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Suche nach einer einfachen und kostengünstigen Methode zum Färben von dNTP

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Ich möchte OD messen, um die Konzentration von dNTP zu kennen. Haben Sie eine Idee, dNTP zum günstigsten Preis und einfachsten zu färben?


Es kann einen solchen Farbstoff geben, aber ich bin mir dessen nicht bewusst. Die Standardmethode zur Messung von dNTPs und Nukleinsäuren im Allgemeinen ist die Absorption bei 260 nm. Dieser Artikel enthält eine Tabelle der molaren Extinktionskoeffizienten für dNTPs (Tabelle 10.2). Sie sind

Wellenlänge molarer Extinktionskoeffizient dATP 259 nm 15.200 dCTP 280 nm 13.100 dGTP 253 nm 13.700 dTTP 267 nm 9.600

In der Praxis für Routinearbeiten mit DNA können Sie 260 nm verwenden und davon ausgehen, dass eine Extinktion von 1 [DNA] = 50 µg ml . entspricht-1. Unter Verwendung eines Durchschnitts der Werte in der Tabelle und ohne Berücksichtigung der Tatsache, dass diese tatsächlich bei unterschiedlichen Wellenlängen liegen, und unter Verwendung eines ungefähren durchschnittlichen dNTP-MW von 500 berechne ich eine Extinktion für eine 50 µg ml-1 Lösung aller 4 dNTPs als 1.3, das ist also eine vernünftige Vereinbarung angesichts aller Annahmen, die ich gemacht habe.

Es gibt Fluoreszenzfarbstoffe, die zur Messung von DNA verwendet werden können, aber diese beruhen auf der Anwesenheit von gestapelten Basen und sind daher für freie dNTPs nicht geeignet.

Also schlechte Nachrichten, wenn Sie kein UV-Spektrophotometer haben. Es gibt Pläne für den Bau einfacher Spektralphotometer aus Lego und einigen optoelektronischen Komponenten. Diese neigen dazu, LEDs als Lichtquelle zu verwenden, aber ich weiß nicht, ob UV-LEDs verfügbar sind.


Es wird schwierig sein, die zur Unterscheidung von dNTPs erforderliche Wellenlängenauflösung zu erreichen, wenn man bedenkt, dass Sie ein DIY-Experiment durchführen. Nur sehr präzise Spektralphotometer können dies erreichen und sind teuer.

Eine andere Technik, die Sie ausprobieren können, ist die Dünnschichtchromatographie (DC). Es ist billig und Sie können leicht ein DIY machen. Aber man braucht Standards, um NTP, NDP und NMP zu unterscheiden; die beiden letztgenannten können aufgrund von Abbau während des Experiments entstehen. Menschen verwenden im Allgemeinen einen Cocktail aus Antioxidantien und Schutzmitteln, um den Abbau von Nukleotiden zu minimieren.

Eine Strategie, um dies zu erreichen, besteht darin, das Phosphat mit Phosphatase zu entfernen und dann eine TLC mit Nukleosiden (die ziemlich stabil sind) durchzuführen.

Sie können diese Überprüfung auf Nukleinsäure-DC überprüfen.


Praktische Einführung in die Elektrophorese für die Biologie

Das Labor, in dem ich arbeite, interessiert sich für die Mechanik grundlegender biologischer Prozesse mit Hefe als Modellorganismus.

Ein guter Freund, von Beruf Physiker und Technikmarketing-Führungskraft, wird hoffentlich zu mir ins Labor stoßen. Dies sind meine informellen Notizen an ihn, um ihn praktisch für unser Labor auf den neuesten Stand zu bringen und sich zunächst auf klassische Methoden der Golden Oldies zu konzentrieren. Ich hoffe, dass er und andere, die an einem solchen Karriereübergang in ein Biolabor interessiert sind, diese praktische Einführung ebenfalls nützlich finden.


Abstrakt

In dieser Arbeit wendeten wir eine Blitzphotolysetechnik an, um das kinetische Verhalten eines synthetischen Flavyliumsalzes in wässriger Lösung zu untersuchen. Die kinetischen Prozesse, die durch den Lichtpuls eines üblichen Kamerablitzes ausgelöst werden, werden mit einem leicht modifizierten, computergesteuerten Spektralphotometer verfolgt. Licht induziert reversible Extinktionsänderungen und zwei verschiedene transiente Spezies werden vor der vollständigen Erholung des Systems nachgewiesen. Das kinetische Verhalten und die Spektren der transienten Spezies werden berichtet. Das vorgeschlagene Experiment ist billig und einfach und ermöglicht es Schülern aller Niveaus, sich mit den Konzepten der transienten Zerfallskinetik und zeitaufgelösten Spektren vertraut zu machen.


Den Färbeprozess mit Synthetischer Biologie überdenken

20 % der Wasserverschmutzung der Erde werden durch die Textilverarbeitung verursacht und 1.800 Gallonen Wasser werden benötigt, um eine einzige Blue Jeans herzustellen. Das ist eine unglaubliche Menge an Frischwasser, die benötigt wird, um ein einziges Kleidungsstück herzustellen – aber die Branche steht kurz davor, sich zu ändern.

Colorifix mit Sitz in Großbritannien möchte die Wasserverschwendung während des Färbeprozesses reduzieren, indem es die biologischen Fähigkeiten von Mikroben nutzt.

„Im Rahmen eines von der University of Cambridge geleiteten Arsen-Biosensor-Projekts reiste unser Team mit unserem Prototyp-Biosensor nach Südasien, erklärte den Leuten, wie er funktioniert, und bat die Leute dann um eine Liste von Chemikalien, die ihrer Meinung nach eine Überwachung wert wären“, sagt Dr. Orr Yarkoni, Mitbegründer und CEO von Colorifix.

„Als wir [nach Großbritannien] zurückkamen und unsere Hausaufgaben machten, stellten wir fest, dass die meisten dieser Chemikalien aus der Textilindustrie stammten und das Färben der Hauptgrund sowohl für den Wasserverbrauch als auch für den Chemikalienverbrauch war“, sagt Yarkoni, der dann entschied die synthetische Biologie zu verwenden, um die Farbstoffe herzustellen und Verunreinigungen zu reduzieren, anstatt sie einfach zu überwachen.

Nach einigen Jahren der Forschung mit Dr. James Ajioka und Dr. David Nugent wurde Colorifix im Jahr 2016 ausgegliedert. Der wissenschaftliche Fortschritt war schnell und das Team suchte schnell nach Möglichkeiten, die durch die Textilindustrie verursachten Umweltschäden zu reduzieren Herstellung von Farbstoffen.

Drs. Nugent (links) und Ajioka (rechts) im Colorifix-Labor in Norwich, England. Bild mit freundlicher Genehmigung von Colorifix.

„Normalerweise wird [das Aufbringen eines Farbstoffs auf Stoff] mit Chemikalien oder biologisch hergestellten Verbindungen durchgeführt, jedoch ohne einen biologischen Wirkstoff. Wir verwenden die Zellen selbst, um das Pigment sowohl zu produzieren als auch in die Faser einzulagern, also verwenden wir die Biologie für den gesamten Prozess. Dadurch können wir Wasser und Energie sparen und Chemikalien entfernen. Wir nutzen die Biologie, um diese Pigmente und Farbstoffe in die Faser zu übertragen“, erklärt Yarkoni.

Bisher hat Colorifix eine Reihe von Farben entwickelt, die jeweils aus natürlichen Pigmenten gewonnen werden.

„Die meisten unserer Pigmente stammen heute von Insekten, einige mikrobiologische, Vögel und so weiter. Also ja, wir suchen derzeit überall nach Pigmenten. Wir haben auch einige Pigmente aus Unterwasserorganismen hergestellt“, sagt Yarkoni, der schnell darauf hinweist, dass der wahre Vorteil von Colorifix der einzigartige Färbeprozess ist, mehr als die Herstellung biobasierter Pigmente.

In einem früheren Interview mit Vogue Australia betonte Yarkoni, dass ihr Färbeprozess zehnmal weniger Wasser verbraucht und 20 Prozent weniger Energie verbraucht, hauptsächlich weil das Unternehmen Melasse, ein Zuckernebenprodukt, verwendet, um die pigmentproduzierenden Mikroben zu füttern und das Fixieren ersetzt. Chemikalien mit Biologie selbst. Der normale Textilfärbeprozess läuft oft bei sehr hohen Temperaturen – weit über 100 Grad Celsius – ab, was viel Energie verbraucht. Die Mikroben von Colorifix können bei 37 Grad färben und dann bei deutlich unter 100 Grad hitzeinaktiviert werden, was Energie spart. Doch damit will das Unternehmen nicht aufhören.

Ein Muster farbiger Textilien aus dem biobasierten Färbeverfahren von Colorifix. Bild mit freundlicher Genehmigung von Colorifix.

„In Bezug auf Wasser freuen wir uns, dass wir nun sowohl die Fermentation als auch das Färben ausschließlich mit Salzwasser erfolgreich pilotiert haben, sodass wir jetzt kein frisches Wasser berühren müssen“, kündigte Yarkoni an.

Das ist ein großer Sprung für die Textilindustrie und könnte während des Färbeprozesses Tausende Liter Süßwasser einsparen. Das Beste daran ist, dass trotz dieser Energie- und Wassereinsparungen der Prozess zum Färben eines Textils weitgehend unverändert bleibt.

„Unsere Färbeflotte geht im Wesentlichen in ihre vorhandene Färbemaschine – sie sind alle kompatibel –, also müssen sie nur die Färbeflotte in ihrer Maschine wechseln“, sagt Yarkoni und bezieht sich auf die wässrige Lösung von Chemikalien, die zum Färben von a Kleidungsstück. „Der einzige Unterschied besteht darin, dass [die Färberei] alle anderen Chemikalien loswerden kann, da der Organismus den Farbstoff fixiert und den Stoff ohne diese Chemikalien färbt.“

Von Denim bis Farbstoffen und allem, was dazwischen liegt – Unternehmen der synthetischen Biologie antworten auf die Rufe einer verschwenderischen Industrie. Unternehmen wie Tinctorium, PILI und Colorifix finden alternative Wege, um dieselben leuchtenden Farben zu erzeugen, die den Verbrauchern gefallen, ohne zusätzliche Toxizität, Chemikalien und Umweltverschmutzung.

Wir treten in einen entscheidenden Moment in der Modebranche ein, in dem biobasierte, nachhaltige Alternativen der neue Trend sein werden.

Niko McCarty

Niko ist Doktorand im Bereich Bioengineering am California Institute of Technology. Zuvor absolvierte er seinen Master in Systems and Synthetic Biology am Imperial College London als Fulbright-Stipendiat.


ERGEBNISSE

Übersicht und Optimierung des DocMF-Systems

Das neuartige DocMF-System misst Protein-DNA-Interaktionen, indem es die Fluoreszenzsignaländerung mittels sequenzieller Bildgebung auf dem Chip vor und nach der Proteininteraktion mit DNBs untersucht, die DNA-Targets enthalten (Abb. 1 und Film S1). Die DNBs bestehen aus Sequenzierungsadaptern und Inserts von Zufallssequenzen, um den gesamten Bereich der Proteinbindungsstellen abzudecken. Hunderte Millionen DNBs werden zuerst in einem gemusterten Array auf die BGISEQ500-Chips geladen, und die Insert-Regionen werden mit dem DNBSeq-Workflow in einer festen Länge sequenziert (16). Nachdem wir die einzigartigen Sequenzinformationen für jede DNB erhalten haben, reformieren wir einzelsträngige DNBs (ssDNBs), indem wir den bei der Sequenzierung synthetisierten farbstoffmarkierten Strang abziehen. Anschließend wird ein nativer Komplementärstrang zur Bildung von dsDNA resynthetisiert und mit Fluoreszenzfarbstoffen endmarkiert. Für DNA-spaltende Proteine ​​wird ein erstes Bild aufgenommen, um den Ort und die Signalintensität einzelner DNBs, d. h. Reads, aufzuzeichnen. Das interessierende Protein bindet an seine dsDNA-Ziele und spaltet entsprechende DNBs, was zu einer Signalreduktion oder Eliminierung dieser DNBs während einer zweiten Runde der Bildgebung führt ( 1A ). Spezifische Motive können aus den Sequenzen ausgewählter DNBs mit Signaleliminierung oder -reduktion größer als ein Schwellenwert identifiziert werden ( 1B ) und in nachfolgenden molekularen Assays verifiziert werden. Ein leicht modifizierter DocMF-Workflow wird verwendet, um Protein-DNA-Bindungspräferenzen zu charakterisieren. In diesem Protokoll werden DNBs zuerst abgebildet, nachdem endmarkierte dsDNA mit DNA-bindenden Proteinen für die anfängliche Signalintensität inkubiert wurde. Im folgenden Schritt wird eine zusätzliche Polymerasereaktion namens MDA durchgeführt, um den markierten Strang zu ersetzen. MDA führt zu einem Signalverlust während des zweiten Bildgebungsschrittes, wie in Abb. 1 dargestellt. S1. Wenn jedoch ein interessierendes Protein an seine DNA-Ziele bindet und MDA hemmt, bleibt das Signal der DNBs mit Proteinbindungsstellen unverändert oder wird weniger beeinflusst als das der Kontrollspur, die keine Proteininkubation beinhaltet, aber die anderen Schritte beibehält. .

Um sicherzustellen, dass eine sequentielle Bildgebung möglich ist, ist es entscheidend, dass der Stripping-Schritt die räumlichen Informationen nicht beeinflusst oder die DNB-Struktur beschädigt. Die in diesem Experiment verwendeten BGISEQ500-Chips sind gemusterte Arrays. Daher beeinflusst die sequentielle Bildgebung die Registrierung von DNB-Standorten nicht im gleichen Maße wie die CHAMP-Methode mit Miseq-Chips (11). Darüber hinaus haben wir eine Vielzahl von Stripping-Puffer getestet und festgestellt, dass der Formamid-Puffer den geringsten Einfluss auf die DNB-Integrität hatte, indem er nur die Wasserstoffbrücken zwischen dsDNA brach, ohne die DNB-Stabilität zu beeinträchtigen oder DNBs von der Oberfläche abzulösen. Abbildung S2 zeigt, dass die Sequenzierungsqualitäts-Scores, einschließlich Q30 (92,83 vs. 90,32), Lag (0,15 vs. 0,15) und RunOn (0,15 vs. 0,12), nach dem Strippen mit Formamidpuffer unbeeinflusst blieben. Im Vergleich dazu senkte der Stripping-Puffer mit NaOH das Q30 signifikant von über 90 % auf fast 0.

Nachdem wir zwei Bilder vor und nach der Protein-DNA-Interaktion erhalten hatten, verglichen wir direkt die Veränderung der Rohsignalintensität jeder DNB. Wenn das Protein DNA spaltet, können die DNBs, die eine signifikante Signalreduktion aufweisen, wiedergewonnen werden (Abb. 1B) und die entsprechenden Sequenzen werden zur Motividentifikation analysiert (Materialien und Methoden). Um Protein-DNA-Bindungsinteraktionen zu messen, erhielten wir die Bindungssequenzinformationen von diesen DNBs mit minimaler Änderung der Signalfalte im Vergleich zur Kontrolle.

DocMF kann eine breite Palette von Endonuklease-Restriktionsschnittstellen (RSs) charakterisieren

Nachdem das System etabliert war, testeten wir sechs Restriktionsendonukleasen (Eco RI, Bpu 10I, Age I, Nme AIII, Mlu I und Bgl I) mit unterschiedlichen RS-Eigenschaften. Die Restriktionsenzyme vom Typ II spalten DNA neben oder innerhalb ihrer Erkennungsstellen (21), die ausführlich untersucht wurden. Die ausgewählten Enzyme enthalten Restriktionsschnittstellen (RSs) im Bereich von 6 bis 11 bp und umfassen normale palindromische Sequenzen, nicht-palindromische Sequenzen und degenerierte Basen. Die DNB-Bibliothek enthält einen Pool von synthetischen Zufalls-DNA-Fragmenten mit einer Länge von 50 nt. Vierzig der 50 Nukleotide dieser Zufallssequenzen wurden unter Verwendung des BGISEQ-500RS High-Throughput Sequencing Set (SE100) gelesen. Bilder wurden vor und nach der Inkubation dieser Enzyme auf dem Chip für 2 Stunden oder über Nacht aufgenommen. DNBs mit FFI > 2 Schwellenwert (positive Reads) wurden identifiziert, um nach Motiven zu screenen (siehe Materialien und Methoden).

Die genaue Länge der Restriktionsschnittstellen (RSs) (L) wurde über eine „Seed-Assembly“-Methode (Materials and Methods) erhalten. Wir haben dann die Site-Raten aller berechnet L-mers unter positiven Reads (Materialien und Methoden). Mit dieser Methode erhielten wir für jede dieser sechs Restriktionsendonukleasen die Site-Raten aller L-mers (L ist die vorhergesagte Länge eines RS) und zeichnete ein Boxplot für die L-mers mit den 50 größten Site-Raten (Abb. 2A). Die den Ausreißern im Boxplot entsprechenden Motive (in Abb. 2A orange eingefärbt) mit der Summe der Stellenhäufigkeit dieser Ausreißer (in Abb. 2A grün eingefärbt) >80% wurden als die von DocMF vorhergesagten Restriktionsschnittstellen (RSs) angesehen. . Somit erhielten wir für Eco RI, Bpu 10I, Age I, Nme AIII und Mlu I ihre Restriktionsschnittstellen (RSs) aus den in 2A gezeigten Ausreißern, da die Summen der Site-Raten dieser Ausreißer alle größer als 80% waren. . Für Bgl I betrug die Site-Rate-Summe der Ausreißer jedoch nur 7,65 %, was zu klein ist, um mit DocMF als Restriktionsschnittstellen (RSs) vorhergesagt zu werden. Daher verwendeten wir für Bgl I die 11-mers (weil 11 die vorhergesagte Länge der RS ​​ist) mit den höchsten 372 größten Site-Raten, um die Restriktionsschnittstellen (RSs) vorherzusagen. Die Site-Rate-Summe dieser 372 Motive war größer als 80 % (Abb. 2B). Eine Sequenz (19)-Darstellung (Fig. 2C) dieser 372 Sequenzen zeigte, dass die RS für Bgl I GCCNNNNNGGC war, was mit der berichteten RS übereinstimmte. Diese Ergebnisse zeigten, dass unser System in Verbindung mit einer optimierten bioinformatischen Methode die DNA-Erkennungsstelle für verschiedene Arten von Restriktionsenzymen zuverlässig identifizieren kann.

(EIN) Boxplots für die Motive mit den Top 50 log10(Standortpreise). Die DNA-Sequenzen der Ausreißer (orange) und die Summe der Ortsraten der Ausreißer (grün) werden angezeigt. (B) Kumulierte Standortpreise für Bgl I. (C) Eine Sequenzlogo-Darstellung der 372 Motive für Bgl I.

DocMF kann das 5′-NGG-3′ PAM von SpCas9 . genau identifizieren

CRISPR-Cas-Effektoren sind RNA-gesteuerte Endonukleasen, die eine PAM als DNA-Bindungssignal verwenden. Die PAM ist eine kurze DNA-Sequenz, normalerweise weniger als 7 bp, die in der Nähe der Ziel-DNA (als Protospacer bezeichnet) des CRISPR-Cas-Systems sitzt (22, 23). Ein weit verbreiteter PAM-Identifikationsansatz transformiert Plasmide, die randomisierte PAM-Sequenzen tragen, in E coli in Gegenwart oder Abwesenheit des CRISPR-Cas-Locus. Die Häufigkeit einer funktionellen PAM-Sequenz ist deutlich geringer, wenn das Cas-Protein vorhanden ist (24). Dieser PAM-Depletion-Assay (24) erfordert zwei Sätze von Bibliotheken für die 5'- oder 3'-PAM-Identifizierung und entsprechende Negativkontrollen. Die Bibliotheksgröße muss auch groß sein, um die meisten, wenn nicht alle PAM-Sequenzen abzudecken. Darüber hinaus wird der Plasmid-Depletion-Assay (24) ist zeitaufwendig und hat einen geringen Durchsatz. Im Gegensatz dazu kann das DocMF-System in einem einzigen Experiment gleichzeitig sowohl 5′- als auch 3′-Sequenzen auf PAMs durchsuchen, wodurch eine Abdeckung erzeugt wird, die um mehrere Größenordnungen größer ist als die herkömmliche Methode. Als interne Negativkontrolle dient eine der beiden PAM-Regionen, die vom Protein nicht erkannt wird.

In einer Machbarkeitsstudie haben wir die Genauigkeit von DocMF bewertet, indem wir die PAM-Anforderungen von SpCas9, dem am weitesten verbreiteten CRISPR-Cas-System, bewertet haben S. pyogenes. SpCas9 spaltet die dsDNA nach Bindung an die entsprechende RNA, und diese Spaltung wird aus PAM-Depletionsassays als abhängig von einer 5'-NGG-3'-PAM-Sequenz berichtet (25). Die in DocMF verwendete PAM-DNB-Bibliothek ist in Fig. 3A gezeigt. Die synthetische Oligoregion enthielt eine bekannte 23-nt-SpCas9-Protospacersequenz (in 3A orange gefärbt), flankiert von 5'- und 3'-PAM-Regionen mit jeweils 15 zufälligen Nukleotiden (in 3A grün gefärbt). Die Sequenzinformationen beider PAM-Regionen wurden durch eine Single-End-Sequenzierung von 50 nt erhalten.

(EIN) Abbildung zur Vorbereitung der PAM DNB-Bibliothek. Die synthetische Oligo-Region enthält eine bekannte 25-nt-SpCas9-Protospacer-Sequenz (orange), flankiert von 5'- und 3'-PAM-Regionen mit jeweils 15 zufälligen Nukleotiden (grün). Hunderte von Kopien jedes zufälligen PAM-flankierten Protospacers werden pro DNB eingebaut, und nur die Kopie wird demonstriert. (B) Die relative Lesehäufigkeit sowohl am 5′-Ende als auch am 3′-Ende für SpCas9. Die x Achse sind alle Kombinationen von 7-nt-Sequenzen, sortiert nach der Differenz zwischen zwei Enden in absteigender Reihenfolge. (C) PAM-Sequenz für SpCas9.

Die Signalfaltenänderung wurde vor und nach SpCas9-Inkubation auf dem Chip für 4 Stunden verglichen. Von 494.866.059 Reads (DNBs) erhielten wir 366.913 DNBs, die eine Faltungsänderung von mehr als 3 aufwiesen und potenziell von SpCas9 gespalten werden könnten. Die 7-nt-Sequenzen sowohl in 5'- als auch in 3'-PAM-Regionen wurden aus diesen DNBs zur weiteren Analyse abgerufen. Die Häufigkeit aller 16.384 (4 7 ) PAM-Kombinationen für sowohl 5'- als auch 3'-PAMs wurde berechnet und gegen die individuelle Sequenz in Fig. 3B aufgetragen. Es wurde berichtet, dass SpCas9-Endonuklease nur an das 3'-Ende der Zielsequenz bindet. Daher wurden 5'-randomisierte 7-nt-Sequenzen als interne Negativkontrolle verwendet. Wir haben die Drei-Sigma-Regel (26) zu den 5′-Sequenzen, um den Cutoff für positive PAM-Signale zu definieren. Mit anderen Worten, beim Cutoff von 0,11 fielen ungefähr 99,7% der Daten aus dem 5′-PAM-Bereich in Hintergrundrauschen. Dieser statistische Cutoff führte zu 944 3'-PAM-Sequenzen, die vorzugsweise von SpCas9 geschnitten wurden. Ein Sequenzlogo (19) die Darstellung der Sequenzen zeigte, dass SpCas9 ein 5'-NGG-3'-Motiv bevorzugt, obwohl etwa 5,8 % (55 von 944) von 5'-NAG-3′ und 1,6 % (15 von 944) von 5'-NGA- 3′ konnte ebenfalls erkannt werden (Abb. 3C), was mit früheren Erkenntnissen übereinstimmt (2729).

DocMF ermöglicht den sensitiven In-vitro-Nachweis von PAMs in verschiedenen CRISPR-Cas-Systemen

Um den Nutzen von DocMF beim Auffinden von PAM-Sequenzen weiter zu demonstrieren, haben wir unsere Studie auf zwei bisher nicht charakterisierte CRISPR-Cas-Systeme ausgedehnt, VeCas9 von Veillonella Gattung und BvCas12 aus Butyricimonas virosa (24). VeCas9 hat ein Cas9-Effektorprotein von 1064 Aminosäuren, und das BvCas12-Protein hat eine Länge von 1245 Aminosäuren. Beide Proteine ​​wurden exprimiert und gereinigt, wie in den ergänzenden Materialien und Methoden beschrieben. Die crRNA und tracrRNA von VeCas9 wurden durch Small-RNA-Sequenzierung identifiziert, während die crRNA von BvCas12 in silico basierend auf den zuvor berichteten Cas12a/Cpf1-Orthologen vorhergesagt wurde (Abb. S3). Um die Diversität ihrer PAM-Sequenzen abzufragen, führten wir DocMF auf VeCas9 und BvCas12 unter Verwendung derselben DNB-PAM-Bibliothek (Abb. 3A) durch, die in der SpCas9-Studie verwendet wurde. Für VeCas9-Experimente haben wir drei individuelle gRNA-Designs eingeschlossen, crRNA:tracrRNA, sgRNA-1 mit SpCas9-Struktur und eine verkürzte sgRNA-2 (Abb. S3).

Vor der Verwendung von DocMF wird ein PAM-Depletion-Assay (24) wurde erstmals auf VeCas9 zum Methodenvergleich durchgeführt (Ergänzende Materialien und Methoden). Wie in Abb. S4 (A und B) mit 4,62 GB Sequenzierungsdaten beobachteten wir 508 Sequenzen mit einem Schwellenwert von 3 für Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1 (AacC2c1), eine positive Kontrolle im Depletionsassay, und identifizierte korrekt das gemeldete PAM, 5′-TTN-3′ (24). Bei noch mehr Sequenzierungsdaten (7,33 Gb) für VeCas9 wurden jedoch 0 und 74 verschiedene Sequenzen mit Schwellenwerten von 3 bzw. 0,8 gefunden (Abb. S4, C und D). Die Ergebnisse für VeCas9 waren unseren Negativkontrollsätzen ziemlich ähnlich (Daten nicht gezeigt), und daher konnten wir mit der traditionellen Depletionsmethode keine korrekten PAM-Sequenzen für VeCas9 erkennen. Das Versagen könnte entweder einer schwachen VeCas9-Proteinexpression oder einer Funktion in zugeschrieben werden E coli Zellen. Außerdem ist die geringe Empfindlichkeit (

20-fache Abdeckung für jede 7-nt-PAM-Sequenz) der E coli Depletion-Assay könnte die Probleme nur verschlimmern.

Unter Verwendung von DocMF wurden DNBs mit Signalfaltungsänderung über dem Schwellenwert für die weitere Analyse ausgewählt. Im Read-Frequenz-Plot (Abb. 4, A und B) zeigten die 5'-PAM-Region von VeCas9 (mit sgRNA-1) und die 3'-PAM-Region von BvCas12 kein Proteinbindungsmuster, und ihre entsprechenden 3 SDs (0,09 für VeCas9 und 0,075 für BvCas12) wurden verwendet, um Cutoff-Linien zu setzen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass 4947 und 5580 einzigartige PAM-Sequenzen von VeCas9 bzw. BvCas12 gespalten werden. Beide CRISPR-Cas-Systeme übermittelten große PAM-Familien, wie in Konsensussequenzen und Sequenzlogo dargestellt, zwei gängige PAM-Berichtsschemata (Abb. 4, C bis E und G) (22, 23). Die Konsensussequenzen von VeCas9 wurden als 5'-NNARRNN-3' oder NYARRMY für einen noch dominanteren Satz von PAM-Sequenzen durch Frequenzdiagramm (Fig. 4C) identifiziert, während das Sequenzlogo 5'-NNNRR-3'-PAM-Sequenzen berichtete ( Abb. 4E). VeCas9 zeigte mit den anderen gRNAs ein ähnliches Muster (Abb. S5). Über 99% der PAMs mit der kurzen sgRNA-2 wurden mit mindestens einer der beiden anderen RNAs gefunden, was auf die hohe Reproduzierbarkeit dieser DocMF-Methode hinweist. Leichte Unterschiede in der PAM von BvCas12 wurden auch zwischen den PAM-Meldemethoden beobachtet. Konsenssequenz und Sequenzlogo berichteten über 5'-TYTN-3' (Fig. 4D) bzw. YYN (Fig. 4G). Diese beiden Meldesysteme ignorierten jedoch die Korrelation zwischen allen sieben Positionen und könnten einige falsche aktive PAMs einführen, wenn jede Position zufällig kombiniert wird.

(EIN) Die relative Lesehäufigkeit sowohl am 5′-Ende als auch am 3′-Ende für VeCas9. (B) Die relative Lesehäufigkeit sowohl am 5′-Ende als auch am 3′-Ende für BvCas12. Konsens-PAM-Sequenz nach Frequenzdiagramm mit allen erkannten 7-nt-Sequenzen für VeCas9 (C) und BvCas12 (D). PAM-Sequenz nach Sequenzlogo für VeCas9, das von allen erkannten 7-nt-Sequenzen generiert wurde (E) und durch die Top 1000 7-nt-Sequenzen aus der FET-Analyse (F). PAM-Sequenz nach Sequenzlogo für BvCas12, das von allen erkannten 7-nt-Sequenzen generiert wurde (g) und durch die Top 1000 7-nt-Sequenzen aus der FET-Analyse (h). (ich) In-vitro-Validierung von VeCas9-PAM-Sequenzen. Neun 7-nt-Sequenzen jeweils oberhalb/unterhalb des Cutoffs wurden ausgewählt. Die FET-Ranking-Nummern werden in Rot angezeigt. NC, negative Kontrolle. (J) In-vitro-Validierung von BvCas12-PAM-Sequenzen. Fünf 7-nt-Sequenzen oberhalb des Cutoffs und zwei 7-nt-Sequenzen unterhalb des Cutoffs wurden ausgewählt.

Um die relative Aktivität jedes PAM abzufragen, wurden zwei Methoden angewendet, FET und das PAM-Rad. FET wurde eingeführt, um die PAM-Sequenzen zu sortieren. FET ist ein weit verbreiteter Test, um festzustellen, ob der Unterschied zwischen zwei Gruppen signifikant ist. Daher ist ein bestimmtes PAM mit einem kleineren P Wert gemäß FET zeigte, dass seine relative Lesefrequenz oder Schneideffizienz signifikanter war im Vergleich zu einem mit einem größeren P Wert. Nach dem Einordnen der PAMs in der Reihenfolge untersuchten wir die Konsensus-PAM-Sequenzen für die Top 1000 Sequenzen ( 4 , F und H). Unter diesen strengen Selektionskriterien wurde eine leicht unterschiedliche PAM-Konsensussequenz, 5'-NNARR-3' für VeCas9 und 5'-TTTN-3 für BvCas12 beobachtet, die besser mit den Ergebnissen der Frequenzdarstellung korrelierte (Abb. 4, C und D'). ). Um die FET-Vorhersage weiter zu validieren, wurde ein In-vitro-Nuklease-Assay mit zufällig ausgewählten PAM-Sequenzen durchgeführt. PCR-Produkte, die einzelne PAMs und einen gemeinsamen Protospacer enthielten, wurden entweder mit Cas9- oder Cas12/Cpf1-Proteinen bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert. Reaktionen mit 50 ng Input wurden auf TAE-Gelen durchgeführt und die verbleibende Inputmenge wurde verwendet, um die Spaltungseffizienz zu berechnen. Wie in Abb. 4 (G und H) gezeigt, hatten die PAMs mit höheren FET-Ranking-Zahlen (in Rot) weniger Input übrig, was auf eine bessere Schneideffizienz hinweist. Das am wenigsten eingestufte PAM ergab ein minimales Schneiden, dessen Produkt auf Agarosegelen, deren Empfindlichkeit um mehrere Größenordnungen niedriger ist als bei NGS, fast nicht sichtbar war. Die Konsistenz legte nahe, dass wir unsere FET-Vorhersage verwenden könnten, um die aktivsten PAMs für die In-vivo-Gen-Editierung auszuwählen.

Ein PAM-Rad wurde auch verwendet, um die PAM-Sequenzen und ihre Basenabhängigkeit umfassend zu verstehen. Das aus interaktiven Krona-Plots abgeleitete PAM-Rad erfasst einzelne PAM-Sequenzen und ihre relative Aktivität, einschließlich derjenigen mit geringer Anreicherung (20). Es kann auch auf jeden Sektor des Rads erweitert werden, um eine Teilmenge von Sequenzen besser anzuzeigen und die Funktion dieser PAMs zu untersuchen. Abbildung 5 (A und B) zeigt die jeweiligen PAM-Räder für VeCas9 und BvCas12. Für VeCas9 besteht eine starke Basenabhängigkeit zwischen Position 3 und 4. Wenn Position 3 eine Basis R (A oder G) hatte, hatte Position 4 tendenziell R (>80% Abb. S6) und ein kleines, aber bemerkenswertes Niveau von C ( >0%). Wenn Position 3 Y (T oder C) ist, begünstigt Position 4 nur R (

99%). T ist die am wenigsten bevorzugte Base an Position 4 oder 5, was mit den in vitro-Schneidergebnissen aus Fig. 5C (Bahnen 9 und 10) übereinstimmt. Das Gel zeigte auch, dass NYARRMY (das Konsensus-PAM basierend auf der dominantesten Konsensussequenz, Spur 1 in Fig. 4C), NNARRNN (Spuren 2 bis 4) und ACAAGCC (Sequenz mit 58. Rang als positive Kontrollspur 11) effizienter geschnitten wurden als NNCRRNN (Spur 5), NNTRRNN (Spur 6) oder NNGRRNN (Spur 7), was erklärt, warum A 47% an Position 3 ausmachte, während die anderen drei Basen jeweils zwischen 16 und 19% lagen (Abb. 5A und Abb. S6 .). ). Für das in Abb. 5B gezeigte BvCas12-PAM-Rad fanden wir, dass Position −4 zufällig war, wenn beide Positionen −2 und −3 Y (T/C) waren. Somit erzeugte PAM YYN mehr Schneidprodukte als YRN in Fig. 5D (Bahnen 1 und 2). Position −4 war jedoch tendenziell T, wenn eine der −2 oder −3 Positionen nicht Y war. Als Ergebnis beobachteten wir etwas mehr Schneiden mit T als V an Position −4, wenn Position −2 und −3 entweder . sind RY oder YR (Fig. 5D Spuren 7 bis 10). R an Position −2 diktierte auch, dass Position −3 Y sein wird (100% Abb. S6). Wie in Fig. 5D gezeigt, zeigte das BvCas12-System klares Schneiden auf 5'-TTTN-3' oder TYTN (Fig. 5D). Unsere Daten legten nahe, dass sowohl VeCas9 als auch BvCas12 über einen Satz entspannter PAM-Sequenzen verfügten, die umfassend von DocMF erfasst wurden.

(EIN) PAM-Rad für VeCas9. Das obere gelbe Kästchen gibt einen Hinweis auf jede Position der PAM-Sequenz und der Pfeil veranschaulicht die Orientierung jeder Base. Die Fläche eines Sektors des Rings für eine Basis an einer bestimmten Position repräsentiert ihre Frequenz an dieser Position. (B) PAM-Rad für BvCas12. (C) In-vitro-Validierung von VeCas9 PAM-Radergebnissen. NYARRMY ist die Konsensussequenz basierend auf der Positionshäufigkeit, während ACAAGCC die 58. FET-Rangsequenz ist, die als Positivkontrolle enthalten ist. (D) In-vitro-Validierung von BvCas12 PAM-Radergebnissen. NNNTTTN oder NNNTYTN ist die Konsensussequenz basierend auf der Positionshäufigkeit, während AATTTTG die 70. FET-rangierte Sequenz ist, die als Positivkontrolle eingeschlossen ist. NC (Negativkontrolle): positive PAMs, inkubiert mit entsprechendem Protein, aber ohne jegliche sgRNA.

DocMF kann Proteinbindungsstellen genau identifizieren

Protein-DNA-Wechselwirkungen wurden in vielen Hochdurchsatz-Plattformen charakterisiert, darunter Microarrays, HT-SELEX und CHAMP (4, 11). Wir haben den oben erwähnten DocMF-Workflow modifiziert, um Protein-DNA-Bindungsmotive zu erkennen. Die Schritte blieben unverändert, bis der natürliche Komplementärstrang zur Bildung von 50-bp-dsDNA neu synthetisiert und mit Fluoreszenzfarbstoffen endmarkiert wurde. Nachdem wir das interessierende Protein an seine dsDNA-Targets gebunden und jeglichen Überschuss abgewaschen hatten, nahmen wir die ersten Bilder auf, um die Signalintensität aufzuzeichnen. Nach dieser ersten Bildgebung wurde eine On-Chip-Inkubation mit MDA-Reaktionspuffer, dNTPs und einer Polymerase mit starker Strangverdrängung bei 30°C für 30 min durchgeführt, um einen zweiten komplementären Strang unter Verwendung des ssDNB als Matrize zu synthetisieren (Abb. S1). Folglich würde der ursprüngliche fluoreszierende Strang ersetzt und von den DNBs verdrängt, was zu einem Signalabfall führte, wenn keine Proteinbindung vorhanden war, um MDA zu verhindern. Um diese Idee zu testen, verwendeten wir ein gut untersuchtes Protein, dCas9, und entfernten seine Endonukleaseaktivität durch Punktmutationen in seinen Endonukleasedomänen HNH und RucV (17). Die Punktmutationen D10A und H840A veränderten zwei wichtige Reste für die Endonukleaseaktivität, was letztendlich zu ihrer Deaktivierung führt. Obwohl dCas9 keine Endonuklease-Aktivität aufweist, bleibt es in der Lage, an seine gRNA und den DNA-Strang zu binden, auf den abgezielt wird, da die Bindung über seine REC1-, BH- und PI-Domänen vermittelt wird (30). Darüber hinaus wurde zuvor gezeigt, dass dCas9 nicht an seine Zielsequenz bindet, wenn kein PAM (NGG) vorhanden ist (31). Im Gegensatz zu den obigen Studien wurden die Messwerte mit einer Fluoreszenzfaltenänderung unterhalb des Schwellenwerts als positiv angesehen, was auf die DNBs hinweist, die dCas9 erkennen und binden konnte. Darüber hinaus haben wir im gleichen Prozess eine Negativkontrollspur ohne dCas9-Inkubation eingeschlossen, da BGISEQ-500 zwei Spuren auf einem einzigen Chip hat. Ungefähr 95 % von insgesamt 253 M Ablesungen von der negativen Kontrollspur verloren die Hälfte der Signalintensität (Daten nicht gezeigt). Wir wählten eine Signaländerung bei 0,5 als Schwellenwert (Bild 2/Bild 1) und holten 14.371.289 von 335.497.075 und 15.647.574 von 337.529.837 Reads aus Versuchs- bzw. Kontrollspuren. Wir haben ein zuverlässiges Konzept der relativen Bindungsstärke eingeführt, um die Bindungsstärke für jede 7-nt-Sequenz zu bewerten. In ähnlicher Weise wurden die Daten am 5′-Ende mit einer Normalverteilung als Hintergrundrauschen betrachtet und die Drei-Sigma-Regel wurde übernommen, um den Cutoff bei 0,135 zu definieren. Nach Abzug der Geräusche stellten wir fest, dass die NGG-Sequenz für die Bindung von dCas9 essentiell war (Abb. 6), was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt. Dies legt nahe, dass mit dem modifizierten DocMF Arbeitsabläufe als allgemeines Werkzeug zur Identifizierung von DNA-Bindungsmotiven genutzt werden können.

(EIN) Die relative Bindungsstärke sowohl am 5′-Ende als auch am 3′-Ende für dCas9. Die x Achse besteht aus allen Kombinationen von 7-nt-Sequenzen und wird mit Excel automatisch nach Buchstaben sortiert. (B) Das Sequenzlogo für dCas9 wurde von allen nachgewiesenen 7-nt-Sequenzen basierend auf denen mit der höchsten relativen Bindungsstärke generiert.


Methylblaufärbung auf Hefe

Das Methylenblau-Färbungsverfahren wird verwendet, um die Lebensfähigkeit der Hefe zu messen, basierend auf der Annahme, dass das Methylenblau in die Zellen eindringt und von lebenden Hefezellen abgebaut wird, die die Enzyme produzieren, die Methylenblau abbauen und die Zellen farblos hinterlassen. Die nicht lebensfähigen Zellen produzieren dieses Enzym (oder diese Enzyme) nicht und als solches wird das Methylenblau, das in die Zellen eindringt, nicht abgebaut, wodurch die Zellen gefärbt bleiben (die oxidierte Form konzentriert sich intrazellulär).

Die farbigen und farblosen Zellen werden dann unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt und die Anzahl der lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen in einem bestimmten Bereich bestimmt. Das Ergebnis würde dann verwendet, um die Anzahl der Zellen in der ursprünglichen Probe zu schätzen.

Dies ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode, um die Menge an lebensfähigen Hefen in einer Probe zu bestimmen, obwohl dies aus einer Reihe von Gründen nicht die beste Methode ist. A major reason is that methylene blue rapidly becomes toxic to the yeast and as such preparations should be examined within 10 minutes of preparation.

The older the cells become, the less likely that they are to take up the methylene blue dye from solution since as the yeast age, they deposit lipid and/or sugar in their cell membrane (in the form of free sterols[predominantly ergosterol and zymosterol with minor portions of lanosterol and fecosterol] and phospholipids[phosphotidylcholine and phosphotidylethanolamine with minor portions of phosphotidylinositol, phosphotidylserine and phosphotidyl-glycerol]) as a survival mechanism to protect their internal mechanisms from the buildup of waste in the external environment.

This means that cells which are not viable would not take up the dye and due to their age and not their ability to break down the methylene blue (as a result of their viability) would remain colourless and be determined to be viable (a false positive). The test itself is also not very accurate since yeast might not be evenly distributed in the original sample and depending on the sample taken for determination , may yield higher or lower viability counts than are really present in the original sample.

This viability count and cell count is absolutely essential since the yeasts are the producers of the ethanol through the breakdown of sugars (catabolism of sugars by glycolysis to pyruvate, which is then converted to CO2 and ethanol) present in the wort/must (the pitching rate is a measure of the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation). These processes can only be performed by viable yeast cells and consequently the greater the umbers of viable yeasts in the sample, the higher the rate of ethanol production. The expected yield of ethanol (alcohol) can also be calculated based on the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation (along with the sugar present in the wort). This is very important in industrial alcohol production to determine the required alcohol content of the final product and the viability of the yeast pitched must be greater then 85% or it is not used.


Pioneering technique paves way for fast and cheap fabrication of rapid medical diagnostic tools

Example 100-micron wide 3D-printed microchannel scaffolds, shown next to a 20p coin - the cost to print 1000 of these channels. Credit: University of Bristol

New technology developed by the University of Bristol has the potential to accelerate uptake and development of on-chip diagnostic techniques in parts of the world where rapid diagnoses are desperately needed to improve public health, mortality and morbidity.

Microfluidic devices underpin lab-on-a-chip (LOC) technologies which are developed to provide the rapid diagnoses at that are needed at point of care (POC) for the swift and effective treatment of many diseases.

Researchers at Bristol have developed a fast, reliable and cost-effective alternative for producing the soft-lithographic moulds used for fabricating microfluidic devices, published in the journal PLOS ONE. This discovery means fabrication of microfluidic devices (with channel dimensions

width of a human hair) is now both accessible and affordable using simple, low-cost 3-D-printing techniques and the open-source resources developed by the team.

"Previously, techniques for producing the soft-lithographic scaffolds/moulds (microfluidic channel patterns) were time-consuming and extremely expensive, while other low-cost alternatives were prone to unfavourable properties. This development could put LOC prototyping into the hands of researchers and clinicians who know the challenges best, in particular those in resource-limited settings, where rapid diagnostics may often have the greatest impact," said lead author of the study, Dr. Robert Hughes.

Dye-mixing inside a microfluidic chip made using 3D-printed interconnecting channel scaffolds. Credit: University of Bristol

"This technique is so simple, quick & cheap that devices can be fabricated using only everyday domestic or educational appliances and at a negligible cost (

0.05% of cost of materials for a single microfluidic device). This means researchers and clinicians could use our technique and resources to help fabricate rapid medical diagnostic tools, quickly and cheaply, with minimal additional expertise or resources required," said co-author, Mr Harry Felton.

"The simplicity and minimal cost of this technique, as well as the playful click-and-connect approach developed, also makes it suitable for hobbyists and educational use, to teach about microfluidics and the applications of lab-on-a-chip technology," said co-author Ms Andrea Diaz Gaxiola.

"It is our hope that this will democratise microfluidics and lab-on-a-chip technology, help to advance the development of point-of-care diagnostics, and inspire the next generation of researchers and clinicians in the field," said Dr. Hughes.

Simplified flow-diagram of the low-cost technique for fabricating microfluidic devices. Resulting channels can be applied directly to a glass surface with no additional treatment. Credit: University of Bristol

The next step for the team is to identify potential collaborators in both research and education to help demonstrate the impact this technology could have in both settings by developing and supporting outreach activities and applications for on-chip diagnostic testing.


Science works in strange ways. The experiment, which requires a few basic metal materials and a small digital clock, also calls for an uncooked spud and America's least expensive coin -- the penny. After setting up an electrical circuit with the objects, the potato's natural acidity interacts with the penny's copper to complete one half of this natural "battery's" circuit.

Science fair students, like real scientists, should work to gain consent from people before including them in an experiment.


Mitgliedschaften

Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Young Hwang, Aoife M. Roche, Abigail Glascock, Susan R. Weiss, Yize Li, Louis J. Taylor & Frederic D. Bushman

Department of Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Jevon Graham-Wooten & Ronald G. Collman

Department of Genetics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Leila Haddad, Peter Deraska, Caitlin Monahan, Andrew Kromer & Arupa Ganguly

Department of Emergency Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Department of Biochemistry and Biophysics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA


Be safe and follow some simple rules

  • Never use the same pots and utensils for dyeing that you use for cooking.
  • Wear rubber gloves and use a face mask when measuring mordants and dyes.
  • Work in a well ventilated area.
  • Dispose of used mordants and dye baths safely.

Nun, da hast du es. A simple and practical guide to the use of mordants and fixitives in your natural dyeing products!

Whilst all this talk may seem a little off-putting at first, hopefully you now see how simple and fun the whole affair really is!

But… if you’re still feeling a bit shell shocked, do consider my Natural Dyeing Bootcamp. I cover 4 stunning natural dyeing projects in detail that don’t require mordants or fixatives at all!

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