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Zellfarbstoff im roten Fluoreszenzspektrum

Zellfarbstoff im roten Fluoreszenzspektrum


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Es stehen einige Zellfarbstoffe zur Verfügung, um Zellen intrazellulär / membranständig zu färben. Andere Kanäle sind mir bekannt (CFSE PKH26). Aber ich möchte Zellen für die Durchflusszytometrie mit einem "roten" Farbstoff färben. Ich habe mir ein paar Optionen von Thermo angeschaut, aber zu beiden keine ausreichenden Daten gefunden.

Konkret plane ich, eine einzelne Zellpopulation mit zwei verschiedenen Farbstoffen zu färben, jede gefärbte Population dazwischen etwas anders zu behandeln, sie dann zusammen zu kultivieren und die Auslesungen später zu unterscheiden. Eine Antikörperfärbung für einen Oberflächenmarker wäre mit Fab-Fragmenten möglich (die Antikörper selbst können die Zellaktivierung während der Kultivierung stören). Daher würde ich eher einen Rotspektrum-Farbstoff wie CFSE oder PKH26 verwenden, da dies möglicherweise billiger und für eine sekundäre Verwendung mit anderen Zelllinien möglich ist.

Ich habe mehrere Zytometer zur Verfügung und die spezifische Emittanz spielt keine Rolle, da wir auswählen können, was allgemein möglich ist (LSR/Fortessa).

Daher suche ich einen Farbstoff mit Emittanz im roten Fluoreszenzspektrum, der über Färbeprotokolle verfügt, die für meine Zwecke angepasst werden können.

Ist jemand bereit, seine Erfahrungen zu teilen?

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  • Klargestellt, dass ich eine 'keine Antikörper-Färbung' brauche
  • Geklärte Frage bzgl. biologischer Fragestellung und FACS

Ich habe die CellTrace-Farbstoffe der Marke ThermoFisher verwendet. Konkret habe ich zwei Zellpopulationen co-kultiviert, eine mit CellTrace Far Red im APC-Kanal und eine andere mit CellTrace Yellow im PE-Kanal. Meine Wahl wurde teilweise von einer Produktbewertung eines anderen Labors geleitet, in der die relativ geringe Zytotoxizität dieser Produkte angepriesen wurde.

Das Protokoll ist ziemlich einfach. Es ist auch in CFSE und Violet erhältlich, obwohl ich diese nicht getestet habe. Diese Farbstoffe sind auch für Lymphozyten optimiert, daher würde ich eine Titration empfehlen, wenn Sie etwas anderes färben.

Die Farbstoffe sind ganz hell, und so gab es zum Beispiel Probleme mit dem Cotaining von APC-Cy7. Am Ende ließ ich meine CellTrace-Farbstoffe als einzige Markierungen auf ihren jeweiligen Lasern und stapelte meine Phänotypisierung auf den 355-nm- und 405-nm-Lasern.

Als Ausgleich kann man einfach bei Zellen bleiben, aber im Produkthandbuch für CellTrace heißt es jedoch:

"Die CellTrace™-Reagenzien diffundieren leicht in die Zellen und binden kovalent an intrazelluläre Amine, was zu einer stabilen, gut erhaltenen Fluoreszenzfärbung führt, die mit Aldehyd-Fixiermitteln fixiert werden kann."

Wenn Sie also die ArC-Amin-reaktiven Comp-Beads für LIVE/DEAD-Kits verwenden, können Sie möglicherweise einfach Comp-Beads daraus herstellen. Das prüfe ich bei Bedarf nach, wenn ich wieder arbeite, da ich es selbst noch nicht gemacht habe, aber ein netter Gedanke!


Es sind verschiedene Farbstoffe möglich, wie Sie in dieser Abbildung (von hier) sehen können:

Eine gute Übersicht findet sich in der Application Note Publication "Selecting Reagents for Multicolor Flow Cytometry" von BD (in Referenz 1) sowie in den Fluorochrome Specifications von BD (Referenz 2).

Verweise:

  1. Auswahl von Reagenzien für die Multicolor-Durchflusszytometrie
  2. BD Life Sciences Fluorochrom-Spezifikationen


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