Dosis-Wirkungs-Kurven für Wachstum und Virulenzfaktor-Produktion für PAO1 wurden für 9 × 9-Arzneimittelkonzentrationsmatrizen bewertet, die die vier Antibiotika in Kombination mit entweder Gallium (EIN) oder Furanon C-30 (B). Es wurden Experimente in Medien durchgeführt, in denen die entsprechenden Virulenzfaktoren für das Wachstum benötigt werden (Pyoverdin: CAA+Tf-Protease: CAS). Wachstum und Virulenzfaktorproduktion wurden nach 48 Stunden gemessen. Alle Werte sind relativ zur unbehandelten Kontrolle skaliert und die Datenpunkte zeigen den Mittelwert über 12 Wiederholungen aus zwei unabhängigen Experimenten. Wir haben Spline-Funktionen verwendet, um die Dosis-Wirkungs-Kurven anzupassen. Die zugrunde liegenden Daten für diese Zahl finden Sie unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, Casaminosäure-Medium CAS, Casein-Medium Tf, humanes Apo-Transferrin.

Wir haben das Bliss-Unabhängigkeitsmodell verwendet, um den Grad der Synergie für jede einzelne Wirkstoffkombination in Bezug auf Wachstumssuppression und Virulenzfaktor-Quenching zu berechnen, wie in Abb. 3 gezeigt für Gallium-Antibiotika-Kombinationen (ANZEIGE für das Wachstum E-H zur Pyoverdin-Produktion) und Furanon-Antibiotika-Kombinationen (I-L für das Wachstum M-P zur Proteaseproduktion). Alle Berechnungen basieren auf 12 Wiederholungen aus zwei unabhängigen Experimenten. Die zugrunde liegenden Daten für diese Zahl finden Sie unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364.

Gallium-Antibiotika-Kombinationen.

Gallium in Kombination mit Ciprofloxacin oder Colistin hatte größtenteils unabhängige Wirkungen auf das Bakterienwachstum (d. h. schwache oder keine Synergie/Antagonismus) ( 4A und 4B ). Hinsichtlich der Hemmung der Pyoverdin-Produktion zeigten beide Wirkstoffkombinationen signifikante Synergien bei mittleren Wirkstoffkonzentrationen ( 4E und 4F , S2 – Abb.). Für Gallium-Meropenem-Kombinationen beobachteten wir größtenteils unabhängige Wechselwirkungen für Wachstum und Pyoverdin-Hemmung, wobei kleine Hotspots von Antagonismus (für Wachstum) und Synergie (für Siderophor-Hemmung) bei mittleren Wirkstoffkonzentrationen vorhanden waren ( 4C und 4G ). Schließlich gab es für Gallium-Tobramycin-Kombinationen relativ starke signifikante synergistische Wechselwirkungen sowohl für das Wachstum als auch für die Pyoverdin-Hemmung bei mittleren Wirkstoffkonzentrationen ( 4D und 4H , S2 ). Interessanterweise beobachteten wir Synergien in Bezug auf die Pyoverdin-Hemmung für alle Wirkstoffkombinationen, was darauf hindeutet, dass die Kombination aus niedriger Zelldichte, die durch die Antibiotika induzierte und Gallium-vermittelte Pyoverdin-Löschung ist, eine erfolgreiche Strategie zur Unterdrückung dieses Virulenzfaktors ist.

Furanon-Antibiotika-Kombinationen.

Für Furanon-Ciprofloxacin-Kombinationen fanden wir relativ starke signifikante antagonistische Wechselwirkungen in Bezug auf die Wachstumshemmung (Fig. 4I), während die Wirkungen auf die Protease-Hemmung größtenteils unabhängig waren (Fig. 4M). Im Gegensatz dazu beobachteten wir für Furanon-Colistin-Kombinationen starke und signifikante synergistische Arzneimittelwechselwirkungen, insbesondere für mittlere und höhere Konzentrationen der Antivirulenzverbindung für das Wachstum und die Proteasehemmung ( 4J und 4N , S2 – Abb.). Furanon-Meropenem hingegen interagierte im Hinblick auf Wachstum und Proteasehemmung meist antagonistisch ( 4K und 4O ). Umgekehrt gab es für Furanon-Tobramycin-Kombinationen durchdringende signifikante Synergiemuster über den gesamten Wirkstoffkombinationsbereich für die Wachstums- und Virulenzfaktor-Hemmung (Fig. 4L und 4P, S2 Fig.).

Korrelieren die Synergiegrade für Wachstums- und Virulenzfaktorhemmung?

Da die Kombinationsbehandlungen sowohl das Wachstum als auch die Virulenzfaktorproduktion beeinflussen, haben wir untersucht, ob der Grad der Synergie zwischen den beiden Merkmalen korreliert (S3 Abb.). Für Gallium-Antibiotika-Kombinationen fanden wir keine Korrelationen für Ciprofloxacin und Meropenem, aber positive Assoziationen für Colistin und Tobramycin (Pearson Korrelationskoeffizient Ciprofloxacin: R = 0.09, T79 = 0.85, P = 0,394 Colistin: R = 0.69, T79 = 8.51, P < 0,001 Meropenem: R = 0.17, T79 = 1.53, P = 0,130 Tobramycin: R = 0.58, T79 = 6.39, P < 0,001). Bei Furanon-Antibiotika-Kombinationen gab es für alle Wirkstoffkombinationen starke positive Korrelationen zwischen den Synergieniveaus der beiden Merkmale (Ciprofloxacin: R = 0.34, T79 = 3.22, P = 0,002 Colistin: R = 0.96, T79 = 32.50, P < 0,001 Meropenem: R = 0.87, T79 = 15.48, P < 0,001 Tobramycin: R = 0.75, T79 = 10.16, P < 0,001).

Antibiotikaresistenz kann zu kollateraler Sensibilität und Kreuzresistenz gegenüber Antivirulenzmitteln führen

In einem nächsten Schritt fragten wir, ob Antivirulenzverbindungen als Adjuvantien verwendet werden könnten, um das Wachstum antibiotikaresistenter (AtbR) Klone zu unterdrücken. Um diese Frage zu beantworten, haben wir zunächst AtbR-Klone experimentell ausgewählt, isoliert und analysiert. Wir strebten einen Klon pro Antibiotikum und Medium an. Am Ende untersuchten wir sieben Klone, da nur eine Selektionslinie das Ciprofloxacin-Selektionsregime überlebte (siehe Materialien und Methoden für Details). Anschließend bewerteten wir die Dosis-Wirkungs-Kurve dieser Klone für die jeweiligen Antibiotika, um ihren Resistenzgrad zu bestätigen und zu quantifizieren (S4 Abb.). Darüber hinaus haben wir die Dosis-Wirkungs-Kurven aller AtbR-Klone für die beiden Antivirulenz-Verbindungen erstellt, um auf kollaterale Sensitivität und Kreuzresistenz zu testen. Hier verglichen wir die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50)-Werte zwischen dem AtbR- und dem Wildtyp (WT)-Stamm (S5 Fig.) und fanden Hinweise auf eine schwache, aber signifikante kollaterale Sensitivität zwischen Colistin und Gallium und eine relativ starke kollaterale Sensitivität zwischen Tobramycin und Furanon. Umgekehrt fanden wir, dass Resistenzen gegen Ciprofloxacin, Colistin und teilweise auch gegen Meropenem eine Kreuzresistenz gegen Furanon bewirken können (alle statistischen Analysen sind in S5 Abb. gezeigt).

Basierend auf diesen Experimenten wählten wir zwei Konzentrationen für Gallium (niedrig, 1,56 μM intermediär, 6,25 μM) und Furanon (niedrig, 6,3 μM intermediär, 22,8 μM) als Adjuvantien in Kombination mit Antibiotika aus, um zu testen, ob Antivirulenzverbindungen die Wachstumshemmung von und Auswahl für AtbR-Klone ändern.

Antivirulenzmittel als Adjuvantien können die Wachstumshemmung antibiotikaresistenter Stämme wiederherstellen

In einer ersten Reihe von Experimenten unterwarfen wir alle AtbR-Klone und das antibiotikasensitive WT alleinigen Antivirulenzbehandlungen und Kombinationsbehandlungen mit Antibiotika (Abb. 5). Für Gallium beobachteten wir, dass die WT- und AtbR-Klone in Abwesenheit von Antibiotika fast identisch auf die Antivirulenz-Verbindungen reagierten, was zeigt, dass AtbR-Klone immer noch empfindlich gegenüber Gallium sind (Fig. 5A). Bei Behandlung mit Antibiotika beobachteten wir, dass die Zugabe von Antivirulenzverbindungen das Wachstum aller AtbR-Klone durchweg reduzierte (Fig. 5A). Der Grad der Synergie zwischen den Wirkstoffen ist für WT- und AtbR-Klone ähnlich, wobei die Effekte in den meisten Fällen nahe Null sind (variieren zwischen schwachem Antagonismus und schwacher Synergie). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Gallium unabhängig von allen getesteten Antibiotika wirkt und dennoch in der Lage ist, Eisenmangel zu induzieren und damit das Wachstum von AtbR-Klonen zu reduzieren. Wichtig zu beachten ist, dass Gallium in diesem Experiment im Vergleich zur Dosis-Wirkungs-Kurvenanalyse (S5 Abb., gesammelt nach 48 Stunden) eine stärkere wachstumshemmende Wirkung hat, da dieses Experiment nur 24 Stunden lang lief.

Test, ob die Zugabe von Gallium (EIN) oder Furanon (B) kann die Wachstumssuppression in AtbR-Klonen (in orange) im Vergleich zum anfälligen Wildtyp (WT in schwarz) wiederherstellen. Unter antibiotischer Behandlung und in Abwesenheit von Antivirulenzmitteln wuchsen alle AtbR-Klone signifikant besser als die WT (zwei Proben T Tests, −26,63 ≤ T21–40 ≤ −3.03, P < 0,01 für alle Behandlungskombinationen k.A. = unbedeutend *P < 0,05 **p < 0.01 ***P < 0,001), ein Ergebnis, das sowohl für das skalierte (wie oben gezeigt) als auch für das absolute Wachstum gilt. In Anwesenheit von Antivirulenzmitteln (obere Reihe von Panels ohne Antibiotika [−Atb] untere Reihe von Panels mit Antibiotika [+Atb]) wurde die Wachstumssuppression in sechs von acht Fällen wiederhergestellt. Ausnahmen waren die Ciprofloxacin-Furanon- und Meropenem-Furanon-Kombinationen. Die untere Reihe von Tafeln zeigt den Grad der Wirkstoffsynergie für die WT- und die AtbR-Klone. Alle Zelldichtewerte (gemessen mit Durchflusszytometrie als Anzahl von Ereignissen, die in 5 µl Kultur nach 24 Stunden nachgewiesen wurden) sind relativ zur unbehandelten Kontrolle skaliert. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler über mindestens 16 Wiederholungen aus 4 bis 6 unabhängigen Experimenten gezeigt. Die zugrunde liegenden Daten für diese Zahl finden Sie unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. AtbR-Klone, antibiotikaresistente Klone.

Für Furanon waren die Muster vielfältiger (Fig. 5B). Es gab zwei Fälle von voller Kreuzresistenz (Ciprofloxacin und Meropenem), bei denen die Zugabe von Furanon keinen Einfluss mehr auf das Bakterienwachstum hatte. In diesen Fällen beobachteten wir eine Veränderung von einer schwachen Wirkstoffsynergie (für den WT) zu einem starken Wirkstoffantagonismus (für die AtbR-Klone). Im Gegensatz dazu fanden wir eine starke Verschiebung von schwachem Antagonismus (für den WT) zu starker Wirkstoffsynergie (für den AtbR-Klon), wenn Furanon mit Colistin kombiniert wurde. In diesem Fall hat Furanon das Antibiotikum repotenziert. Beachten Sie, dass wir auch für diese Wirkstoffkombination zunächst eine gewisse Kreuzresistenz beobachteten (S5 Abb), allerdings nur bei deutlich höheren Furanonkonzentrationen als den hier verwendeten. Schließlich wurde das Muster zwischen Tobramycin und Furanon durch die kollaterale Sensitivität bestimmt, wobei die Zugabe von Furanon zum AtbR-Klon die Wachstumshemmung vollständig wiederherstellte.

Antivirulenz als Adjuvantien kann die Selektion auf Antibiotikaresistenz aufheben oder umkehren

Wir untersuchten dann, ob Antivirulenz-Verbindungen allein oder in Kombination mit Antibiotika die Verbreitung von AtbR-Klonen in gemischten Populationen mit anfälligen WT-Zellen beeinflussen können (Abb. 6). Zuerst konkurrierten wir die AtbR-Klone ohne jegliche Behandlung mit dem anfälligen WT und beobachteten, dass AtbR-Klone durchweg die Konkurrenz verloren (eine Probe T Tests, −13,50 ≤ T15–26 ≤ −2.62, P ≤ 0,050 für alle Vergleiche). Dies bestätigt, dass Antibiotikaresistenz kostspielig ist und ohne Behandlung selektiert wird. Wir fügten dann das Antivirulenz-Medikament allein mit den gleichen Konzentrationen wie für die Monokultur-Experimente hinzu (Abb. 5). Wir fanden, dass die AtbR-Klone in 14 von 16 Fällen keinen selektiven Vorteil erfuhren, mit Ausnahme eines Colistin-resistenten Klons, dessen Häufigkeit leicht zunahm ( 6 ). Diese Analyse zeigt, dass die Kosten der AtbR-Resistenz in Gegenwart von Antivirulenz-Verbindungen weitgehend aufrechterhalten werden. Als nächstes setzten wir die Mischkulturen allein den Antibiotika aus und beobachteten, dass AtbR-Klone erwartungsgemäß unter Behandlung (eine Probe T test, 4,54 T19–26 ≤ 13.41, P < 0,001 für alle Kombinationen).

Test, ob Antivirulenzmittel allein oder in Kombination mit Antibiotika die Selektion auf Antibiotikaresistenz aufheben oder rückgängig machen können. Alle AtbR-Klone wurden 24 Stunden lang mit dem anfälligen WT konkurriert, beginnend mit einem Verhältnis von 1:9. Die gestrichelten Linien bezeichnen Fitnessparität, bei der keine der konkurrierenden Sorten einen Fitnessvorteil hat. Ohne jegliche Behandlung zeigten alle AtbR-Klone einen Fitnessnachteil (Fitnesswerte < 0) gegenüber dem WT, was die Kosten der Resistenz belegt. Bei alleiniger Behandlung mit Antivirulenzmitteln zeigten die AtbR-Klone in 14 von 16 Fällen keinen Selektionsvorteil (Ausnahme: Colistin-Gallium-Kombinationen). Bei alleiniger Behandlung mit Antibiotika erfuhren alle AtbR-Klone wie erwartet signifikante Fitnessvorteile (Fitnesswerte > 0). Wenn Antivirulenz-Verbindungen als Adjuvantien zu Antibiotika hinzugefügt wurden, wurde der Fitnessvorteil von AtbR-Klonen bei sechs von acht Wirkstoffkombinationen reduziert, aufgehoben oder umgekehrt. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler über mindestens 16 Wiederholungen aus 4 bis 7 unabhängigen Experimenten gezeigt. Die Bedeutungsstufen basieren auf T Tests oder ANOVAs: k.A. = nicht signifikant *P < 0,05 **P < 0,01 ***P < 0,001. Ausführliche Informationen zu den statistischen Analysen finden Sie in Tabelle S1. Die zugrunde liegenden Daten für diese Zahl finden Sie unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. - Atb, Behandlungen ohne Antibiotika + Atb, Behandlungen mit Antibiotika AtbR-Klone, antibiotikaresistente Klone CAA, Casaminosäure-Medium CAS, Casein-Medium Tf, humanes Apotransferrin WT, Wildtyp.

Bei der Kombination von Antivirulenzmitteln mit Antibiotika traten drei verschiedene relative Fitnessmuster für AtbR-Klone auf. In drei Fällen (Colistin-Gallium, Ciprofloxacin-Furanon und Meropenem-Furanon) erfuhren AtbR-Klone große Fitnessvorteile und wurden selektiv bevorzugt, unabhängig davon, ob die Antivirulenz-Verbindung vorhanden war oder nicht. In vier Fällen (Ciprofloxacin-Gallium, Meropenem-Gallium, Tobramycin-Gallium, Colistin-Furanon) reduzierte die Zugabe von Antivirulenz-Verbindungen allmählich die relative Fitness der AtbR-Klone, wobei in zwei Fällen (Meropenem-Gallium, Tobramycin-Gallium) die Der selektive Vorteil von AtbR-Klonen wurde vollständig aufgehoben. Schließlich wurde in einem Fall (Tobramycin-Furanon) die Selektion auf AtbR-Klone sogar umgekehrt und AtbR-Klone verloren die Konkurrenz.

Arzneimittelsynergie sagt keine Selektion gegen Antibiotikaresistenz voraus

Wir untersuchten, ob Arzneimittelinteraktionen, die von Antagonismus bis hin zu Synergie für beide AtbR-Klone und den WT reichen (Fig. 5), mit ihrer relativen Fitness im Wettbewerb unter Kombinationsbehandlungen korrelieren. Wir fanden jedoch keine Unterstützung für solche Assoziationen (S6 Abb, ANOVA, AtbR: F1,65 = 0.88, P = 0,353 WT: F1,65 = 1.85, P = 0,179), sondern beobachtete stattdessen, dass die Variation der Fitnessmuster durch bestimmte Medikamentenkombinationen erklärt wurde (Antivirulenz-Antibiotika-Interaktion, AtbR: F3,65 = 37.45, P < 0,001, WT: F3,65 = 14.50, P < 0,001).

Genetische Grundlage experimentell gewachsener Antibiotikaresistenzen

Die Sequenzierung des gesamten Genoms der experimentell entwickelten AtbR-Klone ergab eine kleine Anzahl von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) und Insertionen oder Deletionen (INDELs), von denen bekannt ist, dass sie mit Resistenzen gegen die jeweiligen Antibiotika assoziiert sind (Tabelle 1). Der gegen Ciprofloxacin resistente AtbR-Klon hatte Mutationen in gyrB, ein Gen, das für die DNA-Gyrase-Untereinheit B kodiert, das direkte Ziel des Antibiotikums [40]. Darüber hinaus identifizierten wir eine 18-bp-Deletion im mexR Gen, das für einen Multidrug-Efflux-Pumpen-Repressor kodiert [41]. Die beiden gegen Colistin resistenten AtbR-Klone hatten unterschiedliche Mutationen im gleichen Zielgen phoQ (ein nicht-synonymer SNP in einem Klon gegenüber einer 1-bp-Insertion zusätzlich zu einem nicht-synonymen SNP in dem anderen Klon). PhoQ ist ein Regulator des Lipopolysaccharid-Modifikationsoperons, und Mutationen in diesem Gen stellen den ersten Schritt in der Entwicklung einer hochgradigen Colistin-Resistenz dar [42]. Ein gegen Meropenem resistenter AtbR-Klon hatte einen nicht-synonymen SNP in der kodierenden Sequenz von mpl. Dieses Gen kodiert für eine Murein-Tripeptid-Ligase, die zur Überexpression des Beta-Lactamase-Vorläufergens beiträgt ampC [43]. Der andere gegen Meropenem resistente AtbR-Klon wies Mutationen in drei verschiedenen Genen auf, die alle mit Antibiotikaresistenzmechanismen in Verbindung gebracht werden können: Wir fanden (i) einen nicht-synonymen SNP in parR, das einen Zweikomponenten-Reaktionsregulator kodiert, der an mehreren Resistenzmechanismen beteiligt ist, einschließlich Wirkstoffausfluss, Porinverlust und Lipopolysaccharid-Modifikation [44] (ii) 7 Mutationen in der PA1874 Gen, das eine Effluxpumpe kodiert [45] und (iii) einen nicht-synonymen SNP in nalD, das für den Transkriptionsregulator NalD kodiert, der die Expression von Wirkstoff-Efflux-Systemen reguliert [46,47]. Beide Tobramycin-resistenten AtbR-Klone hatten nicht-synonyme SNPs in fusA1. Dieses Gen kodiert für den Elongationsfaktor G, eine Schlüsselkomponente der Translationsmaschinerie. Obwohl Aminoglykoside nicht direkt an den Elongationsfaktor G binden und der vollständige Resistenzmechanismus noch unbekannt ist, sind Mutationen in fusA1 sind mit einer hohen Resistenz gegenüber Tobramycin verbunden und werden häufig in klinischen Isolaten gefunden [48,49].


Diskussion

Wir haben einen Rahmen entwickelt, der mathematische Modellierung, Hochdurchsatz-Wachstumsratenmessungen und genetische Störungen kombiniert, um die zugrunde liegenden Mechanismen von Arzneimittelinteraktionen zwischen Antibiotika, die die Translation hemmen, aufzuklären. Kinetiken der Antibiotikum-Target-Bindung und des Transports zusammen mit „Wachstumsgesetzen“, d. h. der physiologischen Reaktion auf die Translationshemmung (Abb. 2), bilden ein biophysikalisch realistisches Basismodell für die Vorhersage von Antibiotika-Wechselwirkungen allein aus den Eigenschaften einzelner Antibiotika. Dieses Modell erklärte viele Interaktionen, aber nicht alle, die speziell für unterdrückende Interaktionen versagten. Die Vorhersagen verbesserten sich durch die Berücksichtigung der schrittweisen Progression der Ribosomen durch den Translationszyklus (Abb. 4, 5). This was achieved by mimicking antibiotic perturbations of this progression genetically, which directly identified the contribution of antibiotic-imposed translation bottlenecks to the observed drug interactions. Finally, to explain the origin of suppressive interactions unaccounted for by the biophysical model, we modeled the traffic of translating ribosomes explicitly. Our results show that translocation inhibition can cause ribosomal traffic jams, which dissolve in a non-equilibrium phase transition when initiation is inhibited simultaneously with translocation, thereby restoring growth (Fig. 6). This phase transition explains the suppressive drug interactions between antibiotics targeting initiation and translocation.

Taken together, our framework mechanistically explained 20 out of 28 observed drug interactions (Fig. 1 and Supplementary Figs. 2, 5), as classified based on stringent criteria (Supplementary Information). While 16 out of 28 interactions were already explained by the biophysical model, these include many weak and additive interactions in contrast, only the translation bottleneck approach correctly predicted some of the strongest interactions and, in particular, suppression. Furthermore, we only classified predictions as correct if the majority of growth rates across the dose–response surface quantitatively matched the prediction. As a result, cases where the predicted and observed drug interaction type agree, are often still classified as false because the agreement is not quantitative. If the same stringent criteria are applied to replicate measurements of drug interactions (Supplementary Fig. 1), only 75% of measurement replicates are classified as faithful predictions. Thus, our conservative estimate of the fraction of explained interactions (71%) is close to the maximum achievable at our measurement precision. Notably, even cases rejected as quantitatively different can provide valuable insights. For example, the remapping-based prediction of the CHL-FUS interaction (Fig. 5f) is rejected because it quantitatively exaggerates the suppression between these drugs. Nevertheless, remapping correctly predicts the occurrence of suppression as well as its direction. Qualitative observations like these still advance our understanding of drug interactions by highlighting drug interaction mechanisms that are distorted by additional effects of unknown origin.

While we focused on translation inhibitors, key elements of our framework can be generalized to drugs with other modes of action. Specifically, when considering a drug that targets a specific process mediated by an essential enzyme, our approach of equating the deprivation of the enzyme with the action of an antibiotic is readily applicable. Our observations also highlight the advantages of factor deprivation compared to simple overexpression: the former produced a quantitative prediction for drug interactions, while no meaningful prediction could be made from overexpression data (Supplementary Fig. 8). The general approach of depleting key accessory proteins is particularly useful for antibiotics targeting multi-component complexes or in cases where the effects of overexpressing the drug target are difficult to interpret 35 .

Mimicking the effects of two drugs with controllable genetic perturbations generalizes the concept of genetic epistasis to continuous perturbations. Epistasis studies compare the effects of double gene knockouts to those of single knockouts and identify epistatic interactions—an approach that can reveal functional modules in the cell 6,37,46 . Our results show that continuous genetic perturbations provide valuable additional information on genetic interactions (Fig. 6). Firstly, the direction of epistatic interactions cannot be extracted from measurements of single and double mutants. Secondly, the quantitative information obtained from such “continuous epistasis” measurements provides more stringent constraints for mathematical models of biological systems. In particular, continuous epistasis data can be powerful for the development of whole-cell models that describe the interplay of different functional modules in the cell. Thirdly, this approach allows including essential genes in epistatic interaction networks even for haploid organisms, which otherwise requires the use of less well-defined hypomorphs. Hence, continuous epistasis measurements augment all-or-nothing genetic perturbations.

Continuous epistasis measurements further enable a deeper understanding of previously mysterious antibiotic resistance mutations. Specifically, translation bottlenecks that alleviate the effect of an antibiotic expose a latent potential for resistance development. Indeed, mutations with effects equivalent to factor-imposed bottlenecks occur under antibiotic selection pressure. For example, resistance to ERM in E coli can be conferred by mutations in proteins of the large ribosomal subunit, that hinder its maturation and lower its stability 47 . Consistent with this observation, our results indicate that the action of ERM is alleviated by lowering the stability of the 50S subunit (Fig. 3d). Mutations in recycling factor were observed in Pseudomonas aeruginosa evolved for resistance to the TET derivative tigecycline 48 . The observed alleviation of TET action by a recycling bottleneck (Fig. 3d) offers a mechanistic explanation for the beneficial effects of these mutations. Mutations in other genes predicted based on the effect of translation bottlenecks may be difficult to observe, especially in clinical isolates, due to the associated fitness cost and selection pressure for reverting the mutations in the absence of antibiotic selection. Beyond mutations conferring resistance to individual drugs, consistent or conflicting dependencies of different antibiotics on translation bottlenecks may further indicate the potential for evolving cross-resistance and collateral sensitivity, respectively 49 .

Our work also demonstrates the potential of improved null models for drug interactions that are based on generic biophysical and physiological considerations. The number of parameters is minimal and the biophysical model we presented makes parameter-free predictions. This model is readily extended to capture phenomena such as an inactive fraction of ribosomes (Supplementary Information) or physical interactions between antibiotics on the ribosome 23 . Including more detailed mechanisms, e.g., the interplay between different ribosome states that are targeted by different antibiotics, would require additional parameters with unknown values. In essence, such a detailed model and its parameters would have to be fine-tuned for every antibiotic combination. Meaningful predictions would require independent quantitative measurements of multiple kinetic parameters such as the rates of antibiotic binding to the ribosome in different states for all practical purposes, such a more detailed model would not be predictive. In contrast, the minimal biophysical model we presented provides an improved null expectation for drug interactions. Deviations from this expectation expose drug interactions for which additional details of the antibiotic-ribosome interaction are important. We showed examples of the latter experimentally by halting the ribosome in specific stages of the translation cycle (Fig. 5). Developing a fully parameterized mathematical model of the translation cycle and how it is affected by different antibiotics is a formidable challenge for decades to come.

Crucial to both the minimal biophysical (Fig. 2) and the TASEP-translation model (Fig. 6) is the validity of the growth laws. By experimental validation of such models, we showed that capitalizing on growth laws in theoretical models can offer valuable insights into the interplay of cell physiology and antibiotic action. Unexplained deviations are good starting points for the identification of situations in which growth laws are violated. This underscores the importance of elucidating such growth laws in other organisms.

In conclusion, we presented a systematic approach for discovering the mechanistic origins of drug interactions between antibiotics targeting translation. As the translation machinery is highly conserved, the interaction mechanisms for drugs targeting specific steps of translation we uncovered may generalize to diverse other organisms. Our approach of mimicking drug effects with continuous genetic perturbations is general and can be extended to antibiotics with other primary targets, other types of drugs, and other organisms. Our quantitative analysis relies on the established correlation between ribosome content and growth rate in varying growth environments 13 . In the long run, extending our combined experimental-theoretical approach to other types of drugs and other biological systems will enhance our understanding of drug modes of action and interaction mechanisms and provide deeper insights into cell physiology.


From Hypothesis to Clinical Trial

The report from our NCI group in Krebsforschung provides an ideal case report of what the NCI ALMANAC results might mean for advancing new drug combinations into human trials.

We began by conducting follow-up experiments on a subset of drug pairs identified in the database that exhibited potent cell-killing effects. From this work, we selected two drug pairs for more extensive follow up: nilotinib (Tasigna®) and paclitaxel (Taxol®), as well as bortezomib (Velcade®) and clofarabine. These combinations were tested for their antitumor activity in several mouse models of human tumors, and additional experiments were performed to investigate the mechanisms by which these combinations kill tumor cells.

The results from this work were convincing enough that we launched phase I clinical trials of both drug combinations at the NIH Clinical Center. The nilotinib/paclitaxel and bortezomib/clofarabine trials are ongoing and still recruiting patients.

From Heatmap to Phase I Trial

The screening results captured in the NCI ALMANAC can be viewed in multiple formats, from heatmaps, which provide a way to quickly and easily visualize results, to dose-response graphs, which allow for deeper dives into the data.

Data in the NCI ALMANAC showed that the combination of nilotinib and paclitaxel had robust cell-killing effects in blood cancer and triple-negative breast cancer cell lines. Based on these data, the NCI researchers conducted more in-depth analyses of this combination, including testing in different triple-negative breast cancer mouse models and performing molecular analyses of tumor samples from treated mice.

The experiments confirmed that in many models, each drug on its own had either no effect on tumors or inadequate activity. But, together, they effectively killed cancer cells and shrank tumors. In one model, in fact, the treatment completely eradicated tumors and prevented them from returning for the duration of the experiment.

Additional analyses of tumor samples and cell lines suggested a mechanism for this drug pair’s enhanced cell-killing, but the NCI team noted that further studies are needed to better understand how the combination works.


Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution

Combinations of antibiotics lead to synergistic and antagonistic drug interactions.

The underlying mechanisms of drug interactions can be elucidated using novel techniques.

Drug interactions offer opportunities for drug discovery.

Multidrug treatments can exploit evolutionary tradeoffs to slow resistance evolution.

General principles may enable the prediction of cellular responses to drug combinations.

Combining antibiotics is a promising strategy for increasing treatment efficacy and for controlling resistance evolution. When drugs are combined, their effects on cells may be amplified or weakened, that is the drugs may show synergistic or antagonistic interactions. Recent work revealed the underlying mechanisms of such drug interactions by elucidating the drugs’ joint effects on cell physiology. Moreover, new treatment strategies that use drug combinations to exploit evolutionary tradeoffs were shown to affect the rate of resistance evolution in predictable ways. High throughput studies have further identified drug candidates based on their interactions with established antibiotics and general principles that enable the prediction of drug interactions were suggested. Overall, the conceptual and technical foundation for the rational design of potent drug combinations is rapidly developing.


Improved Patient Outcomes

In the new study, 49% of the patients in each combination therapy group and 48% of the chemotherapy group had tumors that were PD-L1 positive (that is, the tumors had PD-L1 levels of 1% or higher). PD-L1 is involved in the body’s immune response and is a potential indicator of responsiveness to immune checkpoint inhibitors.

Treatment group Median overall survival
Alle Teilnehmer Participants with PD-L1+ tumors
Nivolumab + chemotherapy 13.2 months 15.4 months
Nivolumab + ipilimumab 12.8 months 13.7 months
Chemotherapy alone 10.7 months 9.1 months

With a minimum of 13 months follow-up, overall survival with both of the combinations was better among patients whose tumors were PD-L1 positive, as was the percentage of patients whose tumors shrank (response rate).

The amount of time before the disease worsened (progression-free survival) also was improved among the PD-L1-positive patients in the nivolumab-plus-chemotherapy group, compared with chemotherapy alone.

Different types of side effects occurred among patients who received a chemotherapy-containing regimen and those who did not. The most common side effects associated with the chemotherapy-containing regimens were nausea, decreased appetite, and inflammation of the mouth (stomatitis). Side effects from the dual-immunotherapy regimen included rash, itching, and hypothyroidism.

The clinical trial was sponsored by Bristol Myers Squibb, the maker of nivolumab and ipilimumab.


Three is Better Than Two

In general, Dr. Dispenzieri said, otherwise healthy patients with multiple myeloma who are 75 years old or younger are considered to be eligible for a stem cell transplant, whereas older patients are typically considered transplant ineligible because they are weaker and may have other health issues.

But some transplant-eligible patients may opt to delay the procedure because of its potential toxicity and the risk of developing a second primary cancer, especially when highly efficacious drug regimens are becoming another option, explained Dr. Kazandjian.

Previous early-stage clinical trials demonstrated the safety and efficacy of the combination of bortezomib, lenalidomide, and dexamethasone for the first-line treatment of multiple myeloma. In these trials, however, most patients went on to have a stem cell transplant and it was not possible to directly compare the doublet therapy to the three-drug combination.

“There really wasn’t very good data for what happens if you use this triplet therapy without transplant," Dr. Dispenzieri said. "Is it really better than the doublet therapy? And there was concern that there might be more toxicity. We conducted our trial to try to answer those questions.”

The open-label trial, led by Brian G. M. Durie, M.D., of the Cedars-Sinai Samuel Oschin Cancer Center, enrolled 525 patients with multiple myeloma who had not received previous cancer treatment and who did not plan to immediately have a stem cell transplant.

Patients were randomly assigned to receive the three-drug combination in eight 3-week cycles or the two-drug therapy in six 4-week cycles. After these regimens were completed, patients in both groups were treated with lenalidomide and dexamethasone as maintenance therapy.

At the time of their analysis, the investigators found that, compared with the two-drug therapy, treatment with the three-drug combination extended patients’ median progression-free survival—the primary endpoint of the trial—by 13 months, from 30 months with two-drug therapy to 43 months with the three-drug combination. The secondary endpoint, overall survival, improved by 11 months, from a median of 64 months to 75 months.

Furthermore, they found that treatment with the three-drug combination generated deeper responses—meaning more patients had very good partial responses, complete responses, as well as complete responses as measured by more sensitive tests, such as DNA sequencing.

“The deeper the response, the more likely a patient is to have a longer progression-free survival and overall survival,” explained Dr. Kazandjian.

Approximately 10% of patients enrolled in the trial underwent a stem cell transplant after the study. When the investigators excluded these patients from their analysis, the three-drug combination still showed an 11-month improvement in overall survival compared with the two-drug therapy.


Methoden

Modeling three-node enzymatic networks

To extensively model drug action in diverse conditions and elucidate the connection between network topology and drug interactions, we chose to first study small networks which could be thought of as simplifications of disease related networks. A commonly used small-network formalism to investigate the topology-function relationship is the three-node enzymatic network studied by Ma et al. [22] and others [23], [24]. Because of the frequent use of enzymes as drug targets, we considered enzymatic network as a valid representation of a class of drug target related network. A three-node enzymatic network consists of three enzymes, each existing in active or inactive states. The concentration of each enzyme was 1 μM. Following a prescribed connective structure of the networks, the enzymes catalyze the reversible conversion of other enzymes from one state to the other, thus activate or deactivate them (Figure 1A). To ensure a positive steady state for each enzyme, if an enzyme receives only positive/negative regulations, a background negative/positive enzyme regulation F/E was added (E and F in equations in Figure 1A). All catalyzing reactions were modeled by Michaelis-Menten kinetics, and a background activating enzyme regulation I for node A serves as an input of the system. Concentrations of I and E/F were fixed at 1 μM and 0.5 μM, respectively. All free parameters in the system were generated by latin hypercube sampling [25], done logarithmic uniformly in a biological range of 0.001,10 μM for KM, and 0.1, 10 s −1 for kKatze. We first solved the nonlinear equations with the nonlinear equation solver gsl_multiroot_fsolver_hybrids in GSL (GNU Scientific Library) [26] to obtain a steady state of the system, and then we performed linear stability analysis at the solution to select stable states. Linear stability analysis was performed following standard procedures: first the Jacobi matrix at the steady state was calculated then the eigenvalues of the Jacobi matrix were computed. If all eigenvalues of the matrix had negative real parts, we considered the solution as a stable state and used it for further analysis.

(A) Illustration of the drug modelling process. An example enzymatic network with corresponding ODEs is shown. Solid links represent inter-node regulatory relationships, broken lines are background regulations. With the addition of drugs to chosen links (shown by crosses), the equations are modified by incorporating drugs as competitive inhibitors. (B) An example isobologram calculated from the combination of links 1 and 2 in (A). Points on isobloles represent dose combinations with the same efficacy. The black isobole (solid line) is concave, suggesting a synergistic interaction between the two links. The tipping point is the point where CI reaches minimum (or maximum for antagonistic cases). Inhibition strength is defined as [I]/Ki, i. e. the concentration of the inhibitor divided by its inhibition constant. The combination indices calculated from inhibition strengths are identical with those calculated with concentrations since Kich's cancel. The whole process depicted here was repeated for all (16,038) networks and 100,000 sampled parameter sets.

Modeling drug action on three-node enzymatic networks

One enzyme (node C in Figure 1A) from the three enzyme system was chosen as the output node, whose active form concentration in the stable steady state of the system was recorded to monitor the efficacy of drugs. Thus, if an inhibitor reduced the active form concentration of the output node by a certain percentage (50% reduction used in the current study) from the drug-free value, it would be considered as a candidate drug and the reaction (a specific link in the network) it targeted would be a candidate drug target. After identifying all candidate drug targets, their combinations were studied by computational enumeration. We used the concepts of Loewe synergy [27] and combination index (CI) [28] to distinguish between drug synergy and antagonism. CI is defined as follows: the denominators are the EC50's of the drugs acting alone, whereas the numerators are the concentrations of the drugs in a combination that exert the same 50% reduction effect.

For each drug combination, an EC50-isobole was computed (Figure 1B) and CI was calculated throughout the concentration range. A CI consistently less than 1 (a downward concave isobole) represents drug synergy a CI greater than 1 (an upward concave isobole) indicates drug antagonism. Thresholds of 1.01 and 0.99 were used in the computation. Drug pairs with CIs between 0.99 and 1.01 were classified as Loewe additive. We also tested larger margins (such as 0.9 and 1.1), and the results were qualitatively similar. The whole process is illustrated in Figure 1.

Sampling all possible network topologies for drug interaction patterns

To obtain a complete catalog of patterns of drug synergy/antagonism in our model system, we enumerated all possible network interaction patterns (each node could have three possible links to itself and other two nodes, and the links could be activation or deactivation, generating a total of 3 9 networks. Eliminating networks with no connection from input (A) to output (C) leaves 16,038 networks) for the three-node enzyme network following Ma et al. [22] For each of these networks, the complete Michaelis-Menten reaction kinetics was written as a set of ordinary differential equations (ODEs). After evaluating a stable steady state of the system by nonlinear equation solving and linear stability analysis, the process of drug action modeling described above was conducted. For each possible network topology, we ran a total of 100,000 simulations, each with a random parameter set generated by latin hypercube sampling. Drug interactions behaving consistently under various parameterizing conditions as synergistic or antagonistic were selected, clustered by network Hamming distance (number of differing links between two networks) and further analyzed. The values of CIs at the tipping point of the isoboles (Figure 1B), which we refer to as CIT's, were also recorded as representations of the extent of synergy or antagonism.