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Warum werden zwei Replikaseproteine ​​aus Tabakmosaikvirus-RNA übersetzt?

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Ich versuche zu verstehen, wie TMV exprimiert wird und habe (hier) gelesen, dass es eine große und eine kleine Form der RNA-abhängigen RNA-Replicase gibt. Diese werden aus der gleichen Region des Genoms translatiert, wobei die größere aus dem Durchlesen eines undichten Stopcodons resultiert.

Warum gibt es zwei Formen der Replikase? Mein erster Eindruck war, dass jeder eine subgenomische RNA produzieren könnte, eine für das Bewegungsprotein und eine für das Kapsidprotein, kann aber keine Berichte finden, die dies bestätigen.


Kurze Antwort

Ab 2021 ist die Begründung für die Produktion von zwei Proteinen aus dem Replikase-Gen des Tabakmosaikvirus (TMV) unvollständig verstanden. Die beiden Proteine ​​teilen einige Aktivitäten, andere jedoch nicht, und obwohl sie beim Replikationsvorgang zu kooperieren scheinen, gibt es einen zehnfachen Überschuss der kleineren im Vergleich zu den größeren.

Längere Antwort

„Warum gibt es eine 126-kDa- und eine 183-kDa-Form der TMV-RNA-abhängigen RNA-Replikase?“ Meine Antwort basiert hauptsächlich auf der Rezension von Buck (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B (1999) 354, 613-627), enthält jedoch Material aus einigen späteren Quellen (z. B. Malpica-López et al. (2018)). Viele relativ neue Arbeiten zur Replikase (z. B. diese von 2008 und diese von 2012 neigen dazu, diese Frage zu umgehen und beschränken sich auf die Beschreibung der Eigenschaften der beiden Proteine. Die wichtigsten Punkte sind:

  • Sowohl die TMV-kodierten 126-kDa- als auch die 183-kDa-Proteine ​​sind für eine maximale Effizienz der TMV-RNA-Replikation erforderlich. Das Protein in voller Länge ist unbedingt erforderlich; die Verhinderung der Produktion des kleineren Proteins reduziert die Replikationsrate auf 20 % des Normalwertes.
  • Die Durchleserate des Stopcodons beträgt etwa 10 %, so dass das Verhältnis von 126-kDa:183-kDa-Proteinen 10:1 beträgt.
  • Der Read-Through-Teil des 183-kDa-Proteins enthält Aminosäuremotive, die für RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdRps) charakteristisch sind, und daher stellt das 183-kDa-Protein wahrscheinlich die katalytische Aktivität für die Synthese von TMV-RNA aus NTP-Substraten bereit.
  • „Die C-terminale Domäne des TMV 126-kDa-Proteins ist helikaseartig. Obwohl für das 126-kDa-Protein eines Tobamovirus noch keine Helikaseaktivität nachgewiesen wurde, enthalten diese Proteine ​​sechs Aminosäuremotive, die in bekannten Helikasen, wie dem Translationsinitiationsfaktor eIF-4A, hochkonserviert sind.“
  • „Das TMV 126-kDa-Protein enthält zwei Domänen. Eine N-terminale Domäne mit Aminosäuremotiven und vorhergesagter Sekundärstruktur, die typisch für S-Adenosylmethionin-bindende Proteine, Methyltransferasen und Guanyltransferasen sind, ist wahrscheinlich für die Synthese der 5'-m7GpppG-Cap-Struktur erforderlich. Es wurde gezeigt, dass das TMV 126-kDa-Protein eine Guanylyltransferase-Aktivität besitzt.“
  • Das 126-kDa-Protein hat eine Aktivität beim Stummschalten der Antivirus-Unterdrückung des Wirts. Dem 183-kDa-Protein fehlt diese Aktivität, was auf einen Konformationsunterschied bezüglich der verantwortlichen Region hindeutet.
  • Es gibt Hinweise auf eine Assoziation von zwei Replikaseformen bei der Replikation von membrangebundener viraler RNA. Für einen Komplex mit oder ohne RNA liegen jedoch keine direkten Strukturinformationen (z. B. Röntgenkristallographie, Kryo-EM) vor.

Der einzige Vorschlag von Buck ist, dass die Helikaseaktivität für zwei verschiedene Zwecke erforderlich ist - um doppelsträngige RNA während der Replikation abzuwickeln und um die Sekundärstruktur von einzelsträngiger RNA zu entfernen, wenn diese als Matrize für mehrere Kopien der komplementären RNA verwendet wird Strang - die beiden Formen der Replikase können eine unterschiedliche Substratspezifität in ihrer Helikaseaktivität aufweisen.

Eigene Gedanken

Es ist alltäglich, dass die Einschränkungen bei der Translationsinitiation von eukaryotischer mRNA und die geringe Größe viraler Genome dazu geführt haben, dass Viren unterschiedliche Strategien zur Maximierung ihres Kodierungspotenzials annehmen. Read-Through ist für diese Virenklasse nicht spezifisch. Ich kann mir vorstellen, dass die Replikase dem Durchlesen vorausging, wobei man sich in diesem Fall fragt, ob das ursprüngliche Enzym ein Homo-Dimer war, das durch ein Hetero-Dimer mit ähnlicher Protein-Protein-Interaktion ersetzt wurde. Das Problem hierbei ist, dass das heutige Enzym nur ein aktives Zentrum hat. Offensichtlich sind strukturelle Informationen erforderlich, um diese Möglichkeiten zu adressieren.

Fußnote: Nomenklatur

Die ursprüngliche Frage und einige Quellen (hauptsächlich in der Strukturbiologie) beziehen sich auf die 126-kDa- und 183-kDa-Formen als Untereinheiten des Replikats. Die meisten virologischen Quellen verwenden diese Beschreibung nicht, die meiner Meinung nach irreführend ist, da sie 90% des 126-kDa-Proteins ignoriert, das nicht an der Replikation beteiligt sein kann und daher nicht als Replikase-Untereinheit fungiert. Es schlägt auch eine Ebene der strukturellen Analyse vor, die es nicht gibt. Obwohl Replikaseenzyme oft mehrere Untereinheiten aufweisen, sind sie im Allgemeinen strukturell verschieden. Anders sieht es bei TMV aus.


Die RNA-abhängige RNA-Polymerase der Tobamoviren existiert als Heterodimer, das durch Durchlesen des RdRP-Teils des Genoms (offene Leseraster 1 und 2) exprimiert wird. Die Produkte dieser ORFs sind zwei Proteine ​​von 183 kDa (große Replikase-Untereinheit) und 126 kDa (kleine Replikase-Untereinheit), wobei die 126 kDa ungefähr 10x mehr produziert werden als die 183 kDa-Form. Die Funktionen und Größen der verschiedenen Proteine ​​sind in Watanabe . gut beschrieben et al., (1999):

Das Genom des Tabakmosaikvirus (TMV) besteht aus einem einzelsträngigen RNA-Molekül von ca als 126K- bzw. 183K-Proteine), ein 30-kDa (30K)-Protein für die Virusbewegung von Zelle zu Zelle in infizierten Pflanzen und ein 18-kDa-Protein für die Virushüllenbildung. Die Sequenz des 126K-Proteins wird von der 5'-proximalen Region des viralen Genoms kodiert und umfasst die Methyltransferase- und RNA-Helikase-Motive, während das 183K-Protein ein Read-Through-Protein des offenen Leserahmens (ORF) von 126K ist und enthält: zusätzlich zu den obigen zwei Motiven das RNA-abhängige RNA-Polymerase-Motiv. Es wird angenommen, dass die RNA-Polymerase sowohl an der Transkription als auch an der Replikation beteiligt ist (8). Aus der Sequenzanalyse wird angenommen, dass die virale RNA-Polymerase das 183K-Protein als katalytische Untereinheit enthält, aber die genauen molekularen Zusammensetzungen von Transkriptase und Replikase wurden noch nicht bestimmt.

Ein gemeinsames Merkmal von RdRPs in RNA-Viren ist, dass sie als Heteromere vorliegen. Ein sehr bekanntes Beispiel hierfür ist die RdRP des Influenzavirus (-ssRNA), die als Heterotrimer bestehend aus den PB1-, PB2- und PA-Untereinheiten vorliegt, die aus den gleichnamigen Genomfragmenten hergestellt werden. Es gibt jedoch (viele) andere Beispiele in der Viruswelt, auch in einer anderen Pflanzenvirusgattung Potyvirus, das wie Tobamoviren und 90% der Pflanzenviren ein einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn ist. Die Funktionen des Potyvirus RdRP wurden gerade veröffentlicht, und um den verlinkten Artikel (und die darin enthaltenen Verweise) zu zitieren:

Die RdRp-RdRp-Selbstinteraktion scheint ein gemeinsames Merkmal für einzelsträngige RNA-Viren mit positivem Sinn zu sein, einschließlich Insekten-, Tier- und Menschen- und Pflanzen-infizierende Viren [38,49,50,51,52, 53]. Die Dimerisierung oder Oligomerisierung von RdRps kann die Stabilität dieser Enzyme erhöhen und vor Abbau schützen.

Wie Sie den Informationen im oberen Zitat entnehmen können, sind die Funktionen der verschiedenen Untereinheiten des Proteins unterschiedlich, aber komplementär. Der 126 kDa enthält Helikase- und Methyltransferase-Motive, während der 183 kDa als Polymerase fungiert und die gleichen Helikase- und Methyltransferase-Motive enthält. Lewandowski und Dawson (2000) fanden heraus, dass die 183 kDa-Untereinheit in der Lage war, alle oben aufgeführten Funktionen auszuführen, indem sie als vollständige RdRP fungierte, aber mit der 126 kDa-Untereinheit wurden diese Funktionen ~10-mal schneller ausgeführt. Sie fanden auch heraus, dass die Mutation einer Base in der Helikasedomäne des 126 kDa (183 kDa, geliefert von einem Helfervirus, das nur die 183 kDa-Form exprimiert) zu keiner Replikation der RNA mit der mutierten 126 kDa führte, was darauf hindeutet, dass dieses Protein für RNA-Replikation. Es sollte auch hier als Kommentar angemerkt werden, dass der Beweis für den Heterodimerismus der beiden Formen nicht in Form einer Kristallstruktur vorliegt, sondern in einer 1:1-Stöchiometrie bei der Immunpräzipitation, wie in der oben verlinkten Veröffentlichung von Watanabe diskutiert. Meines Wissens hat noch niemand eine vollständige Kristallstruktur des RdRP eines Tobamovirus erstellt.

Wie Sie jedoch vielleicht bemerkt haben, als Sie sich die Informationen in dem von Ihnen bereitgestellten Link angesehen haben, scheinen nur etwa 4 ORFs und eine kleine Anzahl von Proteinen produziert zu werden, und Sie denken vielleicht etwas in die Richtung von

"Wie schafft es ein Virus zu funktionieren, wenn es nur so wenige Proteine ​​produziert?"

Die Antwort darauf ist, dass virale Proteine ​​viele Funktionen erfüllen (diese Funktion ist nicht spezifisch für virale Proteine). Insbesondere scheint die kleine Untereinheit (126 kDa) als Suppressor des Wirts-Silencing-RNA-Systems (siRNA) zu wirken. siRNA-Systeme in Pflanzen funktionieren ein bisschen wie eine Reaktion des Immunsystems - sie signalisieren innerhalb der Zelle und extrazellulär, um eine virale RNA-abbauende Antwort zu induzieren, so dass sich das Virus nicht leicht ausbreiten oder sich im Wirt etablieren kann. Ich würde spekulieren, dass es einen besseren Ort gibt, um siRNA-Funktionen zu unterdrücken, als an der Stelle der viralen RNA-Replikation selbst.


Virusspezifisches Capping von Tabakmosaikvirus-RNA: Methylierung von GTP vor Bildung des kovalenten Komplexes p126-m 7 GMP

Beim Capping von zellulären mRNAs führt ein kovalentes GMP-Enzym-Intermediat zur Bildung von G(5′)ppp(5′)N am 5′-Ende der RNA, das durch die durch Guanin-7-Methyltransferase katalysierte Methylierung modifiziert wird. Hier zeigen wir, dass isolierte Membranen aus Tabakmosaikvirus (TMV)-infizierten Pflanzen- oder Insektenzellen, die das TMV-Replikaseprotein p126 exprimieren, m 7 GTP synthetisiert unter Verwendung von S-Adenosylmethionin (AdoMet) als Methyldonor und katalysierte die Bildung eines kovalenten Guanylat-p126-Komplexes in Gegenwart von AdoMet. Die Methylgruppe von AdoMet wurde in p126 eingebaut, was darauf hindeutet, dass der Komplex aus m 7 GMP-p126 bestand. Somit teilen TMV und Alphaviren trotz ihrer evolutionären Distanz denselben virusspezifischen Capping-Mechanismus.


Einführung

Viren nutzen als obligatorische Organismen Wirtsfaktoren, um sich in ihrem Wirt anzusammeln und zu verbreiten. Eine erfolgreiche Infektion durch ein Pflanzenvirus umfasst den Eintritt und die Akkumulation in der ersten Zelle, die Bewegung in benachbarte nicht infizierte Zellen und die systemische Infektion durch das pflanzliche Gefäßgewebe (Boevink und Oparka, 2005 Epel, 2009 Harries und Ding, 2011 Niehl und Heinlein, 2011 Schoelz et al., 2011 Tilsner et al., 2011). Pflanzenviren haben unterschiedliche Strategien zum Infizieren von Wirten, die ihre Verwendung existierender funktionell redundanter Wirtsentwicklungswege widerspiegeln. Daher bietet ein Verständnis der Virusinfektionsprozesse auch Einblicke in normale physiologische Prozesse des Wirts. Tabakmosaikvirus (TMV) kodiert vier bekannte funktionelle Proteine: die 126 und 183 kDa Replikations-assoziierten Proteine, das Bewegungsprotein (MP) und das strukturelle Kapsid oder Hüllprotein (CP). Für eine erfolgreiche Infektion kooperieren diese vier multifunktionalen Proteine ​​mit vielen Wirtskomponenten. Die Wirtsmembran und das Zytoskelett sind subzelluläre Strukturen, die für eine TMV-Infektion wichtig sind. TMV-induzierte Granula oder Einschlusskörperchen, die Membranen enthalten, enthalten auch Wirtsproteine. In diesem Übersichtsartikel diskutieren wir die sich ändernden Rollen von Wirtsmembranen, Zytoskelett und Einschlusskörper-assoziierten Proteinen mit fortschreitender Infektion. In der Literatur berichtete Ergebnisse werden zuerst in den Abschnitten vorgestellt, in denen die Wirkung auf die Virusphysiologie beobachtet wurde und nicht, wo sie diese Aktivität zusätzlich beeinflussen könnte. Beispielsweise wurde der Einfluss von Synaptotagmin auf die TMV-Physiologie (Lewis und Lazarowitz, 2010) als Hemmung der interzellulären Ausbreitung des TMV-MP beschrieben, obwohl er wahrscheinlich den intrazellulären Transport dieses Proteins beeinflusst. Dies wurde getan, um klar anzugeben, was in der veröffentlichten Literatur steht, und nicht, was ein Leser die Ergebnisse interpretieren könnte. In einigen Fällen wird jedoch der vermutete Einfluss des beobachteten Ergebnisses auf den Mechanismus der Virusbewegung festgestellt. Als relevant werden Befunde von anderen Tobamoviren erwähnt, um die Allgemeingültigkeit oder Spezifität einer Schlussfolgerung für die Gattung anzuzeigen.


Virusgenetik und Evolution

Wie Yoshimi Okada (Teikyo University, Utsunomiya, Japan) an die Symposiumsteilnehmer erinnerte, akzeptierten die meisten Biologen erst in den 1950er Jahren, dass Gene aus Nukleinsäuren aufgebaut sind. Experimente mit TMV spielten bei dieser Entwicklung eine wichtige Rolle, indem sie den ersten eindeutigen Nachweis erbrachten, dass ein virales RNA-Molekül – speziell die TMV-RNA – für die Infektiosität ausreicht und alle für die Synthese des CP notwendigen Informationen trägt ( Fraenkel-Conrat, 1956 Gierer und Schramm, 1956).

Bea Singer (University of California, Berkeley) erzählte, wie sie und H. Fraenkel-Conrat (University of California, Berkeley) die biochemische Forschung zur TMV-Genetik erweiterten. Sie begannen mit natürlich vorkommenden TMV-Stämmen, um zu zeigen, dass die Nachkommen gemischter Viren (d. h. Protein von einem Stamm und RNA von einem anderen) typgerecht für die TMV-Nukleinsäure waren (Fraenkel-Conrat und Singer, 1957). Fraenkel-Conrat und Singer verwendeten anschließend die mutagene salpetrige Säure (Gierer und Mundry, 1958), um neue Varianten von TMV zu generieren, die dann hinsichtlich ihres Nukleinsäuregehalts, der CP-Zusammensetzung und der Krankheitssymptome verglichen wurden. Aufgrund der labilen Natur der TMV-RNA waren dies schwierige Experimente. Wie Singer sich erinnerte, schützten sie und Fraenkel-Conrat die RNA vor zellulären RNasen, indem sie Tonbentonit hinzufügten, was ihren Kollegen C.A. Knight bemerkte, dass er "diesen Schlamm nicht in seine Sachen stecken würde".

Singer behauptete, dass ihre Arbeit mit Fraenkel-Conrat den wahren Beginn der auf die Virologie angewandten Chemie darstellte. Man könnte jedoch darauf hinweisen, dass diese Arbeit auf gleichzeitige Entwicklungen in der Bakteriologie und Bakteriengenetik beruhte, beginnend mit Forschungen, die ein Jahrzehnt zuvor am Rockefeller Institute durchgeführt wurden, wo Avery und seine Mitarbeiter biochemisch das „transformierende Prinzip“ der Streptokokken DNA sein.

Mit der Aufklärung der vollständigen CP-Sequenz im Jahr 1960 (Anderer et al., 1960, Tsugita et al., 1960) lieferte die Sammlung von TMV-Mutanten Hinweise, die verwendet wurden, um den genetischen Code zu knacken. Erst die verblüffende Entwicklung zellfreier Translationssysteme im folgenden Jahr durch H. Matthei und M. Nirenberg bot ein weniger aufwendiges Mittel zur Entschlüsselung dieses Codes (Übersicht in Kay, 1998), und selbst dann wurden TMV-Mutanten verwendet, um das entstehende Codon zu bestätigen Wörterbuch.

Die TMV-Mutanten beleuchten auch andere biologische Fragen. Wie Singer auch feststellte, waren fast alle Mutanten, die der Behandlung mit salpetriger Säure zugeschrieben wurden, weniger „fit“ als Wildtyp-TMV, eine Beobachtung, die auf spätere Entwicklungen auf dem Gebiet der Virusdiversität und -evolution hindeutet.

Milton Zaitlin (Cornell University, Ithaca, NY) erinnerte daran, wie Fortschritte in molekulargenetischen Techniken es Forschern in den 1970er und 1980er Jahren ermöglichten, eine detaillierte Karte des TMV-Genoms zu erstellen. Tatsächlich lieferten Studien in Zaitlins Labor einen wichtigen Hinweis auf die genetische Zusammensetzung der TMV-RNA, die zeigten, dass sich eine niedermolekulare Komponente namens sgRNA während einer Virusinfektion anhäufte (Jackson et al., 1972). Diese sgRNA wurde bald als mRNA impliziert, die die CP-Produktion steuert (Hunter et al., 1976). Mitte der 1970er Jahre hatte Zaitlins Gruppe korrekt, wenn auch versuchsweise, das Replikase-kodierende Gen am 5′-Ende, das CP-kodierende Gen am 3′-Ende und ein für die Virusbewegung notwendiges Gen im zentralen Teil des Genom (Beachy et al., 1976, siehe Abbildung 1). Nishiguchi, Okada und Mitarbeiter (Nishiguchi et al., 1978 Ohno et al., 1983) bestätigten dann, dass das 30-kD-MP von TMV unter Verwendung des TMV-Stamms L und einer temperaturempfindlichen Variante, Ls-1, kodiert wurde. Mehrere Studien zur reversen Genetik unter Verwendung infektiöser Klone, die erstmals 1986 zusammengestellt wurden (Dawson et al., 1986 Meshi et al., 1986), haben die während dieser früheren Studien zugewiesenen Genfunktionen bestätigt.

Die Initiierung der TMV-Infektion und der Abbau des TMV-Virions wurde von John G. Shaw (University of Kentucky, Lexington) überprüft. Nachdem das TMV-Virion in seine Wirtszelle eingetreten ist, muss es sein CP entfernen, um die virale Replikation zu ermöglichen. Shaw präsentierte ein Modell, das beschreibt, wie diese Enthüllung bidirektional erfolgen könnte, ausgehend sowohl vom 5'- als auch vom 3'-Ende des genomischen TMV-RNA-Moleküls. Die 5'-zu-3'-Enthüllungsreaktion kann kotranslational sein (Wilson, 1984), was zu einer Zerlegung durch einen Ribosomen-vermittelten Mechanismus und einem gleichzeitigen Schutz der unbeschichteten viralen RNA vor zellulären Nukleasen führen würde. Shaw schlug vor, dass die 3′-zu-5′-Enthüllungsreaktion auf koreplikationale Weise ablaufen könnte, da virale Replikasemutanten, die in der 3′-zu-5′-Disassemblierung defekt sind, in Pflanzenprotoplasten durch Zugabe von freier viraler RNA mit einem intakten Replikase-Gen (Wu und Shaw, 1996, 1997). Diese Studien zur TMV-Infektion auf molekularer Ebene veranschaulichen die hocheffiziente Koordination von scheinbar unterschiedlichen Ereignissen, die mit der Virusreplikation verbunden sind.

Ken Buck (Imperial College of Science, Technology, and Medicine, London, UK) analysierte den Prozess der TMV-Replikation und stellte fest, dass die an der TMV-Replikation beteiligten viralen Proteine ​​zwar gut charakterisiert sind, die Beteiligung von Wirtsfaktoren jedoch kaum verstanden wird. Auf der Grundlage ihrer physikalischen Assoziation mit den viralen Replikaseproteinen schlug Buck zwei mögliche Wirtsproteine ​​vor, die an der TMV-RNA-Synthese beteiligt sein könnten: EF-1α, das mit dem Replikasekomplex kolokalisiert, und eine Untereinheit von eIF-3, die mit die Nachbildung. Darüber hinaus erwähnte Buck genetische Ansätze zur Analyse von Virus-Wirt-Interaktionen, die zur Identifizierung der tom-1 und tom-2 Mutanten von Arabidopsis und der Tm-1 Tomatenmutante, bei der die TMV-Replikation eingeschränkt ist.

Auch populationsgenetische Studien mit Tobamoviren haben zu überraschenden Ergebnissen geführt. Obwohl RNA-Viren das Potenzial haben, stärker zu variieren als DNA-Viren (Domingo und Holland, 1994), bietet TMV einen Fall von hoher genetischer Stabilität. Adrian J. Gibbs (Australian National University, Canberra) verglich cDNA-Sequenzen neuerer Isolate von Tabak Mild Green Mottle Tobamovirus (TMGMV) und TMV mit denen von infizierten Nicotiana glauca Exemplare, die seit 1899 in australischen Herbarien hinterlegt wurden. Gibbs berichtete, dass diese Analysen zeigen, dass die genetische Vielfalt von TMGMV in Australien in den letzten 100 Jahren nicht zugenommen hat.Darüber hinaus scheinen die bei TMV beobachteten Mutationen schädlich zu sein, da TMGMV das dominantere Tabakvirus in geworden ist N. glauca in diesem Land (Fraile et al., 1997).

Ganz allgemein scheinen Tobamoviren aus so weit entfernten Orten wie Kalifornien und Kreta Teil einer großen Weltbevölkerung mit sehr begrenzter Variation zu sein. Diese bemerkenswert eingeschränkte Variation legt nahe, dass das virale Genom trotz unterschiedlicher Selektionsdrücke aufgrund langfristiger Wirt-Virus-Interaktionen im Allgemeinen unveränderlich bleibt. Mit anderen Worten, es scheint ein eingeschränktes Fenster der TMV-Sequenzvariabilität zu geben, außerhalb dessen die Fähigkeit der Wirtspflanze, dieses Pathogen zu erkennen und abzustoßen, stark verbessert ist. In dieser Hinsicht scheint sich TMV sehr von anderen Viren wie Influenza und HIV zu unterscheiden, die charakteristischerweise hohe Nukleotidänderungsraten aufweisen. Die eingeschränkte Variation, die TMV weltweit charakterisiert, hat wahrscheinlich frühen Virologen geholfen, die in der Lage waren, Ergebnisse aus entfernten Labors relativ einfach zu duplizieren.


Diskussion

Frühstadien der TMV-Infektion

Die Replikation vieler Positivstrang-RNA-Viren erfolgt in enger Verbindung mit Membranen (z. B. Wu et al. 1992 Molla et al. 1993 Strauss und Strauss 1994 Osman und Buck 1996). In dieser Studie wurde TMV-vRNA spezifisch mit mehreren Arten von Zellmembranen lokalisiert. Zu Beginn der Infektion war vRNA mit einem perinuklearen retikulierten Netzwerk und mit Strängen von Tubuli und kleinen Vesikel assoziiert. Diese Strukturen ähnelten stark dem kortikalen polygonalen ER-Netzwerk aus Tubuli und Blättern mit dazwischenliegenden lamellaren Segmenten, die mit der Kernhülle verbunden waren, die zuvor in Pflanzenzellen beschrieben wurden (Allen und Brown 1988 Hepler et al. 1990 Staehelin 1997). Die Kolokalisation von vRNA mit BiP, einem residenten Protein des ER (Denecke et al. 1995, Boston et al. 1996) und die Zerstörung der fluoreszierenden Strukturen durch BFA (Abb. 8) unterstützen die Hypothese, dass vRNA mit dem ER assoziiert ist. Unsere Beobachtungen, dass virale Replikase (Ishikawa et al. 1986) und die komplementäre Minusstrang-RNA (als Matrize für die vRNA-Replikation verwendet) in diesen Membranstrukturen lokalisiert waren, legen stark nahe, dass die Replikation der TMV-vRNA in enger Verbindung mit dem ER stattfindet. Frühere Berichte beschrieben eine Beziehung zwischen TMV-Replikationskomplexen und membranösen Extrakten aus infizierten Zellen (Watanabe und Okada 1986, Osman und Buck 1996).

Minus-Strang-RNA wurde auch in Strukturen (vermutlich ER) lokalisiert, die den Kern umgeben, mit Ausnahme einer diskreten Region. Das Fehlen von Minusstrang-RNA aus dieser Region könnte eine Kompartimentierung des perinukleären ER widerspiegeln oder darauf hinweisen, dass das ER in Subdomänen mit spezifischen morphologischen oder funktionellen Eigenschaften unterteilt ist (Staehelin 1997). Ishikawaet al. 1986 schlugen vor, dass die Synthese von Plus- und Minus-Strängen von vRNA verschiedene Arten von Faktoren oder molekularen Wechselwirkungen erfordert, eine Beobachtung, die für unsere Studien von Bedeutung sein könnte.

vRNA und virale Replikase wurden in kleinen Flecken, die über das Zytoplasma verteilt sind, kolokalisiert. Wie bereits bei der Poliovirusinfektion angegeben (Bienz et al. 1983), schlagen wir vor, dass Patches, die vRNA und Replikase enthalten, Replikationskomplexen in Verbindung mit ER entsprechen, die die erforderlichen Replikationskomponenten kompartimentieren, um die Virusproduktion zu steigern.

In frühen Infektionsstadien war vRNA mit fluoreszierenden Filamenten assoziiert, die Elementen des Zytoskeletts ähnelten (nicht gezeigt). Basierend auf den Wirkungen von Oryzalin und Cytochalasin D auf die Verteilung von vRNA im Zytoplasma vermuten wir, dass eine Assoziation von vRNA mit dem Zytoskelett in einem sehr frühen Stadium der Infektion besteht. In diesem Szenario nutzt vRNA das Zytoskelett für den Transport vom Zytoplasma zu perinukleären Positionen. Diese Hypothese basiert teilweise auf der Beobachtung, dass die Behandlung von Protoplasten mit Oryzalin zum Zeitpunkt der Inokulation die Lokalisierung von vRNA in der perinukleären Region verhinderte. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschrieb einen Mechanismus in Molch-Lungenepithelzellen, durch den die an Mikrotubuli befestigten ER-Membranen durch einen auf Actomyosin basierenden retrograden Fluss von Mikrotubuli mit ER als Ladung zum Zellzentrum transportiert werden (Waterman-Storer und Salmon 1998). Nach diesem Modell ist es möglich, dass mit ER assoziierte vRNA-Replicase-Komplexe mit einem ähnlichen Mechanismus über Mikrotubuli zu perinukleären Positionen transportiert werden.

Während der Infektion war vRNA in verschiedenen subzellulären Kompartimenten lokalisiert. Wir schlagen vor, dass dies die Bewegung von vRNA in verschiedene Kompartimente widerspiegelt, kann jedoch nicht die Möglichkeit ausschließen, dass die Kompartimentierung die Synthese und den anschließenden Abbau von vRNA darstellt und nicht die Bewegung von vRNA von einem Kompartiment in ein anderes.

Wenn Protoplasten mit vRNA-ΔM infiziert wurden, einer Mutante von TMV, die kein MP produziert, wurde vRNA-ΔM in vesikelähnlichen Strukturen um den Kern herum und in kleinen Flecken im Zytoplasma lokalisiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Assoziation mit dem ER in einem frühen Stadium der Infektion eine intrinsische Eigenschaft der vRNA und/oder der Replikase ist und kein MP erfordert. Es ist möglich, dass vRNA Sequenzen enthält, die auf das ER zielen. Von einigen zellulären mRNAs ist bekannt, dass sie spezifische Signale enthalten, die sie zur Translation an das grobe ER lenken (St. Johnston 1995).

Zwischenstadien der Infektion: Virusakkumulation und intrazellulärer Transport

Im mittleren Infektionsstadium war die vRNA in fluoreszierenden, unregelmäßig geformten Körpern lokalisiert, von denen einige ein vesikelähnliches Aussehen hatten. Außerdem kolokalisieren die Replikase (Fig. 4) und MP (Fig. 5) mit vRNA auf diesen Körpern. Da solche Strukturen in mit vRNA-ΔM infizierten Protoplasten nicht beobachtet wurden, schließen wir, dass MP für die Bildung und/oder Stabilisierung der Körper erforderlich ist. Diese Strukturen können den zuvor beschriebenen „Viroplasmen oder amorphen Einschlüssen“ entsprechen, die durch eine TMV-Infektion induziert werden (Martelli und Russo 1977). Unsere Beobachtungen unterstützen eine frühere Vermutung, dass Replikationskomplexe, die mit grobem ER assoziiert sind, als mRNAs funktionieren (Beachy und Zaitlin 1975). Während seiner Synthese kann MP mit vRNA assoziiert bleiben, als Ankerprotein fungieren und vRNA an ER-abgeleiteten Strukturen einfangen. Dementsprechend fällt die große Akkumulation von MP mit dramatischen morphologischen Veränderungen zusammen, die im ER stattfinden (Reichel und Beachy 1998).

Im Laufe der Zeit werden die zytoplasmatischen Körper zu länglichen Strukturen, oft verbunden mit fluoreszierenden Filamenten, die zur Peripherie der Zelle gerichtet sind. Immunfärbung mit Antitubulin-Antikörper und in situ-Hybridisierungsreaktionen liefern klare Hinweise auf eine Kolokalisation von vRNA mit Mikrotubuli. Die Behandlung von Protoplasten im mittleren Infektionsstadium mit Oryzalin verhinderte die Ausbreitung der Körper in die Peripherie der Zelle, was darauf hindeutet, dass Mikrotubuli eine Rolle bei der intrazellulären Verteilung von vRNA spielen. Zwei verschiedene Mikrotubuli-basierte Mechanismen, Membrangleit- und Spitzenanheftungskomplexe, sind an der Bewegung des ER vom Zellzentrum zur Peripherie von Molch-Lungenepithelzellen beteiligt (Waterman-Storer und Salmon 1998). Bei einer TMV-Infektion können die Komplexe, die MP, vRNA und Replikase enthalten, die mit ER assoziiert sind, unter Verwendung solcher Mechanismen in Richtung der Peripherie der Zellen transportiert werden.

Die Behandlung infizierter Protoplasten mit Cytochalasin D veränderte eindeutig das Muster der vRNA-Verteilung und verursachte eine Verzögerung beim Auftreten der großen Körper, was auf eine Rolle der Mikrofilamente bei ihrer Bildung und/oder Stabilisierung hindeutet. Die Depolymerisation von Mikrotubuli kann jedoch auch zur Zerstörung von Mikrofilamenten führen (Panteris et al. 1992). Daher ist es schwierig, die spezifische Rolle jeder Zytoskelettkomponente bei der intrazellulären Verbreitung von vRNA zu definieren.

vRNA-ΔM war nicht mit Elementen des Zytoskeletts assoziiert, es sei denn, die Zellen wurden in frühen Stadien der Infektion mit Cytochalasin D behandelt. Eine solche Behandlung führte zu einer Akkumulation von vRNA-ΔM in fluoreszierenden Flecken an der Peripherie der Zelle sowie auf Filamenten, die waren im Aussehen den Mikrotubuli ähnlich. Diese Ergebnisse legen nahe, dass vRNA mit Mikrotubuli assoziiert war, wenn sowohl MP als auch Mikrofilamente fehlten. Der Transport von mRNAs entlang zytoskelettaler Komponenten wurde in einer Vielzahl biologischer Systeme beschrieben, insbesondere in Bezug auf die Zelldifferenzierung und -entwicklung (Ferrandon et al. 1994 Kloc und Etkin 1995 Ainger et al. 1997 Broadus et al. 1998). In diesen Fällen beinhalteten RNA-Transportmechanismen spezifische Sequenzen in der 3'-untranslatierten Region, die von Proteinen erkannt werden, die diese Sequenzen binden und die Interaktion mit dem Zytoskelett vermitteln (Oleynikov und Singer 1998). In unserer Studie war die durch Cytochalasin D induzierte Veränderung des Verteilungsmusters von vRNA in Protoplasten, die mit vRNA-ΔM im Vergleich zu wt-vRNA infiziert waren, deutlicher. Diese Daten deuten auf einen gewissen Einfluss des MP auf die Lokalisierung von vRNA in mit Cytochalasin D behandelten Protoplasten hin. Die Implikationen von MP und Mikrofilamenten bei der Bildung und Verankerung der zytoplasmatischen Körper werden unten diskutiert.

Späte Infektionsstadien: Virusausbreitung und/oder -abbau?

Während der Infektion war vRNA um den Zellkern herum lokalisiert, obwohl im mittleren und späten Stadium auch vRNA im Zytoplasma und an der Peripherie der Zelle verteilt war. Die Akkumulation von vRNA um den Zellkern kann die Assoziation mit Wirtskomponenten erleichtern, die für eine Virusinfektion erforderlich sind. Die Ansammlung der viel größeren Körper, die den Kern umgeben, kann jedoch eine andere biologische Rolle bei der Replikation implizieren. Kürzlich wurde ein Modell vorgeschlagen, mit dem fehlgefaltete Proteine, die dem Proteosomen-vermittelten Abbauweg entgehen, zu großen Strukturen aggregieren können, die als „Aggresomen“ bezeichnet werden. Aggresomen werden auf Mikrotubuli von peripheren Stellen zu einem ubiquitinreichen nuklearen Ort im Mikrotubuli-organisierenden Zentrum transportiert, wo sie mit kollabierten Zwischenfilamenten verschränkt werden (Johnston et al. 1998). Nach diesem Modell können die Körper, die MP, vRNA und Replikase enthalten, während einer TMV-Infektion auf Mikrotubuli transportiert werden, um abgebaut zu werden. In anderen neueren Studien haben wir die Ubiquitinierung von MP und die Rolle von Proteosomen beim Abbau von MP beschrieben (C. Reichel und R.N. Beachy, Manuskript zur Veröffentlichung eingereicht).

In späten Stadien der Infektion war vRNA in Strukturen lokalisiert, die aus der Zelloberfläche herausragen. Diese Vorsprünge wurden nicht durch Oryzalin oder Cytochalasin D zerstört. Darüber hinaus beobachteten wir in anderen Studien, dass die Vorsprünge mit DiOC . gefärbt waren6(3) (3, 3'-Dihexyloxacarbocyaniniodid), ein wichtiger Fluoreszenzfarbstoff von ER (nicht gezeigt). Andere Studien weisen darauf hin, dass diese ER-enthaltenden Strukturen nicht per se durch eine Virusinfektion induziert werden, sondern durch eine Infektion stimuliert werden können (P. Más und R. N. Beachy, Manuskript in Vorbereitung). Wir vermuten, dass die hervorstehenden Strukturen mit Desmotubuli verwandt sind, dem angeschlagenen ER, das die zentrale Komponente von Plasmodesmen umfasst (Lucas et al. 1993). Alternativ könnten sie eine Folge einer Zellschädigung in späten Stadien der Infektion sein, die zur Extrusion von ER durch die Plasmamembran führt. Interessanterweise war vRNA-ΔM nicht mit den Vorsprüngen assoziiert, was auf eine Rolle des MP bei der Lokalisierung von vRNA mit diesen Strukturen hinweist. Zusammengenommen können diese Ergebnisse implizieren, dass mindestens zwei verschiedene Arten von ER an der TMV-Infektion beteiligt sind. Eine Art von ER ist an der vRNA-Replikation beteiligt und erfordert nicht die Anwesenheit des MP. Ein zweiter Typ entspricht den filamentösen Vorsprüngen, die an der interzellulären Ausbreitung des Virus beteiligt sein können und einen funktionellen MP erfordern.

Modell der TMV-Infektion

Die hier und in früheren Veröffentlichungen präsentierten Daten stimmen mit einem Modell der TMV-Infektion (Abb. 11) überein, bei dem die Replikation von vRNA in enger Assoziation mit Membranen des ER stattfindet (Abb. 11, Abb. 1). In diesem Modell sind Zytoskelett-Elemente daran beteiligt, vRNA/Replicase-Komplexe zum perinukleären ER zu lenken, möglicherweise über einen retrograden Fluss von Mikrotubuli mit ER als Ladung. Die ER-assoziierten naszierenden vRNAs in Replikationskomplexen fungieren als mRNAs für die Synthese von MP (Abb. 11, Abb. 2). Die MP bleibt im Komplex mit der vRNA assoziiert, was zur Bildung von großen ER-abgeleiteten Strukturen führt (Abb. 11, Abb. 3). An diesem Punkt würde die Verteilung der vRNA durch ein Gleichgewicht zwischen der Bildung und Verankerung der großen Strukturen und ihrer Ausbreitung zur Peripherie der Zelle bestimmt. Unsere Ergebnisse stimmen mit einem Modell überein, bei dem MP und Mikrofilamente an der Bildung und Verankerung der ER-abgeleiteten Strukturen beteiligt sind (Abb. 11, Abb. 3), während Mikrotubuli am Transport zu ihren Zielorten, dh zur Peripherie, beteiligt sind zur interzellulären Ausbreitung oder zum Zellkern zum Abbau (Abb. 11, Abb. 4).

Mehrere Arten experimenteller Beweise unterstützen dieses Modell. Erstens gibt es einen dramatischen Effekt auf die Verteilung von vRNA-ΔM in mit Cytochalasin D behandelten Protoplasten. In diesen Protoplasten wurden nicht nur keine Körper gefunden, im Gegensatz zu wt-vRNA, sondern vRNA-ΔM befand sich auch an oder nahe der Zellperipherie, aber nicht in den Vorsprüngen von der Plasmamembran. Da in unbehandelten Protoplasten vRNA-ΔM in frühen Infektionsstadien nicht an der Peripherie lokalisiert war, wurde die intrazelluläre Ausbreitung, die normalerweise später bei der Infektion auftritt, in Abwesenheit von Mikrofilamenten anscheinend beschleunigt. Zweitens würde die klare Assoziation von vRNA-ΔM mit Mikrotubuli die Rolle der Mikrotubuli bei der intrazellulären Ausbreitung des Virus in Richtung der Zellperipherie erklären. Drittens erklärt die enge Beziehung zwischen dem ER und den Mikrotubuli in den späten Stadien der Infektion die Assoziation von vRNA in Gegenwart des MP mit einem Vorläufer der Plasmodesmen (Abb. 11, Abb -Zellausbreitung des Virus in Blattgeweben.


Abschluss

Ein einfacher, kostengünstiger und effizienter Weg, Pflanzen mit TMV-Vektoren über Agroinfektion zu infizieren, wurde identifiziert. Rekombinante Proteinexpressionsspiegel von etwa 600 bis 1200 Mikrogramm pro Gramm A. tumefaciens infiltriertes Pflanzengewebe erhalten. Rekombinantes Protein kann sowohl aus lokal beimpften Blättern als auch aus systemisch infiziertem Pflanzengewebe gewonnen werden. Diese Verbesserungen sollten es Forschern mit wenig oder keiner Erfahrung mit Pflanzenvirusvektoren ermöglichen, TMV-Expressionsvektoren einfach in ihrer Forschung zu verwenden. Die hier beschriebenen Vektorverbesserungen werden insbesondere in Hochdurchsatzforschungsprojekten nützlich sein.


Diskussion

Pflanzen als sessile Organismen müssen auf biotischen oder abiotischen Stress reagieren, indem sie die Häufigkeit spezifischer Proteine, die eine entscheidende Rolle für Stress spielen, schnell anpassen. Die orchestrierte Hoch- und Herunterregulierung bestimmter Wirtsfaktoren in der Virus-Pflanzen-Interaktion kann zu einer Abwehrreaktion gegen das Virus führen. Alternativ könnte man annehmen, dass solche Veränderungen der Wirtsfaktoren dem eindringenden Virus in einer kompatiblen Interaktion zugute kommen. Die Literatur berichtet, dass Proteinveränderungen mit einer mutmaßlichen Abwehrfunktion gegen eine TMV-Infektion bei Tabak verbunden sind, während andere Proteinveränderungen mit einer erfolgreichen TMV-Infektion bei tabakverursachenden Erkrankungen verbunden sind. Unsere Proteomics-Analyse identifizierte 661 Proteine. Tabak hat bisher eine unvollständige Proteindatenbank (6.793 Akzessionen) und eine niedrige Kommentierungsrate, die die niedrige Identifizierungsrate erklären könnte. Die Verwendung gelfreier Proteomik zur Proteinidentifizierung erfordert eine gut kommentierte Datenbank der untersuchten Wirtsspezies, um zahlreiche Proteine ​​identifizieren zu können.

Trotz der relativ geringen Anzahl identifizierter Proteine ​​fanden wir eine signifikante Korrelation zu den verschiedenen Behandlungen. Es wurde festgestellt, dass sechsunddreißig (36) Proteine ​​bereits ab 15 mpi in der tabakkompatiblen Interaktion unterschiedlich akkumuliert werden. Die Proteinveränderungen, die zur TMV-Resistenz beitragen könnten, umfassen verteidigungsbezogene Proteine ​​wie S-Adenosylmethioninsynthase, Cysteinproteinase-Inhibitor, Glutathion-S-Transferase, Malatdehydrogenase, Snakin-1, Osmotin-ähnliches Protein und RNA-bindendes Glycin-reich Protein (hochreguliert bei TMV-Infektion) sowie mutmaßliche Anfälligkeitsfaktoren wie Phosphoglyceratkinasen und OBERON-ähnliches Protein (herunterreguliert bei TMV-Infektion) (Tabelle 1).

S-Adenosylmethioninsynthase oder SAMS (A0A0F7R532) katalysiert die Bildung von S-Methylmethionin (SMM), das für die Produktion mehrerer osmoprotektiver Proteine ​​notwendig ist (Espartero et al., 1994). Erhöhte SMM-Spiegel könnten zu einer Reaktion gegen Pflanzenstress beitragen, da es ein direkter Vorläufer der osmoprotektiven Sulfoniopropionat-Proteinfamilie ist, die sowohl an biotischen als auch abiotischen Abwehrmechanismen beteiligt ist. SMM beeinflusst auch die Biosynthese von regulatorischen und Abwehrstoffen wie Polyaminen und Ethylen (Tassoni et al., 2008). Der Cystein-Proteinase-Inhibitor (A0A075F933) spielt vermutlich eine Rolle bei der Pflanzenabwehr gegen Virusinfektionen (Shih et al., 1987 Prins et al., 2008). Gutierrez-Campos et al. (1999) exprimierten pflanzliche Cysteinprotease-Inhibitoren in transgenem Tabak, die Resistenz gegen Potyviren verleihen. Glutathion-S-Transferase oder GST (Q4LB98) ist an der Neutralisation von toxischen Verbindungen und reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt, die während einer Virusinfektion gebildet werden (Zechmann et al., 2005). Im Falle des Bambusmosaikvirus, bindet Pflanzen-GST an die virale RNA und liefert Glutathion an den viralen Replikationskomplex (Chen et al., 2013). Glutathion ist ein Schlüsselregulator der Redox-Signalgebung und -Pufferung und spielt eine wichtige Rolle bei der Pflanzenabwehr durch die Aktivierung verteidigungsrelevanter Gene (Foyer und Noctor, 2009). Malatdehydrogenase (A0A075F1V0) katalysiert reversibel die Umwandlung von Oxaloacetat in Malat sowohl in Mitochondrien als auch im Zytoplasma, was zur Produktion von Sekundärmetaboliten (Tomita et al., 2005) wie Alkaloiden, Flavonoiden und Terpenoiden führt, die in der Reaktion auf mechanische Beschädigung oder Infektion (Beggs und Wellman, 1994). Das antimikrobielle Peptid Snakin-1 oder SN1 (A0A0R4WFT2) wurde mit einer erhöhten Resistenz gegen Bakterien, Pilze und Viren in Verbindung gebracht (Almasia et al., 2008 Rong et al., 2013 He et al., 2017). Es wurde festgestellt, dass das SN1-Gen von Sojabohnen die Virusresistenz bei Arabidopsis und Sojabohnen wahrscheinlich durch Veränderung der Expression von Signaltransduktions- und Abwehrreaktionsgenen (He et al., 2017). Das Osmotin-like Protein (A0A075EZS9) gehört zur Pathogen-Related Protein-5 (PR-5)-Familie von Proteinen mit einer mutmaßlichen Abwehrfunktion gegen mehrere Pathogene, neben seiner Rolle als Osmoregulator. Von einer höheren Häufigkeit von Osmotin-ähnlichen Proteinen in TMV-infizierten Blattgeweben wurde berichtet (Broekaert et al., 1997).Das glycinreiche RNA-bindende Protein oder GRP (J7G1D7) nimmt an Wirt-Pathogen-Interaktionen teil und spielt eine Rolle bei der Nukleinsäurebindung, der überempfindlichen Reaktion und der Salicylsäure-Biosynthese (Naqvi et al., 1998). Überexpression der A. thaliana Glycin-reiches RNA-bindendes Protein 7 (AtGRP7) verlieh Resistenz gegen TMV (Lee et al., 2012). Darüber hinaus schwächte die ADP-Ribosylierung der RNA-bindenden Proteine ​​die Wirtsimmunität durch Beeinflussung des RNA-Stoffwechsels und des Pflanzentranskriptoms, das mit der Abwehr verbunden ist (Fu et al., 2007).

Es wurde gezeigt, dass Phosphoglyceratkinasen oder PGKs (Q42961, Q42962) die Replikation mehrerer Positivstrang-RNA-Viren fördern (Cheng et al., 2013 Chen et al., 2017 Prasanth et al., 2017). Dies kann entweder durch ihre ATP-erzeugende Aktivität erreicht werden, die die Bildung viraler Replikationskomplexe (VRCs) erleichtert (Prasanth et al., 2017) oder durch ihre virale RNA-Bindungskapazität, die den Transport viraler RNA in Chloroplasten zur Replikation unterstützt ( Cheng et al., 2013). Interessanterweise ist eine natürlich vorkommende Mutante von PGK in A. thaliana weist Resistenz gegen ein Potyvirus auf, was darauf hindeutet, dass PGKs als Wirtsfaktoren fungieren können, die die Anfälligkeit für Virusinfektionen erhöhen (Ouibrahim et al., 2014). Es wurde gezeigt, dass das OBERON-ähnliche Protein (Q84N38) die systemische Ausbreitung des Potyvirus fördert Rübenmosaikvirus (TuMV) über Wechselwirkung mit dem Vpg-Virusprotein. Die Herunterregulierung des OBERON-ähnlichen Proteins verringert die TuMV-Infektion (Dunoyer et al., 2004).

Alle oben beschriebenen Proteine, die durch Proteomics-Analyse identifiziert wurden, sind in einem sehr frühen Infektionsstadium an den Bemühungen des Wirts beteiligt, sich gegen TMV zu verteidigen, jedoch ohne Erfolg, da Pflanzen systemisch mit dem Virus infiziert werden. Die Proteinveränderungen, die mit einer erfolgreichen TMV-Infektion korreliert sind, betreffen das translations-assoziierte Poly-A-Bindungsprotein (hochreguliert bei TMV-Infektion) sowie Chloroplasten-assoziierte Faktoren wie Carboanhydrasen, das Chloroplasten-Photosystem-bO4-Protein und RuBisCO-Aktivase 2 (herunterreguliert bei TMV-Infektion) (Tabelle 1 und Abbildung 2).

Poly-A-bindendes Protein oder PABP (I2FJN7) kann als Anfälligkeits-Wirtsfaktor wirken, indem es die virale RNA-Translation fördert (Iwakawa et al., 2012). TMV 3′ UTR enthält mehrere einzigartige Sequenzen, die als CAP-unabhängiges Translations-Enhancer-Element (CITE) und A-reiche Sequenzen (ARS) bezeichnet werden, die die virale RNA-Translation vermitteln.

Carboanhydrase- oder CA-Enzyme (EC 4.2.1.1) (A0A077DCK9, A4D0J8, A4D0J9, P27141) wurden als Salicylsäure-bindende Proteine ​​mit antioxidativer Funktion identifiziert und bilden im Allgemeinen einen Teil des Abwehrmechanismus in C3-Pflanzen gegen den Angriff durch verschiedene Pathogene, einschließlich Viren (Slaymaker et al., 2002 Restrepo et al., 2005). Es wurde gezeigt, dass das Protein D1 der PsbO-Gruppe (I0B7J4) bei TMV-empfindlichen Tabaksorten nach einer TMV-Infektion eine signifikant geringere Häufigkeit aufweist als die TMV-toleranten, was darauf hindeutet, dass hohe D1-Spiegel eng mit antiviraler Resistenz korreliert sind (Wang et al., 2016) . Darüber hinaus ist die Stilllegung von PsbO in N. Benthamiana führte zu einer erhöhten TMV-Akkumulation (Abbink et al., 2002). PsbO-Proteine ​​sind an der Kontrolle der Affinität des Photosystems II (PSII) für Mangan (Mn 2+ ) beteiligt und somit an der Stabilisierung des sauerstoffbildenden Komplexes beteiligt (Popelkova et al., 2008). Ein intakter und funktionsfähiger PSII-Komplex ist entscheidend für die Resistenz gegenüber einer TMV-Infektion (Wang et al., 2016). Interessanterweise interagiert das TMV-p126-Helikaseprotein mit einem PsbO-Protein in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System, was darauf hindeutet, dass p126 die normale Lokalisation und/oder Funktion von PsbO unterbrechen kann (Abbink et al., 2002 Wang L. Y. et al., 2012). RuBisCO-Aktivasen oder RCAs (Q40565, V9INR4), die Chaperon-ähnliche Proteine ​​sind, werden zur Optimierung der Photosynthese benötigt und es wurde gefunden, dass sie bei einer TMV-Infektion mit TMV-Replikase in VRCs kolokalisieren. Die Herunterregulierung von RCA erhöht die Infektion mit TMV erheblich (Bhat et al., 2013). Chloroplasten sind Energiegeneratoren, Stresssensoren und Abwehrsignalproduzenten und stellen somit wichtige Angriffsziele für eindringende Viren dar, um erfolgreiche Infektionen zu etablieren (Li et al., 2016 Bhattacharyya und Chakraborty, 2018). Unsere Ergebnisse, die die Abnahme der CA-, PsbO- und RCA-Proteinspiegel bei 15 mpi zeigen, könnten den Beginn einer schnellen Veränderung des Chloroplasten durch TMV darstellen (Tabelle 1 und Abbildung 2). Typische Symptome der TMV-Krankheit auf Tabakblättern wie Mosaik sind mit einer abnormalen Chloroplastenstruktur und einer Verzerrung der Photosynthesemaschinerie korreliert (Lehto et al., 2003).

RNAi gilt als sehr effektiver antiviraler Mechanismus (Padmanabhan et al., 2009 Wang M. B. et al., 2012). Darüber hinaus wurde kürzlich vorgeschlagen, dass dsRNA einen mustergetriggerten Immun(PTI)-Signalweg in Pflanzen induzieren könnte, der eine antivirale Abwehr bietet (Niehl et al., 2016 und Referenzen darin). Es wurden keine Studien über die Produktion von vsiRNAs aus dem TMV-Genom bereits ab 15 mpi berichtet. Tabak-RNAi gegen TMV ist zu diesem Zeitpunkt in der Tabak–TMV-Interaktion funktionsfähig, da vsiRNAs aus Sense- und Antisense-Orientierung des TMV-Genoms produziert werden (Abbildung 4 und ergänzende Tabelle 5). Aber auch diese Abwehrreaktion reicht nicht aus, um Resistenzen zu verleihen, da alle Tabakpflanzen infiziert wurden. Um die RNAi-Maschinerie des Wirts zu stärken, haben wir die topische Anwendung von dsRNAs als Induktoren der RNA-basierten Impfung eingesetzt (Voloudakis et al., 2018). In der vorliegenden Arbeit haben wir kleine RNA-NGS verwendet, um zu zeigen, dass die exogen applizierte dsRNAp126 auf Tabakpflanzen bereits ab 15 mpa effizient prozessiert wird und siRNAs produziert, die aus der gesamten Region des verwendeten dsRNA-Moleküls stammen (Abbildung 3 und ergänzende Tabelle 4). und dies wird unseres Wissens zum ersten Mal berichtet. Da die siRNA-Profile bei TMV- und dsRNAp126-Behandlungen ähnlich sind (ergänzende Abbildung 3), nehmen wir an, dass DCLs eine Schlüsselrolle beim Zerteilen der exogen applizierten dsRNA spielen. Die beobachtete Heterogenität bei der siRNA-Produktion (Hot Spots) (Abbildung 3) könnte möglicherweise auf die Sekundärstrukturen der dsRNA-Moleküle zurückgeführt werden, die die Zugänglichkeit der DCL-Proteine ​​zu ihren Zielen einschränken könnten. TMV über sein p126-Protein, das RNA-Silencing-Suppressor-Aktivität besitzt, könnte die Dicing-Kapazität der DCL-Proteine ​​des Wirts beeinträchtigen und dadurch die exogen angewendete dsRNA-Prozessierung beeinträchtigen. Dies scheint jedoch in unserem experimentellen System nicht zu passieren. Insbesondere die gleichzeitige topische Anwendung von dsRNAp126 zusammen mit TMV erzeugte das gleiche Muster von siRNA-Molekülen in der Region 426𠄱,091 nt (Region der dsRNA) (Abbildungen 3, 5 und ergänzende Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass die Anwesenheit der Virus verändert das Würfelmuster der aufgetragenen dsRNA nicht. Die produzierten siRNAs bei 15 mpi im Bereich von dsRNAp126 (426𠄱.091 nt) sind im Vergleich zu den vsiRNAs, die aus dem Rest des viralen Genoms stammen, in großem Überschuss (Abbildung 5 und ergänzende Tabelle 6). Diese hohe Häufigkeit von dsRNA-abgeleiteten siRNAs ist ein sehr wichtiger Parameter für die RNA-basierte Impfung, da zuvor gezeigt wurde, dass die RNAi-Wirksamkeit dosisabhängig ist (Tenllado und D໚z-Ruíz, 2001). Die Wirksamkeit der dsRNAp126-Anwendung gegen die TMV-Infektion kann durch den Befund veranschaulicht werden, dass sie die Akkumulation von TMV signifikant reduziert, wie durch RT-PCR-Analyse nachgewiesen (Abbildung 6).

1-Aminocyclopropan-1-carboxylat-Oxidase 2 Isoform A (ACO2) (E5LCN0), Cystein-Synthase (CyS) (Q3LAG5, S6A7M4) und Isoformen von Calmodulin (CaM) (Q76ME6, Q76MF3) bilden eine kleine Gruppe von Proteinen, die signifikant häufiger bei der dsRNAp126 + TMV-Behandlung im Vergleich zu den Wasser- und TMV-Behandlungen. Wir vermuten, dass diese Proteine ​​durch dsRNA selbst induziert werden. Es liegen keine bibliographischen Berichte über ACO2 und CyS bei Pflanzenvirusinfektionen vor. Ein Calmodulin-ähnliches Protein (rgd-CaM) unterdrückt jedoch die Gurkenmosaikvirus-2b (CMV-2b), dem Virus-Silencing-Suppressor, durch physikalische Bindung an die dsRNA-Bindungsdomäne von CMV-2b (Nakahara et al., 2012). Es wäre wichtig, die Akkumulation dieser Proteine ​​weiter zu untersuchen, um ihre Beteiligung am pflanzlichen RNAi-Weg und ihre Resistenz gegen Virusinfektionen zu bestätigen.


Struktur-Funktions-Analyse von n

Das Vorhandensein von TIR-, NB- und LRR-Strukturmotiven in der n Gen impliziert, dass es an Proteinkomplexen beteiligt ist, die den TMV-Liganden erkennen und die Signaltransduktion auslösen, die zur Abwehrreaktion führt. Deletions- und ortsgerichtete Mutagenese wichtiger Aminosäurereste in diesen drei Domänen zeigte, dass alle drei Domänen für eine ordnungsgemäße n Funktion ( Dinesh-Kumar et al., 2000). Die meisten In-Frame-Deletionsmutationen im n Gen beseitigte die TMV-Resistenz und war rezessiv gegenüber Wildtyp n-Genfunktion. Die TIR-Deletionsmutanten zeigten einen dominant negativen Phänotyp in einem Wildtyp NN Hintergrund.

Die n-TIR-Domäne wurde ferner dadurch charakterisiert, dass sie auf neun Aminosäuren in dieser Domäne abzielte, die in Pflanzen konserviert sind R Genprodukten, sowie in denen von Drosophila und menschliche Toll und menschliches IL-1R ( Rock et al., 1998). Diese Aminosäuren sind essentiell für die Aktivierung von Signalereignissen in den Toll- und IL-1R-Signalwegen. Einige der Aminosäuresubstitutionen innerhalb der TIR-Domäne verursachten einen vollständigen Verlust von n Funktion ( Dinesh-Kumar et al., 2000). Obwohl beispielsweise die Substitutionsmutation D46Y keinen Einfluss auf n Funktion, D46H führte zu nicht-funktional n. In ähnlicher Weise führten konservative oder nicht-konservative Substitutionen an den Positionen Y12, Q67, W82, I138, W141 und R142 zu einem teilweisen Verlust des Funktionsphänotyps. Die Substitution Y12F zeigte keine Wirkung, während der Zeitpunkt und das Auftreten von HR in Pflanzen mit der Y12S-Mutation unterschiedlich waren. Unabhängig vom Zeitpunkt oder dem Auftreten von HR entwickelten alle diese Mutanten den SHR-Phänotyp. Einige der Funktionsverlust- und Teilfunktionsverlust-Allele wirkten dominant negativ und störten den Wildtyp n Funktion. Ein kritisches Ergebnis dieser Studien war, dass Mutationen, die Drosophila Es wurde auch festgestellt, dass die gebührenpflichtige oder humane IL-1R-Signalgebung die n-vermittelte Resistenzreaktion auf eine TMV-Infektion. Die genaue Rolle der n-TIR-Domäne in der TMV-Resistenzsignalisierung ist noch unbekannt.

Die NB-Domäne der n Gen und andere R Gene teilen Aminosäuresequenzhomologie mit Regionen von Zelltodgenen, CED4 in C. elegans und Apaf1, FLASH, CARD4 und Nick1 vom Menschen (van der Biezen und Jones, 1998 Arvind et al., 1999). Die NB-Domäne findet sich auch in der RAS-Gruppe, ATPasen, Elongationsfaktoren und G-Proteinfamilien von Proteinen ( Saraste et al., 1990). Diese dienen als molekulare Schalter in verschiedenen zellulären Funktionen wie Wachstum und Differenzierung. Die Rolle der NB-Region im TMV-Resistenzweg wurde durch Einführung von 20 Punktmutationen in sieben konservierten Aminosäuren über drei Subdomänen von NB evaluiert: P-Loop (Kinase1), Kinase2a und Kinase3 ( Dinesh-Kumar et al., 2000). Jede Substitution in der Invariante G216 oder K222 der P-Schleife von N führte zum Verlust der Resistenz. Es ist erwähnenswert, dass Mutationen in den G12- und G13-Aminosäuren in RAS eine wichtige Rolle bei der onkogenen Transformation spielen und diese Mutanten eine reduzierte GTPase-Aktivität aufweisen. Entsprechende Mutationen im n-Gen an den Resten G218 und G219 führte zu einem teilweisen oder vollständigen Funktionsverlust-Phänotyp. Interessanterweise sind einige dieser Mutanten dominant gegenüber dem Wildtyp n Allel. Es ist bekannt, dass die Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin in der P-Schleife an der Bindung von Mg 2+ in Verbindung mit gebundenen Nukleotiden (Pai et al., 1990). Die T223S-Substitution an der mutmaßlichen Mg 2+ -Bindungsstelle des n Gen führte zu einem partiellen Funktionsverlust-Phänotyp. Der Zeitpunkt des Auftretens der HR und die Größe der HR-Läsionen waren normal, aber das TMV breitete sich in der Pflanze aus und führte innerhalb von 5–7 Tagen zum Tod der gesamten Pflanze. Interessanterweise führte das Ersetzen von T223 durch Aspargin oder Alanin zu einem Verlust von n Funktion, was zu Mosaiksymptomen führt. Diese Allele sind jedoch dominant gegenüber den n Gen-induzierte HR- und Resistenzreaktionen. Trotz der Notwendigkeit der NB-Domäne für die Krankheitsresistenzfunktion gibt es keinen biochemischen Beweis, der eine direkte Bindung von Nukleotiden an die NB-Domäne von R-Proteinen unterstützt.


ERGEBNISSE

TMV-RNA induzierte Autophagie in HeLa-Zellen

Transfektion von TMV-RNA in HeLa-Zellen

Da es keinen Rezeptor für TMV auf menschlichen Zellmembranen gibt, konnte TMV nicht in HeLa-Zellen eindringen, wenn TMV mit HeLa-Zellen co-kultiviert wurde, CP wurde in HeLa-Zellen nicht nachgewiesen. Um intakte TMV-Partikel oder TMV-RNA in HeLa-Zellen zu importieren, verwendeten wir zwei Methoden: Elektroporation bzw. Liposomentransfektion. Nach dem Elektroporationsverfahren [27] wurden intakte TMV-Partikel durch Elektroschock mit unterschiedlichen Spannungen (0, 140, 280 und 360 V) in HeLa-Zellen umgewandelt. Western-Blotting-Ergebnisse zeigten, dass es in HeLa-Zellen, die mit 280 V behandelt wurden, etwas mehr CP-Expression gab als mit den anderen Spannungen, aber nicht hoch genug in der CP-Expression (Abbildung 1A-a). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass einige Zellen durch die starken elektrischen Ströme möglicherweise tödlich geschädigt wurden. Daraus schlossen wir, dass die Elektroporation nicht das richtige Verfahren für die TMV-Transfektion war. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass die Liposomen-Transfektionsmethode wirksamer und weniger toxisch für Zellen ist als andere Transfektionsmethoden [28]. Daher haben wir dieses Verfahren für die TMV-RNA-Transfektion verwendet. HeLa-Zellen wurden mit einer Mischung aus TMV-RNA und Liposomen in Verhältnissen von 1:1 und 1:2 für 6 h inkubiert. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass CP reichlicher im Verhältnis 1:1 als 1:2 produziert wurde (Abbildung 1A-b), was darauf hinweist, dass TMV-RNA unter Verwendung eines gleichen Anteils an Liposomen effektiv in HeLa-Zellen transfiziert werden kann. Darüber hinaus änderte sich die Morphologie der Zellen während des Inkubationsprozesses nicht. Somit haben wir einen effektiven Weg gefunden, TMV-RNA in HeLa-Zellen zu importieren, und diese Technik wurde ausschließlich in den folgenden Experimenten angewendet.

TMV-RNA induziert Autophagie in HeLa-Zellen

(EIN) Transfektion von TMV oder TMV-RNA in HeLa-Zellen. (ein) TMV wurde durch Elektroporation bei Spannungen von 0, 140, 280 und 350 in HeLa-Zellen transfiziert. Western-Blotting wurde für TMV-CP unter Verwendung von Lysaten von HeLa-Zellen durchgeführt, die 24 h lang mit TMV transfiziert wurden. (B) TMV-RNA (T-RNA) wurde in HeLa-Zellen unter Verwendung von Liposomen im Verhältnis 1:1 und 1:2 (T-RNA/Lipo) transfiziert (T-RNA/Lipo) Nur mit Liposomen behandelte HeLa-Zellen (Lipo) wurden als Negativkontrolle verwendet und diese mit Wildtyp-TMV behandelte wurden als Positivkontrolle verwendet. Western-Blotting wurde für CP unter Verwendung von Lysaten von TMV- oder HeLa-Zellen durchgeführt, die für 24 h transfiziert wurden. Bei Verhältnissen von 1:1 als 1:2 wurde mehr CP nachgewiesen. Somit war die Liposomentransfektion von TMV-RNA für HeLa-Zellen wirksamer und weniger toxisch als die Elektroporation. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (C) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der Ultrastruktur von HeLa-Zellen mit oder ohne TMV-RNA bei verschiedenen H.P.T. mal. Im Zytoplasma (Pfeilspitzen) wurden autophagische Vakuolen und saure vesikuläre Organellen beobachtet, und die Vakuolen nahmen mit zunehmender Transfektionszeit zu. Con, Kontrolle, HeLa-Zellen ohne TMV-RNA-Transfektion Lipo, nur mit Liposomen behandelte HeLa-Zellen. Maßstabsbalken: 2 µm. (D) Die durchschnittliche Anzahl von Vakuolen pro Zelle wurde in mindestens 100 zufällig ausgewählten TEM-Feldern analysiert. Maßstabsbalken: 1 µm. *P<0,001. (B) Western-Blotting wurde für LC3 unter Verwendung von Lysaten von HeLa-Zellen durchgeführt, die mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h transfiziert wurden. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (E) Ein Immunoblot-basierter LC3-Flussassay mittels Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Veränderungen des TMV-RNA-vermittelten autophagischen Flusses zu überwachen. Die Analyse von LC3 in HeLa-Zellen zeigte, dass der Prozentsatz der Zellen mit Autophagosomen deutlich zunahm, wenn sie 24 oder 48 h mit PBS (Con) oder TMV-RNA transfiziert wurden, während in Zellen, die mit 3-MA (einem Inhibitor, 5 mM). *P<0,001. Alle Ergebnisse stammen aus fünf unabhängigen Experimenten.

(EIN) Transfektion von TMV oder TMV-RNA in HeLa-Zellen. (ein) TMV wurde durch Elektroporation bei Spannungen von 0, 140, 280 und 350 in HeLa-Zellen transfiziert. Western-Blotting wurde für TMV-CP unter Verwendung von Lysaten von HeLa-Zellen durchgeführt, die 24 h lang mit TMV transfiziert wurden. (B) TMV-RNA (T-RNA) wurde in HeLa-Zellen unter Verwendung von Liposomen im Verhältnis 1:1 und 1:2 (T-RNA/Lipo) transfiziert (T-RNA/Lipo) Nur mit Liposomen behandelte HeLa-Zellen (Lipo) wurden als Negativkontrolle verwendet und diese mit Wildtyp-TMV behandelte wurden als Positivkontrolle verwendet. Western-Blotting wurde für CP unter Verwendung von Lysaten von TMV- oder HeLa-Zellen durchgeführt, die für 24 h transfiziert wurden. Bei Verhältnissen von 1:1 als 1:2 wurde mehr CP nachgewiesen. Somit war die Liposomentransfektion von TMV-RNA für HeLa-Zellen wirksamer und weniger toxisch als die Elektroporation. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (C) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der Ultrastruktur von HeLa-Zellen mit oder ohne TMV-RNA bei verschiedenen H.P.T. mal. Im Zytoplasma (Pfeilspitzen) wurden autophagische Vakuolen und saure vesikuläre Organellen beobachtet, und die Vakuolen nahmen mit zunehmender Transfektionszeit zu. Con, Kontrolle, HeLa-Zellen ohne TMV-RNA-Transfektion Lipo, nur mit Liposomen behandelte HeLa-Zellen. Maßstabsbalken: 2 µm. (D) Die durchschnittliche Anzahl von Vakuolen pro Zelle wurde in mindestens 100 zufällig ausgewählten TEM-Feldern analysiert. Maßstabsbalken: 1 µm. *P<0,001. (B) Western-Blotting wurde für LC3 unter Verwendung von Lysaten von HeLa-Zellen durchgeführt, die mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h transfiziert wurden. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (E) Ein Immunoblot-basierter LC3-Flussassay mittels Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Veränderungen des TMV-RNA-vermittelten autophagischen Flusses zu überwachen. Die Analyse von LC3 in HeLa-Zellen zeigte, dass der Prozentsatz der Zellen mit Autophagosomen deutlich zunahm, wenn sie 24 oder 48 h mit PBS (Con) oder TMV-RNA transfiziert wurden, während in Zellen, die mit 3-MA (einem Inhibitor, 5 mM). *P<0,001. Alle Ergebnisse stammen aus fünf unabhängigen Experimenten.

TMV-RNA induzierte Autophagie in HeLa-Zellen

Nachdem wir ein zuverlässiges Transfektionssystem etabliert hatten, verfolgten wir die morphologischen Veränderungen in HeLa-Zellen nach TMV-RNA-Transfektion durch Lichtmikroskopie. 24 h nach der Transfektion fanden wir, dass einige Vakuolen im Zytoplasma der HeLa-Zellen produziert wurden. Nach 72 h betrug der Vakuolenanteil mehr als 50 % pro mikroskopischem Gesichtsfeld. Um zu bestimmen, ob Autophagie nach der Transfektion ausgelöst wurde, wurde die Ultrastruktur von HeLa-Zellen, die mit TMV-RNA für 6, 24, 48 und 72 h transfiziert waren, durch TEM analysiert.Im Zytoplasma der transfizierten Zellen wurden zahlreiche Vakuolen und einige für Autophagosomen charakteristische membrangebundene Vakuolen (Pfeilspitzen) beobachtet ( 1C , T-6 h, T-24 h). Darüber hinaus nahmen typische reife Autophagosomen mit Doppelmembran-Vakuolenstrukturen mit sichtbaren zytoplasmatischen Inhalten im Laufe der Zeit zu (Abbildung 1C, T-48 h, T-72 h Abbildung 1D). Vakuolen wurden nur selten in Zellen gefunden, die nicht mit TMV-RNA transfiziert waren (Abbildung 1C, Con), und nur wenige Vakuolen wurden in Zellen beobachtet, die nur mit Liposomen inkubiert wurden (Abbildung 1C, Lipo). Das letztere Ergebnis legt nahe, dass die verabreichte Menge an Liposomen für Zellen weniger toxisch war.

Wie oben beschrieben wird LC3 als spezifischer Marker für das autophagosomale Kompartiment verwendet und die Induktion der Autophagie führt zur Prozessierung von LC3-I zu LC3-II. Um die Umwandlung von LC3-I in LC3-II nachzuweisen, wurden Zellen, die für 24, 48 und 72 h mit TMV-RNA transfiziert waren, durch Western-Blotting analysiert. Wir fanden, dass die Umwandlung von LC3-I in LC3-II gesteigert wurde, wenn die TMV-RNA-Behandlung auf 72 h verlängert wurde (Abbildung 1B). Um Veränderungen des durch TMV-RNA vermittelten autophagischen Flusses zu überwachen, wurde ein Immunoblot-basierter LC3-Fluss-Assay unter Verwendung von Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Anzahl der Autophagosomen zu quantifizieren. Wie in 1(E) gezeigt, waren Zellen mit Autophagosomen, die unter Verwendung eines FITC-konjugierten Anti-LC3-Antikörpers nachgewiesen wurden, in HeLa-Zellen nach TMV-RNA-Transfektion erhöht, während die Expression von LC3-II in den untransfizierten Zellen fast nicht nachweisbar war. Darüber hinaus wurde 3-MA, ein üblicher Inhibitor der Autophagie [29], verwendet, um die Autophagie in HeLa-Zellen zu blockieren. In TMV-RNA-transfizierten Zellen, die 24 h mit 3-MA (5 mM, Sigma) behandelt wurden, wurde die Autophagie deutlich gehemmt. Insgesamt legen diese Beobachtungen nahe, dass TMV-RNA in HeLa-Zellen Autophagie induziert.

TMV-RNA ist der Schlüsselfaktor für die Auslösung der Autophagie in HeLa-Zellen

Die Aktivierung von Autophagie-Genen ist ein kritischer Schritt bei der Bildung von Autophagosomen [17]. Um zu untersuchen, ob das Autophagie-Schlüsselgen (Beclin1) [21] während der TMV-RNA-induzierten Autophagie synergistisch aktiviert wurde, wurden Echtzeit-PCR und Western-Blotting durchgeführt, um die Nukleinsäure- bzw. Proteinspiegel von Beclin1 zu überwachen.

Die Beclin1-mRNA nahm deutlich zu, wenn die Transfektionszeit auf 72 h verlängert wurde (Abbildung 2A). Gleichzeitig akkumulierte das Beclin1-Protein innerhalb von 24 Stunden in TMV-RNA-behandelten HeLa-Zellen deutlich, und die Proteinakkumulation war viel ausgeprägter, wenn die Transfektionszeit auf 72 Stunden verlängert wurde (Abbildung 2B). Weder Beclin1-Nukleinsäure noch Beclin1-Protein wurden in HeLa-Zellen gefunden, die nicht mit TMV-RNA transfiziert waren. Um zu verifizieren, dass die Aktivierung von Beclin1 in HeLa-Zellen tatsächlich mit TMV-RNA-induzierter Autophagie assoziiert war, wurde eine humane Brustkrebs-Zelllinie, in der Beclin1 monoallel deletiert und somit reduziert exprimiert ist (MCF7-Zellen) [30] mit TMV-RNA unter Verwendung des gleichen Protokolls. Um die Expression des Beclin1-Gens in Zellen zu stören, transfizierten wir außerdem einen Beclin1-siRNA-Vektor (small interfering RNA) in HeLa-Zellen. Der Beclin1-siRNA-Vektor wurde 24 h vor der Transfektion von TMV-RNA in HeLa-Zellen transfiziert. Die Analyse der Expression von Beclin1 und LC3 in MCF7-Zellen oder HeLa-Zellen durch Western-Blotting zeigte, dass in MCF7-Zellen mit oder ohne TMV-RNA-Transfektion kein Beclin1 nachgewiesen wurde und sich das Expressionsniveau von LC3 in MCF7-Zellen nach der Transfektion nicht änderte (Abbildung 2C). Darüber hinaus war die Expression sowohl von LC3 als auch von Beclin1 in HeLa-Zellen, die sowohl mit dem Beclin1-siRNA-Vektor als auch mit TMV-RNA transfiziert waren, im Vergleich zu nur mit TMV-RNA transfizierten Zellen reduziert ( 2B und 2C ). Zusammenfassend führt die Invasion von TMV-RNA direkt zur Autophagie, und Beclin1 ist das Schlüsselgen für die Autophagie in TMV-RNA-transfizierten HeLa-Zellen.

TMV-RNA ist der Schlüsselfaktor, der Beclin1 in HeLa-Zellen aktiviert

(EIN) Echtzeit-PCR-Analyse von Beclin1-mRNA aus HeLa-Zellen, die mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 6, 24, 48 oder 72 h transfiziert wurden. Die Beclin1-mRNA stieg deutlich an. *P<0,001. (B) Western-Blot-Analyse von Beclin1 unter Verwendung von Lysaten aus HeLa-Zellen, die mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h transfiziert wurden. Beclin1 wurde aktiviert und erhöht, wenn die Transfektionszeit verlängert wurde. (C) Western-Blot-Analyse von Beclin1 und LC3 unter Verwendung von Lysaten aus HeLa-Zellen, die mit TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h in Gegenwart eines Beclin1-siRNA-Vektors transfiziert wurden. MCF7-Zellen wurden auch 24 h lang mit PBS (Con) oder TMV-RNA transfiziert. Weder die Expression von Beclin1 noch die Umwandlung von LC3-I in LC3-II unterschieden sich signifikant zwischen MCF7-Zellen und HeLa-Zellen. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet.

(EIN) Echtzeit-PCR-Analyse von Beclin1-mRNA aus HeLa-Zellen, die mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 6, 24, 48 oder 72 h transfiziert wurden. Die Beclin1-mRNA stieg deutlich an. *P<0,001. (B) Western-Blot-Analyse von Beclin1 unter Verwendung von Lysaten aus HeLa-Zellen, die mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h transfiziert wurden. Beclin1 wurde aktiviert und erhöht, wenn die Transfektionszeit verlängert wurde. (C) Western-Blot-Analyse von Beclin1 und LC3 unter Verwendung von Lysaten aus HeLa-Zellen, die mit TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h in Gegenwart eines Beclin1-siRNA-Vektors transfiziert wurden. MCF7-Zellen wurden auch 24 h lang mit PBS (Con) oder TMV-RNA transfiziert. Weder die Expression von Beclin1 noch die Umwandlung von LC3-I in LC3-II unterschieden sich signifikant zwischen MCF7-Zellen und HeLa-Zellen. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet.

Um weitere direkte morphologische Beweise für die Verbindungen zwischen TMV-Proteinen und den intrazellulären autophagischen Vakuolen zu erhalten, wurde eine Immunelektronenmikroskopie durchgeführt. Immunogold-Partikel, die TMV-Proteine ​​identifizieren, präsentierten sich hauptsächlich auf den Membranen von Autophagosomen 24 h nach der Transfektion (Abbildung 3A-b), als die Zeit auf 48 h verlängert wurde, akkumulierten die Immunogold-Partikel deutlich auf oder um die Membranen von Autophagosomen (Abbildung 3A-c). In nicht transfizierten Zellen wurden weder Immungoldpartikel noch Autophagosomen gefunden (Abbildung 3A-a).

Elektronenmikroskopische Aufnahmen, die das TMV-Protein auf und um autophagosomale Membranen zeigen

(EIN) Immunelektronenmikroskopie von HeLa-Zellen, die mit PBS (Con, ein) oder TMV-RNA für 24 (T-24 h, B) oder 48 h (T-48 h, C). (B) TP (TMV-Protein) Immunogoldpartikel waren meist auf autophagosomalen Membranen vorhanden (EIN, Autophagosom). (C) TP-Immunogold-Partikel (TP, Pfeilspitzen), die sich auf und um autophagosomale Membranen ansammeln (EIN, Autophagosom). Maßstabsbalken: 0,5 µm, 100 nm (wie in den Vergrößerungen angegeben). (B) Ultrastruktur von HeLa-Zellen durch EM. Verdacht auf TMV-Virionen (B, T, Pfeilspitzen), deren Struktur den TMV-Virionen in Tabakblättern ähnelt (ein, Tabak, T), in paralleler Form ausgerichtet und um zytosolische Vakuolen akkumuliert. Maßstabsbalken: 1 µm, 200 nm (wie in den Vergrößerungen angegeben).

(EIN) Immunelektronenmikroskopie von HeLa-Zellen, die mit PBS (Con, ein) oder TMV-RNA für 24 (T-24 h, B) oder 48 h (T-48 h, C). (B) TP (TMV-Protein) Immunogoldpartikel waren meist auf autophagosomalen Membranen vorhanden (EIN, Autophagosom). (C) TP-Immunogold-Partikel (TP, Pfeilspitzen), die sich auf und um autophagosomale Membranen ansammeln (EIN, Autophagosom). Maßstabsbalken: 0,5 µm, 100 nm (wie in den Vergrößerungen angegeben). (B) Ultrastruktur von HeLa-Zellen durch EM. Verdacht auf TMV-Virionen (B, T, Pfeilspitzen), deren Struktur den TMV-Virionen in Tabakblättern ähnelt (ein, Tabak, T), in paralleler Form ausgerichtet und um zytosolische Vakuolen akkumuliert. Maßstabsbalken: 1 µm, 200 nm (wie in den Vergrößerungen angegeben).

Als erste Studie zur Untersuchung der Invasion von TMV in humane Zellen hofften wir, intakte TMV-Partikel in HeLa-Zellen zu finden, wenn TMV die Fähigkeit hätte, der Immunabwehr zu entkommen und nicht vom Lysosom verdaut zu werden. Tatsächlich beobachteten wir mittels TEM vermutete TMV-Virionen in HeLa-Zellen. Wie in Abbildung 3(B-b) gezeigt, richteten sich die vermuteten TMV-Virionen in einer parallelen Form aus und sammelten sich um die Vakuolen. Die Virionen ähnelten Fadenbündeln, die in das zelluläre Zytoplasma eingelegt waren. Die beobachteten Merkmale ähnelten den TMV-Virionen, die in Tabakblättern beobachtet wurden [31] (Abbildung 3B-a), sodass wir schlossen, dass TMV-RNA in HeLa-Zellen replizieren kann.

Der potenzielle Mechanismus der TMV-RNA-induzierten Autophagie in HeLa-Zellen

Basierend auf den obigen überraschenden Beobachtungen führten wir weitere Experimente durch, um unsere Hypothese zu untermauern. Wie oben erwähnt, funktioniert die genomische Struktur der TMV-RNA wie die der mRNA, indem sie direkt in Proteine ​​übersetzt werden kann. TMV kann das ER des Wirts als primären Ort der Hüll-Glycoprotein-Biogenese, der genomischen Replikation und des Partikelaufbaus nutzen. Wenn die Translation von TMV-RNA im ER stattfand, würde die Akkumulation von TMV-Protein unweigerlich zu zellulären Stressreaktionen wie ERS führen, die die Autophagie in HeLa-Zellen fördern können. Um diese Annahme zu überprüfen, wurden drei Ansätze verfolgt.

TMV-RNA wird in der ER-Membran von HeLa-Zellen translatiert

In eukaryontischen Zellen werden mRNAs zwischen den zytosolischen und ER-Kompartimenten aufgeteilt. Wie in aktuellen Modellen beschrieben, wird dieser allgegenwärtige mRNA-Partitionierungsprozess durch einen cotranslationalen Zyklus der Ribosomenbindung und -freisetzung in das ER angetrieben. Kurz gesagt, alle mRNAs werden im Zytosol translatiert. Zu Beginn der Synthese werden diejenigen mRNA/RNCs (Ribosom/naszierende Polypeptidketten-Komplexe), die an der Synthese von sekretorischen/Membranproteinen beteiligt sind, aufgrund des Vorhandenseins eines SRP (Signal Recognition Particle) zum ER transportiert [32]. Daher versuchten wir zu bestimmen, ob TMV-RNA durch einen cotranslationalen Zyklus der Ribosomenbindung und Translation von Proteinen im ER angetrieben wurde und die Position der TMV-RNA zu bestätigen.

Nach der Transfektion von TMV-RNA für 24, 48 und 72 h wurden Zelllysate geerntet und zum Nachweis von Proteinen durch Western-Blotting verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass TMV-RNA in CP translatiert wurde CP innerhalb von 24 h in TMV-RNA-behandelten HeLa-Zellen deutlich erhöht und die Akkumulation des Proteins nahm weiter zu, wenn die Transfektionszeit auf 72 h verlängert wurde, während es in HeLa . nicht nachweisbar war Zellen, die nicht mit TMV-RNA transfiziert waren (Fig. 4A). In Anbetracht der hohen Expressionsrate von CP in HeLa-Zellen schlossen wir, dass TMV der Immunabwehr entkommen könnte. Um zu bestimmen, ob TMV-RNA im ER translatiert wurde, isolierten wir das ER aus HeLa-Zellen, die mit TMV-RNA für 24, 48 und 72 h transfiziert waren. Die Analyse von CP in der ER-Fraktion durch Western-Blotting zeigte, dass das Expressionsniveau von CP deutlich anstieg, wenn die Zeit auf 72 h verlängert wurde ( 4A ). Um weiter zu bestätigen, ob CP im ER lokalisiert war und um die Position der TMV-RNA zu beobachten, führten wir nacheinander Immunfluoreszenz- (IF) und FISH-Techniken durch [25]. TMV-positive RNA und Proteine ​​wurden identifiziert vor Ort durch konfokale Mikroskopie in Zellen, die durch ein Protokoll fixiert wurden, das die native Zellgröße und -form beibehalten soll. Die TMV-positive RNA wurde durch FISH mit einer strangspezifischen Sonde sichtbar gemacht, die mit einem Cy3-Fluorochrom (rot) markiert war. CP wurde unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-CP-Antikörpers und eines entsprechenden sekundären Antikörpers (Alexa Fluor® 488 Anti-Kaninchen-Antikörper) (grün) nachgewiesen und das ER wurde mit ER-Tracker (blau, Invitrogen) gefärbt. Wie in 4(B) gezeigt, zeigten blaue, rote und grüne Fluoreszenz die Positionen des ER, der TMV-positiven RNA bzw. CP in mit TMV-RNA für 48 h transfizierten HeLa-Zellen an [H.P.T. (Stunden nach Transfektion) 48 h]. Wir beobachteten, dass CP (grün) tatsächlich als kleine, unregelmäßig große Granula im ER akkumulierte, während TMV-RNA (rot) selten im ER auftrat, aber im Nukleolus angereichert war. Weder CP- noch TMV-positive RNA wurde in Zellen gefunden, die nicht mit TMV-RNA transfiziert waren (Fig. 4C-c).

TMV-RNA wird in CP übersetzt und erhöht das ER von HeLa-Zellen weiter

(EIN) Westernblot von CP unter Verwendung von Lysaten aus HeLa-Zellen [transfiziert mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h] oder der ER-Fraktion von HeLa-Zellen (transfiziert mit TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h) . TMV-RNA wurde in HeLa-Zellen in CP übersetzt und im ER akkumuliert, als die Transfektionszeit auf 72 h verlängert wurde. (B) Kombinierter IF und RNA-FISH zum Nachweis von CP und TMV-positiver RNA. HeLa-Zellen wurden mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 48 h transfiziert. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert, um CP unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-CP-Antikörpers und eines entsprechenden sekundären Antikörpers (Alexa Fluor® 488 Anti-Kaninchen-Antikörper) (grün) nachzuweisen. Dieselben Zellen wurden dann für die FISH-Analyse behandelt. Die Zellen wurden mit einer mit einem Cy3-Fluorochrom (rot) markierten Sonde hybridisiert, um TMV-positive RNA nachzuweisen (B-c, T-RNA). Das ER wurde mit einem ER-Tracker (blau, B-d C-b, ER). Die Zellen wurden dann durch konfokale Mikroskopie beobachtet. (ein) HeLa-Zellen (B, C), DIC (Differenzinterferenzkontrast) CP (grün, B-b) blieb weitgehend in der Notaufnahme (Sei: zusammengeführt B und D) TMV-positive RNA (rot, B-c, T-RNA,) war selten auf dem ER lokalisiert (B-f: zusammengeführt C und D), aber es erschien im Kern. (C) Weder CP- noch TMV-positive RNA wurde in mit PBS transfizierten Zellen gefunden (C-c) (Maßstab: 10 µm).

(EIN) Westernblot von CP unter Verwendung von Lysaten aus HeLa-Zellen [transfiziert mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h] oder der ER-Fraktion von HeLa-Zellen (transfiziert mit TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h) . TMV-RNA wurde in HeLa-Zellen in CP übersetzt und im ER akkumuliert, als die Transfektionszeit auf 72 h verlängert wurde. (B) Kombinierter IF und RNA-FISH zum Nachweis von CP und TMV-positiver RNA. HeLa-Zellen wurden mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 48 h transfiziert. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert, um CP unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-CP-Antikörpers und eines entsprechenden sekundären Antikörpers (Alexa Fluor® 488 Anti-Kaninchen-Antikörper) (grün) nachzuweisen. Dieselben Zellen wurden dann für die FISH-Analyse behandelt. Die Zellen wurden mit einer mit einem Cy3-Fluorochrom (rot) markierten Sonde hybridisiert, um TMV-positive RNA nachzuweisen (B-c, T-RNA). Das ER wurde mit einem ER-Tracker (blau, B-d C-b, ER). Die Zellen wurden dann durch konfokale Mikroskopie beobachtet. (ein) HeLa-Zellen (B, C), DIC (Differenzinterferenzkontrast) CP (grün, B-b) blieb weitgehend in der Notaufnahme (Sei: zusammengeführt B und D) TMV-positive RNA (rot, B-c, T-RNA,) war selten auf dem ER lokalisiert (B-f: zusammengeführt C und D), aber es erschien im Kern. (C) Weder CP- noch TMV-positive RNA wurde in mit PBS transfizierten Zellen gefunden (C-c) (Maßstab: 10 µm).

Als nächstes verwendeten wir eine nicht verwandte Sonde als negative Kontrolle, um die Position der TMV-positiven RNA zu überprüfen. Zellen, die 24 und 48 h mit TMV-RNA transfiziert waren, wurden fixiert und unter Verwendung der gleichen IF- und RNA-FISH-Techniken analysiert, der einzige Unterschied bestand darin, dass anstelle des ER-Färbeschritts Zellkerne mit DAPI (blau, Invitrogen) gefärbt wurden. Somit stellte blaue Fluoreszenz die Lage des Zellkerns in Abbildung 5 dar. Als wir die Zellen nach der TMV-RNA-Transfektion für 24 h überwachten, wurde TMV-positive RNA (rot) in den Zellen als kleine, unregelmäßig große Körnchen gefunden (Abbildung 5B, HPT 24 h), die sich dann nach 48 h als hochdichtes Granulat im Zellkern ansammelte (Abbildung 5C, HPT 48 h). Darüber hinaus war CP (grün) um den Zellkern herum lokalisiert und reicherte sich innerhalb von 48 h im Zytoplasma an. Im Gegensatz dazu konnte TMV-positive RNA nicht in Zellen nachgewiesen werden, die mit TMV-RNA transfiziert waren, die mit einer nicht verwandten Sonde hybridisiert wurden (Fig. 5A-c, Con). Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass TMV-RNA intrazelluläre Ribosomen verwendet, um virale Proteine ​​im ER zu synthetisieren, und dass sich die positive RNA im Kern lokalisiert, um andere Funktionen auszuführen. Dieses Ergebnis könnte unser vorheriges Ergebnis erklären (Abbildung 3B-b), das das Vorhandensein von vermuteten TMV-Virionen in HeLa-Zellen zeigte.

Akkumulation von TMV-positiver RNA in HeLa-Zellkernen

IF und RNA-FISH wurden kombiniert, um die Position von TMV-positiver RNA zu überprüfen. HeLa-Zellen wurden mit TMV-RNA für 24 (EIN, B, H.P.T. 24 h) oder 48 h nach Transfektion (C, H.P.T. 48 h) und dann fixiert und mit einer nicht verwandten Sonde hybridisiert (EIN, Con) oder eine strangspezifische Sonde (B, C). Abgesehen von der blauen Fluoreszenz, die den Zellkern anzeigt (gefärbt mit DAPI, A-b, B-d, C-d, blau) anstelle des ER (Abbildung 4), die anderen Färbungen waren die gleichen wie in Abbildung 4 (A), (A–C), HeLa-Zellen, DIC (differentieller Interferenzkontrast) CP (B-b, C-b, grün) wurde innerhalb von 48 h konsistent im Zytoplasma gefunden (B-e, C-e, zusammengeführt B und D). Bei 24 H.P.T. TMV-positive RNA (B-c, T-RNA, rot) wurde in der gesamten Zelle verteilt und reicherte sich größtenteils um den Zellkern an (B-f, zusammengeführt C und D). Da die Zeit auf 48 h verlängert wurde, wurde TMV-positive RNA (C-c, T-RNA, rot) akkumuliert in HeLa-Zellkernen (C-f, zusammengeführt C und D). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass TMV-positive RNA nach und nach aus dem Zytoplasma in den Zellkern transportiert wurde (insbesondere im Nucleolus akkumuliert), während sie nicht in mit TMV-RNA transfizierten Zellen gefunden wurde, sondern stattdessen mit einer nicht verwandten Sonde hybridisierte, die mit dem Cy3-Fluorochrom markiert war (A-c) (Maßstab: 10 µm).

IF und RNA-FISH wurden kombiniert, um die Position der TMV-positiven RNA zu überprüfen. HeLa-Zellen wurden mit TMV-RNA für 24 (EIN, B, H.P.T. 24 h) oder 48 h nach Transfektion (C, H.P.T. 48 h) und dann fixiert und mit einer nicht verwandten Sonde hybridisiert (EIN, Con) oder eine strangspezifische Sonde (B, C). Abgesehen von der blauen Fluoreszenz, die den Zellkern anzeigt (gefärbt mit DAPI, A-b, B-d, C-d, blau) anstelle des ER (Abbildung 4), die anderen Färbungen waren die gleichen wie in Abbildung 4 (A), (A–C), HeLa-Zellen, DIC (Differential-Interferenz-Kontrast) CP (B-b, C-b, grün) wurde innerhalb von 48 h konsistent im Zytoplasma gefunden (B-e, C-e, zusammengeführt B und D). Bei 24 H.P.T. TMV-positive RNA (B-c, T-RNA, rot) wurde in der gesamten Zelle verteilt und reicherte sich größtenteils um den Zellkern an (B-f, zusammengeführt C und D). Da die Zeit auf 48 h verlängert wurde, wurde TMV-positive RNA (C-c, T-RNA, rot) akkumuliert in HeLa-Zellkernen (C-f, zusammengeführt C und D). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass TMV-positive RNA nach und nach aus dem Zytoplasma in den Zellkern transportiert wurde (insbesondere im Nucleolus akkumuliert), während sie nicht in mit TMV-RNA transfizierten Zellen gefunden wurde, sondern stattdessen mit einer nicht verwandten Sonde hybridisierte, die mit dem Cy3-Fluorochrom markiert war (A-c) (Maßstab: 10 µm).

TMV-RNA-induzierte ERS

Das ursprüngliche Ziel der ERS-Antwort besteht darin, gestresste Zellen zu schützen, indem die Homöostase wiederhergestellt oder die schädlichen Folgen einer Verletzung auf andere Weise neutralisiert werden. Hier fanden wir, dass TMV-RNA die Akkumulation von CP im ER fördert. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die Akkumulation dieses Proteins ERS in HeLa-Zellen induzierte.

Um diese Hypothese zu testen, haben wir die Expression von GRP78, einem Marker für ERS, sowohl in Ganzzell- als auch in ER-Fraktionen untersucht.Western-Blotting-Ergebnisse zeigen, dass sich GRP78 innerhalb von 24 Stunden sowohl in den Ganzzell- als auch in den ER-Fraktionen akkumuliert und sein Spiegel deutlich ansteigt, wenn die Transfektionszeit auf 72 Stunden verlängert wurde. Im Gegensatz dazu wurde keine Akkumulation von GRP78 in HeLa-Zellen beobachtet, die nicht mit TMV-RNA transfiziert waren ( 6A ). Diese Daten zeigen, dass TMV-RNA ERS induziert, die Akkumulation von TMV-Protein im ER induziert ERS und aktiviert GRP78, um an ungefaltete Proteine ​​(wie CP) zu binden, wodurch ihre Faltungskapazität erhöht wird. Sobald die Fülle dieser ungefalteten Proteine ​​die Kapazität von GRP78 übersteigt, würde ERS eine Reihe von Ereignissen wie Autophagie auslösen, um die normale Zellfunktion wiederherzustellen.

GRP78, ein Marker von ERS, wird aktiviert und reichert sich im ER an, und elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die Bildung von Autophagosomen mit der Expansion der ER-Membran verbunden ist

(EIN) Western Blotting für GRP78 unter Verwendung von Lysaten aus HeLa-Zellen [transfiziert mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h] oder der ER-Fraktion von HeLa-Zellen (transfiziert mit TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h) zeigten, dass GRP78 in HeLa-Zellen stark exprimiert wurde und sich hauptsächlich im ER anhäufte, wenn die Transfektionszeit auf 72 h verlängert wurde. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (H.P.T., Stunden nach der Transfektion). (B) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen, die die Ultrastruktur von HeLa-Zellen zeigen, die entweder mit PBS (ein, Con) oder TMV-RNA für 48 h. Die Analyse dieser mikroskopischen Aufnahmen ergab, dass sich die meisten ER-Membranen in TMV-RNA-transfizierten Zellen in einem Expansionszustand befanden und zahlreiche Vakuolen, einschließlich naszierender Vakuolen und typischer Autophagosomen mit Doppelmembran-Vakuolenstrukturen, die sichtbaren zytoplasmatischen Inhalt enthielten, um das expandierte ER. Das distale Ende der ER-Membran dehnte sich aus und ähnelte geschwollenen Fingern oder Gabeln, was bei Kontrollen selten beobachtet wurde (ein). Wie in den Bildern zu sehen, dehnte sich das distale Ende der ER-Membran in Richtung der vorderen Vakuole (B, Kasten) Eine ER-Membran, die sich zu geschwollenen Fingern ausdehnte, könnte gerade eine Vakuole (C, Kasten, Pfeilspitzen) ein weiteres distales Ende der ER-Membran expandierte in Richtung der vorderen Vakuole und schien diese einzukapseln (D, Kasten). Das andere distale Ende der expandierten ER-Membran hat gerade eine Vakuole (D, Pfeilspitzen), und die ER-Membran war so stark aufgeweitet, dass sie möglicherweise mehr Vakuolen erzeugt haben könnte (e, Pfeilspitzen). Entstehende Vakuolen, die aus dem Endpunkt der expandierten ER-Membranen (F, Kasten, Pfeilspitzen) und Fusionsereignisse könnten zwischen Lysosomen und autophagischen Vakuolen aufgetreten sein (F, Kasten). Schließlich bildete sich im Zytoplasma ein riesiges Autolysosom, partielle ER-Membranen erweiterten sich zu Gabeln (g, zwei kleine Kästen) und eine Vakuole wurde gerade von anderen partiellen ER-Membranen sequestriert (g, Pfeilspitzen) (Maßstab: 2 µm). Aus diesen mikroskopischen Aufnahmen gehen wir davon aus, dass ERS die Expansion des ER stimulierte, was zur Bildung von Autophagosomen führte.

(EIN) Western Blotting für GRP78 unter Verwendung von Lysaten aus HeLa-Zellen [transfiziert mit PBS (Con) oder TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h] oder der ER-Fraktion von HeLa-Zellen (transfiziert mit TMV-RNA für 24, 48 oder 72 h) zeigten, dass GRP78 in HeLa-Zellen stark exprimiert wurde und sich hauptsächlich im ER anhäufte, wenn die Transfektionszeit auf 72 h verlängert wurde. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (H.P.T., Stunden nach der Transfektion). (B) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen, die die Ultrastruktur von HeLa-Zellen zeigen, die entweder mit PBS (ein, Con) oder TMV-RNA für 48 h. Die Analyse dieser mikroskopischen Aufnahmen ergab, dass sich die meisten ER-Membranen in TMV-RNA-transfizierten Zellen in einem Expansionszustand befanden und zahlreiche Vakuolen, einschließlich naszierender Vakuolen und typischer Autophagosomen mit Doppelmembran-Vakuolenstrukturen, die sichtbaren zytoplasmatischen Inhalt enthielten, um das expandierte ER. Das distale Ende der ER-Membran dehnte sich aus und ähnelte geschwollenen Fingern oder Gabeln, was bei Kontrollen selten beobachtet wurde (ein). Wie in den Bildern zu sehen, dehnte sich das distale Ende der ER-Membran in Richtung der vorderen Vakuole (B, Kasten) Eine ER-Membran, die sich zu geschwollenen Fingern ausdehnte, könnte gerade eine Vakuole (C, Kasten, Pfeilspitzen) ein weiteres distales Ende der ER-Membran expandierte in Richtung der vorderen Vakuole und schien diese einzukapseln (D, Kasten). Das andere distale Ende der expandierten ER-Membran hat gerade eine Vakuole (D, Pfeilspitzen), und die ER-Membran war so stark aufgeweitet, dass sie möglicherweise mehr Vakuolen erzeugt haben könnte (e, Pfeilspitzen). Entstehende Vakuolen, die aus dem Endpunkt der expandierten ER-Membranen (F, Kasten, Pfeilspitzen) und Fusionsereignisse könnten zwischen Lysosomen und autophagischen Vakuolen aufgetreten sein (F, Kasten). Schließlich bildete sich im Zytoplasma ein riesiges Autolysosom, partielle ER-Membranen erweiterten sich zu Gabeln (g, zwei kleine Kästen) und eine Vakuole wurde gerade von anderen partiellen ER-Membranen sequestriert (g, Pfeilspitzen) (Maßstab: 2 µm). Aus diesen mikroskopischen Aufnahmen gehen wir davon aus, dass ERS die Expansion des ER stimulierte, was zur Bildung von Autophagosomen führte.

ERS ist der wahrscheinliche Auslöser für Autophagie

Die Autophagie wird allmählich als wichtiger Akteur bei den Entscheidungen über Leben und Tod der ERS-Reaktion anerkannt. Die Kontrollmechanismen dieser Prozesse sind nicht vollständig verstanden und stehen im Fokus vieler laufender Untersuchungen. Mehrere Berichte haben gezeigt, dass ERS die Autophagie aktivieren kann und umgekehrt die Blockierung der Autophagie den ERS-induzierten Zelltod verstärken kann [33]. In neueren Immunelektronenmikroskopie-Studien hat Dunn berichtet, dass Autophagosomen, die aus vorbestehendem ER stammen, während der Reifung zu Autolysosomen schrittweise lysosomale Marker erwerben. Dunn teilte Vakuolen auch morphologisch und zytochemisch in zwei Gruppen ein: (i) entstehende autophagische Vakuolen (oder Autophagosomen) und (ii) abbauende autophagische Vakuolen (oder Autolysosomen) [34,35]. Hier zeigten wir, dass die Invasion von TMV-RNA nicht nur Autophagie auslöste, sondern auch ERS in HeLa-Zellen induzierte. Um den Zusammenhang zwischen Autophagie und ERS weiter aufzuklären, untersuchten wir die morphologischen Veränderungen der Zellen mittels EM.

Zunächst deutete die EM-Analyse darauf hin, dass die autophagosomale Membran auf ultrastruktureller Ebene von der ER-Membran stammen könnte. Wie in Abbildung 6(B) gezeigt, befanden sich die meisten ER-Membranen in TMV-RNA-transfizierten Zellen in einem Expansionszustand, und zahlreiche Vakuolen, einschließlich naszierender Vakuolen und typischer Autophagosomen mit einer Doppelmembran-Vakuolenstruktur, die sichtbaren zytoplasmatischen Inhalt enthielten, erschien um das erweiterte ER. Die entstehenden Vakuolen schienen von den Enden der ER-Membranen (Pfeilspitzen) gebildet zu werden, und sie dehnten sich auf einigen Bildern aus, um geschwollenen Fingern zu ähneln. Solche Strukturen könnten transportiert werden, um Autophagosomen zu bilden. Einige Bilder zeigten auch, dass sich die ER-Membran so ausdehnte, dass sie Gabeln ähnelte, die sich in Richtung der vorderen Vakuole erstrecken (Abbildungen 6B-b, 6B-d und 6B-g), was darauf hindeutet, dass partielle ER-Membranen verwendet werden könnten, um Phagophoren zu bilden, Strukturen, die mit a . fusionieren entstehende Vakuole. Weder autophagische Vakuolen noch die Expansion des ER wurden in Zellen gefunden, die nicht mit TMV-RNA transfiziert waren (Fig. 6B-a). Zusammengefasst gibt es eine Reihe interessanter Ereignisse, die am distalen Ende der ER-Membran auftreten, die sich wie geschwollene Finger oder Gabeln ausdehnt, was darauf hindeuten könnte, dass die Zellen durch die TMV-RNA stimuliert und in einen ERS-Zustand induziert wurden. Dieses Phänomen der ER-Membranexpansion wurde in Zellen nicht gefunden, die nicht mit TMV-RNA transfiziert waren (Fig. 6B-a).

Wie gezeigt, könnte die ER-Membran, die geschwollenen Fingern ähnelt, gerade eine Vakuole erzeugt haben (Abbildung 6B-c, Pfeilspitzen). Membranende erweiterte sich in Richtung der vorderen Vakuole und schien diese einzukapseln (Abbildung 6B-d). Darüber hinaus wurde das andere distale Ende der expandierten ER-Membran in einer Vakuole sequestriert (Abbildung 6B-d, Pfeilspitzen). Die ER-Membran expandierte so stark, dass sie möglicherweise mehr Vakuolen produziert haben könnte (Abbildung 6B-e, Pfeilspitzen), wobei entstehende Vakuolen aus den Endpunkten der expandierten ER-Membranen hervortreten (Abbildung 6B-f, Pfeilspitzen). Darüber hinaus könnten Fusionsereignisse zwischen Lysosomen und autophagischen Vakuolen aufgetreten sein (Abbildung 6B-f, Ausschnitt). Schließlich bildete sich im Zytoplasma ein riesiges Autolysosom, einige partielle ER-Membranen expandierten zu Gabeln, die sich zur Vakuole hin erstreckten (Abbildung 6B-g, zwei kleine Scheiben) und eine Vakuole war gerade aus anderen partiellen ER-Membranen hergestellt worden (Abbildung 6B-g, Pfeilspitzen). Basierend auf diesen Daten schien es, dass der Prozess der Autophagie, einschließlich der Reifung und Bildung von Autophagosomen, für die Expansion der ER-Membran erforderlich war. Daher bestätigten alle diese Beobachtungen, dass die Membranen von TMV-RNA-verwandten autophagischen Vakuolen an ER-Membranen angrenzen oder von diesen stammen könnten. Dieses Ergebnis erklärt, warum bei Verlängerung der Transfektionszeit immer mehr Vakuolen auftraten und sich um die expandierten ER-Membranen akkumulierten. Wir gehen davon aus, dass sich das distale Ende der ER-Membran unter ERS ausdehnt, um die Umwandlung in mehr Vakuolen zu maximieren, die, wenn sie von einer einschichtigen Membran eingekapselt werden, Phagophoren genannt werden (die sich aus teilweise expandierten ER-Membranen bilden könnten, siehe Abbildungen 6B-c, 6B -d und Bf). Wenn sich erweiterte Phagophor-Zisternen um einen Teil des Zytoplasmas und/oder der Organellen wickeln, wird die Autophagie ausgelöst. Während des autophagosomalen Reifungsprozesses wird das segregierte Zytoplasma, das von einem Phagophor verschlungen wird, durch Fusionsereignisse zwischen Autophagosomen und endosomalen und/oder lysosomalen Vesikel an das endo-/lysosomale Lumen abgegeben. Sowohl das Zytoplasma als auch die umgebende Membran werden dann von lysosomalen Hydrolasen abgebaut und die Abbauprodukte werden in das Zytoplasma zurücktransportiert, wo sie für den Stoffwechsel wiederverwendet werden können. Zusammen mit unseren Daten führt die durch ERS induzierte Expansion des ER zur Bildung von Autophagosomen in TMV-RNA-transfizierten HeLa-Zellen.

Diese Studien liefern einige Hinweise auf den Weg der TMV-RNA-induzierten Autophagie. Sobald die TMV-RNA in HeLa-Zellen eindringt, synthetisiert sie zunächst Proteine ​​im ER, wie durch CP im ER nachgewiesen wird. Mit der Ansammlung von TMV-Proteinen im ER erfahren die Zellen ERS und aktivieren ER-Chaperone (wie GRP78 im ER-Lumen), um die Proteinfaltungskapazität zu erhöhen. Wenn genügend TMV-Proteine ​​produziert werden, so dass die Kapazität von GRP78 überschritten wird, stimuliert ERS die Enden der ER-Membranen, sich auszudehnen, um die Sequestrierung in Vakuolen zu maximieren, in denen TMV-Proteine ​​(wie CP) produziert werden könnten. Diese neuen Vakuolen werden schnell von Phagophoren umhüllt (die wahrscheinlich auch aus dem ER stammen und wie die Gabeln in unseren elektronenmikroskopischen Bildern aussehen), die weiter Autophagosomen bilden. Schließlich bilden sich durch die Fusion von Autophagosomen und Lysosomen Autolysosomen, um den vakuolären Inhalt zu verdauen. Letztere Behauptung wird durch unsere Hinweise auf die Akkumulation von TMV-Proteinen auf und um autophagosomale Membranen, durch den erhöhten CP im ER und durch die Anreicherung von TMV-positiver RNA im Nukleolus gestützt. Zusammenfassend induziert TMV-RNA ERS-bezogene Autophagie in HeLa-Zellen, und ein potenzieller Abwehrmechanismus, der ERS und ERS-bezogene Autophagie umfasst, die von HeLa-Zellen gegen TMV-RNA verwendet wird, ist in Abbildung 7 modelliert.

Schematische Darstellung des potenziellen ERS-bezogenen autophagischen Abwehrmechanismus, der von HeLa-Zellen gegen TMV-RNA . genutzt wird

Nachdem TMV-RNA in HeLa-Zellen eingetreten ist, wird sie von Ribosomen, die sich auf der ER-Membran befinden, in Protein übersetzt. TMV-Proteine ​​wie CP werden wahrscheinlich als fremde oder ungefaltete Proteine ​​im ER-Lumen erkannt und lösen ERS aus. GRP78 ist ein Marker von ERS, wird stark exprimiert und fungiert als Chaperon, um die Faltung von CP zu unterstützen. Wenn die Menge an CP zu groß ist, könnte GRP78 CP verlassen und das distale Ende der ER-Membranen stimulieren, sich auszudehnen und anzuschwellen, um CP in Vakuolen zu sequestrieren. Diese neuen Vakuolen würden schnell von Phagophoren umhüllt, die wahrscheinlich aus dem ER stammen. Diese neuen Phagophoren ähneln Gabeln, die sich in Richtung der Vakuole erstrecken, und sie verschlingen diese, um die Reifung zu Doppelmembran-Autophagosomen zu fördern. Schließlich werden Autophagosomen durch Fusion mit einem Lysosom zu Autolysosomen mit Monomembranstruktur. Der Großteil der CP-Last ist abgebaut. In einem alternativen Weg wird CP möglicherweise nicht abgebaut und erreicht stattdessen eine Immunflucht durch einen unbekannten molekularen Mechanismus.

Nachdem TMV-RNA in HeLa-Zellen eingetreten ist, wird sie von Ribosomen, die sich auf der ER-Membran befinden, in Protein übersetzt. TMV-Proteine ​​wie CP werden wahrscheinlich als fremde oder ungefaltete Proteine ​​im ER-Lumen erkannt und lösen ERS aus. GRP78 ist ein Marker von ERS, wird stark exprimiert und fungiert als Chaperon, um die Faltung von CP zu unterstützen. Wenn die Menge an CP zu groß ist, könnte GRP78 CP verlassen und das distale Ende der ER-Membranen stimulieren, sich auszudehnen und anzuschwellen, um CP in Vakuolen zu sequestrieren. Diese neuen Vakuolen würden schnell von Phagophoren umhüllt, die wahrscheinlich aus dem ER stammen. Diese neuen Phagophoren ähneln Gabeln, die sich in Richtung der Vakuole erstrecken, und sie verschlingen diese, um die Reifung zu Doppelmembran-Autophagosomen zu fördern. Schließlich werden Autophagosomen durch Fusion mit einem Lysosom zu Autolysosomen mit Monomembranstruktur. Der Großteil der CP-Last ist abgebaut. In einem alternativen Weg wird CP möglicherweise nicht abgebaut und erreicht stattdessen eine Immunflucht durch einen unbekannten molekularen Mechanismus.


MATERIALEN UND METHODEN

Pflanzenmaterialien, Virusstämme und Virusimpfungen

Nicotiana tabacum und Nicotiana Benthamiana wurden wie beschrieben angebaut (Harries et al., 2008). In einigen Studien wurden gereinigtes Virus (TMV) U1-Stamm (Shintaku et al., 1996)] oder Viren aus Pflanzenextrakten TVCV, CMV und PVX (Yang et al., 2004) verwendet. Pflanzenextrakte, die TVCV, CMV oder PVX enthielten, wurden durch Mahlen von infiziertem Blattgewebe in flüssigem Stickstoff und anschließende Zugabe von ungefähr 2 Volumina 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH 7) erhalten. Rohextrakte oder gereinigter TMV U1-Stamm, verdünnt mit Phosphatpuffer, wurden dann direkt auf mit Carborundum (330 grit, Fisher) bestäubte Pflanzen inokuliert, wie beschrieben (Ding et al., 1998). Zusätzliche Studien wurden unter Verwendung von Plasmiden durchgeführt, die für TMV kodieren. MP.GFP. CP (früher als TMV-MP-GFP-CP bezeichnet), TMV. MP-GFP (früher als TMV-MP:GFP bezeichnet) und TMV. MP-GFP. CP (früher als TMV-MP:GFP-CP bezeichnet Cheng et al., 2000 Liu et al., 2005) und TVCV-GFP, TBSV-GFP und PVX-GFP (Quellen beschrieben in Harries et al., 2009 ). Virale infektiöse Transkripte wurden aus 1 ug linearisierter Plasmid-DNA unter Verwendung eines geeigneten T7/T3/SP6-mMessage-mMachine-in-vitro-Transkriptionskits (Ambion) erhalten. Pflanzenblätter wurden mechanisch mit der Hälfte jeder Transkriptreaktion unter Verwendung von Carborundum als Schleifmittel beimpft. Virus-inokulierte Pflanzen wurden entweder in die Wachstumskammer oder das Gewächshaus gestellt. Die Bedingungen in der Wachstumskammer waren 23°C +/− 1°C mit 16 h Licht (ca. 155 µmol m –2 s –1 ) und 8 h Dunkelheit. Gewächshausbedingungen waren 24°C +/− 2°C mit 16 h Zusatzbeleuchtung (400 µmol m –2 s –1 ) und 60% Luftfeuchtigkeit.

Isolierung und Reinigung des TMV-Replicase-Komplexes

Die TMV-RNA-Replikase-enthaltenden Fraktionen wurden von infizierten N. tabacum ‚Xanthi-nn‘ wie beschrieben (Osman und Buck, 1997). Blätter von N. tabacum Mit TMV (U1-Stamm) inokulierte Pflanzen wurden bei 4 dpi geerntet und in Puffer B homogenisiert. Der TMV-Replicase-Komplex wurde weiter durch Differentialzentrifugation isoliert, um eineg Pellet, das weiter einem Suc-Dichtegradienten (20% bis 60% [Gew./Gew.] in Tris-EDTA-Dithiothreitol (TED)-Puffer)-Zentrifugation unterzogen wurde. TED-Puffer bestand aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol und 5 % (Vol./Vol.) Glycerin. Suc-Dichtegradientenfraktionen wurden auf RNA-POL-Aktivität analysiert, wie von Osman und Buck (1997) beschrieben, mit einigen unten diskutierten Modifikationen. Aktive Fraktionen (Fraktionen 4 und 5 von oben) wurden zur weiteren Reinigung ausgewählt. Diese wurden mit TED-Puffer 10-fach verdünnt und bei 40.000 . zentrifugiertg, und das resultierende Pellet, das rohe membrangebundene RNA POL enthielt, wurde mit Natriumtaurodesoxycholat solubilisiert und einer Anionenaustauschchromatographie auf DEAE-Bio-Gel A (Bio-Rad) und High Q (Bio-Rad) unter Verwendung eines HPLC-Systems (Pharmacia .) unterzogen ) wie zuvor beschrieben (Osman und Buck, 1997). Gesammelte Fraktionen wurden dann auf RNA-POL-Aktivität untersucht. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 50 µl RNA-POL-Präparation durchgeführt, die zu 50 µl 2× Puffer B mit 2 mm ATP, 2 mm GTP, 2 mm CTP, 20 µm UTP, 10 µCi [α- 32 P]UTP und Bentonit ( 4,8 mg/ml). Die Reaktionen wurden 1 h bei 30°C durchgeführt. Reaktionsprodukte wurden durch Phenolextraktion und Ethanolfällung isoliert und in 10 µl Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und durch PAGE mit 8 M Harnstoff analysiert, gefolgt von Autoradiographie. Fraktionen, die die höchste RNA-POL-Aktivität zeigten, wurden unter Verwendung von 4% bis 15% SDS-PAGE auf die Proteinzusammensetzung analysiert, gefolgt von einer Proteinfärbung mit dem Bio-Rad Silver Stain Plus Kit. Ähnliche Verfahren wurden unter Verwendung von Gewebe von nicht infizierten Pflanzen durchgeführt, um Kontrollproben zu erhalten. Exzision, tryptische Verdau im Gel und massenspektrometrische Analysen einzelner Proteinbanden wurden wie beschrieben durchgeführt (Watson et al., 2003).

Rohe VRC-Fraktionen wurden wie beschrieben (Covey und Hull, 1981) mit den folgenden Modifikationen erhalten. Gewebe wurde bei 4 dpi mit TMV (U1-Stamm) extrahiert, das eine MP-GFP-Fusion und CP exprimierte, wenn sich das Virus in der maximalen Replikationsphase befand und das MP-GFP im VRC vorhanden war, wodurch ein Marker für diesen Komplex bereitgestellt wurde (Liu et al ., 2005). Die Blätter wurden in flüssigem Stickstoff gemahlen, gefolgt von der Zugabe von Puffer A (50 m m Tris-HCl, pH 7,6, 60 m m KCl, 6 m m 2-Mercaptoethanol und vollständiger EDTA-freier Protease-Inhibitor [Roche]) bei 4°C. Der Extrakt wurde dann durch acht Lagen Käsetuch filtriert. Das Filtrat wurde bei 2.000 . zentrifugiertg 10 Minuten bei 4°C. Die Pelletfraktion wurde in Puffer A, der Triton X-100 (1%) und EDTA (5 mm) enthielt, resuspendiert und durch Zentrifugation bei 2.000 . repelliertg für 10min. Das obige Zentrifugationsverfahren wurde zweimal wiederholt und das endgültige Pellet in Puffer A, der Glycerin (15 %) enthielt, resuspendiert. Die gereinigten TMV-VRCs wurden auf Fluoreszenz von GFP durch konfokale Mikroskopie analysiert. Proteine ​​innerhalb von GFP-angereicherten Fraktionen wurden durch SDS-PAGE (Laemmli, 1970) getrennt und durch Silberfärbung wie beschrieben sichtbar gemacht (Blum et al., 1987). Exzision, tryptische Verdau im Gel und Nano-LC-MS/MS-Analysen einzelner Proteinbanden wurden wie beschrieben durchgeführt (Lei et al., 2005).Die Proteinidentifizierung wurde durch eine Suche in der nicht redundanten Proteindatenbank des National Center for Biotechnology Information durchgeführt.

VIGS Konstrukte und Agroinfiltration

In voller Länge AtpC und RCA komplementäre DNA (cDNA)-Sequenzen aus N. tabacum wurden durch RT-PCR unter Verwendung von Moloney-Maus-Leukämievirus-Reverse-Transkriptase (Promega), exTaq POL (Takara), Oligo-dT und genspezifischen Primern amplifiziert (Ergänzungstabelle S1). Die cDNAs voller Länge wurden in pCR-Blunt II-TOPO wie angewiesen (Invitrogen) kloniert. Ein 425-bp-Fragment aus dem offenen Leseraster von AtpC und RCA wurden durch PCR unter Verwendung von exTaq POL und genspezifischen Primern (Ergänzungstabelle S1) amplifiziert, sequenziert und in den Silencing-Vektor pTRV2 (Liu et al., 2002) unter Verwendung der Gateway-Klonierungstechnologie (Invitrogen) kloniert. pTRV1- und pTRV2-Konstrukte in Agrobacterium tumefaciens wurden angebaut und infiltriert N. Benthamiana Blätter wie beschrieben (Ding et al., 2004). Gen-Silencing wurde durch Standard-RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR-Analyse bestätigt.

Gesamt-RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR-Analyse

Gesamt-RNA aus Blattgeweben wurde mit einem RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) extrahiert und mit DNase I behandelt. Die Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung eines 12- bis 18-Basen-Oligo(dT)-Primers (Invitrogen) und Moloney-Maus-Leukämievirus-Reverse . synthetisiert Transkriptase (Promega). Zwei Mikroliter 20-fach verdünnte cDNA, genspezifische Primer und der Power SYBR Green Mastermix (Applied Biosystems) wurden für quantitative RT-PCR-Analysen von AtpC und Rca mRNA-Spiegel mit einem ABI Prism 7900 HT-Sequenznachweissystem (Applied Biosystems). Um die mRNA-Spiegel von Zielgenen zwischen Proben zu normalisieren, wurden relative EF1α-mRNA-Spiegel unter Verwendung von EF1α-spezifischen Primern und einer relativen Quantifizierungsmethode bestimmt (Pfaffl, 2001). Auch der Einfluss einer Virusinfektion auf die EF1α- und Ubiquitin-mRNA-Spiegel wurde mit dieser Methode bestimmt. Zusätzlich wurden Virusspiegel in Geweben durch reverse Transkription und quantitative PCR mit virusspezifischen Primern bestimmt. Um Standardkurven zur Quantifizierung der Viruskonzentrationen zu erstellen, wurde Virus-RNA aus infiziertem Gewebe durch virusspezifische Verfahren isoliert: TMV und TVCV (Bruening et al., 1976 Gooding und Hebert, 1967), PVX (AbouHaidar et al., 1998 Francki and McLean, 1968) und CMV (Roossinck und White, 1998). Die virale RNA wurde durch Spektrophotometrie quantifiziert. Virale RNA-Spiegel aus Behandlungsgewebe wurden quantifiziert, indem ihre Zyklusschwellenwerte, die während der quantitativen RT-PCR erhalten wurden, mit Zyklusschwellenwerten verglichen wurden, die aus scheingeimpftem Gewebe, das mit bekannten Mengen an viraler RNA gespickt war, erhalten wurden. Bei der Umkehrstrangsynthese wurde SSRT III (Invitrogen) verwendet. Primer für alle quantitativen RT-PCR-Reaktionen werden bereitgestellt (Ergänzende Tabelle S1).

Statistische Analyse von VRC-Zahlen und -Größen in AtpC- und Rca-silenced im Vergleich zu schein- und TRV-infizierten Kontrollpflanzen verwendeten generalisierte lineare oder lineare gemischte Modelle (Anzahl: GENMOD-Verfahren, Größe: MIXED-Verfahren) mit wiederholten Messungen in SAS 9.3 (SAS Institute, Inc.). Nach Bedarf wurden die Daten transformiert, um die Annahmen für gleiche Varianzen zwischen den Mittelwerten zu erfüllen. Individuelle Vergleiche der Behandlungsmittelwerte nutzten die Tukey-Kramer-Anpassung von P Werte.

ELISAs

Für ELISA-Analysen wurden Scheiben gleicher Größe, die Gewebe von außerhalb des Umfangs der größten grün fluoreszierenden Läsion enthielten, bei einem bestimmten dpi, wie in den Ergebnissen beschrieben, geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Gefrorene Gewebe wurden in 100 μl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Puffer (0,14 m NaCl, 3 mm KCl, 10 mm Phosphatpuffer, pH 7,0) gemahlen und ELISAs wurden für die TMV-CP-Akkumulation wie beschrieben durchgeführt (Derrick et al., 1997).

GST-Konstrukte und Pull-Down-Assay

Die cDNA-Fragmente von MT (Nukleotide 69–959), I, II (Nukleotide 956–2487), HEL (Nukleotide 2483–3416) und POL (Nukleotide 3421–4916) von 126-/183-kD-Proteinen wurden in pGEX-5X-2 (GE Lifesciences) und ausgedrückt in Escherichia coli. Exprimierte GST oder GST-fusionierte MT-, I-II-, HEL- und POL-Domänen wurden wie angewiesen an 50 &mgr;l Glutathion-Sepharose 4B gebunden (GE Lifesciences). Überstandsfraktion (S30) von N. tabacum wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Yamaji et al., 2006). Röhrchen, die ungefähr gleiche Mengen an GST- oder GST-Virus-Genfusionen enthielten, die an Sepharosekügelchen gebunden waren, wie durch SDS-PAGE-Analyse der gebundenen Kügelchen bestimmt, wurden mit 200 μl S30-Fraktion in Proteininteraktionspuffer (PBS mit 1% Triton X- 100, 0,5 % NP-40, 0,1 % SDS und 1 mm Phenylmethylsulfonylfluorid) für 1 h bei 4 °C. Die Kügelchen wurden dreimal gewaschen, zweimal mit PBS, das 1% Triton X-100 enthielt, und einmal in PBS. Ungebundene Fraktionen wurden entfernt und die gebundenen Kügelchen wurden in SDS-PAGE-Probenpuffer bei 100 °C für 10 Minuten erhitzt und bei 18 000 . zentrifugiertg für 5min. Der Überstand wurde auf 4% bis 10% SDS-PAGE aufgetrennt und einem Immunblotting unterzogen.

Gesamtproteinextraktion und Western-Blot-Assays

In flüssigem Stickstoff eingefrorenes Pflanzengewebe wurde zu feinem Pulver gemahlen und in Proteinextraktionspuffer aufgetaut (5 m m Tris-HCl, pH 8,0, 150 m m NaCl, 2 m m MgCl&sub2;2, 50 m m KCl, 1% Triton X-100, 0,5 m m Dithiothreitol) enthaltend Protease-Inhibitor (komplett EDTA-frei, Roche 1 Tablette/50 ml). Die Proben wurden 30 min auf Eis gelegt und bei 18.000 . zentrifugiertg für 10min. 15 Mikrogramm jeder Proteinprobe wurden in SDS-PAGE-Probenpuffer bei 100°C für 10 Minuten gekocht und bei 18.000 . zentrifugiertg für 5min. Der Überstand wurde auf 4% bis 10% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (Immun-Blot, Bio-Rad) elektrogeblottet. Blots wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 5% Magermilch blockiert und mit den entsprechenden primären Antikörpern von Kaninchen, Anti-RCA (1:7000 Verdünnung) oder Anti-GFP (0,5 µg/ml BioVision Research Products) sondiert. Sie wurden dann in Tris-gepuffertem Kochsalzpuffer, der 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen und mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Sekundärantikörper gegen Kaninchen (Promega) sondiert. Die immungetesteten Proteine ​​wurden durch kolorimetrische Reaktion mit Nitroblautetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat nachgewiesen.P-Toluidin (Promega).

Mikroskopie

Fluoreszierende virale Läsionsbilder wurden mit einem Olympus SZX-12 Fluoreszenz-Stereomikroskop (Olympus) aufgenommen. Die Läsionsbereiche (Pixel) wurden mit dem MetaMorph 4.5-Programm (Universal Imaging) gemessen. TMV. MP-GFP-VRCs wurden auf einem Bio-Rad-Modell 1024ES abgebildet. Die Bilder wurden mit Adobe Photoshop bearbeitet. GFP wurde unter Verwendung einer 488-nm-Linie von einem Krypton/Argon-Laser angeregt und Emissionen wurden bei 522 nm erfasst.

Subzelluläre Lokalisierung von AtpC und RCA

In voller Länge AtpC und Rca offene Leserahmen wurden in das 5G-mCherry C1-Plasmid kloniert, erhalten von Dr. Elison Blancaflor (Noble Foundation) und in A. tumefaciens GV2260 durch Elektroporation. Für Studien zur Interaktion von AtpC und RCA mit ektopisch exprimierter 126-kD-Protein-GFP-Fusion, A. tumefaciens mit der 126-kD-Protein-GFP-Fusion wurde mit A. tumefaciens mit AtpC-mCherry oder Rca-mCherry mit einer nadellosen Spritze und beobachtet 2 dpi. Für Studien, die eine spätere Herausforderung mit dem Virus beinhalten, N. Benthamiana Blätter wurden mit einer Spritze infiltriert A. tumefaciens enthält AtpC-mCherry oder Rca-mCherry und für 2 d in die Wachstumskammer gestellt. Blätter, die AtpC-mCherry oder RCA-mCherry exprimierten, wurden dann mit TMV inokuliert. MP-GFP und 4 dpi wurden die infizierten Zellen unter Verwendung eines Perkin-Elmer UltraView ERS konfokalen Systems mit rotierender Scheibe, das mit einem inversen Mikroskop Zeiss Observer D1 gekoppelt war, abgebildet. Die Zellen wurden mit einem 63× Wasserimmersionsobjektiv beobachtet. GFP wurde bei 488 nm angeregt und die Emission wurde bei 510 nm nachgewiesen. Die Chloroplasten-Autofluoreszenz wurde durch Anregung bei 647 nm nachgewiesen, und die Emission wurde bei 680 nm nachgewiesen. mCherry wurde bei 587 nm angeregt und die Emission wurde bei 610 nm nachgewiesen.

Sequenzdaten aus diesem Artikel sind in den GenBank/EMBL-Datenbibliotheken unter den Zugangsnummern X63606 und Z14980 zu finden.

Ergänzende Daten

Ergänzende Abbildung S1. Fraktionsanalyse für TMV 126- und 183-kD-Proteine ​​und RNA-POL-Aktivität.

Ergänzende Abbildung S2. Fehlende AtpC- oder RCA-mCherry-Kolokalisation mit TMV.MP-GFP in Epidermiszellen von N. Benthamiana.

Ergänzende Abbildung S3. Fehlende AtpC- oder RCA-mCherry-Kolokalisation mit einer 126-kD-Protein-GFP-Fusion in Epidermiszellen von N. Benthamiana.

Ergänzende Abbildung S4. Wirts-EF1α- und Ubiquitin-mRNA-Spiegel in N. tabacum mit TVCV, CMV und PVX herausgefordert.

Ergänzende Abbildung S5. Virusakkumulation in Extrakten aus infizierten Pflanzen, auf die untersucht wurde AtpC und Rca mRNA-Spiegel in Abbildung 2.

Ergänzende Abbildung S6. AtpC und Rca mRNA-Silencing-Phänotypen in N. Benthamiana Pflanzen.

Ergänzende Abbildung S7. Einfluss von AtpC oder Rca Silencing auf die interzelluläre Bewegung von TBSV-GFP und PVX-GFP.

Zusatztabelle S1 . Primer für VIGS-Konstrukte und quantitative RT-PCR-Analysen.


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