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Warum verdauen Restriktionsendonukleasen transformierte Plasmide nicht?

Warum verdauen Restriktionsendonukleasen transformierte Plasmide nicht?


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In dem Lehrbuch, das ich verwende, wird erklärt, dass Bakterien ihre eigene chromosomale DNA nicht verdauen, weil die Stellen, die von ihrer eigenen Endonuklease geschnitten würden, methyliert sind. Gibt es einen ähnlichen Mechanismus, um seine eigenen Plasmide zu schützen? Wenn ja, wie werden Plasmide geschnitten, während sie als Vektoren dienen?


Für Klonierungszwecke verwendete Laborstämme wurden gentechnisch verändert, um dieses Problem anzugehen, typischerweise durch Deletion von Genen der verschiedenen Restriktions-Modifikations-Systeme. Es gibt vier große Klassen von Restriktionsmodifikationssystemen, die ich einzeln besprechen werde. Sofern nicht im Einzelnen angegeben, basieren die meisten nachfolgenden Informationen auf den folgenden technischen Hinweisen des Lieferanten:

Promega: Welche Auswirkungen haben die bakteriellen DNA-Restriktions-Modifikations-Systeme auf das Klonen?

New England Biolabs: Restriktion fremder DNA durch E. coli K-12


Tippe I

In Escherichia coli, besteht dieses System aus den hsdR-, hsdM- und hsdS-Genen und ist in der Lage, sowohl unmethylierte DNA als auch hemimethylierte DNA einzuschränken (zu verdauen). Knockout von hsdR und/oder hsdM verhindert Restriktion bzw. Methylierung. Dies ermöglicht das Engineering von Stämmen für bestimmte Zwecke. Zum Beispiel ein gemeinsames E coli Der für die Klonierung verwendete Stamm, DH5α, hat den Genotyp hsdR17 (rK-, mK+) die die Restriktionsaktivität aufhebt, aber die Methylierungsaktivität beibehält. Dies bedeutet, dass exogene DNA nicht eingeschränkt wird, sondern methyliert wird und daher im Bedarfsfall ohne Angst vor Abbau in r+-Stämme transformiert werden kann.


Typ II

Dies ist die Klasse von Restriktionsenzymen, die im Labor üblicherweise zum Schneiden von DNA verwendet wird, da sie im Allgemeinen kurze, palindromische Sequenzen erkennen und innerhalb oder in der Nähe der Erkennungsstelle schneiden. Die E coli Hintergrundstämme K und B, von denen die meisten Laborstämme abgeleitet sind, enthalten keine Enzyme vom Typ II. Das Typ-II-Enzym EcoRI zum Beispiel wurde aus dem . isoliert E coli RY13-Stamm (Yoshimori, 1971; Doktorarbeit).


Typ III

Ähnlich wie Typ II besitzen die K- und B-Stämme dieses Restriktions-Modifikationssystem nicht, das erstmals in charakterisiert wurde E coli 15T-.


Typ IV

Dieses System unterscheidet sich von den anderen dadurch, dass es methylierte und hemimethylierte DNA spaltet, obwohl es weder die Methylierung durch Typ-I- oder Typ-II-Modifikationssysteme noch die Dam- oder Dcm-Methylierung erkennt. In E coli, besteht dieses System aus den mcrA-, mcrBC- und mrr-Genen und ist am problematischsten, wenn versucht wird, DNA aus Organismen mit ubiquitärer Cytosin- oder Adeninmethylierung (zB Pflanzen und Säugetiere) zu transformieren. Zum Beispiel hat der Laborstamm T7 Express, der vom gemeinsamen Stamm BL21 abgeleitet ist, den Genotyp (mcrC-mrr)114::IS10 die mcrBC, hsdRMS und mrr löscht.


Hinweis zu Dam- und Dcm-Methylasen

Diese bakteriellen Enzyme methylieren Adenin- bzw. Cytosinreste, sind jedoch nicht direkt an den oben diskutierten Restriktionsmodifikationssystemen beteiligt. Einige zum Klonen verwendete Typ-II-Enzyme reagieren jedoch empfindlich auf diese Methylierung, und daher sind Laborstämme mit diesen Enzymen deletiert erhältlich.


Schau das Video: Restriktionsenzymer (Dezember 2022).