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Gibt es einen Grund, ein aufrechtes Mikroskop einem inversen Mikroskop vorzuziehen?

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Ich habe noch nie ein inverses Mikroskop besessen, aber es scheint nur Vorteile gegenüber einem aufrechten Mikroskop zu haben: höhere, schwerere Proben; kein Aufprall des Objektivs auf den Objektträger; einfacher zu bedienen usw.

Warum verwenden die Leute dann immer noch normale, aufrecht stehende Mikroskope? Gibt es einen Nachteil, den ich übersehe?


Wie bereits in den Kommentaren erwähnt, sind die Kosten einer der Hauptgründe für einfache Lichtmikroskope. Invertierte Zielfernrohre haben eine komplexere Optik und den Vorteil, größere Proben untersuchen zu können, haben im Allgemeinen einen stabileren Rahmen usw. All dies führt zu höheren Kosten.

Ein Vorteil, den ich mir bei kleineren aufrechten Zielfernrohren vorstellen kann, ist die Möglichkeit, sie als Sezierfernrohr zu verwenden, bei dem die Probe undurchsichtig ist und Sie sie von oben sehen müssen. Ein weiterer Vorteil ist dieser:

Viele Fluoreszenzmikroskope sind aufrecht, da neben dem Okular eine erhebliche Menge an Zusatzausrüstung montiert werden muss, darunter Laser, Tischmotoren, Kameras und andere Detektoren. Dies kann dauern Menge Platz, und der Einfachheit halber ist es oft am einfachsten, es oben zu montieren, wo es zugänglich ist.


Was ist ein inverses Mikroskop?

Mikroskope werden in vielen wissenschaftlichen Prozessen eingesetzt, insbesondere bei der Beobachtung kleiner Objekte, einschließlich Zellen.

Ob in der traditionellen Medizin oder in der Forensik, Mikroskope sind unverzichtbare Instrumente. Mit dem Fortschritt der Wissenschaft werden jedoch neue technologische Fortschritte entwickelt, um eine größere Vergrößerung zu ermöglichen, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Hier kommt ein inverses Mikroskop ins Bild.

Wenn Sie jedoch noch nicht mit dieser Innovation auf dem Gebiet der Wissenschaft vertraut sind, lesen Sie diesen Artikel weiter, um mehr über das inverse Mikroskop zu erfahren.


EINLEITUNG

Ganz allgemein lassen sich Lichtmikroskopie-Techniken in zwei Kategorien einteilen: Hellfeld und Fluoreszenz. Bei der Hellfeldmikroskopie werden Lichtquelle und Detektionsobjektiv auf gegenüberliegenden Seiten der Probe platziert und die Probe wird durch ihre Wirkung auf das durch sie hindurchtretende Licht abgebildet, wenn die Probe das Licht absorbiert, streut oder ablenkt. Da die meisten Zellen dünn und transparent sind, absorbieren sie nicht viel Licht und sind daher schwer zu erkennen, ohne eine Optik hinzuzufügen, die es ermöglicht, die durch die Zellen induzierte Phasenverschiebung des Lichts zu sehen. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken zur Visualisierung dieser Phasenverschiebung sind der Phasenkontrast, der Zellen auf einem hellen Hintergrund dunkel erscheinen lässt, und der differentielle Interferenzkontrast (DIC), der Zellen ein pseudo-dreidimensionales (3D) schattiertes Erscheinungsbild verleiht ( Murphy und Davidson, 2012). Hellfeld ohne Phasenkontrast oder DIC reicht normalerweise aus, um die allgemeinen Umrisse von Zellen zu sehen, aber Phasenkontrast oder DIC ist erforderlich, um detaillierte, kontrastreiche Hellfeldbilder zu erhalten.


Verschiedene Mikroskope

Die einfachste Form eines Mikroskops ist eine Lupe. Sie können es sich nicht wirklich als Mikroskop vorstellen, aber es ist! Es vergrößert ein Bild, aber es invertiert das Bild nicht oder vergrößert es nicht genug, um wirklich winzige Dinge wie Zellstrukturen oder andere Details zu sehen, die für mikroskopische wissenschaftliche Studien notwendig sind.

Was Sie normalerweise als Mikroskop einstufen würden, ist das, was Sie in einem Schulklassenzimmer oder in einer wissenschaftlichen Fernsehsendung sehen, und diese werden als zusammengesetzte Mikroskope bezeichnet. Zusammengesetzte Mikroskope invertieren Bilder! Sie tun dies wegen der zwei Linsen, die sie haben, und wegen ihrer erhöhten Vergrößerung. Das macht sie auch erkennbar.

Offensichtlich spiegeln auch andere Arten von Mikroskopen Bilder um, und es gibt andere mit einer zusätzlichen Linse, die das Bild wieder in seine ursprüngliche Ausrichtung zurückkehrt. Das bedeutet, dass das Bild, das Sie sehen, invertiert und dann wieder invertiert wurde, um die ursprüngliche Position wieder einzunehmen.

Nicht wenige Mikroskope, einschließlich Elektronenmikroskope und Digitalmikroskope, zeigen Ihnen keine invertierten Bilder. Auch Binokular- und Seziermikroskope zeigen aufgrund ihrer erhöhten Vergrößerung kein invertiertes Bild. Wo Sie sich befinden und welche Art von Arbeit Sie ausüben, hat viel damit zu tun, welche Art von Bild Sie betrachten.

Selbst bei einem invertierten Bild können Mikroskope die Vergrößerung eines Bildes phänomenal erhöhen. Sie haben der Welt zum Fortschritt verholfen, indem sie Ärzten, Ingenieuren, Studenten und allen anderen geholfen haben, eine Welt zu sehen, die über die hinausgeht, die wir mit bloßem Auge sehen. Sie haben im medizinischen Bereich mit Geweben und Zellen sowie Krankheiten und Antibiotika Erstaunliches vollbracht.

Es hilft uns nicht nur bei den von uns erstellten Strukturen und den von uns durchgeführten Verfahren voranzukommen, sondern hilft auch in Bereichen wie der Forensik, der Biologie und der Untersuchung von Keimen, Viren und Bakterien. Mikroskopische Bilder helfen uns, die Welt aus einer neuen Perspektive zu sehen, die ohne sie nicht möglich wäre. Wir müssen nur erkennen, wenn das Bild richtig ist!

Brandon ist ein Enthusiast, Hobbyist und Amateur in der Welt der Mikroskopie. Seine Liebe zur Wissenschaft und zu allem, was mikroskopisch ist, bewegt ihn dazu, alles zu teilen, was er über Mikroskopie und Mikrobiologie weiß.

Kürzliche Posts

Zu lernen, die Welt aus einem winzigen Blickwinkel zu sehen, schafft einen immensen Unterschied in unserer Lebensperspektive. Egal, ob Sie ein Lehrer, Schüler oder einfach nur ein Mikroskop-Enthusiast sind, diese fesselnden.

Indem wir die Mikroorganismen verstehen, die jenseits dessen leben, was das menschliche Auge sehen kann, können wir unsere Geschichte als Lebewesen besser verstehen. Zu dieser mikroskopischen Welt der Organismen gehören.


Olympus FV3000: Grundlegende Mikroskopbedienung

Wichtiger Hinweis - das FV3000 ist ein inverses Mikroskop, was bedeutet, dass Menschen eine Vielzahl von Behältern für ihre Proben verwenden. Es besteht auch die Möglichkeit, den Inkubator mit Tischaufsatz zu verwenden, der die Präparate noch höher aufstellt. Dies bedeutet, dass die Fokusebene überall sein kann und wird, und Sie sollten sich darauf einstellen, dass Sie sich etwas Zeit nehmen, um sie für Ihr Präparat zu finden.

I. Steuerung der XYZ-Bewegung

Diese Bedienelemente befinden sich auf der rechten Seite des Lufttischs. Durch Drehen der Fokusknöpfe zu sich hin werden die Objektive (zum Objekt hin) angehoben, von sich weg drehen sie die Objektive ab. Bei Ölobjektiven mit kurzen Arbeitsabständen sollten Sie in erster Linie den Feinfokussierknopf verwenden. Die X-Y-Knöpfe sollten ausschließlich zum Bewegen des Tisches verwendet werden.

Dieses Gerät steuert den Ansichtsmodus (Okulare oder konfokal), die Beleuchtungsform der Okulare (Epi-Fluoreszenz oder DIC-Hellfeld), die Objektive und ermöglicht die Aufnahme von 8 separaten xy-Koordinaten, um den Tisch zu senden zu interessanten Regionen.

Der „Escape“-Knopf senkt den Objektivrevolver ab, der für die Verwendung von Ölobjektiven benötigt wird (wird später ausführlich behandelt).

Die Funktion „Fokussuche“ ist eine nette Abkürzung, die das Deckglas findet. Wenn das Gerät das Deckglas erfolgreich bestraft, hören Sie einen Piepton (gut). Wenn dies nicht möglich ist, hören Sie 3 Pieptöne (schlecht). Wenn dies fehlschlägt, ist die wahrscheinlichste Ursache ein früherer Benutzer, der einen ganz anderen Probenbehälter verwendet und die Fokusebene verschoben hat. Am besten gehen Sie zum 2x-Objektiv, um auf den Rand eines Deckglases oder Brunnens zu fokussieren, und wechseln dann zurück zum 10x-Ziel, um Ihr Ziel zu finden. Anschließend können Sie den Z-Ursprung und das Z-Limit (falls erforderlich) in der Fluoview-Software zurücksetzen. Die Suchfunktion schlägt auch fehl, wenn das ZDC DM „Out“ statt „In“ ist (Register „Mikroskop“ in der Fluoview-Software).

Auf der Registerkarte „EPI“ können Sie den Filterwürfel steuern:

Es stehen 3 Filter zur Verfügung: DAPI, FITC (grün/gelb fluoreszierend) und TRITC (orange/rot fluoreszierend). Es gibt keine Filter zum Betrachten von Farbstoffen, die im Bereich von 600+ nm fluoreszieren, aber Sie können sie mit dem 640-nm-Laser im konfokalen Modus sehen.

Die Bildschirmoption „DIA“ wird am häufigsten verwendet, um die Lichtintensität anzupassen.

Sie haben die Wahl zwischen 3 Objekttischeinsätzen für Ihre fixierten Präparate: 1) dem Wellplattenhalter, 2) dem universellen Objektträgerhalter (den Sie für einen einzelnen Objektträger oder eine 60 mm oder kleinere Schale verwenden können) und 3) den 4-Objektträger Halter. Denken Sie daran, Ihr Deckglas nach unten zu legen. Wenn Sie ein Plastikgefäß verwenden, sind Sie auf die Luftobjektive (2x, 10x und 20x) beschränkt. Wenn Sie ein Ölobjektiv verwenden möchten, müssen Sie einen Glasboden oder ein Deckglas der richtigen Dicke verwenden (

NS. Das Tokai Hit Bühnengehäuse

Unser System beinhaltet ein Bühnengehäuse, da unser Raum zugig ist und wir den Thermostat nicht steuern können. Bei feststehenden Exemplaren können Sie die Frontklappe oben lassen. Für einen Zeitraffer-Scan von beliebiger Länge haben Sie die Möglichkeit, diesen Deckel abzulegen, um die Bühnenumgebung stabiler zu halten. Dieses Gehäuse führt einen zusätzlichen Schritt zum Zurückkippen des Kondensors ein (was Sie tun müssen, wenn Sie Tischeinsätze platzieren oder Objektive ölen/abwischen).

Um den Raum um den Kondensator zu öffnen, schieben Sie die beiden Schieber (rote Pfeile) nach außen. Sie können dann die Fokussierknöpfe des Kondensors nach oben und hinten drücken, um ihn nach hinten zu neigen. Sie können die Oberseite offen lassen, sodass Sie keine Zugluft von der Bühne fernhalten müssen. Der Nachteil dieser Anordnung ist, dass man sehr leicht vergisst, den Kondensator nach hinten zu kippen. Wenn Sie im konfokalen Modus kein Bild erhalten, sollten Sie zuerst nach links schauen, um zu überprüfen, ob Sie dies sehen. Die Laser werden blockiert, es sei denn, der Kondensor ist unten.

V. Wechsel von Luft- zu Ölzielen

Mit einem inversen Mikroskop können Sie Proben in Wellplatten oder -schalen oder Well-Objektträgern mit höheren N/A-Ölobjektiven abbilden, indem Sie diese Objektive darunter platzieren, damit die Probe nicht mit Öl verunreinigt wird. Der Nachteil ist, dass das Ölen der Objektive schwieriger ist als bei einem aufrechten System. Der Öltropfen in einer umgekehrten Konfiguration sitzt etwas prekär auf der Spitze der Objektivlinse und muss zwischen der Linse und dem Deckglas-/Schalenboden bleiben. Zu wenig Öl, und Sie haben keinen richtigen Weg für das Licht. Zu viel Öl, und es beginnt an den Seiten des Objektivs herunterzulaufen, sobald es mit dem anderen Glasstück in Kontakt kommt. Diesen brauchbaren Ölklecks zwischen die Glasstücke zu bekommen, ist eine Kunstform, und selbst erfahrene Benutzer müssen es möglicherweise mehrmals versuchen. Sobald Sie es richtig platziert haben, können Sie die Bühne innerhalb der Grenzen Ihres Ölklecks bewegen und mehrere Bilder aufnehmen. Wenn Sie jedoch außerhalb des Bereichs Ihres aktuellen Ölklecks abbilden müssen oder Proben wechseln, müssen Sie das gesamte Öl mit dem Linsenpapier vom Objektiv abwischen und einen neuen Tropfen auftragen. Es ist mühsam, aber notwendig, weil zu viel Öl nach unten fließt, was aus mehreren Gründen schlecht ist.

Wenn Sie eine Well-Platte verwenden, müssen Sie das Ölobjektiv, das Sie verwenden möchten, vorölen, bevor Sie die Platte in den Objekttisch stellen.

Wir haben 2 Arten von Öl: die blaue Flasche (ne = 1,518) für das 60x-Objektiv und die grüne Flasche Silikonöl (ne = 1,406) für die 30x- und 40x-Si-Objektive.

Noch ein paar Details zum Objektivwechsel

Unten links am Bühnengehäuse befindet sich ein Knopf, der ein Licht einschaltet, um diesen Raum zu beleuchten, wodurch Ölobjektive leichter zu erkennen sind. Denken Sie daran, es wieder auszuschalten, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen. Der Regler daneben steuert die Helligkeit.

Der universelle Objekttischeinsatz ist beim Ölen von Objektiven am einfachsten zu verwenden, da rund um Ihren Objekthalter Freiraum für den Zugang zum Objektiv vorhanden ist. Mit dem 4-Schlitten-Einsatz bleibt auf der linken oder rechten Seite genügend Freiraum zur Nutzung, auch wenn Sie 4 Dias montieren. Wenn Sie eine Well-Platte oder den Inkubator mit Tischaufsatz verwenden, müssen Sie Ihr Objektiv vorölen und dann auf 2x oder 10x umschalten, bevor Sie Ihre Probe/die Kammer in die Tischöffnung einsetzen.

Wenn ein Objektiv „entkommen“ ist, berühren Sie keine Fokusknöpfe. Wenn Sie dies tun, wird es "entkommen" und bewegt sich wieder nach oben. Der Zweck dieser Funktion besteht darin, Kollisionen zwischen den Objektiven und dem Tischeinsatz zu vermeiden. Die Fluoview-Software ist ausgegraut und inaktiv, während ein Ziel entkommen ist.

Um Öl von Ihrem Objektträger zu entfernen, tupfen Sie mit Linsenpapier (in der Schachtel auf dem Computertisch) ab und wischen Sie dann den Rest mit etwas Ethanol ab. Verwenden Sie KEINE Kimwipes auf Objektive oder irgendetwas (wie Objektträger oder Schüsseln), das sich in der Nähe von Objektiven befindet. Ihre Probenhalter sollten ölfrei sein, wenn Sie sie in den Core bringen, insbesondere wenn Sie sie zuvor mit Öl auf einem Mikroskop einer anderen Marke betrachtet haben. Jeder Mikroskophersteller hat seine eigene Version von Immersionsölen mit unterschiedlichen Brechungsindizes, sodass sie nicht kompatibel sind.


Aufrechte metallurgische Mikroskope

Der Unterschied zu aufrechten metallurgischen Mikroskopen besteht darin, dass sich das Beleuchtungssystem oberhalb des Probentisches befindet, wodurch Licht (von Objektiven) auf die Probe und zurück zu den Okularen gelenkt werden kann.

Das Mikroskop kann je nach Bedarf des Benutzers mit einem Säulenstativ oder dem typischen Basisstativ geliefert werden. Während beispielsweise das typische Basisstativ eine größere Stabilität des Mikroskops für relativ kleine Proben ermöglicht, ermöglicht das Säulenstativ eine verbesserte Flexibilität, die es ermöglicht, Proben unterschiedlicher Größe zu betrachten.

Zu den Features des aufrechten Mikroskops gehören eine einstellbare Intensitätsregelung, eine Dioptrie, 10x Weitfeldokulare sowie planachromatische unendlich korrigierte Objektive.

MicroscopeMaster Upright Metallurgical Bewertungen:

Während die verschiedenen Arten von metallurgischen Mikroskopen je nach Verwendungszweck einen Vorteil bieten, hat sich das inverse Mikroskop gegenüber dem aufrechten Mikroskop als eine Reihe von Vorteilen erwiesen. Diese beinhalten:

Mehr Freiheit - Beim inversen Mikroskop befindet sich die Optik unter dem Mikroskoptisch, während die Probe typischerweise über den Objektiven platziert wird. Dies beseitigt die Einschränkungen, denen das aufrecht stehende Mikroskop in Bezug auf die Größe der Probe ausgesetzt ist.

Hier profitiert der Anwender vom größeren Arbeitsabstand, wodurch größere und schwerere Proben zur Beobachtung am Mikroskop platziert werden können (bis 30kg)

Effizienz - Anwender profitieren beim Einsatz eines inversen Mikroskops davon, dass sie in kürzerer Zeit mehr Proben betrachten.

Bei einem aufrechten Mikroskop umfasst das Betrachten der Probe eine Reihe von Schritten, darunter das Absenken des Objekttisches, das Einstellen, darauf achten, die Probe auf dem Objekttischhalter zu schützen usw. Dies ist beim inversen Mikroskop nicht der Fall, da der Benutzer das Objekt einfach platzieren kann Objekt auf den Objekttisch und bilde es nach dem Fokussieren ab.

Der Fokus wird bei unterschiedlichen Vergrößerungen beibehalten, was bedeutet, dass der Benutzer bei der gleichen Art von Probe das Betrachten einfacher finden würde.

Das Ziel ist geschützt - Das Objektiv des inversen Mikroskops befindet sich unter dem Tisch, zusätzlich zum Vorhandensein einer Fokusstoppfunktion (bei einigen Mikroskopen), die das Objektiv jederzeit schützt und die Gefahr von Beschädigungen minimiert. Dies ist bei aufrechten Mikroskopen nicht der Fall, bei denen sich das Objektiv über dem Probentisch befindet, wo es jederzeit mit der Probe oder anderen harten Gegenständen in Kontakt kommen kann.


Biografie des Autors und Kontaktinformationen

Bio: Robert Berdan ist ein professioneller Naturfotograf aus Calgary, AB, der sich auf Natur-, Tier- und Wissenschaftsfotografie spezialisiert hat. Robert hat sich vor Jahren aus der Zell- und Neurobiologie-Forschung zurückgezogen, um sich ganz der Fotografie zu widmen. Robert bietet Fotoguiding und Privatunterricht in allen Aspekten der Naturfotografie und Adobe Photoshop-Schulungen an - einschließlich Mikrofotografie und Makrofotografie. Porträt von Robert Berdan mit Bildern aus einigen seiner wissenschaftlichen Publikationen, aufgenommen von Dr. Sharif Galal. Rechts ist sein erstes Forschungsmikroskop zu sehen.


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Gibt es einen Grund, ein aufrechtes Mikroskop einem inversen Mikroskop vorzuziehen? - Biologie

Stephen M. Wolniak
Professor
Abteilung für Zellbiologie & Molekulare Genetik
Universität von Maryland
College Park, Maryland, 20742
[email protected]

Lehrinteressen - Mikroskopie

Die nachfolgend aufgeführten Informationen stelle ich für Studierende bereit, die in der Regel wenig über die Grundlagen der Bildentstehung im Lichtmikroskop wissen. Wenn Sie diese Informationen verwenden möchten, schreiben Sie mir bitte den Aufwand für die Erstellung des Dokuments zu.

Grundlagen der Mikroskopie


Hellfeldmikroskopie

Das Mikroskop, das Ihnen für den allgemeinen Gebrauch in diesem Labor zur Verfügung steht, ist ein ausgereiftes optisches Instrument, das Ihnen hochauflösende Bilder einer Vielzahl von Präparaten liefern kann. Die Bildqualität hängt weitgehend von Ihrer Fähigkeit ab, das Mikroskop richtig zu verwenden. Im Folgenden finden Sie einige grundlegende Informationen, die Sie wahrscheinlich schon einmal gehört haben, aber Informationen, die selten ausführlich dargestellt werden.

Die Vergrößerung kleiner Dinge ist eine notwendige Facette der biologischen Forschung, aber die feinen Details in Zellen und in subzellulären Komponenten erfordern, dass jedes bildgebende System in der Lage ist, räumliche Informationen über kleine Entfernungen bereitzustellen. Auflösung ist definiert als die Fähigkeit, zwei sehr kleine und eng beieinander liegende Objekte als separate Einheiten zu unterscheiden. Die Auflösung ist am besten, wenn der Abstand zwischen den beiden kleinen Objekten gering ist. Die Auflösung wird durch bestimmte physikalische Parameter bestimmt, darunter die Wellenlänge des Lichts und das Lichtsammelvermögen der Objektiv- und Kondensorlinsen. Eine einfache mathematische Gleichung definiert den kleinsten Abstand (dMindest) trennt die beiden sehr kleinen Objekte:


DMindest = 1,22 x Wellenlänge / N.A. Zielsetzung + N.A. Kondensator

Dies ist das theoretische Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops. In der Praxis begrenzt die Probenqualität normalerweise dMindest etwas größer als seine theoretische untere Grenze.

N.A. (Numerical Aperture) ist eine mathematische Berechnung der Lichtsammelfähigkeit eines Objektivs. Die N.A. jeder Objektivlinse ist in das Metallrohr eingeschrieben und reicht von 0,25-1,4. Je höher der N.A., desto besser die Lichtsammeleigenschaften des Objektivs und desto besser die Auflösung. Höhere N.A.-Werte bedeuten auch kürzere Arbeitsabstände (Sie müssen das Objektiv näher an das Objekt bringen). N.A.-Werte über 1,0 weisen auch darauf hin, dass das Objektiv mit einer Immersionsflüssigkeit wie Immersionsöl verwendet wird.

Aus der obigen Gleichung sollten Sie wissen, dass der N.A. des Kondensors bei der Bestimmung der Auflösung genauso wichtig ist wie der N.A. des Objektivs. Aus diesem Grund führt das Schließen der Kondensorblende zu einem Auflösungsverlust. In der Praxis ist es bei voller Öffnung und guten Ölimmersionslinsen (N.A. 1,4 für Kondensor und Objektiv) möglich, etwas besser als 0,2 µm aufzulösen. Aus der obigen Gleichung sollte auch klar sein, dass Licht mit kürzerer Wellenlänge (blaueres Licht) Ihnen eine bessere Auflösung bietet (kleineres dMindest Werte). Es gibt jedoch praktische Überlegungen, wie kurz die Wellenlänge sein kann. In den frühen 1950er Jahren wurde ein UV-Mikroskop entwickelt, das jedoch Quarzobjektive und ein spezielles Abbildungsgerät erforderte. Die Quarzlinsen lieferten eine etwas bessere Auflösung (dMindest = 0,1 &mgr;m), aber die Bildqualität litt unter der Unfähigkeit der Hersteller, durch den Quarz verursachte Aberrationen zu korrigieren. Das menschliche Auge ist am besten für grünes Licht geeignet und unsere Fähigkeit, Details zu sehen, kann durch die Verwendung von Blau oder Violett etwas beeinträchtigt werden. Die meisten Mikroskophersteller korrigieren ihre einfachsten Linsen (Achromate) auf grünes Licht.


- Vergrößerung und Bildgebung -

Die meisten derzeit verwendeten Mikroskope sind als zusammengesetzte Mikroskope bekannt, bei denen ein vergrößertes Bild eines Objekts durch die Objektivlinse erzeugt wird und dieses Bild durch ein zweites Linsensystem (das Okular oder Okular) zum Betrachten vergrößert wird. Somit hängt die endgültige Vergrößerung des Mikroskops von der Vergrößerung des Objektivs mal der Vergrößerung des Okulars ab. Objektive Vergrößerungsleistungen reichen von 4X bis 100X. Eine niedrigere Vergrößerung ist bei einem zusammengesetzten Mikroskopstativ aufgrund der räumlichen Beschränkungen bei der Bildkorrektur und Beleuchtung unpraktisch. Eine höhere Vergrößerung ist aufgrund von Einschränkungen bei der Lichtsammelfähigkeit und kurzen Arbeitsabständen, die für sehr starke Objektive erforderlich sind, unpraktisch. Okulare Vergrößerungsbereiche sind normalerweise 8X-12X, obwohl 10X Okulare am häufigsten sind. Als Ergebnis bietet Ihnen ein Standardmikroskop einen endgültigen Vergrößerungsbereich von

Jedes Objektiv besteht aus sechs oder mehr Glasstücken, die zusammen ein klares Bild eines Objekts erzeugen. Die sechs oder mehr Linsen in der Objektivlinse werden benötigt, um Korrekturen bereitzustellen, die eine Bildklarheit erzeugen. Die Wechselwirkung von Licht mit dem Glas in einer Linse erzeugt Aberrationen, die zu einem Verlust der Bildqualität führen, da Lichtwellen in verschiedenen Teilen einer Linse unterschiedlich gebogen oder gebrochen werden und unterschiedliche Lichtfarben unterschiedlich stark gebrochen werden durch das Glas. Räumliche Aberrationen (z.B., sphärische Aberration) können durch die Verwendung von Linsen mit unterschiedlicher Krümmung auf ihren Oberflächen und chromatischen (d.h., Farbe) Aberrationen können durch die Kombination mehrerer Glasarten minimiert werden. Diese Korrekturen erhöhen die Kosten der Linse in dem Maße, dass eine apochromatische Objektivlinse mit Vollfarbkorrektur und extrem hoher N.A. mehrere tausend Dollar kosten kann. Dieses Objektiv ist etwa so groß wie Ihr Daumen.

Die Objektive der meisten Mikroskope sind Achromate und am besten für die Abbildung mit grünem Licht geeignet. Grüne Filter verengen die Bandbreite des Lichts und machen Achromat-Objektive für die meisten Routineanwendungen einigermaßen effektiv. Die Achromat-Objektive sind nicht für kritische hochauflösende Abbildungen mit weißem Licht geeignet, da rotes und blaues Licht nicht in derselben Ebene fokussieren wie grünes Licht. Chromatische Aberrationen verschlechtern die Auflösung in Farbbildern, die mit achromatischen Objektiven erhalten wurden. Farbmikrofotografie mit dem Ziel höchster Auflösung und Bildschärfe sollte mit vollständig korrigierten apochromatischen Objektiven durchgeführt werden. Fluorit-Linsen bieten mittlere Korrekturstufen, besser als Achromate, aber nicht so gut wie Apochromate. Fluoritlinsen sind aufgrund ihrer hohen Transmission für Licht kürzerer Wellenlängen gut für die Fluoreszenzmikroskopie geeignet. Höhere Korrekturstufen machen Objektivlinsen teurer, die Preisspanne für apochromatische Objektive reicht von etwa 3.000 USD bis über 10.000 USD.

Die Okulare der meisten Mikroskope sind so konzipiert, dass sie optimal mit den Objektiven des gleichen Herstellers arbeiten. Jeder Hersteller nimmt einen Teil der Farb- und Raumkorrekturen im Objektiv vor und den Rest der Korrekturen im Okular. Das Mischen von Marken führt normalerweise zu einem verschlechterten Image. Darüber hinaus ist das vergrößerte und korrigierte Bild, das Sie durch das Okular sehen, beim Blick in ein Mikroskop tatsächlich ein virtuelles Bild (im Gegensatz zu einem realen Bild). Das Okular, das bei Betrachtung mit dem Auge ein korrigiertes virtuelles Bild liefert, ist nicht für die Erzeugung von Foto- oder Videobildern durch das Mikroskop geeignet. Für die Fotografie oder Videomikroskopie ist es erforderlich, ein Projektionsobjektiv zu verwenden, das ein korrigiertes Realbild erzeugt. Viele der neueren Mikroskope bieten vollständige Bildkorrekturen in der Objektivlinse, wodurch viele Bedenken hinsichtlich der passenden Glaskomponenten desselben Herstellers vermieden werden. Trotzdem sollten Sie keine Teile eines Herstellers mit denen eines anderen mischen, da dies zu einer unbeabsichtigten Bildverschlechterung führen kann.

Ein wesentlicher Faktor für ein gutes Bild mit dem Lichtmikroskop ist die Erzielung ausreichender Lichtverhältnisse in der Objekt- bzw. Objektebene. Es ist nicht nur notwendig, um das Objekt herum helles Licht zu erhalten, sondern für eine optimale Abbildung sollte das Licht im gesamten Sichtfeld gleichmäßig sein. Die beste Methode zur Beleuchtung der Probe besteht in der Verwendung eines weiteren Linsensystems, eines sogenannten Kondensors. Das vordere Element des Kondensors ist normalerweise eine große, abgeflachte Linse, die direkt unter der Probe sitzt. Die Platzierung auf einem beweglichen Gestell bietet Ihnen die Möglichkeit, den am Objekt vorbeikommenden Lichtstrahl zu fokussieren, die Intensität zu maximieren und die Gleichmäßigkeit der Beleuchtung zu steuern. Zwei Blenden im Beleuchtungssystem ermöglichen die Regulierung des Durchmessers des Beleuchtungsstrahls durch Schließen oder Öffnen von Irisblenden. Eine dieser Blenden, die im Hellfeldkondensator untergebracht ist und als Kondensorblende bekannt ist, ermöglicht eine Erhöhung des Kontrasts, jedoch auf Kosten einer Verschlechterung der Auflösung. Die zweite dieser Blenden, bekannt als Feldaperturblende, beeinträchtigt die Auflösung nicht so stark und wird regelmäßig für eine optimale Ausleuchtung eingestellt.

Eine optimale Ausleuchtung einer Probe mit allen derzeit hergestellten Mikroskopen wird durch die Verwendung einer Variante der Kohler-Beleuchtung erreicht, bei der (für Technikbegeisterte) der Glühfaden der Lichtquelle in der hinteren Brennebene des Objektivs fokussiert ist. Im Betrieb ist es einfach, eine optimale Beleuchtung für Hellfeld (oder Phasenkontrast) zu erhalten, indem zuerst eine beliebige Probe auf den Objekttisch gelegt und auf das Objekt fokussiert wird. Drehen Sie als nächstes den Ring für die Feldaperturblende (die kleinste Blende des Mikroskops) so, dass seine Kanten den Rand des Sehfelds verdecken. Als nächstes erhöhen oder senken der Kondensator bis die Ränder der Feldaperturblende klar fokussiert sind. Fokussieren Sie das Objektiv nicht erneut auf das Objekt, während Sie den Kondensor justieren. Es kann erforderlich sein, die Aperturblende mit den Kondensor-Zentrierschrauben zu zentrieren. Bei richtiger Beleuchtung des Mikroskops sollten sich sowohl das Objekt als auch die Ränder der Feldaperturblende in der gleichen Fokusebene befinden und die Feldirisblende sollte im Gesichtsfeld zentriert sein.


Phasenkontrastmikroskopie

Das menschliche Auge kann Veränderungen der Lichtamplitude (Intensität) wahrnehmen. Ungefärbte biologische Proben, wie lebende Zellen, sind für unsere Augen im Wesentlichen transparent, aber sie interagieren mit Licht auf ziemlich gleichmäßige Weise, indem sie den Durchgang eines Lichtstrahls um ungefähr 1/4 einer Wellenlänge verzögern (verlangsamen) ( />) . Durch die Verlangsamung eines Lichtstrahls relativ zu einem anderen Lichtstrahl, der durch das umgebende Medium hindurchgegangen ist, ändert die biologische Probe die Phase der Strahlen. Intensität (Amplitude) ist additiv und Lichtstrahlen, die 1/2 /> phasenverschoben sind, werden als Dunkelheit wahrgenommen. Zernicke erkannte, dass er Amplitudenänderungen in lebenden Zellen erzeugen könnte, wenn er das durch biologische Proben hindurchtretende Licht verzögern könnte, ohne das durch das umgebende Medium hindurchtretende Licht zu beeinträchtigen. Das Phasenkontrastmikroskop wurde in den 1930er Jahren von Zernicke erfunden, um Kontraste in biologischen Proben zu erzeugen, indem diese unsichtbaren Phasenunterschiede in sichtbare Amplitudenunterschiede umgewandelt werden.

Zernicke verwendete einen optischen Trick, um die mit der Probe wechselwirkenden Lichtstrahlen von denen zu trennen, die nicht auf die Probe treffen. Um die Lichtstrahlen voneinander zu trennen, legte er einen transparenten Ring (sogenannter Annulus) in eine undurchsichtige Scheibe und schob diese Scheibe innerhalb des Kondensors in den Strahlengang des Mikroskops. Er platzierte einen komplementären Ring in der Objektivlinse. Nahezu das gesamte Licht, das durch die Probe geht, aber die Probe verfehlt, passiert dann die Objektivlinse durch diesen Ring. Das meiste Licht, das durch die Probe tritt, wird gestreut und ein Teil davon tritt so in die Objektivlinse ein, dass es nicht durch den Objektivring, sondern diese Ebene an einer anderen Stelle passiert. Er entwarf die Glasplatte, die den Ring hielt, so dass alles Licht, das dem Ring fehlte, eine zusätzliche Verzögerung von 1/4 /> relativ zu den Lichtstrahlen erfuhr, die nicht mit der Probe interagiert hatten, und platzierte die Lichtstrahlen, die mit der Probe interagiert hatten phasenverschoben mit Strahlen, die nicht mit der Probe um 1/2 /> wechselgewirkt hatten. Er stellte fest, dass eine Verringerung der Intensität des Lichts, das nicht durch das Präparat hindurchgegangen war, einen grauen Hintergrund erzeugen und den Kontrast noch weiter erhöhen würde, wobei einige Teile des Präparats dunkler und andere Teile des Präparats heller als der Hintergrund sind.

Der Betrieb eines Mikroskops im Phasenkontrastmodus erfordert zunächst die richtige Hellfeldbeleuchtung mit einer zentrierten Feldblende, deren Kanten in der Objektebene scharfgestellt sind. Drehen Sie anschließend den Kondensorrevolverzylinder, bis die Nummer auf dem Kondensorrevolver mit der auf der Objektivlinse eingravierten Nummer übereinstimmt. Unter dieser Bedingung ist der Kondensorring an den im Objektiv vorhandenen Phasenring angepasst. Entfernen Sie anschließend eines der Okulare und setzen Sie das Bertrand-Fokussierteleskop in das Okularloch ein. Mit diesem Objektiv können Sie die hintere Brennebene des Objektivs sehen, die Ebene, in der sich der Ring befindet. Sie sehen einen hellen Lichtkreis (den Kondensorring) und einen dunklen Ring (im Objektiv vorhanden). Der dunkle Ring ist stationär, der helle Ring jedoch nicht. Möglicherweise müssen Sie den Ring mit dem Ring ausrichten, damit die beiden übereinander liegen. Auf der Rückseite Ihres Kondensors finden Sie zwei Justierschrauben, die diese Ausrichtung ermöglichen. Wenn Ring und Anulus ausgerichtet sind, setzen Sie das Okular wieder in das Mikroskop ein. Der Unterschied zwischen Phasenkontrast und Hellfeld für die Beobachtung lebender Zellen ist signifikant.

Fluoreszenzmikroskopie

In bestimmten Klassen von Atomen und Molekülen absorbieren Elektronen Licht, werden energetisiert und verlieren diese Energie dann schnell in Form von Wärme und Lichtemission. Wenn das Elektron seinen Spin behält, spricht man von einem Singulett-Zustand, und die Art von Licht, die bei der Rückkehr des Elektrons in den Grundzustand emittiert wird, wird als Fluoreszenz bezeichnet. Wenn das Elektron bei Anregung seinen Spin ändert, tritt es in den Triplettzustand ein, und die Art von Licht, die bei der Rückkehr des Elektrons in den Grundzustand emittiert wird, wird als Phosphoreszenz bezeichnet. Phosphoreszenz ist viel langlebiger als Fluoreszenz. Sowohl Fluoreszenz- als auch Phosphoreszenzemissionen haben für spezifische angeregte Elektronen bestimmte Wellenlängen. Beide Emissionsarten hängen von spezifischen Wellenlängen des Anregungslichts ab, und bei beiden Emissionsarten ist die Anregungsenergie größer als die Emissionsenergie. Described another way, />of excitation light is shorter than />of emission light. In biology, we can utilize fluorescence in localization reactions, to identify particular molecules in complex mixtures or in cells. Fluorescence has the advantage of providing a very high signal-to-noise ratio, which enables us to distinguish spatial distributions of rare molecules. To utilize fluorescence, we need to label the specimen (a cell, a tissue, or a gel) with a suitable molecule (a fluorochrome) whose distribution will become evident after illumination. The fluorescence microscope is ideally suited for the detection of particular fluorochromes in cells and tissues.

The fluorescence microscope that is in wide use today follows the basic "incident-light" design of Ploem, who employed a novel arrangement of filters with a chromatic beam splitter (often wrongly called a dichroic filter both by biologists and microscope sales people). With the incident light fluorescence microscope, the object is illuminated with fluorescence excitation light through the objective lens. The object emits longer-l fluorescence in response to the shorter- excitation light. The objective lens then serves both for illumination and imaging. The chromatic beam splitter transmits or reflects light, depending on its color. For this application, shorter light is reflected and longer light is transmitted by the splitter. Ploem placed the chromatic splitter in the optical path between the objective lens and the ocular, at a 45° angle, so that it would reflect shorter light downward toward the objective. The longer- fluorescence emission light would be transmitted through the chromatic beam splitter toward the ocular.

The microscopes that you have utilized in this and other courses all operate in the same general fashion. Light beams pass through a condenser lens system and provide illumination of an object at many points simultaneously. For incident light fluorescence microscopy, the objective lens also acts as a condenser for the excitation light beam. In its interaction with the object, some of this light is absorbed, some of this light is scattered, some of this light is reflected, and some of this light is slowed or retarded (relative to a beam of light that does not pass through the object). A portion of the light that has interacted with the object then passes through the imaging lens system of the microscope where it provides us with visual or pictorial image information about the object. Like the process of illumination, the process of image generation operates in a parallel fashion, where large numbers of light beams contribute to the image simultaneously. Resolution is limited by the closeness of overlapping points of brightness or darkness. In a practical sense, the limit of resolution is 0.18-0.2 µm with the best available objective lenses and a good specimen.

To observe cells with the fluorescence microscope, it is important to know the spectral characteristics of the fluorochrome that has been employed. In order to excite the fluorochrome properly and then observe its fluorescence emission, the appropriate filter packages must be present in the microscope. The fluorochrome may not fluoresce at all if the cells are illuminated with the inappropriate filter pack present in the optical path. Finally, for any kind of fluorescence localizations to be performed, it is essential to have the appropriate controls, to be sure that the cells do not exhibit excessive autofluorescence (that is, they do not glow in the absence of the fluorochrome), and that the fluorochrome is responsible for the localization pattern observed. In the laboratory, we have several microscopes equipped for incident light fluorescence microscopy.

Confocal Scanning Optical Microscopy

In the incident light fluorescence microscope, a light beam passes through a chromatic beam splitter and then the objective lens to illuminate a specimen. This light beam is used to excite electrons in fluorochrome molecules present in the object. As some of those excited electrons return to their ground state, the emission of light is detectable through the oculars of the microscope, or with a camera or video printer. The image is generated continuously, across the entire field of view. A primary problem with the fluorescence images generated in this way is that out-of-focus fluorescence appears as 'flare' in the object, and reduces the signal substantially. In addition, human eyes are not sufficiently sensitive photodetectors for the lowest levels of fluorescence, and most video-based imaging systems are only slightly better than your eyes. Under conditions where there is sufficient signal for you to easily observe fluorochrome distribution patterns, the excitation light can be of sufficient intensity to photooxidize (d.h., burn) your specimen. Much information can be lost with just a few seconds of exposure to the excitation lamp. The Confocal Scanning Optical Microscope, an expensive piece of instrumentation that illuminates the object with a small beam of light in a point-by-point (d.h., serial) fashion, eliminates most of the photoxidation problems, permitting the observation of objects for extended periods at very high resolution with little loss of signal. The placement of a small aperture in the beam path generates a small depth of field, and effectively eliminates out of focus information in image formation.

The confocal scanning optical microscope is designed to illuminate an object in a serial fashion, point by point, where a small beam of light (from a LASER) is scanned across the object rapidly in an X-Y raster pattern. The raster pattern can be created in several ways, but in one of the more popular instruments, it occurs as a consequence of the simultaneous rotation and vibration of a polygonal mirror. The vibration is caused by the activity of a servogalvanometer, while the rotation is caused by the activity of a small electric motor. Thus, a bright spot of light scans across an object from top to bottom, line by line. The image is also generated point-by-point. Image formation is translated into intensities at each spot in the X-Y raster by a photomultiplier tube. The intensity information is digitized and stored in a computer. A complex image processing software package permits visualization and manipulation of the images. Resolution is limited by spot size for the LASER and approaches 0.12-0.15 µm for an ideal specimen and with the best available objective lenses.

The manufacturers of confocal scanning optical microscopes include a pinhole diaphragm at a very special place in the optical path, near to the site of the photomultiplier tube. This pinhole is situated in a plane where the light from the in-focus part of the image converges to a point. Light from object planes above or below that of the focused image do not converge at the spot in the optical path occupied by the pinhole. Because of this design, out of focus image information is darkened to the extent that it is not detectable. The consequence is that all out of focus information is removed from the image and the confocal image is basically an 'optical section' of what could be a relatively thick object. The 'thickness' of the optical section may approach the limit of resolution, but in practice, the resolution in the Z-direction is somewhat greater, approximately 0.4-0.8 µm. The value of optical sectioning is best realized with fluorescence microscopy, where out-of-focus information alters, distorts, or even degrades the image. Because the confocal images are stored in a computer, it is possible to stack them up and generate three-dimensional reconstructions. The image processing programs also enable us to rotate these images and observe three-dimensional aspects of cellular structure. It may be clear to you that the computer responsible for these image manipulations must be fast and powerful. The biggest problem is one of image storage, where single images can routinely occupy >1,000,000 bytes of space. In rather short periods of use, it is easy to accumulate sufficient numbers of images to fill the largest of hard disks.

Two of the three the confocal scanning optical microscopes located on campus were manufactured by Carl Zeiss, located in Germany. The newest instrument (model 510) has three lasers and four photomultipliers and is designed so that we could illuminate with two or three colors of light in rapid succession and detect as many as three superimposed signals (essentially) simultaneously. The signals are separated from each other on the basis of color, using an acoustical optical tunable filter (AOTF). The optical microscope is an inverted stand. The most important operational difference between this microscope and the upright microscope in most laboratories is that with this instrument, the slide is placed in the stage holder upside-down. Like most modern research microscopes, this microscope is equipped for phase contrast, differential interference contrast and fluorescence microscopy and can be used with these imaging techniques for conventional imaging. However, it is equipped with a number of very highly corrected (read expensive) objective lenses attached to the turret, just below the stage. These lenses are necessary for high resolution confocal microscopy. The confocal part of this microscope is contained in a box that is attached to the inverted stand through an access port. As is the case with incident light fluorescence, the laser light passes through the objective lens to illuminate the specimen. An air suspension table is designed to eliminate vibrations present in the building.

Deconvolution Microscopy and Image Reconstruction

An alternative approach for eliminating flare from fluorescent image stacks is to perform intensive, iterative image analysis and processing, from objects that have been illuminated and photographed at multiple, adjacent focal planes. The images are obtained with a high-performance CCD camera, operating at very high magnification, using standard incident light fluorescence microscopy. The excitation source is a mercury arc lamp, and bandwidth for excitation and emission are controlled by filters placed in rotating filter wheels. The lamp is stabilized and the beam is randomized for uniform illumination of the specimen. Unlike confocal scanning instruments, the whole field of view is illuminated simultaneously with this microscope. It is possible to perform rapid sequential imaging (4 colors) from multiple fluorochromes with this microscope. At very high magnification, fluorescence from any spot in a cell acts as a point source. By knowing the image spread functions above and below the plane of focus, it is possible to determine points of origin for fluorescence, and spreading beams of light from that point source, above and below the plane of focus. An iterative algorithm, which is essentially a linear combination is performed by a computer on the adjacent pixels within a single image plane, and in successive image planes through the thickness of the object. Spreading light beams are subtracted from reconstructed image stack, and that light is added back to the source, thereby reducing noise and increasing signal, respectively. We have recently acquired a sophisticated DeltaVision microscope from Applied Precision, Inc., which is designed to acquire these images and then perform the computer-intensive operations. This kind of microscope is particularly well suited for generating three-dimensional fluorescence images from small, living cells.

Polarization Light Microscopy

When light passes through an object, it interacts with some or all of the atoms and molecules present in that object. In these interactions, sometimes light of a particular (d.h., color) is absorbed by the atoms or molecules, while sometimes light is scattered. The interaction of light with a translucent object often results in a slight reduction in the velocity of the light beam. The extent of this reduction in velocity can be measured as the refractive index of the object. For certain kinds of objects, especially those with high order in particular axes of the object, such a crystalline or paracrystalline arrays, the interaction with light beams is vastly different, depending on the orientation of the object relative to the impinging light beam. As a result, the refractive indices are measurably different in different axes of the object. Such an object with multiple refractive indices is termed birefringent. Birefringence (multiple refractive indices) results from the alignment of atoms or molecules in particular planes of an object these atoms or molecules interact strongly with light beams impinging on them from a particular direction, and to a far lesser extent with light beams impinging on them from a different direction. There are two kinds of birefringence, intrinsic birefringence, which results from atomic or molecular order in a crystalline or paracrystalline array (d.h., calcite crystals, membranes) and form birefringence, which results from supramolecular associations in paracrystalline arrays (d.h., microtubules in a spindle).


- Polarized Light and Birefringent Retardation -

Any light beam shining in a particular direction vibrates in all directions around the axis of travel. Light beams whose vibration has been restricted to a single plane, or to a few planes is known as polarized light. Birefringence is directly observable as differences in intensity in different axes of crystalline or paracrystalline objects when they are viewed with polarized light. Since birefringence results from differences in the number of interactions between the light beam and atoms or molecules in the object in different directions, in practice, the object is rotated around the plane of vibration for the polarized light beam to maximize the intensity differences in the object (usually, the dominant object axis is at a 45o angle relative to the plane of polarization). The extent of the difference in refractive indices in different axes of the object is a measurable quantity known as birefringent retardation (BR). BR is measured (as a distance) by placing an object with known birefringent retardation into the light beam, and, by rotating the calibrated object around the optic axis, extinguishing the brightness in the sample. Using this compensation technique, BR has been shown to be directly related to the number of aligned microtubules in mitotic spindles in living cells. This principle and procedure can be of importance in studying microtubule dynamics, where mitotic spindles of developing sea urchins can be visualized in a totally noninvasive way.


Stereo Dissecting Microscope Focusing

If you are trying to get a stereo microscope into focus, the body of the microscope is either too far away or too close to your sample. If you know the working distance for the stereo microscope, you can properly set up the microscope so the head is the correct distance from the stand. Working distance is the distance that is required between the lens of the stereo microscope body and the top of your sample in order for your sample to appear in focus when looking through the microscope.

Keep in mind that when you add or remove a stereo microscope auxiliary lens, the working distance of your stereo microscope will change as well.


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