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Wie betäubt man Mücken während einer Feldstudie zum Einfangen von Massen?

Wie betäubt man Mücken während einer Feldstudie zum Einfangen von Massen?


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Hat jemand von Ihnen Erfahrung mit der Betäubung von Mücken während einer Feldstudie zum Einfangen von Massen?

Normalerweise haben Mückenfallen ein kleines Netz, in dem Sie die Mücken fangen. Die Netze können nach dem Sammeln in einen Gefrierschrank gelegt werden, um die Mücken auszuschalten. Die für meine Studie verwendete Falle hat jedoch kein Netz, sodass Mücken in der Falle herumfliegen.

Ich dachte darüber nach, Ethylacetat zu verwenden, um die Mücken auszuschalten, aber die Falle muss geruchsfrei bleiben, also ist das keine Option. Ich denke, die Verwendung von CO2 wäre am bequemsten, aber ich werde nicht in der Lage sein, einen großen CO2-Zylinder zu allen meinen Fangstellen zu ziehen.

Kann man vielleicht CO2-Tabletten verwenden, die sich in Wasser auflösen lassen? Ich könnte dann eine Plastikflasche verwenden, bei der die Kappe mit einem Röhrchen verbunden ist, das ich in die Falle stellen kann. Wäre das effizient? Was denken Sie?

Danke vielmals!


Entwicklung und Feldevaluation eines synthetischen Mückenköders, der attraktiver ist als der Mensch

Zugehörigkeiten Themengruppe Biomedical and Environmental Sciences, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania, School of Biological Sciences, University of Nairobi, Nairobi, Kenia, Disease Control and Vector Biology Unit, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, Vereinigtes Königreich

Zugehörigkeiten Themengruppe Biomedizinische und Umweltwissenschaften, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania, School of Biological Sciences, Durham University, Durham, Vereinigtes Königreich, Vector Group, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Vereinigtes Königreich

Zugehörigkeiten Themengruppe Biomedical and Environmental Sciences, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania, Abteilung Krankheitskontrolle und Vektorbiologie, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, Vereinigtes Königreich

Zugehörigkeit Themengruppe Biomedical and Environmental Sciences, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania

Affiliation Laboratory of Entomology, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, Niederlande

Zugehörigkeit Themengruppe Biomedical and Environmental Sciences, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania

Zugehörigkeit Themengruppe Biomedical and Environmental Sciences, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania

Affiliation College of Agriculture and Life Sciences, Cornell University, Ithaca, New York, Vereinigte Staaten von Amerika

Zugehörigkeit Themengruppe Biomedical and Environmental Sciences, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania

Affiliation Laboratory of Entomology, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, Niederlande

Zugehörigkeit Themengruppe Biomedical and Environmental Sciences, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania

Affiliation School of Biological Sciences, University of Nairobi, Nairobi, Kenia

Zugehörigkeiten Themengruppe Biomedical and Environmental Sciences, Ifakara Health Institute, Ifakara, Tansania, Disease Control and Vector Biology Unit, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, Vereinigtes Königreich, School of Biological Sciences, Durham University, Durham, Vereinigtes Königreich


Hintergrund

Durch Mücken übertragene Krankheiten stellen weiterhin eine schwere Belastung für die menschliche Gesellschaft dar und behindern das Wohlergehen und die wirtschaftliche Entwicklung [1]. Trotz vielversprechender Rückgänge der Malaria-Inzidenz innerhalb der letzten 15 Jahre [2], nehmen andere durch Stechmücken übertragene Krankheiten wie Zika, Dengue, Chikungunya und das West-Nile-Virus zu und haben sich über verschiedene Kontinente ausgebreitet [3, 4]. Neben dem Klimawandel gelten der internationale Handel und der menschliche Transport als Haupttreiber für die Einführung neuer Vektoren, mit oder ohne ihre Krankheitserreger, in verschiedene geografische Regionen [5,6,7,8,9].

Der kürzlich gemeldete weltweite Rückgang der Malaria wurde hauptsächlich durch den weit verbreiteten Einsatz von lang anhaltenden mit Insektiziden behandelten Netzen (LLINs), das Besprühen von Innenresten (IRS) und die angemessene Medikamentenbehandlung erreicht, aber Insektizidresistenz und Resistenz gegen Malariamedikamente drohen, weitere zu verhindern Kürzungen oder sogar zu einem Wiederaufflammen der Erkrankung führen [10, 11]. Innovative Alternativmethoden werden entwickelt, wie der Einsatz entomopathogener Pilze [12], Biolarvizide (Bazillus spp.) [13, 14], Push-Pull-Systeme und Massenfangtechniken mit Geruchsködern [15, 16] in Kombination mit Hausverbesserungen [17]. Es wird erwartet, dass der kombinierte Einsatz dieser Instrumente zusammen mit LLINs, IRS und einer angemessenen medikamentösen Behandlung eine nachhaltigere Strategie für die Kontrolle vektorübertragener Krankheiten darstellen kann [18]. Vor kurzem hat die Weltgesundheitsorganisation einen strategischen Ansatz namens Global Vector Control Response auf den Weg gebracht, der auf lokal angepasste nachhaltige Kontrollmaßnahmen abzielt, um mehrere Vektoren zu bekämpfen [19, 20].

Die erfolgreiche Implementierung neuer Vektorkontrolltools zusammen mit bestehenden Tools nach dem Ansatz des integrierten Vektormanagements erfordert ein detailliertes Verständnis des Mückenverhaltens. Zum Beispiel ist die Kontaktrate von Mücken mit mit Insektiziden behandelten Moskitonetzen ein wichtiger Parameter zum Verständnis der Wirksamkeit dieser Technologie [21, 22] eine höhere Wirksamkeit von Mückenfallen erfordert Kenntnisse über das Falleneintrittsverhalten [23, 24, 25], und Push-Pull-Strategien können effektiver gestaltet werden, wenn das Nahrungssucheverhalten der Mücken im peridoestischen Bereich gut verstanden wird [26].

Innovative Tracking-Techniken haben neue Möglichkeiten zur Untersuchung des Insektenverhaltens sowohl im Labor als auch im (Halb-)Feld eröffnet [27,28,29]. Der Fokus unseres Reviews liegt auf der Verfolgung von Mücken im Weltraum, um grundlegende Aspekte ihres Verhaltens in verschiedenen Phasen ihrer Lebensgeschichte aufzuklären. Es wird ein Überblick über Werkzeuge zur Verhaltensverfolgung von Mücken und deren technische Komplexität gegeben. Wir diskutieren, wie tiefgreifendes Wissen über das Verhalten von Mücken für die Entwicklung und Bewertung von Vektorkontrollstrategien genutzt werden kann.


Buzzkill: Zielt auf das Gehörsystem der Mücke

Ein komplexes Hörsystem ermöglicht es männlichen Mücken, Geräuschen entgegenzufliegen, die weiblichen Flugtönen ähneln (Phonotaxis).

Andere Aspekte des akustischen Verhaltens von Mücken, wie die Rolle der Geräuschwahrnehmung bei Weibchen, sind noch unklar.

Studien an isolierten männlich-weiblichen Paaren unterstützen verschiedene Modelle der akustischen Kommunikation von Moskitos, die auf ihre Erprobung warten.

Akustische Interaktionen zwischen artverwandten Männchen und Weibchen innerhalb von Paarungsschwärmen sind weitgehend unerforscht.

Eine verstärkte Zusammenarbeit zwischen Physiologen, Ökologen und Kontrollexperten ist erforderlich, um die akustische Biologie für die Kontrolle zu nutzen.

Schall spielt eine wichtige Rolle in der sensorischen Ökologie von Mücken. Akustische Wahrnehmung und akustisch getriebenes Verhalten stellen daher potentiell wirksame Kontrollziele dar. Frühere wissenschaftliche Bemühungen zur akustisch-basierten Steuerung und Überwachung waren nicht systematisch, und es bestehen Unklarheiten bezüglich der genauen Rolle der akustischen Kommunikation bei artverwandten Interaktionen. Hier geben wir einen kurzen Überblick über die jüngsten Fortschritte in der Hörphysiologie und Verhaltensökologie von Mücken sowie laufende Aktivitäten zur Einbeziehung von Geräuschen in Kontroll- und Überwachungsinstrumente. Wir heben Bereiche hervor, in denen eine verstärkte Zusammenarbeit zwischen Physiologen, Molekularbiologen, Verhaltensökologen und Kontrollexperten erforderlich ist, um aus diesem Fortschritt Kapital zu schlagen und das Potenzial klangbasierter Technologien und Strategien auszuschöpfen.


Materialen und Methoden

Mücken

Der Mbita-Stamm von Ein. gambiae sensu strikto Die seit Januar 2001 gegründete Kolonie wurde unter Umgebungsklimabedingungen (d. h. Temperatur von 23,2 ± 1,3 °C und 77,0 ± 2,6% relative Luftfeuchtigkeit (RH)) aufgezogen und für Halbfeld-Bioassays verwendet. Alle Halbfeldexperimente wurden in einem Gewächshaus mit Siebwänden auf dem Thomas Odhiambo Campus des International Center of Insect Physiology and Ecology (Eis-TOC) (00°25'S, 34°13'E und 1240 m über dem Meeresspiegel) in der Gemeinde Mbita Point im Westen Kenias. Erwachsene Mücken wurden dreimal pro Woche an einem menschlichen Arm mit Blut gefüttert und mit 6% (w/v) Glucoselösung auf Filterpapier versorgt. Die Eier wurden auf nasses Filterpapier gelegt und in Plastikschalen (mit den Maßen 35 cm × 25 cm × 5 cm) gelegt, die gefiltertes Wasser aus dem Viktoriasee enthielten. Große Partikel wurden gefiltert, indem das Seewasser über Holzkohle geleitet wurde, um die Filterzufuhr von . zu verbessern Ein. Gambiae Mückenlarven auf ca. 0,5 mg Tetramin Baby-Fischfutter (Melle, Deutschland)/Larve dreimal täglich verabreicht. Die Puppen wurden täglich gesammelt, in saubere, halb mit gefiltertem Seewasser gefüllte Becher (10 cm Durchmesser und 14 cm Höhe) gegeben und dann in mit Netzen bedeckte Käfige (30 × 30 × 30 cm) überführt. Insgesamt 200 weibliche Mücken im Alter von 3–5 Tagen und ohne vorherige Blutmahlzeit wurden zufällig aus dem Käfig abgesaugt und für 8 h ausgehungert, bevor sie in Halbfeldexperimenten (20:00–06:30 Uhr) eingesetzt wurden. Die Mücken wurden nur auf Baumwollhandtüchern mit Wasser versorgt, die auf die Mückenhaltebecher gelegt wurden.

Lockstoffe für Mücken

In allen Experimenten wurde der synthetische Mückenlockstoff „Ifakara Blend 1 (IB1)“ [21] in Kombination mit Kohlendioxid aus hefefermentiertem Zucker [22,23] verwendet. Alle elf Bestandteile von IB1 mit Ausnahme von Kohlendioxid wurden aus LDPE (Audion Elektro, Weesp, Niederlande) Beuteln oder Nylonstreifen (Bata Shoe Company, Kenia) freigesetzt. Jeder LDPE-Beutel maß 2,5 cm × 2,5 cm und war mit einem Milliliter eines einzelnen chemischen Bestandteils von IB1 gefüllt. Die Foliendicken der zur Abgabe der einzelnen Lockstoff-Compounds verwendeten LDPE-Beutel betrugen 0,2 mm (99,6 % Propionsäure, 99,9 % Butansäure, 99 % Pentansäure, 99 % 3-Methylbutansäure und destilliertes Wasser), 0,1 mm (98 % Heptansäure). Säure, 99,9 % Octansäure), 0,03 mm (99 % Tetradecansäure und 25 % Ammoniaklösung) und 0,05 mm (L-Milchsäure (85 %)). Chemikalien wurden von der Sigma-Aldrich Corporation (SIAL: NASDAQ GS, Deutschland) bezogen, während destilliertes Wasser von Buyimpex Laboratory Equipment Suppliers Limited in Kisumu, Kenia, geliefert wurde.

Einzelne Nylonstreifen mit den Maßen 26,5 cm × 1 cm wurden separat in einem Milliliter jedes chemischen Bestandteils bei optimalen Konzentrationen (% v/v) von 0,01 % (Propionsäure), 1 % (Butansäure), 0,0001 % (Pentansäure, Heptansäure) getränkt Säure und Octansäure), 0,000001% (3-Methylbutansäure), 0,00025% (Tetradecansäure), 2,5% (Ammoniak), 85% (Milchsäure) und 100% (destilliertes Wasser) [14,15]. Die Nylonstreifen enthielten 90 % Polyamid und 10 % Elasthan. Tetradecan- und Octansäure wurden in Ethanol gelöst, während Propion-, Butan-, Pentan-, Heptan-, 3-Methylbutansäure und Ammoniak in destilliertem Wasser gelöst wurden. Die behandelten Nylonstreifen wurden vor Versuchsbeginn 5 h bei Raumtemperatur luftgetrocknet.

Kohlendioxid (ca. 63 ml/min) wurde durch Mischen von 2 l Leitungswasser (Halbfeldversuche) oder Flusswasser (Feldversuche), 17,5 g Instant-Trockenhefe (Angel Company, China) und 250 g raffiniertem Zucker ( Sony Sugar Company Ltd, Kenia) 30 Minuten vor Beginn jedes Experiments [15,21]. Dieses Gas wurde durch ein Siliziumrohr (0,5 cm Innendurchmesser) in eine MM-X-Falle (American Biophysics, North Kingstown, RI, USA) geleitet, die mit Mischung IB1 angeködert war. Die mit einzelnen Lockstoffchemikalien gefüllten LDPE-Beutel wurden vor und nach jeder Versuchsnacht gewogen [8,15]. Mit Komponenten gefüllte Sachets wurden nur bei Leckage oder Erschöpfung ersetzt. Die Austauschhäufigkeit variierte signifikant zwischen den einzelnen Komponenten [15,24]. Obwohl Kontroll- und IB1-behandelte Nylonstreifen einmal hergestellt und (ohne Nachfüllen) in allen Experimenten dieser Studie wiederverwendet wurden, wurde CO2 wurde in jeder Versuchsnacht neu präpariert [15]. Äquivalente Anzahlen von 10 unbehandelten LDPE-Beutel und Nylonstreifen (dh Kontrollen/ohne Geruchsköder) [12,23] sowie 10 IB1-behandelten LDPE-Beutel und Nylonstreifen wurden separat an einem Drahthaken aufgehängt und in das Geruchsfahnenrohr von . gelegt die MM-X-Falle (14).

Dauerhafte Anziehungskraft von Ein. Gambiae zu behandeltem Nylon unter Halbfeldbedingungen

Es hat sich gezeigt, dass lockstoffimprägnierte Nylonstreifen locken Ein. Gambiae Mücken für 40 aufeinanderfolgende Nächte ohne erneute Behandlung [15]. In dieser Folgestudie sollte untersucht werden, ob dieser Residualeffekt in wöchentlichen Abständen über einen Zeitraum von einem Jahr (also 52 Nächte) reproduziert werden kann. Vier Behandlungen wurden verwendet: (a) Kontroll-LDPE-Beutel (kein Geruchsköder), (b) Kontroll-Nylonstreifen (kein Geruchsköder), (c) LDPE-Beutel gefüllt mit Mischung IB1 und (d) IB1-behandelte Nylonstreifen. Die Experimente wurden nach Behandlung und Fallenposition während jeder experimentellen Nacht randomisiert. Einzelne Behandlungen wurden in das Geruchsauslassrohr von separaten MM-X-Siphons montiert, die mit 12 V betrieben wurden. Das Geruchsaustrittsende jeder Falle wurde in einer Höhe von 15 cm über dem Boden aufgehängt [25,26]. Die MM-X-Fallen verteilten Geruchsstoffe und sammelten Mücken, die von jeder Behandlung angezogen wurden. Gesammelte Moskitos kamen nicht in direkten Kontakt mit den in die Falle gelegten Nylon- oder LDPE-Beutelmaterialien (14). Die Behandlungen wurden während der gesamten Studie bestimmten Fallen zugewiesen und wechselten sich jede Nacht ab, um die potenzielle Auswirkung der Stelle auf den Mückenfang zu überwinden [15,21]. Einfangassays zur Bewertung der Anziehungskraft der Mücken auf die vier Behandlungen wurden ein Jahr lang seit der Imprägnierung dreimal pro Woche wiederholt. Die am Ende jeder Versuchsnacht in einzelnen Fallen gesammelten Mücken wurden entfernt, gezählt und aufgezeichnet. Die Behandlungen wurden zwischen den experimentellen Nächten separat im Kühlschrank (4 °C) aufbewahrt. Nicht gefangene Moskitos wurden unter Verwendung von manuellen Aspiratoren aus dem mit Siebwänden versehenen Gewächshaus wieder eingefangen und getötet. Die Fallen wurden zwischen den Experimenten mit einer 70%igen Methanollösung gereinigt. Die Umgebungstemperatur und relative Luftfeuchtigkeit während aller experimentellen Nächte wurden mit Datenloggern (Tinytag Ultra, Modell TGU-1500, INTAB Benelux, Niederlande) aufgezeichnet.

Identifizierung von Verbindungen auf Nylonstreifen ein Jahr nach der Behandlung

Diese Studie zielte darauf ab, festzustellen, welche Chemikalien noch auf IB1-behandelten Nylonstreifen vorhanden waren, die wiederholt verwendet wurden, um anzuziehen Ein. Gambiae Mücken einmal pro Woche über einen Zeitraum von 52 Nächten ohne erneute Behandlung. Headspace-Probennahmen wurden verwendet, um VOCs zu sammeln, die aus drei Streifensätzen freigesetzt wurden, die jeweils aus 10 separaten Nylonstreifen (jeweils 4,5 cm × 1 cm) bestanden. Jeder Streifen wurde nur mit einer einzigen Komponente von IB1 imprägniert. Flüchtige Stoffe wurden mit einem Purge and Trap auf Tenax-TA 20/35 (Markes International, Llantrisant, UK) aus jedem der zehn IB1-imprägnierten Nylonstreifen mitgerissen, die in separaten 5-Liter-Glasbehältern mit Deckeln mit Lufteinlässen und Steckdosen. Um flüchtige Hintergrundstoffe zu reduzieren, wurde Luft durch eine Standardglaskartusche mit 200 mg Tenax-TA in die Küvette gesaugt [19]. Flüchtige Stoffe im Kopfraum wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/min zwei Stunden lang auf einer zweiten Kartusche, die 200 mg Tenax-TA enthielt, die mit dem Auslass der Küvette verbunden war, mitgerissen. Die Proben wurden mittels Thermodesorption (TD) mit Gaschromatographie und Massenspektrometrie-Detektion (GC/MS) analysiert. Ein Thermotrace GC ultra gekoppelt mit Thermotrace DSQ und Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) wurde zur Trennung und Detektion flüchtiger Verbindungen von den Nylonstreifen verwendet.

Vor der Freisetzung von flüchtigen Bestandteilen wurde jede Probe unter einem Stickstoffstrom (20 ml/min) 10 min lang bei Umgebungstemperatur trockengespült, um Feuchtigkeit zu entfernen. Darauf folgte die thermische Freisetzung flüchtiger Stoffe aus dem Tenax TA-Adsorptionsmaterial unter Verwendung einer Ultra 50:50-Thermodesorptionseinheit (Markes) bei 250 °C für 10 min unter einem Heliumfluss von 20 ml/min, während die flüchtigen Stoffe in einem gekühlten Lösungsmittelfalle bei 10°C unter Verwendung von UNITY (Marker). Sobald der Desorptionsprozess abgeschlossen war, wurden flüchtige Verbindungen aus der Kühlfalle mit einer schnellen Heizrate von 40 °C/s auf 280 °C für 10 Minuten freigesetzt. Die flüchtigen Stoffe wurden zur weiteren Trennung im Splitless-Modus auf eine ZB-5MSi-Analysesäule (30 ml × 0,25 mm I.D. × 1,00 &mgr;m F.T. (Phenomenex, Torrance, CA, USA)) übertragen. Die GC-Ofentemperatur wurde anfangs 2 min bei 40 °C gehalten und danach mit 10 °C/min auf eine Endtemperatur von 280 °C erhöht und 4 min unter einem Heliumfluss von 1 ml/min in einem konstanten Fluss konstant gehalten Modus. Das DSQ-Massenspektrometer (MS) wurde im Scan-Modus in einem Bereich von 35–350 amu bei 5,38 Scans/s betrieben. Die Spektren wurden im Elektronenstoß-Ionisations-(EI)-Modus bei 70 eV aufgezeichnet, während die MS-Übertragungsleitung und die Ionenquelle auf 275 bzw. 250°C eingestellt wurden. Die vorläufige Identifizierung von Verbindungen basierte auf dem Vergleich der Massenspektren mit denen in den MS-Bibliotheken von NIST 2005 und Wageningen Mass Spectral Database of Natural Products. Experimentell berechnete lineare Retentionsindizes (LRI) wurden auch als zusätzliche Maßnahmen zur Bestätigung der Identität von Verbindungen verwendet. Die in den Proben erhaltenen durchschnittlichen Peakflächen wurden verwendet, um die Häufigkeit einzelner flüchtiger Stoffe abzuschätzen. Flüchtige Stoffe aus der Druckluft, leeren Gläsern, sauberen Tenax TA-Adsorbentien und dem Analysensystem selbst wurden als Blindproben behandelt und zur Korrektur während der Analyse verwendet.

Identifizierung von Bakterien auf mit Lockstoffen behandeltem Nylon

Der Zweck dieser Studie bestand darin, das Vorhandensein und die Identität von Bakterien zu bestimmen, die auf IB1-behandelten Nylonstreifen gefunden wurden, die seit der Behandlung ein Jahr lang wiederholt verwendet wurden, um Mücken anzulocken. Alle behandelten Nylonstreifen (4,5 cm × 1 cm) wurden separat auf Trypticase-Soja-Agar (TSA)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 34 °C inkubiert. Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, indem Streifen gleicher Größe und Anzahl verwendet wurden, die aus einem Stück Nylonsocke geschnitten wurden, die 12 Stunden lang von einem menschlichen Freiwilligen getragen wurde, und Nylonstreifen zur Kontrolle (unbehandelt). Die am häufigsten vorkommenden Bakterienarten, die aus Kolonien von IB1-behandelten Nylonstreifen stammten, wurden isoliert und identifiziert. Bakterienkolonien wurden mit sterilen Pipettenspitzen von den Platten gepickt und in 20 µl Lysepuffer (50 mM NaOH, 0,20% SDS) in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach 15-minütigem Erhitzen auf 95 °C wurde jedes Röhrchen auf Eis gestellt, gefolgt von der Zugabe von 200 &mgr;l Wasser. Die Proben wurden 5 min bei 12.000 U/min zentrifugiert, bevor 0,5 &mgr;l des Überstands mit DNA für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet wurden. Vor der Amplifikation für die Sequenzierung wurde eine Fingerabdruck-BOX-PCR [27] verwendet, um zu bestätigen, dass die am häufigsten vorkommenden Kolonien auf der Platte zu derselben Spezies gehörten. Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung der universellen 16S rDNA-Primer fD1 und rp2 [28,29]. Amplifikationsprodukte wurden unter Verwendung zuvor beschriebener Verfahren [28,30] (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Deutschland) sequenziert. Die 16S-rDNA-Sequenzen wurden mit denen verglichen, die im Basic Local Alignment Search Tool (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) verfügbar sind, um eine vorläufige Speziesidentität der Bakterienisolate aufzudecken.

Wirkung von bakterienproduzierten flüchtigen Stoffen auf die Anziehung von Ein. Gambiae im Labor

Die Anziehungskraft von Ein. Gambiae auf flüchtige Stoffe, die von den zwei am häufigsten vorkommenden Bakterienkolonien produziert wurden, die aus IB1-behandelten Nylonstreifen im vorhergehenden Abschnitt isoliert wurden, wurde bewertet. Beide Isolate wurden über Nacht in einem Flüssigmedium gezüchtet (15 g Trypton, 5 g Soyton und 5 g Natriumchlorid/1000 ml H&sub2;2O) bei 34 °C vor dem Testen auf individuelle Verhaltensreaktionen der Wirtssuche Ein. Gambiae [19]. Das flüssige Medium wurde durch Plattieren auf TSA auf eine optimale Konzentration von 263 cfu/cm 2 verdünnt [19]. Attraktivität der von den beiden Bakterienisolaten produzierten flüchtigen Stoffe für den Suakoko-Stamm von Ein. gambiae s.S Form M. (vor kurzem umbenannt Ein. colluzzii) Moskitos wurde in einem Dual-Port-Olfaktometer [19,31] am Labor für Entomologie der Universität Wageningen, Niederlande, getestet.

Für jeden Test 30 Frauen Ein. Gambiae Stechmücken im Alter von 5–8 Tagen, die keine Blutmahlzeit erhalten hatten, wurden 14 h vor dem Experiment ausgewählt und in einen Freilassungskäfig mit Leitungswasser auf feuchter Watte gelegt. Die Experimente wurden während der letzten 4 h der Scotophase durchgeführt. In jedem Versuch wurden Testgerüche in den Luftstrom freigesetzt, bevor eine Gruppe von Mücken aus einem Käfig freigelassen wurde, der 1,60 m in Windrichtung von den beiden Häfen entfernt aufgestellt wurde. Nach 15 Minuten wurden Mücken, die in jede der beiden Fallenvorrichtungen eindrangen, gezählt und aufgezeichnet. Ausgeschnittene TSA-Blöcke (1,5 × 1,5 × 0,3 cm) mit oder ohne Bakterien wurden auf einen Glasobjektträger (1,5 × 1,5 cm) gelegt und in jede Auffangvorrichtung platziert [19]. Jede Behandlung wurde viermal über zwei Tage getestet. Die Reihenfolge der Testgerüche wurde am selben Tag und zwischen den Tagen randomisiert. Teststimuli wurden zwischen rechten und linken Ports des Olfaktometers abgewechselt, um jegliche Positionseffekte auszuschließen.

Auswirkung des Autoklavierens auf die Anziehung von Ein. Gambiae zu behandelten Nylonstreifen

Diese Studie wurde entwickelt, um festzustellen, ob das physische Vorhandensein von Bakterien auf autoklavierten IB1-behandelten und Kontroll-Nylonstreifen die Attraktivität von wirtssuchenden Laboratorien beeinträchtigen würde Ein. Gambiae Mücken. Die Studie wurde durch randomisierte Dual-Choice-Bioassays durchgeführt, die (a) nicht autoklavierte Kontrolle versus autoklavierte Kontroll-Nylonstreifen, (b) nicht autoklavierte Kontrolle versus autoklavierte IB1-behandelte Nylonstreifen, (c) nicht autoklavierte Kontrolle versus nicht autoklavierte IB1-behandelte Nylonstreifen, (d) autoklavierte Kontrolle versus autoklavierte IB1-behandelte Nylonstreifen, (e) autoklavierte Kontrolle versus nicht autoklavierte Nylonstreifen und (f) nicht autoklavierte Kontrolle versus autoklavierte IB1-behandelte Nylonstreifen. Die Experimente wurden nach Behandlung und Fallenort randomisiert. Die verwendeten Nylonstreifen wurden zuvor in wöchentlichen Abständen für einen Zeitraum von 52 Wochen nach der Behandlung in einer Halbfeldumgebung zum Anlocken von Moskitos exponiert. Jeder Bioassay wurde vier Nächte lang in einem Gewächshaus mit Siebwänden durchgeführt. Die autoklavierten und nicht autoklavierten IB1-behandelten und Kontroll-Nylonstreifen für einzelne Behandlungen wurden getrennt in Aluminiumfolie eingewickelt und zwischen den Versuchsnächten bei –4°C gekühlt. Während des Autoklavierens wurden Kontroll- und IB1-behandelte Nylonstreifen separat in eine 200-ml-Glasflasche (Pyrex, England) gegeben, versiegelt und bei 121°C bei 100 kPa (15 psi) für 30 Minuten autoklaviert (Webeco Vertikal Modell BCH-Stand, Deutschland ) vor Beginn jedes Experiments. Nicht autoklavierte Behandlungen wurden zwischen den experimentellen Nächten bei 4°C aufbewahrt. Die Behandlungen wurden zwischen Fallenpositionen abgewechselt und während des gesamten Studienzeitraums wiederholt angewendet.

Die gleichen Behandlungen, die verwendet wurden, um die Wirkung des Autoklavierens von IBI-behandelten Nylonstreifen auf die Anziehung von Mücken unter Halbfeldbedingungen zu untersuchen, wurden auch im Freien (18:30–06:30 Uhr) im Dorf Kigoche an 20 aufeinanderfolgenden Nächten getestet (Dezember 2011 bis Januar 2012 .). ) ohne erneute Behandlung. Diese Feldstudie wurde durch ein 4 × 4 Latin Square experimentelles Design ausgewertet, das nach Behandlung und Hausstandort randomisiert wurde. Das Dorf Kigoche liegt in der Nähe der Stadt Ahero in den Kano-Ebenen des Landkreises Kisumu im Westen Kenias [23]. Einzelne Behandlungen, die bestimmten MM-X-Fallen zugewiesen wurden, wurden im Freien unter der Traufe neben dem Schlafzimmer ausgewählter Häuser aufgehängt. Die Behandlungen wurden in nächtlichen Abständen zwischen den verschiedenen Versuchshäusern abgewechselt. Am Ende jeder Versuchsnacht wurden erwachsene Mücken, die in jeder Falle gefangen wurden, gesammelt und zum Sortieren und Zählen in ein Feldlabor am Ahero Multipurpose Development Training Institute (AMDTI) transportiert. Mücken, die aus jeder Falle gesammelt wurden, wurden durch Einfrieren getötet, morphologisch identifiziert [32,33], gezählt und basierend auf Geschlecht und Gattung oder Art aufgezeichnet (Ein. Gambiae Sensu lato, Ein. funest, Culex Spezies, Mansonia Arten und andere Anopheline). Andere Anopheline beziehen sich auf gefangene Arten von Anopheles außer Ein. Gambiae s.l. und Ein. funest.

Ethische Zustimmung

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Kenya Medical Research Institute (KEMRI ERC NON-SSC No. 350) genehmigt. In allen Fällen wurden Zweck und Verfahren der Studie den örtlichen Leitern, Haushaltsvorständen und Freiwilligen erklärt, bevor sie um Erlaubnis zur Durchführung der Studie gebeten wurden. Experimente wurden nur in örtlichen Häusern durchgeführt, deren Besitzer zustimmten, nachdem sie das Protokoll der Studie gelesen und verstanden hatten, bevor sie zwei Kopien der schriftlichen Einverständniserklärung unterzeichneten, die von der Ethikkommission von KEMRI genehmigt wurde. Eine der Kopien wurde vom Teilnehmer behalten, die zweite vom Projekt.

Datenanalyse

Ein Logit-Modell der Baseline-Kategorie wurde verwendet, um die Restaktivität der Mischung IB1 auf die Anziehung von . zu analysieren Ein. Gambiae Mücken [34], während ein χ 2 -Test verwendet wurde, um für jeden Two-Choice-Test, der im Olfaktometer und im Gewächshaus mit Schirmwänden durchgeführt wurde, zu analysieren. Die Wirkung des Autoklavierens auf die Attraktivität von IB1-imprägnierten Nylonstreifen für Feldmücken, die während des randomisierten 4 × 4 Latin Square experimentellen Designs nach Behandlung und Hausstandort gefangen wurden, wurde unter Verwendung eines generalisierten linearen Modells (GLM) mit Poisson-Verteilung und einer logarithmischen Verknüpfung bewertet Funktion [35,36]. Als Parameter im Modell wurden die Auswirkungen von Behandlung und Stallposition auf den Mückenfang getestet. Dem GLM folgten paarweise Vergleiche mit der Korrektur der kleinsten Quadrate, um Unterschiede in der Falleneintrittsreaktion zwischen den Behandlungen zu testen. Alle Analysen wurden mit der Statistiksoftware IBM SPSS, Version 20.0, durchgeführt.


Diskussion

In dieser Studie wurde beobachtet, dass die Reaktionen von im Labor aufgezogenen Ein. gambiae s.s. Mücken zur MB5 Referenzlockstoffmischung mit CO2 waren im Vergleich zu MB5 allein signifikant höher, CO2 allein oder eine Falle ohne Köder. In allen Halbfelduntersuchungen MB5 + CO2 zogen deutlich mehr Mücken an als seine Varianten, die die unterschiedlichen Verdünnungen von 2-Butanon enthalten, das als Ersatz für CO . verwendet wird2. Bei Verwendung der Mischungen aus MB5 + 2-Butanon wurden die höchsten Fänge mit der Konzentration von 99,5 % 2-Butanon und der Konzentration von 1,0 % von 2-Butanon in Verbindung gebracht. Gesamtfänge von Ein. arabiensis waren weitaus niedriger als die von Ein. Gambiae unter Halbfeldbedingungen, wahrscheinlich weil die menschenähnlichen Lockstoffmischungen entwickelt und angepasst wurden unter Verwendung von Ein. Gambiae als Testorganismus [25, 26] und das Ein. arabiensis hat eine opportunistischere Gastgeberpräferenz [1]. In der Feldstudie, Ein. gambiae s.l., Ein. funest und Culex Arten wurden sowohl von MB5 + CO2 als auch von MB5 + 99,5 % 2-Butanon angezogen, ohne dass es zwischen den Mischungen einen signifikanten Unterschied in der Fanggröße gab. Diese Ergebnisse zeigen, dass 2-Butanon unter Feldbedingungen als Ersatz für CO2 verwendet werden kann.

Der Befund, dass deutlich mehr im Labor gezüchtete Mücken von MB5 + CO . angezogen wurden2 als zu MB5 allein (P < 0,001), CO2 allein (P < 0,001) oder eine Falle ohne Köder (P < 0,001) unterstreicht die Wirkung von CO2 als Synergist in Mückenlockstoffen [21, 29]. Es ist bekannt, dass das Gas Moskitos aktiviert, indem es das Startverhalten hervorruft und sie im Wirtsflug hält [6, 7, 30]. Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen von Studien überein, die gezeigt haben, dass Verbindungen für wirtssuchende Mücken attraktiver sind, wenn sie gemischt werden, als wenn sie allein angewendet werden [31].

Es wurde beobachtet, dass die reine (99,5%) Form von 2-Butanon ein potenzieller Ersatz für CO . ist2 bei Mückenlockstoffen. Unter Feldbedingungen gab es keine Unterschiede zwischen der Anzahl der Ein. gambiae s.l. und Ein. funest Mücken werden von MB5 + CO . angezogen2 verglichen mit MB5 + 99,5 % 2-Butanon. 2-Butanon ist ein Naturstoff, der in den Emanationen verschiedener Wirbeltiere und Arthropoden identifiziert wurde [32, 33] und mehrere Insekten zeigen eine Verhaltensreaktion, wenn sie dieser Verbindung ausgesetzt sind. Zwei separate Studien [34, 35] haben berichtet, dass die Geruchsrezeptorzelle der Fruchtfliege Bactrocera tyoni das reagiert auf CO2 reagiert auch auf 2-Butanon. Und in jüngerer Zeit haben Turner et al. [14] demonstrierten die Fähigkeit von 2-Butanon, eine dosisabhängige Aktivierung des CO . zu induzieren2 Rezeptorneuron in den Oberkieferpalpen von Ein. gambiae, Aedes aegypti und Culex quinquefasciatus. Wird dieser Effekt unter Halbfeldbedingungen nicht beobachtet, kann dies darauf hindeuten, dass 2-Butanon eher als Langstrecken- als als Kurz- oder Mittelstrecken-Signal fungiert oder dass die Nähe einer attraktiveren Alternative (MB5 + CO2) wurde bevorzugt, wenn Mücken eine direkte Wahlmöglichkeit boten. Darüber hinaus gab es keine statistischen Unterschiede in der Anzahl der Ein. funest angezogen von MB5 + CO2 oder MB5 + 2-Butanon (99,5%) unter Freilandbedingungen, aber da an der Forschungsstation in Mbita keine Kolonie dieser Mückenart etabliert wurde, konnte die Reaktion dieser Art unter Halbfeldbedingungen nicht getestet werden.

Die relativ hohe Anzahl wilder Männchen Ein. gambiae s.l. und Ein. funest Mücken in Fallen, die mit synthetischen Geruchsmischungen beködert sind, widerspricht den Erwartungen, da Männchen phytophag sind und im Vergleich zu weiblichen Moskitos wahrscheinlich nicht auf wirtssuchende Geruchsmischungen reagieren [3, 37]. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Männchen die Weibchen zur Paarung verfolgten, wenn dieses lebensgeschichtliche Merkmal jemals in Innenräumen ohne Schwärmen auftritt. Gegenwärtig besteht ein dringender Bedarf an wirksamen synthetischen Geruchsmischungen zur Probenahme und Bekämpfung von männlichen Mücken. Solche Mischungen könnten eingesetzt werden, um den Paarungserfolg zu reduzieren und auch die Anzahl der trächtigen weiblichen Mücken und die Prävalenz von durch Mücken übertragenen Krankheiten zu reduzieren. Weil die Aussichten, Malaria zu eliminieren, durch die rasche Entwicklung arzneimittelresistenter Plasmodium Parasiten und insektizidresistente Malariavektoren werden neuartige Werkzeuge benötigt. Im Westen Kenias wurde die Fangtechnologie mit Geruchsködern erfolgreich eingesetzt, um Mückenstiche und Malariaprävalenz zu reduzieren [38]. Die Zahl der Mücken in der Nähe von Häusern wurde durch den Masseneinsatz von Außenfallen reduziert, die mit MB5, angereichert mit 2-Butanon anstelle von CO ., angeködert wurden2 [36, 38]. Die Köderfallen wurden effektiv und wiederholt zum Fangen von im Freien stechenden Moskitovektoren verwendet. Obwohl über eine restliche Anziehungskraft von Mücken auf synthetische Verbindungen, die auf Nylonstreifen imprägniert sind, berichtet wurde [23], sind ähnliche Studien für Mückenlockstoffe erforderlich, die mit 2-Butanon angereichert sind. Ein Geruchsköder mit einer Restaktivität von langer Dauer ohne häufiges Nachfüllen wäre sowohl für die Überwachung als auch für die Entfernung von Mücken in abgelegenen Gebieten Afrikas südlich der Sahara geeignet.

Menschliche Landefänge, Lichtfallen, von Menschen besetzte Moskitonetze, Pyrethrum-Spray-Fänge und Menschenlande-Fänge werden häufig für die Probenahme von Malariavektoren und die Schätzung der Malariaübertragungsintensität verwendet [39]. Die Methoden unterscheiden sich in Bezug auf Zuverlässigkeit und Wirksamkeit, daher werden standardisierte Werkzeuge benötigt, die empfindlich, spezifisch, zuverlässig und ethisch vertretbar für den Fang und die Probenahme von Malariavektoren sind. Jüngste Studien zeigen, dass synthetische Geruchsköder, die von MM-X-Fallen abgegeben werden, zuverlässig verwendet werden können, um lebende und artspezifische Proben von stechender Malaria im Innen- und Außenbereich und anderen Mückenvektoren, insbesondere solchen, die wirtssuchend sind, zu sammeln [13, 18, 29] . Daher ist es wichtig, die Geruchsmischung zu vergleichen, mutmaßliches CO2 Ersatz- und Geruchsköderfallen, die in der aktuellen Studie mit den oben beschriebenen üblichen Fangwerkzeugen verwendet wurden.


Abstrakt

In der vorliegenden Studie wurde Carifend ® ein alpha-Cypermethrin-beschichtetes Netz zur Kontrolle von Lasioderma serricorne und Ephestia elutella in Halbfeld- und Feldversuchen in zwei Lagern. In the semi-field tests, three Carifend ® Multi-Cubicles (CMCs), within which one carton box filled with tobacco was placed, were suspended in three separate rooms. Two MoBe traps were placed, one inside and one outside of each CMC. Three additional tobacco quantities in similar carton boxes, with a MoBe trap on them, were placed in three separate adjacent rooms and served as controls. In each room, 50 L. serricorne and 50 E. elutella adults were released outside of each tobacco quantity and the traps were inspected at weekly intervals for 3 weeks. A similar approach was followed in the field test conducted in a commercial tobacco storage facility. However, no insects were released and the test was based on the naturally-occurring immigrations of populations of E. elutella und L. serricorne from outside the facility or from unprotected tobacco. In semi-field tests, significantly more adults were captured in the first week in the control traps compared to counts from CMCs, either inside or outside. However, differences were significant only in the case of E. elutella. Only one single L. serricorne individual was found in the traps that had been placed inside CMCs, whereas no adult E. elutella were detected inside CMCs. In the field-test, traps that had been placed inside the CMCs captured only 3 and 1 adults of E. elutella und L. serricorne, respectively, during the entire survey period. Results of this study show that Carifend ® is highly effective for the control of both species on stored tobacco, and could be further successfully utilized as an alternative method over the use of traditional insecticidal treatments (such as repeated fumigations of phosphine gas) on tobacco.


Beneficial symbionts in olive fruit fly and related species

Tephritid species have established symbiotic associations with a variety of bacterial and fungal species (Petri, 1909 Mazzon et al., 2008 Andongma et al., 2015 Augustinos et al., 2015 Ben-Yosef et al., 2015 Morrow et al., 2015 Hadapad et al., 2016 ). Although less is known about the function of fungi compared to bacteria, inactivated yeasts are applied successfully to the artificial diet of tephritids (Cohen, 2003 ) and are common attractors in tephritid baits (Bortoli et al., 2016 ). This indicates that yeast is important for nutrition in wild tephritids as well, just as yeast and yeast-like fungi are in Drosophilidae (Vega & Blackwell, 2005 Hamby & Becher, 2016 ). Associated cultivable yeasts have been identified in Bactrocera tryoni (Froggatt) (Deutscher et al., 2017 ) and the total gut fungal microbiome has been investigated in wild B. oleae (Malacrinò et al., 2015 ).

Medfly is the model species in the Tephritidae family. Bacterial communities vary between medfly strains and populations, and can vary among life stages (Aharon et al., 2013 ), particularly when exposed to different environments. These shifts in community composition may allow medfly to feed on various host plants (Aharon et al., 2013 ). Medfly symbionts are typically taken up from the environment, but can also be passed on via vertical transmission (Behar et al., 2008a Ben Ami et al., 2010 ). Besides passing on the bacteria, the female medfly also provides eggs with an antibiotic substance during oviposition (Marchini et al., 1991 ), which is probably meant to ward off pathogenic bacteria and select for the beneficial symbionts. The medfly is known to be associated with bacterial species predominantly from the Enterobacteriaceae family (Enterobakterien, Klebsiella, und Pectobacterium species). The core bacteria of medfly are diazotrophic (atmospheric nitrogen fixators) and pectinolytic (hydrolysers of pectin substances in plants) and seem to help by accelerating fruit decay and providing nitrogen for the larva as soon as they are inoculated by the adult by oviposition (Behar et al., 2005 , 2008a ). Bacteria also affect survival depending on the nutrients the fly receives (Behar et al., 2008b ). The benefit of medfly symbionts can be diet dependent: when enough food is present some are beneficial by accumulating fats and improve mating success, but when food is scarce those bacteria may have a negative effect (Behar et al., 2008b ). It has also been demonstrated that mass rearing and irradiation may adversely affect bacterial communities in medfly, by increasing the density of potentially pathogenic Pseudomonas species (Ben Ami et al., 2010 ).

Similar to related tephritid species, B. oleae possesses several symbiotic-supporting devices (Petri, 1909 Girolami, 1973 , cited in Sacchetti et al., 2014 ), with ceca connected to the larval midgut which can grow and store bacteria, an oesophageal bulb with the same capabilities in adults, and additionally an ovipositor diverticulum in adult females. These specialized organs suggest that the fly and the symbiont(s) have a tight evolutionary bond and are in close symbiosis, in which the bacteria provide benefits for the survival of the fly and vice versa. Even though the exact transmission mechanism has not yet been elucidated, the presence of the ovipositor diverticulum and the bacteria covering the egg suggest vertical transmission (Stammer, 1929 Sacchetti et al., 2008 Estes et al., 2009 ).

Various bacterial species have been reported in association with B. oleae over the years (Table 2). Recent studies have clearly demonstrated that the major symbiont of B. oleae ist Candidatus Erwinia dacicola, a non-cultivable γ-proteo-bacterium, which is present both intra- and extracellularly (Capuzzo et al., 2005 Estes et al., 2009 , 2012 Kounatidis et al., 2009 Savio et al., 2012 Ben-Yosef et al., 2014 , 2015 ). Zusätzlich zu Ca. E. dacicola, several bacterial species have been detected in laboratory and natural populations of olive fruit fly. These are summarized in the review by Estes et al. ( 2011 ), but additional studies were done since by Savio et al. ( 2012 ), Estes et al. ( 2012 ), and Ben-Yosef et al. ( 2014 , 2015 ). In wild flies, these symbionts are mostly found in low densities (Ben-Yosef et al., 2015 ), and are suggested to be transient (Estes et al., 2011 ). The most dominant species are members of Enterobacteriaceae, for instance, Enterobakterien (Stamopoulos & Tzanetakis, 1988 Estes et al., 2009 ), Klebsiella (Tsiropoulos, 1983 Konstantopoulou et al., 2005 ), Pantoea (Ben-Yosef et al., 2015 ), and Serratia (Tsiropoulos, 1983 Konstantopoulou et al., 2005 ), which are commonly associated with fruit digestion in other fruit fly species (Drew & Lloyd, 1991 Behar et al., 2008a Ben-Yosef et al., 2010 , 2015 ).

Jahr SIT and rearing milestones Bacteria ID studies Microbiology milestones
1909 First bacteria identifieda ein Isolation of bacteria through culturing plus morphological and/or biochemical identification of cultivable bacteria.
Petri ( 1909 ) Intensive study of symbiotic device, description of vertical transmission Petri ( 1909 )
1956 Wild adult fliesa ein Isolation of bacteria through culturing plus morphological and/or biochemical identification of cultivable bacteria.
Hellmuth ( 1956 )
1963 Elaborate study on B. oleae rearing under laboratory conditions for SIT Hagen et al. ( 1963 )
1966 Successful sterilisation and first field trial with sterilized flies Tzanakakis et al. ( 1966 ) Orphanidis et al. ( 1966 ) Symbiont needed for protein and unripe olive digestion Acidophilus spec. cannot replace all functions of the original symbiont but can provide two essential amino acids Hagen ( 1966 )
1973 Antibiotics inhibit larval development Tzanakakis & Stavrinides ( 1973 )
1975 Current larval diet defined Tsitsipis ( 1975 )
1977 Laboratory adultsa ein Isolation of bacteria through culturing plus morphological and/or biochemical identification of cultivable bacteria.
Haniotakis & Avtzis ( 1977 )
1982 Summary of research on SIT, mentioning its problems Economopoulos & Zervas ( 1982 )
1983 Current adult diet defined Tsitsipis & Kontos ( 1983 ) Wild and laboratory adultsa ein Isolation of bacteria through culturing plus morphological and/or biochemical identification of cultivable bacteria.
Tsiropoulos ( 1983 )
1988 Wild adults Stamopoulos & Tzanetakis ( 1988 )
1991 Phylloplane Ercolani ( 1991 )
1999 Antibiotics influence allele frequencies in laboratory flies Konstantopoulou et al. ( 1999 ) Host–bacterial interactions affect development and detection of Adh Allele Konstantopoulou et al. ( 1999 )
2003 Wild and laboratory adults and phylloplane Belcari et al. ( 2003 )
2005 Wild adultsb B Isolation of bacteria through culturing plus 16S rRNA gene-based identification, including Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE of cultivable bacteria.
, c C Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, PCR, cloning, and screening of libraries, through Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE.
Capuzzo et al. ( 2005 ) Uncultivable Ca. Erwinia dacicola found as the main symbiont Capuzzo et al. ( 2005 )
Laboratory and wild pupaea ein Isolation of bacteria through culturing plus morphological and/or biochemical identification of cultivable bacteria.
Konstantopoulou et al. ( 2005 ) Host–bacterial interactions affect development and detection of Adh Allele Konstantopoulou et al. ( 2005 )
2007 Fly attraction to microbes Landini et al. ( 2007 ) Sacchetti et al. ( 2008 )
2008 Laboratory adults and wild pupae Chrysargyris ( 2008 )
2009 Laboratory pupae and adults, wild larvae, pupae, and adultsb B Isolation of bacteria through culturing plus 16S rRNA gene-based identification, including Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE of cultivable bacteria.
, c C Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, PCR, cloning, and screening of libraries, through Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE.
Estes et al. ( 2009 ) Ca. E. dacicola goes intracellular during larval metamorphosis, and is dominant in all life stages in wild and olive-reared flies Estes et al. ( 2009 )
Laboratory adults and wild larvae Estes ( 2009 ) Fewer, other, or no symbionts found in laboratory flies compared to wild flies Estes et al. ( 2009 ) Kounatidis et al. ( 2009 )
Laboratory pupae and larvae, wild adultsb B Isolation of bacteria through culturing plus 16S rRNA gene-based identification, including Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE of cultivable bacteria.
, c C Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, PCR, cloning, and screening of libraries, through Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE.
Kounatidis et al. ( 2009 ) Acetobacter tropicalis is present in Greek natural and laboratory populations Kounatidis et al. ( 2009 )
2011 Reviewing previous knowledge with intent to try SIT again Estes et al. ( 2011 )
2012 Laboratory pupae and adults olive and non-olive reared, wild larvae, pupae, and adultsc C Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, PCR, cloning, and screening of libraries, through Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE.
Estes et al. ( 2012 )
Wild adultsc C Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, PCR, cloning, and screening of libraries, through Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE.
Savio et al. ( 2012 )
2014 Adult diet without antibiotics is not problematic in non-mass-rearing situation Rempoulakis et al. ( 2014 ) Probiotic diet has positive effect on adult females Sacchetti et al. ( 2014 )
Wild larvae, pupae, and adultsb B Isolation of bacteria through culturing plus 16S rRNA gene-based identification, including Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE of cultivable bacteria.
, d D Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, preparation of 16S rRNA libraries (not cloning), and Next Generation Sequencing.
Ben-Yosef et al. ( 2014 ) Symbionts can also create essential amino acids from urea Ben-Yosef et al. ( 2014 )
2015 Laboratory adults, wild larvae, and adultsd D Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, preparation of 16S rRNA libraries (not cloning), and Next Generation Sequencing.
Ben-Yosef et al. ( 2015 ) Ca. E. dacicola most probably responsible for counteracting oleuropein herbivory-protective effect in olive mechanism described Ben-Yosef et al. ( 2015 )
2016 Wild adult females and larvaeb B Isolation of bacteria through culturing plus 16S rRNA gene-based identification, including Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE of cultivable bacteria.
, e e Culture-independent approach, based on whole-genome characterization: it uses single-cell genomics technology to assemble whole bacteria genomes.
Blow et al. ( 2016 ) Draft genome of Ca. E. dacicola Blow et al. ( 2016 )
  • ein Isolation of bacteria through culturing plus morphological and/or biochemical identification of cultivable bacteria.
  • B Isolation of bacteria through culturing plus 16S rRNA gene-based identification, including Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE of cultivable bacteria.
  • C Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, PCR, cloning, and screening of libraries, through Sanger sequencing and/or PCR-RFLP and/or DGGE.
  • D Culture-independent approach, using a 16S rRNA gene-based characterization: it includes total DNA extraction, preparation of 16S rRNA libraries (not cloning), and Next Generation Sequencing.
  • e Culture-independent approach, based on whole-genome characterization: it uses single-cell genomics technology to assemble whole bacteria genomes.
  • RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism (detects differences in the gene by the presence of fragments of different lengths after digestion of the sequence with one or more restriction endonucleases) DGGE, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (detects differences in DNA fragments induced by denaturing conditions within a sequence according to their mobility on an agarose gel).

It has been reported that B. oleae (as well as its close tephritid relatives) cannot survive under sterile laboratory conditions unless its artificial larval diet contains hydrolysed proteins (Hagen et al., 1963 ). This clearly suggests that microorganisms are somehow essential and play a role in digestion in natural populations. Die Hauptfunktion des B. oleae symbionts seems to be to provide the fly with the ability to digest unripe olives. This is evident when the bacteria are removed with antibiotics, which causes inability to digest unripe olives and non-hydrolysed proteins (Hagen, 1966 Ben-Yosef et al., 2015 ). The bacteria seem to produce essential amino acids by converting proteins and non-essential amino acids (Ben-Yosef et al., 2010 ) and additionally help to overcome the olive's protective compound oleuropein in unripe olives (Ben-Yosef et al., 2015 ), as supported by a recent transcriptomic study (Pavlidi et al., 2017 ). Zusätzlich, B. oleae without symbionts becomes more prone to infections by pathogenic microbes (Cavalloro & Girolami, 1968 , cited in Estes et al., 2011 ), suggesting a protective function of the symbionts.


Ergebnisse

A total of 7265 insects were collected from the Ambohidray site, of which 2989 and 4276 were captured in control and baited traps respectively. These insects were represented by five orders, including Diptera, Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera and Hemiptera. Among the Diptera, 5010 (69%) were mosquitoes belonging to the family Culicidae, of which 2002 (40%) were captured in control traps and 3008 (60%) in baited traps. In this family, two genera: Culex und Anopheles were identified. Die volle Anzahl an Anopheles collected was 3384 (68%) of which 1348 (39.8%) in the control traps and 2036 (60.2%) in the baited traps (Fig. 1).

Total number of insects, mosquitoes and Anopheles spp. caught in control and baited traps in the village of Ambohidray.

Statistically, no significant differences were observed between the mean numbers of insects, mosquitoes and Anopheles spp. in the baited trap and those captured in the control trap (P > 0.05) for all products tested. Zum Culex, three species were caught including Cx. decens, Cx. tritaeniorynchus und Cx. giganteus. Im Falle des Anopheles, three species were identified morphologically: Ein. squamosus, Ein. coustani, Ein. mascarensis und der Ein. gambiae complex or Ein. gambiae s.l was also captured, but not identified at species level. The total numbers of Anopheles gambiae s.l, und Anopheles species collected in the control and baited traps are shown in (Table 1).

Average number of mosquitoes and Anopheles spp. in baited traps

The average number of mosquitoes in baited traps was significantly different (F = 8.44, P < 0.001) for tested products. We observed two phenomena simultaneously: a decrease in insect captures that was associated with the duration of trapping. Mehr Anopheles malaria vectors were captured in the baited traps compared to the control in all cases. Die LSD multiple comparison test showed that traps baited with 4-hydroxycoumarin (2 mg) within the first trapping days and octenol (2 mg) in the second trapping period had the highest mean number of mosquitoes captured, 213 and 234 individuals, respectively. They were followed by 4-hydroxycoumarin (10 mg) with an average of 152 individuals during the third trapping period. The lowest number of captured mosquitoes was observed during the fourth and the fifth trapping period in the presence of the product combinations: 4-hydroxycoumarin (10 mg) plus octenol (2 mg) and 4-hydroxycoumarin (10 mg) plus octenol (2 mg) plus CO2. There were less than 30 individual mosquitoes captured with these blends however, these tests were performed at the end of the field experiment.

Significant differences were also observed for the average number of Anopheles spp. including anthropophilic and zoophilic species in the baited traps of the different products (F = 7.52, P < 0.001). LSD analysis showed that the traps with octenol (2 mg) had the highest average number of Anopheles spp. with 175 individuals, followed by 4-hydroxycoumarin with a mass of 2 mg and 10 mg with 114 and 128 individuals, respectively. As in the previous results, the mean number of Anopheles spp. was lower in the two combinations: 4-hydroxycoumarin (10 mg) plus octenol (2 mg) and 4-hydroxycoumarin (10 mg) plus octenol (2 mg) plus CO2 with only 10 and 20 individuals, respectively.

Comparison of average number of mosquitoes in control and baited traps

The effect of the tested products on the number of Anopheles vectors captured was examined and significant differences were observed between the number of the two malaria vectors together: Ein. gambiae s.l Plus Ein. mascarensis in the control and baited traps for the first test (P < 0.001) for 4-hydroxycoumarin (2 mg). The mean number of Ein. gambiae s.l Plus Ein. mascarensis in the baited trap was significantly higher with 30 individuals than that recorded in the control trap with 5 individuals. Similar results were also observed in the presence of 4-hydroxycoumarin (10 mg) in combination with octenol (2 mg) (P < 0.001) with a mean number of 5 individuals captured in the baited trap and 0 individual in the control trap. In the case of the other compounds, analysis showed no significant difference between the mean number of malaria vectors in the control and baited traps specifically because their number became too small.

Für jeden Anopheles species, results showed that there were significant differences between the mean number of Ein. gambiae s.l in both traps (P < 0.001) for 4-hydroxycoumarin (2 mg). The mean number of Ein. gambiae s.l in the baited trap was significantly higher with 24 individuals than that recorded in the control with 5 individuals. Similar results were also observed for the species Ein. mascarensis (P = 0.04) with the same compound using the same amount of 2 mg with a mean number of 7 individuals recorded in the baited trap and 0 individual in the control trap. It was the same in the case of Ein. gambiae s.l in the presence of the 4-hydroxycoumarin (10 mg) plus octenol (2 mg) combination (P = 0.012) (Fig. 2). Zum Ein. coustani und Ein. squamosus, statistically there was no significant difference between the mean number of mosquito individuals in the control and baited traps for all tested products.

Average (±SD) of the number of Ein. gambiae s.l, und Ein. mascarensis captured in control and baited traps. Asterix in the graph denotes that the mean number of individuals in baited traps is significantly higher than that in control traps at P < 0.05 beyogen auf t-test Analyse.

Comparing the mean number of individuals caught in the baited traps for each Anopheles species, analysis showed that statistically there were significant differences between the mean number of Ein. gambiae s.l for the different tested products (F = 18.48, P < 0.0001). The highest mean was recorded in the first test using 4-hydroxycoumarin (2 mg) with 24 individuals. It was lower for blend 4-hydroxycoumarin (10 mg), octenol (2 mg) and CO2 with only 2 individuals. Similar results were also observed for Ein. mascarensis (F = 3.75, P = 0.01) und Ein. squamosus (F = 9.34, P < 0.001) with respectively 7 and 33 individuals on average for 4-hydroxycoumarin (2 mg). Im Falle des Ein. coustani, significant difference was also observed between the mean number of individuals for the different tested products (F = 4.71, P = 0.007) but the highest average was recorded for octenol (2 mg) with 131 individuals.

Kairomone index

For 4-hydroxycoumarin (2 mg), the kairomone index was almost negligible for mosquitoes. It was less than 7%. This was especially observed for Anopheles spp. However, the KI was higher for the malaria vectors: Ein. gambiae s.l Plus Ein. mascarensis with 70%. For the same product but with a mass of 10 mg, KI for mosquitoes and Anopheles spp. were close to 50%. For malaria vectors, KI was 48%. Similar results were observed in the second test, octenol (2 mg), but the KI for mosquitoes, Anopheles spp. and malaria vectors ranged from 20% to 28% indicating no selectivity for malaria vector species. For the blend 4-hydroxycoumarin (10 mg) and octenol (2 mg), the KI for malaria vectors was higher with 72%, although of that Anopheles spp. was 25%. For mosquitoes, KI was very low with only 9%. The KI for mosquitoes was very low also in the case of the blend 4-hydroxycoumarin (10 mg), octenol (2 mg) and CO2. In this combination, KI of Anopheles spp. and malaria vectors were 24% and 33%, respectively.

Zum Ein. gambiae s.l, kairomone indexes were higher for 4-hydroxycoumarin (2 mg) and the blend 4-hydroxycoumarin (10 mg) and octenol (2 mg) with 64% and 70%, respectively. For 4-hydroxycoumarin (10 mg), KI of this Ein. gambiae complex was 48%. KI were low for octenol (2 mg) and the blend 4-hydroxycoumarin (10 mg), octenol (2 mg) and CO2 with less than 33%. Zum Ein. mascarensis, Kairomones indexes were very higher for 4-hydroxycoumarin (2 mg) and the blend 4-hydroxycoumarin (10 mg) and octenol (2 mg) with 95% and 100%, respectively. In contrast, KI of Ein. mascarensis were zero for the other products (Fig. 3).

Kairomone indexes (%) of Ein. gambiae s.l, und Ein. mascarensis for all tested products.

On average, the temperature recorded at the site during this study was about 19.8 °C and the relative humidity was around 81.8%. Statistically, no significant differences were observed between the averages of relative humidity during this experiment. A similar result was also found for the averages of temperature. However, temperatures observed in the last two sampling periods appeared to be lower than the others around 17 °C (Fig. 4).

Averages (±SD) Temperature (°C) and relative humidity (%) recorded during the sampling periods.


Danksagung

We are grateful to the community in the villages in Ulanga and Kilombero district for their participation in the study. We thank all our Ifakara Health Institute colleagues for their support during the work. We would like to extend our sincere gratitude to Prof. George Corliss for his constructive comments and English revision of this manuscript. EPAB was funded by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (Grant 88881.133584/2016-01) and AEE funded by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico of the Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (CNPq/MCTI) (Grant 310205/2014-0) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) (Grant PPM-00502-15). FOO was funded by a Wellcome Trust Intermediate Research Fellowship (Grant WT102350/Z/13/Z) and a Visiting Researcher Fellowship from CNPq/MCTI (Grant 42070/2013-2).


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