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Welche Wirkung hat der pH-Wert auf die Aktivität einer Pilzpektinase?

Welche Wirkung hat der pH-Wert auf die Aktivität einer Pilzpektinase?


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Ich arbeite an einem Enzymtest für eine Pilz-Pektinase. Ich habe das Enzym in verschiedenen Puffern von pH 1-12,5 getestet. Das Enzym hat jedoch gute Aktivitäten ab pH 1-10,5.

Ist eine Enzymaktivität über einen so breiten pH-Bereich möglich?


Ich bezweifle eigentlich, dass die Pektinase einen so breiten pH-Bereich hat, in dem sie optimal funktioniert. Beim Durchsuchen des Internets fand ich zwei Zahlen, die meine Zweifel stützen:

Der erste stammt aus einem Artikel ("Immobilisierung von Pektinase durch Adsorption auf einem mit Alginat beschichteten Chitinträger"), der die Aktivität von nativer und immobilisierter Pektinase unter verschiedenen Bedingungen vergleicht. Der zweite ist aus dem Datenblatt einer Firma, die das Enzym verkauft. Beide zeigen etwa zwischen pH 3,5 und 5,5 eine Aktivität von über 50%, jedoch nicht bei höheren oder niedrigeren pH-Werten.


Welche Wirkung hat der pH-Wert auf die Aktivität einer Pilzpektinase? - Biologie

Katalase

Wasserstoffperoxid (H2Ö2) ist ein häufiges Nebenprodukt von Stoffwechselreaktionen. In hoher Konzentration ist es toxisch, daher wäre seine Anreicherung in den Zellen schädlich. Die meisten Gewebe enthalten jedoch das Enzym Katalase, das den Abbau von Peroxid zu Wasser und Sauerstoff wie folgt katalysiert: Die Reaktion ist extrem schnell. Die Wirkung des Enzyms kann leicht durch die Entwicklung von Sauerstoff in Form von Gasblasen nachgewiesen werden, wenn ein Extrakt eines das Enzym enthaltenden Gewebes zu einer verdünnten Lösung von Wasserstoffperoxid gegeben wird. Als Katalasequelle verwenden wir homogenisierte (zerkleinerte) Hühner- oder Rinderleber. Katalase

  • Katalase - allgemeine Informationen Klassenzimmer des 21. Jahrhunderts
  • Katalase - ein außergewöhnliches Enzym
  • Hitzedenaturierungsenzym
  • Struktur von Katalase-Bild und -Graph
  • Links -

Amylase

    Amylase-Referenzen:
    • Amylase - Unabhängige Studie von Amy Caruana (Studentin an der Kean Univ)
    • Amylase - Ergebnisse von U. North Dakota
    • Enzyme Amylase, Temperatur, pH, Substratkonzentration
    • Benedicts-Test zur Zuckerreduktion - Ergebnisbild
    • Amylase Wie funktioniert es?
    • Amylase - Stärkehydrolyse
    • Speichel-Amylase - pH
    Pepsin ist eine Protease, die mit der Verdauung von Proteinen beginnt und sie in Peptide und Aminosäuren aufspaltet. Pepsinogen wird von den Magendrüsen des Magens in den Magen sezerniert. Dort, im sauren Milieu des Magens, wird Pepsinogen in Pepsin umgewandelt.

    Obwohl sowohl Pepsin als auch Trypsin Proteasen sind, benötigen sie für ihre Wirkung ganz unterschiedliche Säure- und Alkalinitätsbedingungen.

      Pepsin-Referenzen:
      • Pepsin -
      • Pepsin - Molekül des Monats
      • pH-Optimum -
      • Pepsin - erwähnt pH-Optimum
      Trypsin ist eine Protease, die von der Bauchspeicheldrüse in den Dünndarm sezerniert wird. Als Pepsin verdaut Trypsin Proteine ​​in Peptide und Aminosäuren und wird in einer inaktiven Form, Trypsinogen, hergestellt und sezerniert.

      Obwohl sowohl Pepsin als auch Trypsin Proteasen sind, benötigen sie für ihre Wirkung ganz unterschiedliche Säure- und Alkalinitätsbedingungen.

        Trypsin-Referenzen:
        • Beschreibung der Trypsin-Enzyklopädie
        • Illustrationssuche nach Trypsin in dieser großen Datei
        • Bilder Google-Suchmaschine

        Eine Analogie

        Angenommen, Sie interessieren sich für den Kauf eines Pizzageschäfts und möchten untersuchen, wie produktiv das Geschäft ist, ohne dass der derzeitige Besitzer es weiß, da Sie befürchten, dass der Besitzer den Preis erhöht. Anstatt also in den Laden zu gehen und zu beobachten, was passiert, und zu bitten, die Bücher zu untersuchen, in denen Ausgaben und Gewinne verzeichnet sind, beschließt man, den Laden von außen zu beobachten.

        Sie beobachten, wie oft Lastwagen mit Pizzateig, Pizzabelag (Käse, Pepporoni usw.) und anderem Zubehör ankommen. Sie beobachten auch, wie oft Arbeiter den Laden verlassen, um den Kunden Pizzen zu liefern.

        In dieser Analogie sind die Pizzavorräte die Reaktanten und die verpackten Pizzen, die an die Kunden geliefert werden, die Endprodukte. Die Arbeiter im Laden, die den Teig formen, den Belag hinzufügen und die Pizzen in Öfen und schließlich in Kisten legen, sind das Äquivalent der Enzyme.

        Obwohl wir die Arbeiter nicht wirklich bei ihrer Arbeit sehen, können wir daraus schließen, dass die Arbeiter (Enzyme) müssen, wenn der Laden große Mengen an Reaktanten (Teig und Beläge) verwendet und / oder eine große Anzahl von Endprodukten (Pizzen) herstellt sehr aktiv sein.


        Das könnte dir auch gefallen

        Beta-Amylase kommt im menschlichen Gewebe nicht vor. Eisenfußnagel 8. Januar 2013

        Ich habe neulich tatsächlich gelesen, dass es einige natürliche Chemikalien gibt, die Sie dazu bringen können, zu denken, dass etwas süß ist, wenn es es nicht ist. Es passiert zum Beispiel, wenn Sie eine Artischocke essen. Danach schmeckt vieles süß (wie zum Beispiel reines Wasser).

        Sie versuchen, Wege zu finden, es als kalorienarmen Süßstoff zu verwenden. Ich frage mich, ob es mit Enzymen so funktioniert wie Amylase. Obwohl ich mit Amylase denke, dass es tatsächlich Stärke in Zucker umwandelt, wobei die Chemikalien die Dinge einfach so schmecken lassen, als ob sie Zucker enthalten. Croydon 8. Januar 2013

        @Iluviaporos - Eigentlich glaube ich nicht, dass es an der Verdauung liegt, dass den Leuten gesagt wird, sie sollen mehr kauen. Ich meine, es mag für manche Menschen zutreffen, die generell Probleme mit ihrer Verdauung haben, und es könnte ein bisschen für Lebensmittel gelten, die nicht leicht verdaulich sind, wie Fleisch. Darüber weiß ich nichts.

        Aber mir wurde immer gesagt, dass die Leute ihr Essen mehr kauen sollten, weil es den gesamten Prozess des Essens verlangsamt und dem Körper Zeit gibt, einem zu sagen, dass er satt ist. Ich dachte immer, die Leute hören einfach auf zu essen, wenn ihr Magen voll ist, aber als bei mir eine Insulinresistenz diagnostiziert wurde, erklärte mir mein Arzt, dass der Körper tatsächlich entscheidet, dass er satt ist, wenn er genug Blutzucker hat.

        Ich denke, viel Kauen könnte dabei auch helfen, da es die Verdauung beschleunigen und den Blutzucker schneller ansteigen lassen würde. luviaporos 7. Januar 2013

        Amylase ist der Grund dafür, dass Sie versuchen sollten, Ihr Essen gründlich zu kauen, bevor Sie es schlucken. Speichel ist nicht nur dazu da, den Mund vor dem Austrocknen zu bewahren, sondern startet auch den Verdauungsprozess, bevor das Essen überhaupt in den Magen gelangt.

        Früher wurde empfohlen, dass die Leute jeden Bissen etwa 40 Mal kauen, bevor sie ihn schlucken. Ich weiß nicht, ob es der wirkliche Betrag ist, für den Sie es tun sollten, aber die meisten Leute tun es definitiv nicht genug.


        Ergebnisse

        Screening von Isolaten auf Pektinaseaktivität

        Pektinase hat viele Anwendungen in verschiedenen industriellen Prozessen ([16] #1170 [17] #1311). Um ausgezeichnete Stämme auf die Pektinaseproduktion zu screenen, wurden einige Isolate aus dem primären Screening punktuell auf Pektinagarplatten (PAPs) in dreifacher Ausfertigung inokuliert. Dazu wurde ein zusätzliches Bild genauer gezeigt [siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S1]/(siehe Zusatzdatei 1). Der Hc-Wert von 33 lag bei diesem Isolat deutlich über den Werten anderer Isolate (8,87 ± 0,15, Abb. 1). Dieses Bakterium wurde als Isolat bezeichnet B. Tequilensis CAS-MEI-2-33 und weitere Charakterisierung und Identifizierung wurden durchgeführt.

        Die Hc-Werte von gescreenten Stämmen. Die Werte werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (n =3). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede bei 5% hin

        Morphologische Eigenschaften von B. Tequilensis CAS-MEI-2-33

        B. tequilensis CAS-MEI-2-33 war ein grampositives Bakterium, das Sporen enthielt, und die Form der Bakterienzellen war keulenförmig. Bei Kultivierung bei 37 °C für 8–12 h in LB-Agar, Kolonien von B. tequilensis CAS-MEI-2-33 waren rund, glatt und cremefarben, und der Rand war ganz.

        Biochemische Charakterisierung von B. Tequilensis CAS-MEI-2-33

        Die biochemische Charakterisierung von B. tequilensis CAS-MEI-2-33 wurde mit einer Vielzahl von Tests durchgeführt, darunter Voges-Proskauer, Nitratreduktion, Glucoseverwertung, Katalase, Motilität, Lysozymtoleranz, Phenylalanin, Gelatine, Stärke, Laktose, Casein und Mannit. Die Ergebnisse der Phenylalanin-, Stärke- und Mannittests waren negativ, während die Ergebnisse der übrigen Tests positiv waren (Tabelle 1).

        Identifizierung basierend auf phylogenetischer Analyse

        Der mit der 16S-rRNA-Gensequenz des Bakterienisolats erstellte phylogenetische Baum zeigte die höchste Homologie (100%) mit B. tequilensis. Darüber hinaus unterschied sich die biochemische Charakterisierung der Fähigkeit von CAS-MEI-2-33, Stärke und Mannit zu metabolisieren, von der von Bacillus subtilis aber ähnlich wie bei B. tequilensis. Nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology wurde dieser Stamm benannt B. tequilensis CAS-MEI-2-33 ([18] #1309). Der erstellte phylogenetische Stammbaum zeigte, dass dieser Stamm die engste genetische Verwandtschaft mit dem B. Tequilensis Stamm P12Pb (Fig. 2). Der Baum wurde durch das Neighbor-Joining-Verfahren unter Verwendung der MEGA 7.0-Software abgeleitet. Die Zahlen an den Knoten des Baums sind Hinweise auf die Ebenen der Bootstrap-Unterstützung basierend auf der Neighbor-Joining-Analyse von 1000 abgeleiteten Replikationen.

        Phylogenetischer Baum basierend auf 16S ribosomaler RNA-Sequenzanalyse, die die Position des Stamms CAS-MEI-2-33 unter Verwendung der MEGA 7.0-Software zeigt. Zahlen an Verzweigungspunkten beziehen sich auf Bootstrap-Werte (1000 Resamplings) mit 0,50 als Sequenzdivergenz

        Toxizität von Nikotin gegen B. Tequilensis CAS-MEI-2-33

        TS enthält Nikotin, das für viele Bakterien schädlich ist und als eindeutige Nahrungsquelle dient. Der durchschnittliche Nikotingehalt in TS beträgt 1900–3800 mg/kg ([1] #1136), was 76–152 mg/L im Fermentationsmedium entspricht. In dieser Studie wurden 500–2000 mg/L Nikotin im Medium getestet. Die höchste Nikotinkonzentration im Testmedium war ungefähr das 13-fache der im TS-Fermentationsmedium. Allerdings ist das Wachstum von B. Tequilensis CAS-MEI-2-33 wurde unter den experimentellen Bedingungen weniger beeinflusst (Abb. 3).

        Das Wachstum von B. Tequilensis CAS-MEI-2-33 unter verschiedenen Konzentrationen von exogenem Nikotin. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3) angegeben

        Produktion von Pektinase

        Die Produktion hoher Pektinase-Titer durch Optimierung der Wachstumsparameter ist von größter Bedeutung in der Industrie ([19] #1145). In der vorliegenden Studie wurde die Ein-Faktor-zu-Zeit-Methode implementiert, um die Komponenten des Mediums und der Bedingungen zu optimieren. Die enzymatische Aktivität wurde unter Verwendung von 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)-Reagens (Beijing Leagene Biotech. Co., Ltd.) basierend auf der Produktion von D-Galacturonsäure ([20] #1161) nachgewiesen. Die Kurve für die Produktion von Pektinase während der Fermentation von B. tequilensis CAS-MEI-2-33 war ausschlaggebend für die Anzeige der optimalen Fermentation. Die Pektinase-Aktivität nahm bis 40 h, mit Ausnahme von 32 h, allmählich zu und begann dann abzunehmen (Fig. 4a). Die höchste Pektinaseaktivität für den Fermentationsprozess unter Verwendung von TS als Einsatzmaterial betrug 293 U/ml nach 40 h. Parameter wie der pH-Wert des Fermentationsmediums haben einen wesentlichen Einfluss auf das Wachstum von Stämmen und die Pektinase-Produktion. Die Pektinase-Aktivität (618 ± 9 U/ml, Abb. 4b) war bei pH 7,0 im Vergleich zu der unter anderen Bedingungen signifikant erhöht.

        Pektinase-Aktivität von B. Tequilensis CAS-MEI-2-33 während der Fermentation. ein Pektinaseaktivität während B. Tequilensis CAS-MEI-2-33-Wachstum. B Wirkung des anfänglichen pH-Wertes des Fermentationsmediums auf die Enzymaktivität. C Wirkung der Tabakstengelkonzentration im Fermentationsmedium auf die Enzymaktivität. D Wirkung der Menge des Inokulums auf die Enzymaktivität. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3) angegeben. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede bei 5% hin

        Nach der Bestimmung der Pektinase-Aktivität mit unterschiedlichen Konzentrationen von TS im Fermentationsmedium wurde festgestellt, dass bei der Konzentration von 40 g/L TS und dem optimierten pH-Wert die Pektinase-Aktivität am höchsten war (730 ± 38 U/mL, Abb. 4c ), wie durch ANOVA (P = 0.05).

        Die Inokulummenge spielte eine Schlüsselrolle bei der anfänglichen Fermentation. Unter der optimalen pH- und TS-Konzentration wurden Impfkonzentrationen von 1, 3, 5, 7 und 9% getestet. Die höchste Pektinase-Aktivität (1370 ± 126 U/mL, Abb. 4d) mit 3% Inokulum unterschied sich nicht signifikant von der mit 5% Inokulum. Bei höheren Konzentrationen, wie 7 und 9 %, ging die Enzymproduktion zurück, was auf die Konkurrenz um Nährstoffe innerhalb der Bakterienpopulation zurückzuführen sein könnte, wie in beobachtet wurde Thermomucor indicae-seudaticae ([21] #1230).

        Pektinase-Eigenschaften

        Die Ergebnisse der Pektinase-Eigenschaftsanalyse sind in Fig. 5 gezeigt. Der pH-Wert des Reaktionssystems kann die Pektinase-Aktivität beeinflussen. Die Pektinase-Aktivität nahm zu, wenn der pH-Wert der Reaktionssysteme von 6,0 auf 10,0 erhöht wurde, aber diese Aktivität war bei pH 11,0 fast nicht nachweisbar. Unsere Ergebnisse zeigten, dass 791 ± 42 U/ml Pektinase-Aktivität bei pH 10,0 der höchste aufgezeichnete Wert war (Fig. 5a). Anschließend wurde der Einfluss der Temperatur auf die Pektinaseaktivität untersucht. Die Pektinase-Aktivität erhöhte sich, wenn die Reaktionstemperatur von 30 °C auf 40 °C erhöht wurde, erreichte die maximale Aktivität bei 40 °C und nahm dann schnell ab, wenn die Temperatur über 40 °C hinaus stieg. Die Pektinaseaktivität war bei 40 °C höher als bei anderen Temperaturen (Abb. 5b). Somit war Pektinase bei einem alkalischen pH und einer mittleren Temperatur aktiver. Die Auswirkungen verschiedener Metallionen auf die Pektinaseaktivität sind in Abb. 5c dargestellt. Ag + , Li + , Cu 2+ , Ca 2+ , Ba 2+ und Mn 2+ Ionen erhöhten insbesondere die Enzymaktivität, Ag + Ionen erhöhten die Pektinaseaktivität um 193,95%, was ungefähr 1,94 Mal höher war als die der Kontrolle . K + , Co 2+ , Ni 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ , Cd 2+ und Fe 3+ Ionen, insbesondere Zn 2+ , hemmten die Pektinaseaktivität. Abbildung 5d zeigt die thermische Stabilität der Pektinase, die durch B. tequilensis CAS-MEI-2-33. Die Pektinase-Aktivität nahm jedoch ab, wenn der zellfreie Überstand bei 60 °C gehalten wurde. Die Pektinase-Aktivität war stabil, wenn der zellfreie Überstand bei 40 °C inkubiert wurde, jedoch konnte die Pektinase die hohe Temperatur nicht lange vertragen.

        Enzymatische Eigenschaften von Pektinase. ein Wirkung des Substrat-pH-Werts auf die Pektinase-Aktivität. B Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Pektinaseaktivität. C Wirkung von Metallionen auf die Pektinaseaktivität. D Temperaturstabilität der Pektinase. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3) angegeben. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede bei 5% hin

        Teilreinigung von Pektinase aus CAS-MEI-2-33

        Unter den optimalen Fermentationsbedingungen wurden 2,30 l Überstand durch Zentrifugieren der Bakterien in einem 3,0 l Fermentationskolben erhalten. Die Pektinase-Aktivität erreichte 1771 U/ml und die Gesamt-Pektinase-Aktivität betrug 4.074.513 U (Tabelle 2).

        Entsprechend der Ammoniumsulfat-Fraktionierungskurve wurde eine geeignete Sättigung zum Aussalzen gewählt. Die Fraktionierungskurve ist in Fig. 6a gezeigt. Wenn Ammoniumsulfat zu 70–80 % gesättigt war, nahm die Pektinaseaktivität des Niederschlags zu, während die des Überstands signifikant abnahm. Als die Sättigungsrate 80–90% erreichte, änderten sich die Pektinaseaktivitäten (pH 10,0, Gly-NaOH) des Niederschlags und des Überstands nicht signifikant. Das Zielprotein wurde nach dem Aussalzen mit 30 ml Puffer (pH 8,0, Tris-HCl) gelöst. Dann wurde das Zielprotein mit 55,0 ml Puffer (pH 8,0, Tris-HCl) durch einen Dialysebeutel weiter renaturiert. Die Pektinaseaktivität betrug 5166 U/ml und die Gesamtaktivität 284.144 U.

        Die Reinigung der alkalischen Pektinase aus B. Tequilensis CAS-MEI-2-33. ein Ammoniumsulfat-Fraktionierungskurve B Elutionskurve der Mini Macro-Prep High-Q-Ionenaustauschchromatographie C. Elutionskurve der Sephacryl S-100 Säulenchromatographie D. Die partielle Reinigung der alkalischen Pektinase aus B. tequilensis CAS-MEI-2-33 unter Verwendung von TS. M: Molekulargewichtsmacher 1. Sephacryl S-100 Säulenchromatographie mit pH 7,2 2: Mini Macro-Prep High-Q Ionenaustauschchromatographie mit pH 8,0 3. Konzentrierte Ammoniumsulfat-Aussalzlösung

        Nach der Dialyse wurde der Überstand mit einer Mini Macro-Prep High-Q Ionenaustauschersäule gereinigt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6b gezeigt. Die Pektinase wurde mit Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, eluiert, und wenn die Säule mit einem Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 0–1 mol/L NaCl enthielt, Gradienteneluiert wurde, wurden Peaks eluiert. Durch den Nachweis der Pektinase-Aktivität wurde festgestellt, dass der erste Elutionspeak aktiv war. Der erste Elutionspeak wurde mit einer Pektinaseaktivität von 862.352 U/ml gesammelt. Die Gesamtaktivität betrug 77.611 U. Sephacryl S-100 wurde mit Reinstwasser äquilibriert, Proben entnommen und dann mit pH 7,2 PBS-Puffer mit einer Flussrate von 0,8 ml/min eluiert, und der Abfluss wurde online mit einem UV-Detektor bei a . nachgewiesen Wellenlänge von 280 nm, um die Ultraviolett-Absorptionspeakkurve aufzuzeichnen (Fig. 6c). Die Komponenten wurden gesammelt und zur Bestimmung der Enzymaktivität und des Proteingehalts verwendet. Die Pektinaseaktivität betrug 13.786 E/ml und die Gesamtaktivität 41.357 E.

        Das Molekulargewicht der gereinigten alkalischen Pektinase wurde mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wie von Mehrnoush et al. ([22] #1306). Das Molekulargewicht der Pektinase, das ungefähr 45,4 kDa betrug, ist in Fig. 6d gezeigt. Dann wurde die Proteinbande aus dem SDS-PAGE-Gel ausgeschnitten, einer LC-MS/MS-Analyse von Shanghai Applied Protein Technology ([23] #1320 [24] #1321) unterzogen und durch Durchsuchen der UniProt-Datenbank identifiziert. Die zusätzliche Abbildung zum Protein-Base-Peak wurde dies detaillierter gezeigt [siehe Zusatzdatei 2: Abbildung S2]/(siehe Zusatzdatei 2 zum Proteinpeak). Schließlich wurde das Protein als Pektatlyase identifiziert, die Sequenz war K.ASSSNVYTVSNR.N (Fig. 7). Das Molekulargewicht betrug 45,4 kDa, was mit den SDS-PAGE-Ergebnissen übereinstimmte. Die Ergebnisse zeigten, dass das Enzym ein guter Kandidat für Pektatlyase war. Darüber hinaus war diese Studie ein neuer Versuch, TS in der landwirtschaftlichen Produktion zu recyceln und wiederzuverwenden.

        LC-MS/MS-Analyse von Proteinbanden durch SDS-PAGE


        Alkaliphile

        Am anderen Ende des Spektrums stehen alkaliphile Mikroorganismen, die pH-Optima zwischen 8,0 und 11 aufweisen. Vibrio cholerae , der Erreger der Cholera, wächst am besten bei einem leicht basischen pH-Wert von 8,0. Er kann pH-Werte von 11,0 überstehen, wird aber durch die Magensäure inaktiviert. Wenn es ums Überleben bei hohem pH-Wert geht, ist das leuchtend rosa halophile Archaeon Natronobakterium , gefunden in den Sodaseen des afrikanischen Rift Valley, könnte den Rekord bei einem pH-Wert von 10,5 . halten (Abb. 9.37). Extreme Alkaliphile haben sich durch verschiedene evolutionäre Modifikationen an ihre raue Umgebung angepasst. Alkaliphile Archaeen haben Diether-Lipidmembranen. Die Etherbindung ist im Vergleich zu den estergebundenen Phospholipiden beständiger gegen chemischen oder thermischen Abbau. Angesichts des Mangels an Protonen in alkalischen Umgebungen ist die Aufrechterhaltung einer Protonenantriebskraft wahrscheinlich die dringendste Herausforderung für Alkaliphile. Eine der Anpassungen alkaliphiler halophiler Bakterien und Archaeen in Sodaseen und anderen stark salzhaltigen Umgebungen ist die Entwicklung gekoppelter Transporter und Flagellen, die die Natriummotorik ausnutzen und so das PMF für die oxidative und Photophosphorylierung durch die ATP-Synthase konservieren. Die Zelloberfläche von Alkaliphilen weist eine hohe Konzentration an sauren (dh negativ geladenen) Molekülen auf, und es wurde vermutet, dass dies als „Protonenschwamm“ fungiert, der eine schnellere laterale Diffusion von Protonen vom ETS zur ATP-Synthase ermöglicht als die Diffusionsgeschwindigkeit in das umgebende Wasser [1] Schließlich können Alkaliphile Na + /H + -Antiport verwenden, um eine Natrium-Antriebskraft zu erzeugen. Zum Beispiel das Alkaliphil Bacillus firmus leitet die Energie für Transportreaktionen und Motilität von SMF und nicht von einer Protonenantriebskraft ab. Wie bei den Acidophilen haben sich die Gene für sezernierte Proteine ​​von Alkaliphilen zu Enzymen entwickelt, die Deprotonierung/Denaturierung und chemischem Abbau bei dem hohen pH ihrer Umgebung widerstehen. Diese Enzyme sind auch für Biotechnologieunternehmen interessant. Tatsächlich enthalten Waschmittel, die alkalisch sind, alkaliphile Lipasen und Proteasen, um ihre Fleckenentfernungsfähigkeiten zu verbessern.

        Abbildung 9.37. Blick aus dem All auf den Lake Natron in Tansania. Die rosa Farbe ist auf die Pigmentierung der extrem alkaliphilen und halophilen Mikroben zurückzuführen, die den See besiedeln. [Kredit: NASA]


        Welche Wirkung hat der pH-Wert auf die Aktivität einer Pilzpektinase? - Biologie

        Die Reaktionsgeschwindigkeit bei Leber, Äpfeln und Kartoffeln mit Wasserstoffperoxid

        Der Zweck dieses Labors bestand darin, die Enzymfunktion in verschiedenen Umgebungen zu testen. Substratkonzentration, Temperatur und pH-Wert beeinflussen alle die chemische Reaktion. In diesem Labor wurde das Enzym Katalase verwendet, um Wasserstoffperoxid in weniger giftiges Wasser und Sauerstoffgas aufzuspalten. Sowohl durch quantitative als auch qualitative Beobachtungen wurde das Konzept, dass Enzyme nach einer Reaktion verbleiben, aus dem ersten Test bestätigt. Nach dem Testen von Leber, Apfel und Kartoffel wurde geschlossen, dass die Leber am meisten Katalase enthielt. Der letzte Test konzentrierte sich auf die Reaktionsgeschwindigkeit der Leber in verschiedenen pH-Lösungen. Die Beziehung zwischen der Katalase-Reaktionsgeschwindigkeit und dem pH-Wert erwies sich als parabolisch mit einem Peak nahe dem Neutralpunkt.

        Dieses Labor befasste sich mit der Messung der Auswirkungen von Änderungen der Temperatur, des pH-Werts und der Enzymkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion in einem kontrollierten Experiment. Die Fragen, wie Umweltfaktoren die Geschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen beeinflussen, wurden in diesem Labor beantwortet. Die Reaktionsgeschwindigkeiten von Enzymen wurden stark von Änderungen der Temperatur, des pH-Werts und der Enzymkonzentration beeinflusst. Das in diesem Labor untersuchte Enzym war Katalase. Katalase spaltet Wasserstoffperoxid, das giftig ist, in 2 sichere Substanzen auf – Wasser und Sauerstoff, indem es eine Reaktion beschleunigt. Enzyme wie Katalase sind für unseren Körper lebensnotwendig, denn würden giftige Stoffe wie Wasserstoffperoxid in unserem Körper nicht in harmlose Stoffe zerlegt, würden sie unsere Zellen vergiften. Die ablaufende Reaktion ist in dieser Form: 2H2O2 ----> 2H2O + O2


        Methoden
        Diese Studie wurde am 8. Oktober 2015 am New Tech High @ Coppell unter der Leitung von Frau Wootton durchgeführt. In den drei Teilen des Labors wurde die Fähigkeit von Enzymen zum Abbau untersucht. In Teil A verwendeten wir 3 ml 3% Wasserstoffperoxid auf einem Stück Leber, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu beobachten. Sobald dies erledigt war, nahmen wir die übrig gebliebenen Flüssigkeiten und verwendeten sie für ein neues Stück Fleisch, um zu sehen, ob das Enzym wiederverwendbar war. In Teil B haben wir die Reaktionsgeschwindigkeit mit Wasserstoffperoxid auf drei Substanzen getestet, beobachtet und aufgezeichnet: Apfel, Leber und Kartoffel. In Teil C änderten wir den pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Tropfen verdünnter Salzsäure, um zu sehen, ob dies einen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit bei Katalysen auf Leberstücken hatte.

        Wenn das Substrat von Wasserstoffperoxid zu den Substanzen hinzugefügt wurde, führte jede eine sehr unterschiedliche Reaktion durch. Nach dem Auftropfen des Wasserstoffperoxids auf die Apfelproben wurde keine Reaktion angezeigt, daher wurde eine Bewertung von 0 erhalten. Sobald die gleiche Menge des Substrats zu der Kartoffel gegeben wurde, gab es eine leichte sprudelnde und sprudelnde Reaktion, die die Bewertung 2 erhielt Katalase wurde dann getestet und führte zu der größten Reaktion, die aufgrund der Geschwindigkeit und Stärke mit 5 bewertet wurde. Nach dem Testen jeder Substanz begann die Gruppe dann, die optimalen pH-Bedingungen für die Reaktionen zu untersuchen. Nach Zugabe von Salzsäure zur Leber schien die Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmendem Säuregehalt abzunehmen.

        Substrat: Wasserstoffperoxid

        Wenn wir unsere Daten für das erste Experiment betrachten, können wir folgern, dass die Leber das Katalase-Enzym enthält, während das Wasserstoffperoxid das Substrat ist. Dies ist wahr, weil bei der Reaktion beobachtet wird, dass das Wasserstoffperoxid eine chemische Veränderung durchgemacht hat, die sich in Wassermoleküle und Dioxidmoleküle verwandelt, während die Leber gleich geblieben ist. Da das Substrat die chemische Reaktion bereits durchlaufen hat, konnte es keine weitere mit neuer Katalase durchlaufen, aber die alte Katalase hatte noch funktionelle Enzyme und konnte daher wiederverwendet werden. Die Reaktion war sehr offensichtlich und schnell, was sinnvoll ist, wenn man bedenkt, dass die Funktion der Leber in einem Organismus darin besteht, Zellen abzubauen und zu reinigen.

        Im zweiten Teil des Experiments war die Intensität der Reaktion in aufsteigender Reihenfolge Apfel, Kartoffel und Leber. Die Apfelprobe besteht einfach aus Kohlenhydraten, die als Nahrung für den Apfelkern gedacht sind und keine Enzyme enthalten, daher wurde keine Reaktion beobachtet. Die Kartoffel reagiert halb intensiv, da nur eine geringe Konzentration der Kartoffelprobe Enzyme enthält, während der Rest aus Stärke und organischen Verbindungen besteht. Die Leber reagiert stark, da der Großteil der Leber aus Proteinen und Enzymen besteht, die das Wasserstoffperoxid abbauen.

        Im dritten Experiment wurde gefolgert, dass mit zunehmender Acidität des Substrats die Reaktionsgeschwindigkeit abnahm. Unsere Daten zeigen einen linearen Trend, Untersuchungen zeigen jedoch, dass der Trend tatsächlich eine nach unten öffnende Parabel mit einem Maximum bei einem pH-Wert von 5 ist, dem Säuregehalt von Wasserstoffperoxid allein. Da wir nur eine Umgebung mit einem niedrigeren pH-Wert stimulieren konnten, konnten wir nur eine Neigungsrichtung erhalten, die lineare Ergebnisse zeigte. Dies zeigt, dass Enzyme nur bei einem bestimmten pH-Wert funktionieren. Wenn es zu hoch oder zu niedrig ist, verringert es die Effizienz und verlangsamt die Reaktionsgeschwindigkeit.

        Durch unsere Experimente wurde die Reaktion zwischen dem Enzym Katalase und Wasserstoffperoxid getestet. Die Wiederholung der Reaktion mit verschiedenen Materialien erlaubte die Rückschlüsse auf die Konzentration der Katalase. Unter Verwendung von Leber als Kontrolle änderten wir den pH-Wert der Lösung in jedem Versuch, um die Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmendem Säuregehalt zu testen. Wir kamen zu dem Schluss, dass die Reaktionsgeschwindigkeit mit steigendem pH-Wert einer Lösung umgekehrt bis zu einem pH-Wert von etwa 5 zunahm. Der Fehler in unserem Experiment änderte nur den spezifischen pH-Wert, aber das Gesamtergebnis des letzten Tests bleibt wahr.


        Kostimulation der Bodenglycosidaseaktivität und Bodenatmung durch Stickstoffzugabe

        Synthesis Research Center of Chinese Ecosystem Research Network, Key Laboratory of Ecosystem Network Observation and Modeling, Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Peking, 100101 China

        Abteilung für Mikrobiologie und Pflanzenbiologie, University of Oklahoma, Norman, OK, 73019 USA

        Department of Agriculture and Environmental Sciences, Tennessee State University, Nashville, TN, 37209 USA

        Tiantong National Field Observation Station for Forest Ecosystem, School of Ecological and Environmental Sciences, East China Normal University, Shanghai, 200062 China

        Zentrum für Ökologie und Umweltwissenschaften, Northwestern Polytechnical University, Xi'an, 710072 China

        State Key Laboratory of Löss and Quartary Geology (SKLLQG), Key Laboratory of Aerosol Chemistry and Physics, Institute of Earth Environment, Chinese Academy of Sciences, Xi'an, 710061 China

        Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Peking, 100049 China

        Abteilung für Mikrobiologie und Pflanzenbiologie, University of Oklahoma, Norman, OK, 73019 USA

        Abteilung für Mikrobiologie und Pflanzenbiologie, University of Oklahoma, Norman, OK, 73019 USA

        Zentrum für Erdsystemwissenschaften, Tsinghua-Universität, Peking, 100084 China

        Department of Agriculture and Environmental Sciences, Tennessee State University, Nashville, TN, 37209 USA

        Korrespondenz: Junji Cao, tel. +86 29 62336233, Fax +86 29 62336234, E-Mail: [email protected]

        Jianwei Li, tel. +1 615 963 1523, Fax +1 615 963 1523, E-Mail: [email protected]

        Rui-Wu Wang, tel. +86 29 88460816, Fax +86 29 88460816, E-Mail: [email protected]

        Tiantong National Field Observation Station for Forest Ecosystem, School of Ecological and Environmental Sciences, East China Normal University, Shanghai, 200062 China

        Center for Global Change and Ecological Forecasting, East China Normal University, Shanghai, 200062 China

        State Key Laboratory of Löss and Quartary Geology (SKLLQG), Key Laboratory of Aerosol Chemistry and Physics, Institute of Earth Environment, Chinese Academy of Sciences, Xi'an, 710061 China

        Institut für Globalen Umweltwandel, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, 710049 China

        Korrespondenz: Junji Cao, tel. +86 29 62336233, Fax +86 29 62336234, E-Mail: [email protected]

        Jianwei Li, tel. +1 615 963 1523, Fax +1 615 963 1523, E-Mail: [email protected]

        Rui-Wu Wang, tel. +86 29 88460816, Fax +86 29 88460816, E-Mail: [email protected]

        Zentrum für Ökologie und Umweltwissenschaften, Northwestern Polytechnical University, Xi'an, 710072 China

        Korrespondenz: Junji Cao, tel. +86 29 62336233, Fax +86 29 62336234, E-Mail: [email protected]

        Jianwei Li, tel. +1 615 963 1523, Fax +1 615 963 1523, E-Mail: [email protected]

        Rui-Wu Wang, tel. +86 29 88460816, Fax +86 29 88460816, E-Mail: [email protected]

        State Key Laboratory of Löss and Quartary Geology (SKLLQG), Key Laboratory of Aerosol Chemistry and Physics, Institute of Earth Environment, Chinese Academy of Sciences, Xi'an, 710061 China

        Abteilung für Mikrobiologie und Pflanzenbiologie, University of Oklahoma, Norman, OK, 73019 USA

        State Key Laboratory of Löss and Quartary Geology (SKLLQG), Key Laboratory of Aerosol Chemistry and Physics, Institute of Earth Environment, Chinese Academy of Sciences, Xi'an, 710061 China

        Department of Biological Sciences, University of Arkansas, Fayetteville, AR, 72701 USA

        State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, 100085 China

        Synthesis Research Center of Chinese Ecosystem Research Network, Key Laboratory of Ecosystem Network Observation and Modeling, Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Peking, 100101 China

        Abteilung für Mikrobiologie und Pflanzenbiologie, University of Oklahoma, Norman, OK, 73019 USA

        Department of Agriculture and Environmental Sciences, Tennessee State University, Nashville, TN, 37209 USA

        Tiantong National Field Observation Station for Forest Ecosystem, School of Ecological and Environmental Sciences, East China Normal University, Shanghai, 200062 China

        Abstrakt

        Im letzten Jahrhundert wurden in Ökosystemen beispiellose Mengen an Stickstoff (N) abgelagert, von denen erwartet wird, dass sie kaskadierende Auswirkungen auf die mikrobiell vermittelte Bodenatmung (SR) haben. Extrazelluläre Enzyme spielen eine entscheidende Rolle beim Abbau organischer Bodensubstanz, und Messungen ihrer Aktivitäten sind potenziell nützliche Indikatoren für SR. Die Zusammenhänge zwischen extrazellulären enzymatischen Aktivitäten (EEAs) im Boden und SR unter N-Zugabe wurden jedoch nicht nachgewiesen. Wir führten daher eine Metaanalyse von 62 Publikationen durch, um die Reaktionen von Boden-EEA und SR auf erhöhten N zu synthetisieren. Die Zugabe von Stickstoff erhöhte die Glycosidase-Aktivität (GA) signifikant um 13,0 %, α-1,4-Glucosidase (AG) um 19,6%, β-1,4-Glucosidase (BG) um 11,1 %, β-1,4-Xylosidase (BX) um 21,9% und β-D-Cellobiosidase (CBH) um 12,6 %. Erhöhungen der GA waren deutlicher bei langer Dauer, hoher Rate, organischer und gemischter N-Zugabe (Kombination von organischer und anorganischer N-Zugabe) sowie bei Studien aus Ackerland. Die Ansprechraten (RRs) von GA waren positiv mit den SR-RRs korreliert, auch wenn sie einzeln für AG, BG, BX und CBH bewertet wurden. Diese positive Korrelation zwischen GA-RR und SR-RR wurde für die meisten Vegetations- und Bodenarten sowie für verschiedene Methoden der N-Zugabe beibehalten. Unsere Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass GA mit SR unter N-Zugabe über eine Reihe von Ökosystemen verbunden ist und unterstreichen die Notwendigkeit weiterer Studien zur Reaktion anderer Boden-EEA auf verschiedene Faktoren des globalen Wandels und deren Auswirkungen auf Ökosystemfunktionen.

        Anhang S1 Ergänzende Hinweise.

        Tabelle S1 Ergebnisse für Publikationsbias.

        Tabelle S2 Beschreibung der 12 Arten von Enzymen, die in unserer vorläufigen Analyse enthalten sind.

        Tabelle S3 Verteilung der Stickstoffzugabemethoden für die verschiedenen Vegetations- und Bodenarten.

        Abbildung S1 Globale Verteilung der in dieser Metaanalyse ausgewählten Stickstoffadditionsexperimente. Die Karte wurde mit ArcGIS erstellt.

        Abbildung S2 Häufigkeitsverteilungen der Antwortquoten (RR) von (a) α-1,4-Glucosidase (AG), (b) β-1,4-Glucosidase (BG), (c) β-D-Cellobiosidase (CBH) und (d) β-1,4-Xylosidase (BX).

        Abbildung S3 Beziehungen zwischen dem Response Ratio (RR) der Bodenatmung (SR) und den RRs von (a) α-1,4-Glucosidase (AG), (b) β-1,4-Glucosidase (BG), (c) β-D-Cellobiosidase (CBH), (d) β-1,4-Xylosidase (BX), (e) Phenoloxidase (PO), (f) Polyphenoloxidase (PHO), (g) Invertase, (h) Urease, (i) Peroxidase (PER), (j) β-1,4-N-Acetylglucosaminidase (NAG), (k) saure (alkalische) Phosphatase (AP) und (l) Leucin-Aminopeptidase (LAP).

        Abbildung S4 Beziehungen zwischen dem Ansprechverhältnis (RR) der Bodenglycosidaseaktivität und (a) N-Zugaberate, (b) N-Zugabedauer, (c) N-Zugabehäufigkeit und (d) Probengröße.

        Abbildung S5 Beziehungen zwischen der Response Ratio (RR) der Glykosidaseaktivität und der RR der Bodenatmung (SR) für die verschiedenen Methoden der SR-Messung.

        Abbildung S6 Die Auswirkungen der N-Zugabe auf die Bodenatmung aus früheren Metaanalysen. Fehlerbalken stellen Bootstrap-95 %-Konfidenzintervalle (KIs) dar. Der Effekt der N-Zugabe wurde als signifikant angesehen, wenn der KI der Effektstärke nicht Null überlappte. Die Stichprobengröße für jede Variable wird neben dem CI angezeigt. Diese Zahl wurde aus früheren Metaanalysen von (a, b und c) Zhou . neu gezeichnet et al. 2014 , (d) Liu et al. 2010 , (e) Lu et al. 2011 und (f) Janssens et al. 2010. Ra, autotrophe Atmung Rh, heterotrophe Atmung SR, Bodenatmung.

        Abbildung S7 Beziehungen zwischen den möglichen Veränderungen in mikrobiellen Gemeinschaften und der Physiologie und den Reaktionsverhältnissen (RR) der Glycosidaseaktivität von (a) mikrobiellem Überfluss, (b) Bakterienüberschuss, (c) Pilzüberschuss, (d) Pilzen/Bakterien, (e) Mikroben Biomasse-Kohlenstoff (MBC), (f) mikrobieller Biomasse-Stickstoff (MBN) und (g) MBC/MBN. Die Beziehungen zwischen den durch die N-Zugabe induzierten Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaften und der Physiologie und ihre Zusammenhänge mit den entsprechenden Veränderungen der Bodenatmung wurden von Treseder . synthetisiert et al. ( 2008 ).

        Abbildung S8 (a) Die Auswirkungen der N-Addition auf die Aktivitäten von oxidativen C-erhaltenden Enzymen im Boden. Häufigkeitsverteilungen der Reaktionsverhältnisse (RR) von (b) oxidativen Enzymen, (c) Phenoloxidase (PO), (d) Peroxidase (PER) und (e) Polyphenoloxidase (PHO). Fehlerbalken stellen Bootstrap-95 %-Konfidenzintervalle (KIs) dar. Der Effekt der N-Zugabe wurde als signifikant angesehen, wenn der KI der Effektstärke nicht Null überlappte. Die Stichprobengröße für jede Variable wird neben dem CI angezeigt. QB und Qw sind im Abschnitt Materialien und Methoden definiert.

        Abbildung S9 Relationships between the response ratio (RR) of glycosidase activity and the (a) RR of soil total nitrogen (STN), (b) RR of dissolved organic nitrogen (DON), (c) RR of the substrate C:N ratio and (d) substrate C:N ratio.

        Figure S10 Relationships between the response ratio (RR) of glycosidase activity and (a) the substrate pH and (b) the RR of the substrate pH.

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        Zusammenfassung

        Initially, an increase in substrate concentration leads to an increase in the rate of an enzyme-catalyzed reaction. As the enzyme molecules become saturated with substrate, this increase in reaction rate levels off. The rate of an enzyme-catalyzed reaction increases with an increase in the concentration of an enzyme. At low temperatures, an increase in temperature increases the rate of an enzyme-catalyzed reaction. At higher temperatures, the protein is denatured, and the rate of the reaction dramatically decreases. An enzyme has an optimum pH range in which it exhibits maximum activity.


        Immobilization of Enzymes and Cells: Methods, Effects and Applications

        Traditionally, enzymes in free solutions (i.e. in soluble or free form) react with substrates to result in products. Such use of enzymes is wasteful, particularly for industrial purposes, since enzymes are not stable, and they cannot be recovered for reuse.

        Immobilization of enzymes (or cells) refers to the technique of confining/anchoring the enzymes (or cells) in or on an inert support for their stability and functional reuse. By employing this technique, enzymes are made more efficient and cost-effective for their industrial use. Some workers regard immobilization as a goose with a golden egg in enzyme technology. Immobilized enzymes retain their structural conformation necessary for catalysis.

        There are several advantages of immobilized enzymes:

        A. Stable and more efficient in function.

        B. Can be reused again and again.

        C. Products are enzyme-free.

        D. Ideal for multi-enzyme reaction systems.

        e. Control of enzyme function is easy.

        F. Suitable for industrial and medical use.

        g. Minimize effluent disposal problems.

        There are however, certain disadvantages also associated with immobilization.

        A. The possibility of loss of biological activity of an enzyme during immobilization or while it is in use.

        B. Immobilization is an expensive affair often requiring sophisticated equipment.

        Immobilized enzymes are generally preferred over immobilized cells due to specificity to yield the products in pure form. However, there are several advantages of using immobilized multi-enzyme systems such as organelles and whole cells over immobilized enzymes. The immobilized cells possess the natural environment with cofactor availability (and also its regeneration capability) and are particularly suitable for multiple enzymatic reactions.

        Methods of Immobilization:

        The commonly employed techniques for immobilization of enzymes are—adsorption, entrapment, covalent binding and cross-linking.

        Adsorption:

        Adsorption involves the physical binding of enzymes (or cells) on the surface of an inert support. The support materials may be inorganic (e.g. alumina, silica gel, calcium phosphate gel, glass) or organic (starch, carboxymethyl cellulose, DEAE-cellulose, DEAE-sephadex).

        Adsorption of enzyme molecules (on the inert support) involves weak forces such as van der Waals forces and hydrogen bonds (Fig. 21.3). Therefore, the adsorbed enzymes can be easily removed by minor changes in pH, ionic strength or temperature. This is a disadvantage for industrial use of enzymes.

        Entrapment:

        Enzymes can be immobilized by physical entrapment inside a polymer or a gel matrix. The size of the matrix pores is such that the enzyme is retained while the substrate and product molecules pass through. In this technique, commonly referred to as lattice entrapment, the enzyme (or cell) is not subjected to strong binding forces and structural distortions.

        Some deactivation may however, occur during immobilization process due to changes in pH or temperature or addition of solvents. The matrices used for entrapping of enzymes include polyacrylamide gel, collagen, gelatin, starch, cellulose, silicone and rubber. Enzymes can be entrapped by several ways.

        1. Enzyme inclusion in gels:

        This is an entrapment of enzymes inside the gels (Fig. 21.4A).

        2. Enzyme inclusion in fibres:

        The enzymes are trapped in a fibre format of the matrix (Fig. 21.4B).

        3. Enzyme inclusion in microcapsules:

        In this case, the enzymes are trapped inside a microcapsule matrix (Fig. 21.4C). The hydrophobic and hydrophilic forms of the matrix polymerise to form a microcapsule containing enzyme molecules inside. The major limitation for entrapment of enzymes is their leakage from the matrix. Most workers prefer to use the technique of entrapment for immobilization of whole cells. Entrapped cells are in use for industrial production of amino acids (L-isoleucine, L-aspartic acid), L-malic acid and hydroquinone.

        Microencapsulation:

        Microencapsulation is a type of entrapment. It refers to the process of spherical particle formation wherein a liquid or suspension is enclosed in a semipermeable membrane. The membrane may be polymeric, lipoidal, lipoprotein-based or non-ionic in nature. There are three distinct ways of microencapsulation.

        1. Building of special membrane reactors.

        3. Stabilization of emulsions to form microcapsules.

        Microencapsulation is recently being used for immobilization of enzymes and mammalian cells. For instance, pancreatic cells grown in cultures can be immobilized by microencapsulation. Hybridoma cells have also been immobilized successfully by this technique.

        Covalent Binding:

        Immobilization of the enzymes can be achieved by creation of covalent bonds between the chemical groups of enzymes and the chemical groups of the support (Fig. 21.5). This technique is widely used. However, covalent binding is often associated with loss of some enzyme activity. The inert support usually requires pretreatment (to form pre-activated support) before it binds to enzyme. The following are the common methods of covalent binding.

        1. Cyanogen bromide activation:

        The inert support materials (cellulose, sepharose, sephadex) containing glycol groups are activated by CNBr, which then bind to enzymes and immobilize them (Fig. 21.6A).

        Some of the support materials (amino benzyl cellulose, amino derivatives of polystyrene, aminosilanized porous glass) are subjected to diazotation on treatment with NaNO2 and HCI. They, in turn, bind covalently to tyrosyl or histidyl groups of enzymes (Fig. 21.6B).

        3. Peptide bond formation:

        Enzyme immobi­lization can also be achieved by the formation of peptide bonds between the amino (or carboxyl) groups of the support and the carboxyl (or amino) groups of enzymes (Fig. 21.6C). The support material is first chemically treated to form active functional groups.

        4. Activation by bi- or poly-functional reagents:

        Some of the reagents such as glutaraldehyde can be used to create bonds between amino groups of enzymes and amino groups of support (e.g. aminoethylcellulose, albumin, amino alkylated porous glass). This is depicted in Fig. 21.6D.

        Cross-Linking:

        The absence of a solid support is a characteristic feature of immobilization of enzymes by cross- linking. The enzyme molecules are immobilized by creating cross-links between them, through the involvement of poly-functional reagents. These reagents in fact react with the enzyme molecules and create bridges which form the backbone to hold enzyme molecules (Fig. 21.7). There are several reagents in use for cross-linking. These include glutaraldehyde, diazobenzidine, hexamethylene diisocyanate and toluene di- isothiocyanate.

        Glutaraldehyde is the most extensively used cross-linking reagent. It reacts with lysyl residues of the enzymes and forms a Schiff’s base. The cross links formed between the enzyme and glutaraldehyde are irreversible and can withstand extreme pH and temperature. Glutaraldehyde cross- linking has been successfully used to immobilize several industrial enzymes e.g. glucose isomerase, penicillin amidase. The technique of cross-linking is quite simple and cost-effective. But the disadvantage is that it involves the risk of denaturation of the enzyme by the poly-functional reagent.

        Choice of Immobilization Technique:

        The selection of a particular method for immobilization of enzymes is based on a trial and error approach to choose the ideal one. Among the factors that decide a technique, the enzyme catalytic activity, stability, regenerability and cost factor are important.

        Immobilization of L-amino acid acylase:

        L-Amino acid acylase was the first enzyme to be immobilized by a group of Japanese workers (Chibata and Tosa, 1969). More than 40 different immobilization methods were attempted by this group. Only three of them were found be useful. They were covalent binding to iodoacetyl cellulose, ionic binding to DEAE-Sephadex and entrapment within polyacrylamide.

        Stabilization of Soluble Enzymes:

        Some of the enzymes cannot be immobilized and they have to be used in soluble form e.g. enzymes used in liquid detergents, some diagnostic reagents and food additives. Such enzymes can be stabilized by using certain additives or by chemical modifications. The stabilized enzymes have longer half-lives, although they cannot be recycled. Some important methods of enzyme stabilization are briefly described.

        Solvent Stabilization:

        Certain solvents at low concentrations stabilize the enzymes, while at high concentrations the enzymes get denatured e.g. acetone (5%) and ethanol (5%) can stabilize benzyl alcohol dehydro­genase.

        Substrate Stabilization:

        The active site of an enzyme can be stabilized by adding substrates e.g. starch stabilizes a-amylase glucose stabilizes glucose isomerase.

        Stabilization by Polymers:

        Enzymes can be stabilized, particularly against increased temperature, by addition of polymers such as gelatin, albumin and polyethylene glycol.

        Stabilization by Salts:

        Stability of metalloenzymes can be achieved by adding salts such as Ca, Fe, Mn, Cu and Zn e.g. proteases can be stabilized by adding calcium.

        Stabilization by Chemical Modifications:

        Enzymes can be stabilized by suitable chemical modifications without loss of biological activity. There are several types of chemical modifications.

        A. Addition of poly-amino side chains e.g. polytyrosine, polyglycine.

        B. Acylation of enzymes by adding groups such as acetyl, propionyl and succinyl.

        Stabilization by Rebuilding:

        Theoretically, the stability of the enzymes is due to hydrophobic interactions in the core of the enzyme. It is therefore, proposed that enzymes can be stabilized by enhancing hydrophobic interactions. For this purpose, the enzyme is first unfold and then rebuilt in one of the following ways (Fig. 21.8).

        1. The enzyme can be chemically treated (e.g. urea and a disulfide) and then refolded.

        2. The refolding can be done in the presence of low molecular weight ligands.

        3. For certain enzymes, refolding at higher temperatures (around 50°C) stabilize them.

        Stabilization by Site-Directed Mutagenesis:

        Site-directed mutagenesis has been successfully used to produce more stable and functionally more efficient enzymes e.g. subtilisin E.

        Immobilization of Cells:

        Immobilized individual enzymes can be successfully used for single-step reactions. They are, however, not suitable for multi-enzyme reactions and for the reactions requiring cofactors. The whole cells or cellular organelles can be immobilized to serve as multi-enzyme systems. In addition, immobilized cells rather than enzymes are sometimes preferred even for single reactions, due to cost factor in isolating enzymes. For the enzymes which depend on the special arrangement of the membrane, cell immobilization is preferred.

        Immobilized cells have been traditionally used for the treatment of sewage. The techniques employed for immobilization of cells are almost the same as that used for immobilization of enzymes with appropriate modifications. Entrapment and surface attachment techniques are commonly used. Gels, and to some extent membranes, are also employed.

        Immobilized Viable Cells:

        The viability of the cells can be preserved by mild immobilization. Such immobilized cells are particularly useful for fermentations. Sometimes mammalian cell cultures are made to function as immobilized viable cells.

        Immobilized Non-viable Cells:

        In many instances, immobilized non-viable cells are preferred over the enzymes or even the viable cells. This is mainly because of the costly isolation and purification processes. The best example is the immobilization of cells containing glucose isomerase for the industrial production of high fructose syrup. Other important examples of microbial biocatalysts and their applications are given in Table 21.5.

        Limitations of Immobilizing Eukaryotic Cells:

        Prokaryotic cells (particularly bacterial) are mainly used for immobilization. It is also possible to immobilize eukaryotic plant and animal cells. Due to the presence of cellular organelles, the metabolism of eukaryotic cells is slow. Thus, for the industrial production of biochemical, prokaryotic cells are preferred. However, for the production of complex proteins (e.g. immunoglobulin’s) and for the proteins that undergo post- translational modifications, eukaryotic cells may be used.

        Effect of Immobilization on Enzyme Properties:

        Enzyme immobilization is frequently associated with alterations in enzyme properties, particularly the kinetic properties of enzymes.

        Some of them are listed below:

        1. There is a substantial decrease in the enzyme specificity. This may be due to conformational changes that occur when the enzyme gets immobilized.

        2. The kinetic constants Km und Vmax of an immobilized enzyme differ from that of the native enzyme. This is because the conformational change of the enzyme will affect the affinity between enzyme and substrate.

        Immobilized Enzyme Reactors:

        The immobilized enzymes cells are utilized in the industrial processes in the form of enzyme reactors. They are broadly of two types — batch reactors and continuous reactors. The frequently used enzyme reactors are shown in Fig. 21.9.

        Batch Reactors:

        In batch reactors, the immobilized enzymes and substrates are placed, and the reaction is allowed to take place under constant stirring. As the reaction is completed, the product is separated from the enzyme (usually by denaturation).

        Soluble enzymes are commonly used in batch reactors. It is rather difficult to separate the soluble enzymes from the products hence there is a limitation of their reuse. However, special techniques have been developed for recovery of soluble enzymes, although this may result in loss of enzyme activity.

        Stirred tank reactors:

        The simplest form of batch reactor is the stirred tank reactor (Fig. 21.9A). It is composed of a reactor fitted with a stirrer that allows good mixing, and appropriate temperature and pH control. However, there may occur loss of some enzyme activity. A modification of stirred tank reactor is basket reactor. In this system, the enzyme is retained over the impeller blades. Both stirred tank reactor and basket reactor have a well-mixed flow pattern.

        Plug flow type reactors:

        These reactors are alternatives to flow pattern type of reactors. The flow rate of fluids controlled by a plug system. The plug flow type reactors may be in the form of packed bed or fluidized bed (Fig. 21.9B and 21.9C). These reactors are particularly useful when there occurs inadequate product formation in flow type reactors. Further, plug flow reactors are also useful for obtaining kinetic data on the reaction systems.

        Continuous Reactors:

        In continuous enzyme reactors, the substrate is added continuously while the product is removed simultaneously. Immobilized enzymes can also be used for continuous operation. Continuous reactors have certain advantages over batch reactors. These include control over the product formation, convenient operation of the system and easy automation of the entire process. There are mainly two types of continuous reactors-continuous stirred tank reactor (CSTR) and plug reactor (PR). A diagrammatic representation of CSTR is depicted in Fig. 21.9D. CSTR is ideal for good product formation.

        Membrane Reactors:

        Several membranes with a variety of chemical compositions can be used. The commonly used membrane materials include polysulfone, polyamide and cellulose acetate. The biocatalysts (enzymes or cells) are normally retained on the membranes of the reactor. The substrate is introduced into reactor while the product passes out. Good mixing in the reactor can be achieved by using stirrer (Fig. 21.10A). In a continuous membrane reactor, the biocatalysts are held over membrane layers on to which substrate molecules are passed (Fig. 21.10B).

        In a recycle model membrane reactor, the contents (i.e. the solution containing enzymes, cofactors, and substrates along with freshly released product are recycled by using a pump (Fig. 21.10C). The product passes out which can be recovered.

        Applications of Immobilized Enzymes and Cells:

        Immobilized enzymes and cells are very widely used for industrial, analytical and therapeutic purpose, besides their involvement in food production and exploring the knowledge of biochemistry, microbiology and other allied specialties. A brief account of the industrial applications of immobilized cells is given in Table 21.5.

        Manufacture of Commercial Products:

        A selected list of important immobilized enzymes and their industrial applications is given in Table 21.6. Some details on the manufacture of L-amino acids and high fructose syrup are given hereunder.

        Production of L-Amino Acids:

        L-Amino acids (and not D-amino acids) are very important for use in food and feed supplements and medical purposes. The chemical methods employed for their production result in a racemic mixture of D- and L-amino acids. They can be acylated to form D, L-acyl amino acids. The immobilized enzyme aminoacylase (frequently immobilized on DEAE sephadex) can selectively hydrolyse D, L-acyl amino acids to produce L-amino acids.

        The free L-amino acids can separated from the un-hydrolysed D-acyl amino acids. The latter can be recemized to D, L-acyl amino acids and recycled through the enzyme reactor containing immobilized aminoacylase. Huge quantities of L-methionine, L-phenylalanine L-tryptophan and L-valine are produced worldwide by this approach.

        Production of High Fructose Syrup:

        Fructose is the sweetest among the monosaccharide’s, and has twice the sweetening strength of sucrose. Glucose is about 75% as sweet as sucrose. Therefore, glucose (the most abundant monosaccharide) cannot be a good substitute for sucrose for sweetening. Thus, there is a great demand for fructose which is very sweet, but has the same calorific value as that of glucose or sucrose.

        High fructose syrup (HFS) contains approximately equivalent amounts of glucose and fructose. HFS is almost similar to sucrose from nutritional point of view. HFS is a good substitute for sugar in the preparation of soft drinks, processed foods and baking.

        High fructose syrup can be produced from glucose by employing an immobilized enzyme glucose isomerase. The starch containing raw materials (wheat, potato, corn) are subjected to hydrolysis to produce glucose. Glucose isomerase then isomerizes glucose to fructose (Fig. 21.11). The product formed is HFS containing about 50% fructose. (Note: Some authors use the term high fructose corn syrup i.e. HFCS in place of HFS).

        This is an intracellular enzyme produced by a number of microorganisms. The species of Arthrobacter, Bacillus and Streptomyces are the preferred sources. Being an intracellular enzyme, the isolation of glucose isomerase without loss of biological activity requires special and costly techniques. Many a times, whole cells or partly broken cells are immobilized and used.

        Immobilized Enzymes and Cells- Analytical Applications:

        In Biochemical Analysis:

        Immobilized enzymes (or cells) can be used for the development of precise and specific analytical techniques for the estimation of several biochemical compounds. The principle of analytical assay primarily involves the action of the immobilized enzyme on the substrate.

        A decrease in the substrate concentration or an increase in the product level or an alteration in the cofactor concentration can be used for the assay. A selected list of examples of immobilized enzymes used in the assay of some substances is given in Table 21.7. Two types of detector systems are commonly employed.

        Thermistors are heat measuring devices which can record the heat generated in an enzyme catalysed reaction. Electrode devices are used for measuring potential differences in the reaction system. In the Fig. 21.12, an enzyme thermistor and an enzyme electrode, along with a specific urease electrode are depicted.


        Enzyme Reactions: Discussion and Results

        Tabelle 1. Solution concentrations, volumes and observations for Experiment 1: Observing the enzyme reaction.

        Test TubedH2Potato ExtractCatecholBeobachtungen
        15 ml + 500μl—–500μLSolution turned milky-white to clear. (High substrate)
        25 ml500μl500μlSolution turned yellowish-brown. (High substrate)
        35 ml + 500μl500μl—–Solution is clear, but cloudy-white at the bottom. (Zero substrate)

        *The chemical reaction was observed with the introduction of catechol to the potato extract (tube 2).

        Tabelle 2. Solution concentrations, volumes and observations for Experiment 2: The effect of substrate concentration on enzyme activity.

        Test TubedH2Potato ExtractCatecholBeobachtungen
        15 ml + 500μl500μl500μLSolution turned light, yellowish-brown. (High substrate)
        25 ml + 900μl500μl100μlSolution turned translucent peach. (Low substrate, diluted)

        *The reaction time for tube 1 was the fastest due to the high substrate concentration and lower dH20 concentration.

        Tisch 3. Solution concentrations, volumes and observations for Experiment 3: The effect of enzyme concentration on enzyme activity.

        Test TubedH2Potato ExtractCatecholBeobachtungen
        15 ml + 500μl500μl500μLThe solution turned from bluish-green to light, yellowish-brown. (High substrate)
        25 ml + 900μl100μl500μlSlightly cloudier than the original clear solution no real change in color. (High substrate, diluted, low enzyme)

        *Lower Dh20 and higher potato extract concentrations allowed for a faster reaction time

        Table 4. Solution concentrations, Buffer pH, volumes, and observations for Experiment 4: The effect of pH on enzyme activity.

        Buffer pHBuffer VolumedH2Potato ExtractCatecholBeobachtungen
        42ml3ml500μl500μlCloudy white
        62ml3ml500μl500μlDunkelgelb
        82ml3ml500μl500μLOrangish-brown
        102ml3ml100μl500μlTranslucent peach

        *The reaction rate increased as the pH increased, with a pH of 6 being the best buffer for catechol oxidase activity. Increasing the pH past 6 showed a decrease in the reaction rate.

        Table 5. Solution concentrations, temperatures, volumes and observations for Experiment 5: The effect of temperature on enzyme activity.

        Test TubedH2Potato ExtractCatecholBeobachtungen
        1 (0°C)5ml500μl500μlReally light yellowish-brown
        2 (15°C)5ml500μl500μlYellowish-peach
        3 (37°C)5ml500μl500μLOrange-peach
        4 (100°C)5ml500μl500μlReally light peach

        *The fastest reaction rate was observed at 37°C. The colder the temperature (0°C – 15°C), the slower the reaction rate. Enzyme denaturation was observed at 100°C.

        Table 6. Solution concentrations, volumes and observations for Experiment 6: Inhibitor Effects – Inhibiting the Action of Catechol Oxidase

        Test TubedH2Potato ExtractPTUCatecholBeobachtungen
        15ml + 1ml500μl—–500μlYellowish-peach (Control)
        25ml + 500μL500μl500μl500μlReally light peach
        35ml500μl500μl500μLCloudy, clear-white

        *The fastest, and most pronounced reaction was observed in tube 1 (the solution without phenylthiourea)

        Enzyme Lab Discussion

        For the first experiment, Observing the Enzyme Reaction, it was hypothesized that the enzyme reaction would only occur in the second test tube due to the fact that it was the only tube to contain both the enzyme and substrate. As expected, the solution in tube 2 was the only solution to show the characteristic yellow-brown pigment of benzoquinone production, which was caused by the potato extract converting its catechol into the new product.

        In experiment 2, The Effect of Substrate Concentration on Enzyme activity, the hypothesis was that the tube with the higher substrate concentration would show a faster and more pronounced chemical reaction than the tube with less catechol.

        The hypothesis was supported by the fact that the higher catechol concentration in tube 1 allowed for a similar result to tube 2 from experiment 1, the only difference being that the extra 5mL of dH20 diluted some of the yellowish-brown color observed in the first reaction.

        While there was a chemical reaction observed in tube 2 (experiment 2), it was much slower (with a translucent peach pigment) due to lower a catechol concentration and a higher dH20 concentration. The higher the concentration of catechol, the more benzoquinone that can be produced.

        It was hypothesized in experiment 3, The Effect of Enzyme Concentration on Enzyme Activity, that the higher the concentration of enzyme in the solution, the faster and more pronounced the chemical reaction would be.

        This hypothesis was able to be accepted based on the rate at which the tube with the higher potato extract concentration reacted. Tube 1 had 400μL more potato extract and 400μL less dH20 than tube 2. Because enzymes are biological catalysts that speed up chemical reaction time, the solution in tube 1 quickly changed from a bluish-green pigment, to the yellowish-brown color associated with benzoquinone.

        The lower concentration of potato extract and a higher concentration of dH20 in tube 2 showed no change in color, other than the cloudiness of the potato extract itself.

        In experiment 4, The Effect of pH on Enzyme Activity, the initial hypothesis was that the lower the pH level of the buffer added to the solution, the quicker the reaction rate would be. This hypothesis was not supported by the data observed because higher acidity levels actually slowed the production of benzoquinone – which was the opposite of what was predicted.

        The solution with a pH buffer of 4 remained cloudy white, while the solution with a 6 pH buffer turned yellowish-brown. As the pH increased, the benzoquinone production rate increased. While lower pH buffers proved to be too acidic, more neutral buffers allowed for the best environment for catechol oxidase activity.

        Buffer pH levels higher than 6 showed a slower and less pronounced chemical reaction as well – illustrating the enzyme reaction’s need for neutrality.

        The hypothesis for experiment 5, The Effect on Temperature on Enzyme Activity, was that extremely low temperature would slow the rate of benzoquinone production, while extremely high temperatures would cause the enzymes to denature. This hypothesis was supported by the rate at which the solutions at 0°C – 15°C slowly reacted, and the rate at which the solution at 37°C quickly produced benzoquinone.

        After five minutes at each solution’s designated temperature, the colder solutions barely started to change color, while the warmer temperatures quickly reacted – so much so that at 100°C, the enzymes denatured and the solution began to pale in pigment. Colder temperatures slowed the movement of molecules in the solutions, while warmer temperatures (not including 100°C) allowed for a better environment for catechol oxidase activity.

        For experiment 6, Inhibitor Effects – Inhibiting the Action of Catechol Oxidase, it was hypothesized that the addition of phenylthiourea (PTU) would keep the enzyme reaction from occurring. The hypothesis was able to be accepted due to the fact that the tubes which contained the PTU showed very little change in pigment.

        Tube 1 served as the control, which showed the production of benzoquinone (yellowish-brown color) and allowed for comparison between the three solutions. Considering PTU is a non-competitive inhibitor, tubes 2 and 3 contained solutions that prevented the enzyme from catalyzing the reaction, regardless of whether or not the substrate was bound to the active site.

        The only real issue with any of the 6 experiments was the unsupported hypothesis for the Effect of pH on the Enzyme Activity experiment. I must have tied the preservative nature of benzoquinone with how acidic lemon juice keeps apples from turning brown, so I assumed a low pH would increase the reaction rate. In reality, acidity slows the reaction rate – which is warum the apples don’t change color.

        In conclusion, these experiments have shown that benzoquinone production can only occur with the presence of both an enzyme and substrate. Factors such as substrate and enzyme concentration, pH, temperature, and the presence of noncompetitive inhibitors can affect enzyme reaction. High substrate concentration will allow for greater benzoquinone production, while high enzyme concentration will speed up the reaction rate – and vise versa.

        In order for enzyme reaction to rapidly occur, it must be done in an environment where the pH is as close to neutral as possible, with the reaction rate slowing in both highly acidic or basic solutions. The same goes for temperature – extremely high or extremely cold temperatures can decrease enzyme reaction rates, or cause the enzymes to denature altogether.

        The introduction of a noncompetitive inhibitor (such as phenylthiourea) allows it to bind to the allosteric site on the enzyme, which keeps the reaction from occurring (regardless of the enzyme or substrate concentration).



Bemerkungen:

  1. Maulkree

    Du liegst falsch. Schreiben Sie mir in PM, wir werden diskutieren.

  2. Seamere

    Logisch, ich stimme zu

  3. Mogue

    Natürlich hast du recht. Das hat etwas daran, und ich denke, das ist eine großartige Idee.

  4. Yvet

    Dies ist ein merkwürdiges Thema

  5. Voisttitoevetz

    Danke für die interessante Retrospektive!

  6. Arnott

    Was für eine faszinierende Botschaft

  7. Bern

    Ich finde es falsch.



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