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Wie finden mRNAs Ribosomen?

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Nachdem die mRNA aus dem Kern freigesetzt wurde, ist der nächste Prozess ihre Translation durch Ribosomen. Durch welchen physikalischen, chemischen oder biochemischen Prozess erreicht die mRNA das Ribosom im Zytoplasma?


Bitte schauen Sie sich diesen Artikel und seine Bilder an.

R. J. Jackson et al., 2010, Nature Rev. Mol. Dr. Zellbiol. 11:113.

https://www.nature.com/articles/nrm2838

Kurz gesagt, die Erkennung von mRNA durch Ribosomen erfolgt in mehreren Schritten. Dazu führt die Interaktion der mRNA mit (eukaryotischen) Initiationsfaktoren (eIF). Der eIF4-Komplex interagiert mit der mRNA und dann wird mit Hilfe der ATP-Hydrolyse eine intermediäre zirkuläre mRNA gebildet. Diese zirkuläre mRNA heftet sich an die kleine Untereinheit des Ribosoms zirkulärer mRNA zur kleinen Untereinheit, können Sie sagen, dass die mRNA das Ribosom "gefunden" hat, da die kleine Untereinheit dann einen Komplex mit der großen Untereinheit bilden und den Elongationsschritt der Translation beginnen würde.


Die Antwort auf den ersten Teil Ihrer Frage lautet: Diffusion. Nach der Transkription und einer gewissen Verarbeitung wird die eukaryotische mRNA in das Zytoplasma exportiert. Hier schwebt es herum, bis es auf ein Ribosom trifft. Die Bindung von Ribosomen an mRNA wird durch Proteine, die als Initiationsfaktoren (IFs) bezeichnet werden, und der 5'-Kappe der mRNA erleichtert$^1$.

Im zweiten Teil Ihrer Frage geht es im Wesentlichen um die zellfreie Proteinsynthese unter Verwendung einer RNA-Vorlage. Das hat sich bereits bewährt: man erinnert sich an das berühmte Nirenberg-Matthaei-Experiment$^2$, was letztendlich zum Knacken des genetischen Codes führte. Nirenberg und Matthaei arbeiteten mit bakteriellen Zellextrakten, aber auch Systeme auf Basis eukaryontischer Zellextrakte wurden entwickelt$^3$.


Referenzen und weiterführende Literatur:

  1. Nelson DL, Cox MM. Lehninger Prinzipien der Biochemie. 7. Aufl. (internationale Ausgabe). Basingstoke, England: Macmillan Higher Education; c2017. Kapitel 27, Proteinstoffwechsel; P. 1077-1126.
  2. Nirenberg MW, Matthaei JH. Die Abhängigkeit der zellfreien Proteinsynthese in E. coli von natürlich vorkommenden oder synthetischen Polyribonukleotiden. PNAS. 1. Okt 1961; 47(10):1588-1602. https://doi.org/10.1073/pnas.47.10.1588
  3. Chong S. Überblick über die zellfreie Proteinsynthese: historische Meilensteine, kommerzielle Systeme und wachsende Anwendungen. Curr Protoc Mol Bio. 2014 Okt 1.;108(1):16.30.1-11. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1630s108

Einführung in die RNA-Biologie: Cartoon Edition

DNA enthält die Anweisungen, wie wir alles in unserem Körper aufbauen können. Jede Ihrer Zellen enthält eine Kopie Ihrer DNA – wie eine Reihe von Bauplänen. Teile dieser Anweisungen werden nach Bedarf in verschiedenen Zellen ausgeführt.

Typischerweise werden die Anweisungen in den DNA-Bauplänen befolgt, um verschiedene Proteine ​​​​zu bauen. Proteine ​​leisten einen Großteil der Arbeit, die erforderlich ist, um den Körper funktionsfähig zu halten. Zu einem bestimmten Zeitpunkt könnte eine Zelle den Anweisungen zur Herstellung eines Immunproteins folgen, um den Körper vor Eindringlingen wie Viren zu schützen, während eine andere ein Protein herstellt, das dem Magen hilft, Nahrung zu verdauen.

Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

Im Allgemeinen wird die DNA im Zellkern aufbewahrt, wo es eine zentrale Bauplanbibliothek für die gesamte Zelle gibt. Proteine ​​werden jedoch in einem anderen Teil der Zelle gebaut. Wie werden die Anweisungen für die Proteine ​​von den DNA-Bauplänen dorthin übertragen, wo die Proteine ​​tatsächlich gebaut werden? Sie werden in Form von Boten-RNA oder mRNA transportiert. Jede mRNA enthält eine Kopie eines bestimmten Bauplans aus der größeren DNA-Bibliothek. Es trägt diesen Bauplan in die Zelle, wo Proteine ​​hergestellt werden. (mRNAs sind nicht die einzige Art von RNA. Es gibt viele andere Typen, die andere Dinge tun, und wir werden später mehr darüber sagen!)

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Die mRNA wird in einem Prozess namens Transkription erzeugt. Ein Enzym namens RNA-Polymerase wandert entlang des DNA-Strangs und bringt komplementäre RNA-Bausteine ​​ein, um ein „Transkript“ der in der DNA enthaltenen Informationen zu erstellen. Das resultierende Molekül ist ein RNA-Strang mit einer Mission: seine Botschaft an den Teil der Zelle zu übermitteln, der Proteine ​​​​produziert.

Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

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Sobald das Transkript erstellt wurde, muss es einige Modifikationen durchlaufen, um für die Translation bereit zu sein (der Prozess, bei dem der Inhalt der mRNA von einer molekularen Maschine namens Ribosom gelesen und in eine Sequenz von Proteinbausteinen namens Aminosäuren übersetzt wird.)

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Wie wird mRNA reguliert?

Zellen haben verschiedene Möglichkeiten entwickelt, um zu regulieren, welche Proteine ​​wann hergestellt werden. mRNAs werden im Laufe der Zeit auf natürliche Weise abgebaut, wobei die meisten eine relativ kurze Lebensdauer haben: mRNA-Moleküle in Säugerzellen können einige Minuten bis zu einigen Tagen verweilen, bevor sie abgebaut werden. Eine Möglichkeit, wie Zellen regulieren, wie viel von einem bestimmten Protein zu einem bestimmten Zeitpunkt hergestellt wird, besteht darin, zu kontrollieren, wie lange eine mRNA intakt bleibt. Solange eine mRNA intakt ist, kann sie immer wieder translatiert werden, um mehr Proteine ​​zu produzieren.

Einige mRNAs halten bis zu tausendmal länger als andere. Einer der Hauptregulatoren dafür, wie lange mRNAs intakt bleiben, ist eine andere Art von RNA, die als miroRNA (miRNA) bezeichnet wird.

Klein aber oho

MicroRNAs sind eine der vielen Arten von RNAs, die nicht für Proteine ​​kodieren. Diese winzigen RNAs, die nur 22 Bausteine ​​lang sind, werden im Ribosom nicht wie Boten-RNAs übersetzt. Stattdessen zielen sie auf Sequenzen in spezifischen mRNAs ab und binden daran und können die Translation der mRNA blockieren.


Hintergrund

Die Translationselongation ist ein entscheidender Prozess, bei dem die genetische Information in einem Transkript von Ribosomen sequentiell in eine Peptidkette entschlüsselt wird. Die mRNA-Sequenz der kodierenden Regionen kann jedoch mehr Informationen enthalten als die Aminosäuresequenz [1] die lokale Translationselongationsrate ist uneinheitlich und fein abgestimmt [2, 3]. Eine programmierte Variation der Elongationsrate kann an der Regulierung der Proteinfaltung beteiligt sein [2, 4, 5], die in den überfüllten und klebrigen zellulären Umgebungen eine Herausforderung darstellt [6, 7]. Eine Änderung der Translationselongationsrate kann zu einer Proteinfehlfaltung führen [2, 5], die weiter zu Entwicklungsstörungen, neurologischen Erkrankungen und Krebserkrankungen führt [8].

Trotz der Bedeutung der Translationselongation wurde sie hauptsächlich mit heterologen Reportergenen untersucht [9,10,11]. In diesen Reportergenen wurde oft ein starkes ribosomales Stalling-Signal platziert -Ribosomen) oder sogar Triribosomen. Strukturanalysen zeigten, dass Di- und Triribosomen oft nicht in der Lage waren, die Translation wieder aufzunehmen und den Ribosomen-assoziierten Proteinqualitätskontrollweg (RQC) auslösen können [9, 12, 13, 14, 15, 16].

Das Wissen über die Ursachen endogener Translationspausen ist noch sehr begrenzt, vor allem weil der Nachweis von Translationspausen in endogenen Genen technisch anspruchsvoll ist. Die Entwicklung von riboseq, einem Ansatz, der Ribosomen-geschützte mRNA-Fragmente bei Codon-Auflösung sequenziert, hat unser Wissen zur Translationselongation signifikant erweitert [17, 18]. Die Anhäufung von Ribosomen-Fußabdrücken an einer Stelle weist auf eine langsame Translationselongation (dh eine Translationspause) hin. Basierend auf dieser Idee wurden Sequenzdeterminanten der Translationselongation entdeckt, wie zum Beispiel synonyme Codonverwendung [19,20,21], positiv geladene naszierende Peptide [ 22] und mRNA-Sekundärstrukturen [23]. Allerdings übersehen traditionelle riboseq die Information über Ribosomenkollisionen [24, 25]. Stattdessen können Ribosomenkollisionen durch Sequenzieren der durch Disomen geschützten mRNA-Fragmente untersucht werden, die sich in dieser Studie auf endogene gestapelte Ribosomen beziehen. Disomen waren durch Saccharosegradientenzentrifugation nachweisbar [26] und wurden in fehlerhaften mRNAs oder 3'-untranslatierten Regionen beobachtet [24]. Die genomische Landschaft und die Sequenzdeterminanten endogener Ribosomenkollisionen bleiben jedoch in den kodierenden Sequenzen von originalgetreu transkribierten mRNAs weitgehend unbekannt.

Auch die Folgen endogener Translationspausen bleiben unklar. Es wurde vorgeschlagen, dass die Translationselongation die kotranslationale Proteinfaltung regulieren kann [2, 4, 5, 27, 28]. Beispielsweise häufen sich Hinweise darauf, dass die CAG-Expansion bei der Huntington-Krankheit zu einer falschen Translationspause und damit einer falschen Faltung des Signalpeptids für die subzelluläre Lokalisation des Htt-Proteins führte [29]. Nicht optimale Codons bildeten während der Evolution Cluster [30, 31] sie könnten langsame Translationsregionen bilden und an der Proteinfaltung teilnehmen [32]. Die Mechanismen, durch die Translationspausen die kotranslationale Proteinfaltung regulieren, sind jedoch noch nicht ausreichend erforscht.

In dieser Studie haben wir die mRNA-Fußabdrücke erfasst, die durch zwei gestapelte Ribosomen in schnell proliferierenden Hefezellen geschützt sind. Solche Daten bieten eine Chance, die Translationsdynamik aufzudecken, die durch die traditionelle Ribo-Seq (d. h. Monosomen-Seq) nicht nachweisbar ist. Wir identifizieren die Sequenzmerkmale, die mit Ribosomenkollisionen verbunden sind und validieren einige Merkmale mit Reportergenen. Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Analysen zeigen, dass die Mehrheit der endogenen Ribosomenkollisionen eine andere Struktur als die RQC-induzierenden Di-Ribosomen bilden. Mit bioinformatischen Analysen zeigen wir, dass Ribosomenpausen oder Kollisionen dazu neigen, in den Lückenregionen zwischen α-Helices stattzufinden. Tatsächlich werden pausierte oder kollidierte Ribosomen oft mit spezifischen Chaperonen in Verbindung gebracht, die die Proteinfaltung unterstützen können, wie massenspektrometrische Analysen zeigen. Als Konsequenz ist ein entstehendes Peptid bereit, während der Translation korrekt gefaltet zu werden.


Die eukaryotische Prä-mRNA durchläuft eine umfangreiche Verarbeitung, bevor sie translatiert werden kann. Die zusätzlichen Schritte der eukaryotischen mRNA-Reifung erzeugen ein Molekül mit einer viel längeren Halbwertszeit als eine prokaryotische mRNA. Eukaryotische mRNAs halten mehrere Stunden, während die typischen E coli mRNA dauert nicht länger als fünf Sekunden.

Prä-mRNAs werden zunächst mit RNA-stabilisierenden Proteinen umhüllt, die die prä-mRNA vor Abbau schützen, während sie verarbeitet und aus dem Zellkern exportiert wird. Die drei wichtigsten Schritte der Prä-mRNA-Prozessierung sind das Hinzufügen von stabilisierenden und signalgebenden Faktoren an den 5'- und 3'-Enden des Moleküls und das Entfernen von dazwischenliegenden Sequenzen, die die entsprechenden Aminosäuren nicht angeben. In seltenen Fällen kann das mRNA-Transkript nach der Transkription „bearbeitet“ werden.

5′ Kappen

Während die Prä-mRNA noch synthetisiert wird, a 7-Methylguanosin-Kappe wird durch eine Phosphatbindung an das 5'-Ende des wachsenden Transkripts angefügt. Diese Einheit (funktionelle Gruppe) schützt die entstehende mRNA vor Abbau. Darüber hinaus erkennen Faktoren, die an der Proteinsynthese beteiligt sind, die Kappe, um die Translation durch Ribosomen zu initiieren.

3′ Poly-A-Schwanz

Sobald die Elongation abgeschlossen ist, wird die Prä-mRNA durch eine Endonuklease zwischen einer AAUAAA-Konsensussequenz und einer GU-reichen Sequenz gespalten, wobei die AAUAAA-Sequenz auf der Prä-mRNA verbleibt. Ein Enzym namens Poly-A-Polymerase fügt dann eine Kette von ungefähr 200 A-Resten hinzu, die als bezeichnet wird Poly-A-Schwanz. Diese Modifikation schützt die prä-mRNA weiter vor Abbau und signalisiert den Export der zellulären Faktoren, die das Transkript benötigt, in das Zytoplasma.

Prä-mRNA-Spleißen

Eukaryotische Gene bestehen aus Exons, die proteinkodierenden Sequenzen entsprechen (Ex-on bedeutet, dass sie Exgedrückt) und intervening sequenzen genannt Introns (intron bezeichnet ihre intdienende Rolle), die an der Genregulation beteiligt sein können, aber während der Verarbeitung aus der prä-mRNA entfernt werden. Intronsequenzen in mRNA kodieren keine funktionellen Proteine.

Die Entdeckung von Introns überraschte die Forscher in den 1970er Jahren, die erwarteten, dass Prä-mRNAs Proteinsequenzen ohne weitere Verarbeitung spezifizieren würden, wie sie es bei Prokaryonten beobachtet hatten. Die Gene höherer Eukaryoten enthalten sehr oft ein oder mehrere Introns. Diese Regionen können regulatorischen Sequenzen entsprechen, jedoch ist die biologische Bedeutung von vielen Introns oder sehr langen Introns in einem Gen unklar. Es ist möglich, dass Introns die Genexpression verlangsamen, weil es länger dauert, prä-mRNAs mit vielen Introns zu transkribieren. Alternativ können Introns nicht-funktionelle Sequenzreste sein, die während der Evolution von der Fusion alter Gene übrig geblieben sind. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass separate Exons oft separate Proteinuntereinheiten oder -domänen kodieren. Größtenteils können die Sequenzen von Introns mutiert werden, ohne dass das Proteinprodukt letztendlich beeinflusst wird.

Alle Introns einer Prä-mRNA müssen vor der Proteinsynthese vollständig und präzise entfernt werden. Wenn der Prozess auch nur um ein einziges Nukleotid fehlschlägt, würde sich der Leserahmen der wieder zusammengefügten Exons verschieben und das resultierende Protein wäre dysfunktional. Der Vorgang des Entfernens von Introns und des Wiederverbindens von Exons wird als . bezeichnet Spleißen (Abbildung 1). Introns werden entfernt und abgebaut, während sich die Prä-mRNA noch im Kern befindet. Das Spleißen erfolgt durch einen sequenzspezifischen Mechanismus, der sicherstellt, dass Introns entfernt und Exons wieder mit der Genauigkeit und Präzision eines einzelnen Nukleotids verbunden werden. Das Spleißen von Prä-mRNAs wird durch Komplexe von Proteinen und RNA-Molekülen durchgeführt, die als Spleißosomen bezeichnet werden.

Übungsfrage

Abbildung 1. Prä-mRNA-Spleißen beinhaltet die präzise Entfernung von Introns aus dem primären RNA-Transkript. Der Spleißprozess wird durch Proteinkomplexe, die Spleißosomen genannt werden, katalysiert, die aus Proteinen und RNA-Molekülen, den snRNAs, bestehen. Spleißosomen erkennen Sequenzen am 5'- und 3'-Ende des Introns.

Fehler beim Spleißen werden mit Krebs und anderen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Welche Mutationen können zu Spleißfehlern führen?

Beachten Sie, dass mehr als 70 einzelne Introns vorhanden sein können und jedes den Prozess des Spleißens – zusätzlich zum 5′-Capping und dem Hinzufügen eines Poly-A-Schwanzes – durchlaufen muss, um ein einzelnes, translatierbares mRNA-Molekül zu erzeugen.

RNA-Editierung in Trypanosomen

Figur 2. Trypanosoma brucei ist der Erreger der Schlafkrankheit beim Menschen. Die mRNAs dieses Pathogens müssen durch Zugabe von Nukleotiden modifiziert werden, bevor die Proteinsynthese erfolgen kann. (Kredit: Änderung der Arbeit von Torsten Ochsenreiter)

Die Trypanosomen sind eine Gruppe von Protozoen, zu denen der Erreger gehört Trypanosoma brucei, die beim Menschen Schlafkrankheit verursacht (Abbildung 2). Trypanosomen und praktisch alle anderen Eukaryoten haben Organellen, die Mitochondrien genannt werden, die die Zelle mit chemischer Energie versorgen. Mitochondrien sind Organellen, die ihre eigene DNA exprimieren und als Überbleibsel einer symbiotischen Beziehung zwischen einem Eukaryonten und einem verschlungenen Prokaryonten gelten. Die mitochondriale DNA von Trypanosomen stellt eine interessante Ausnahme von The Central Dogma dar: Ihre Prä-mRNAs haben nicht die richtigen Informationen, um ein funktionelles Protein zu spezifizieren. Dies liegt in der Regel daran, dass der mRNA mehrere U-Nukleotide fehlen. Um dies zu beheben, führt die Zelle einen zusätzlichen RNA-Verarbeitungsschritt namens RNA-Editierung durch.

Andere Gene im mitochondrialen Genom kodieren 40- bis 80-Nukleotide lange Leit-RNAs. Eines oder mehrere dieser Moleküle wechselwirken durch komplementäre Basenpaarung mit einigen der Nukleotide im prä-mRNA-Transkript. Die Leit-RNA hat jedoch mehr A-Nukleotide als die Prä-mRNA U-Nukleotide zum Binden hat. In diesen Regionen schleift die Leit-RNA aus. Die 3'-Enden von Guide-RNAs haben einen langen Poly-U-Schwanz, und diese U-Basen werden in Regionen des Prä-mRNA-Transkripts eingefügt, an denen die Guide-RNAs eine Schleife bilden. Dieser Prozess wird vollständig durch RNA-Moleküle vermittelt. Das heißt, Leit-RNAs – und nicht Proteine ​​– dienen als Katalysatoren bei der RNA-Bearbeitung.

RNA-Editing ist nicht nur ein Phänomen von Trypanosomen. In den Mitochondrien einiger Pflanzen werden fast alle Prä-mRNAs editiert. RNA-Editierung wurde auch bei Säugetieren wie Ratten, Kaninchen und sogar Menschen identifiziert. Was könnte der evolutionäre Grund für diesen zusätzlichen Schritt in der Prä-mRNA-Verarbeitung sein? Eine Möglichkeit besteht darin, dass die Mitochondrien, die Überreste alter Prokaryonten sind, eine ebenso alte RNA-basierte Methode zur Regulierung der Genexpression haben. Um diese Hypothese zu untermauern, unterscheiden sich Änderungen an prä-mRNAs je nach zellulären Bedingungen. Obwohl spekulativ, könnte der Prozess der RNA-Editierung ein Überbleibsel aus einer Urzeit sein, als RNA-Moleküle anstelle von Proteinen für die Katalyse von Reaktionen verantwortlich waren.


Entdeckung eines Sensors für Ribosomenkollisionen

Ein kollaboratives Team der LMB-Abteilungen Zellbiologie und Strukturstudien hat einen zellulären Faktor identifiziert, der Ribosomenkollisionen erkennt. Das Ribosom ist die molekulare Maschine, die für das Lesen des genetischen Codes verantwortlich ist, um Proteine ​​zu produzieren, ein Vorgang, der als Translation bekannt ist. Solche Kollisionen zwischen Ribosomen sind ein Zeichen dafür, dass während der Translation etwas schief gelaufen ist, und der Kollisionserkennungsfaktor ist entscheidend, um Wege zur Lösung des Problems einzuleiten. Es ist bekannt, dass, wenn blockierte Ribosomen in Mäusen nicht effizient aufgelöst werden, sie eine Neurodegeneration entwickeln. Somit beleuchtet die neue Forschung, wie unser Körper seine Proteinproduktionslinien überwacht, damit Probleme umgehend gelöst werden können, bevor sie zu zellulärem Stress und Krankheiten führen.

Jede Zelle unseres Körpers enthält Millionen von Ribosomen, die Boten-RNAs (mRNAs), die Träger des genetischen Codes, in Proteine ​​übersetzen, die die meisten lebenswichtigen biochemischen Reaktionen ausführen. In hochaktiven Zellen haben die meisten mRNAs zwischen 4 und 12 Ribosomen entlang ihrer Länge, von denen jedes etwa 6 Codons pro Sekunde translatiert. Eine gesunde Zelle ist auf den reibungslosen Betrieb dieser proteinproduzierenden Fließbänder angewiesen. Übermäßig langsame Ribosomen sind ein Indikator dafür, dass etwas nicht richtig funktioniert, daher haben Zellen einen Prozess namens Ribosomen-assoziierte Qualitätskontrolle (RQC), um das Problem zu lösen. Der RQC-Weg recycelt problematische Ribosomen und initiiert den Abbau ihrer assoziierten mRNA und des teilweise synthetisierten Proteins. Aber wie erkennen Zellen selektiv langsame oder gestoppte Ribosomen?

In früheren Arbeiten hatte Szymon Juszkiewicz aus der Gruppe von Manu Hegde in der Abteilung Zellbiologie des LMB entdeckt, dass ein kritischer Faktor im RQC-Signalweg ein Protein namens ZNF598 ist. Dieses Protein bindet einen Ubiquitin-Tag an eine bestimmte Stelle des Ribosoms, der für die Initiierung des RQC-Wegs erforderlich ist. In einer neuen Studie untersuchte Szymon, was ZNF598 tatsächlich erkennt, und erwartete, dass es an blockierte, aber nicht aktiv translatierende Ribosomen bindet. Unerwarteterweise stellte er fest, dass ZNF598 nur dann an ein blockiertes Ribosom band, wenn ein anderes Ribosom hinten kollidiert war.

Parallel dazu untersuchte Vish Chandrasekaran aus dem Labor von Venki Ramakrishnan in der Abteilung für Strukturstudien des LMB Polyribosomen und vermutete, dass ihre charakteristische Architektur unter bestimmten Umständen von der Zelle erkannt werden könnte. Vish erarbeitete Methoden, um solche kollidierten Polyribosomen zu isolieren und bestimmte ihre Struktur mittels Kryo-Elektronenmikroskopie. Die Struktur zeigte, dass sich zwei kollidierte Ribosomen in einer genauen Orientierung befinden, so dass sich die Ubiquitin-Tag-Anheftungsstelle für ZNF598 in der Nähe der Grenzfläche zwischen den Ribosomen befindet. Durch die Erkennung dieser charakteristischen Schnittstelle ist ZNF598 in der Lage, mehrere Ursachen für eine Verlangsamung der Translation zu erkennen, während alle normal translatierenden Ribosomen vermieden werden.

Es ist wichtig zu verstehen, wie Zellen fehlerhafte Translation erkennen, da die Anhäufung defekter Proteine ​​eine der Hauptursachen für Krankheiten beim Menschen ist, insbesondere für Neurodegeneration. Das Team versucht nun genau zu verstehen, wie ZNF598 mit kollidierten Ribosomen interagiert, wie der an kollidierten Ribosomen angebrachte Ubiquitin-Tag für deren Zerlegung verwendet wird und welche zellulären mRNAs besonders anfällig für Probleme sind, die Ribosomenkollisionen induzieren.

Diese Arbeit wurde vom MRC, dem Wellcome Trust, dem Agouron Institute und der Louis-Jeantet Foundation unterstützt.


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Einführung

Die Lokalisierung von mRNAs innerhalb von Zellen dient dazu, die Genexpression räumlich einzuschränken, was für die Bestimmung des Zellschicksals und die richtige Körpermusterung während der Embryogenese entscheidend ist (St Johnston, 2005). Die lokalisierte mRNA-Translation ist auch für viele Prozesse in differenzierten somatischen Zellen wichtig (Kislauskis et al., 1997 Adereth et al., 2005 Huttelmaier et al., 2005) und wird in neuronalen Zellen ausgiebig genutzt, um die Expression bestimmter Proteine ​​auf Synapsen zu beschränken ( Kiebler und Bassell, 2006). In Xenopus laevis und Drosophila melanogastersind mRNAs, die für Proteine ​​kodieren, die an der mitotischen Progression beteiligt sind, auf der mitotischen Spindel angereichert (Raff et al., 1990 Groisman et al., 2000). Darüber hinaus werden zytologische und biochemische Untersuchungen von X. laevis Eiextraktspindeln und Seeigel-Mikrotubuli haben gezeigt, dass Ribosomen eng mit mitotischen Mikrotubuli verbunden sind, was darauf hindeutet, dass die lokalisierte Translation ein wichtiger Regulator der Mitose sein könnte (Suprenant, 1993 Liska et al., 2004 Mitchison et al., 2004). Das Ausmaß der mRNA-Targeting auf spezifische subzelluläre Strukturen wie die Spindel wurde jedoch nicht umfassend untersucht und die zugrunde liegenden Mechanismen und Funktionen sind kaum verstanden.

Um einen Einblick in die Rolle lokalisierter mRNAs während der Mitose zu gewinnen, identifizierten wir umfassend mRNAs, die sich in Mikrotubuli in meiotischen X. laevis Eiextrakte und mitotischen menschlichen Zellextrakten unter Verwendung von Affymetrix-Mikroarrays. Wir fanden heraus, dass eine spezifische und konservierte Gruppe von mRNAs, die als Mikrotubuli-gebundene mRNA (MT-mRNA) bezeichnet wird, auf Mikrotubuli angereichert ist. Wir beobachteten, dass nur eine Untergruppe von MT-mRNAs mit Mikrotubuli-gebundenen Polyribosomen assoziiert war, was darauf hindeutet, dass mitotische Spindeln sowohl translationsaktive als auch inaktive mRNAs enthalten. Darüber hinaus fanden wir, dass keine aktive Translation erforderlich ist, um endogene oder exogene mRNAs auf mitotische Mikrotubuli zu richten. Wir schlagen vor, dass die Lokalisierung spezifischer mRNAs an der Spindel ein konservierter Mechanismus zur Verbesserung der Proteinlokalisierung und zur Segregation von translationsinaktiven mRNAs ist.


Ribosom

Schneller Blick:
Ein Ribosom fungiert als Mikromaschine zur Herstellung von Proteinen. Ribosomen bestehen aus speziellen Proteinen und Nukleinsäuren. Die ÜBERSETZUNG von Informationen und die Verknüpfung von AMINOSÄUREN sind das Herzstück des Proteinproduktionsprozesses.
Ein Ribosom, das aus zwei miteinander verbundenen Untereinheiten gebildet wird, hat folgende Funktionen: (1) Übersetzen kodierter Informationen aus dem Zellkern, die von Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) bereitgestellt werden, (2) Verknüpfen ausgewählter und aus dem Zytoplasma gesammelter Aminosäuren durch Transfer von Ribonukleinsäure ( tRNA). (Die Reihenfolge, in der die Aminosäuren miteinander verknüpft sind, wird durch die mRNA bestimmt) und (3) Exportieren des produzierten Polypeptids in das Zytoplasma, wo es ein funktionelles Protein bildet.

Ribosomen werden im Zytoplasma ‘frei’ gefunden oder an das endoplasmatische Retikulum (ER) gebunden, um raues ER zu bilden. In einer Säugetierzelle kann es bis zu 10 Millionen Ribosomen geben. An denselben mRNA-Strang können mehrere Ribosomen angehängt werden, diese Struktur wird als Polysom ​​bezeichnet. Ribosomen haben nur eine vorübergehende Existenz. Wenn sie ein Polypeptid synthetisiert haben, trennen sich die beiden Untereinheiten und werden entweder wiederverwendet oder aufgebrochen.

Ribosomen können mit einer Geschwindigkeit von 200 pro Minute Aminosäuren verbinden. Kleine Proteine ​​können daher relativ schnell hergestellt werden, aber für größere Proteine ​​wie das massive Muskelprotein Titin mit 30.000 Aminosäuren werden zwei bis drei Stunden benötigt.

Ribosomen in Prokaryoten verwenden einen etwas anderen Prozess zur Herstellung von Proteinen als Ribosomen in Eukaryoten. Glücklicherweise bietet dieser Unterschied ein Fenster mit molekularen Möglichkeiten für einen Angriff durch Antibiotika wie Streptomycin. Leider verwenden es auch einige bakterielle Toxine und das Poliovirus, um den Translationsmechanismus anzugreifen.

Für ein Übersichtsdiagramm der Proteinproduktion klicken Sie hier.
(Das Diagramm öffnet sich in einem separaten Fenster)

Dies ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme, die einen Teil des rauen endoplasmatischen Retikulums in einer Pflanzenwurzelzelle aus Mais zeigt. Die dunklen Flecken sind Ribosomen.

(mit freundlicher Genehmigung von Chris Hawes, The Research School of Biology & Molecular Sciences, Oxford Brookes University, Oxford, UK)

Ein längerer Blick auf Ribosomen:

Ribosomen sind makromolekulare Produktionseinheiten. Sie bestehen aus ribosomalen Proteinen (Riboproteinen) und Ribonukleinsäuren (Ribonukleoproteinen). Das Wort Ribosom entsteht aus der Einnahme vonribo“ aus Ribonukleinsäure und Hinzufügen zu „soma“, das lateinische Wort für Körper. Ribosomen können durch eine oder mehrere Membranen gebunden sein, sind aber nicht membranös.

Ribosom: eine Mikromaschine zur Herstellung von Proteinen
Ein Ribosom ist im Grunde eine sehr komplizierte, aber elegante Mikro-„Maschine“ zur Herstellung von Proteinen. Jedes vollständige Ribosom ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut. Ein eukaryotisches Ribosom besteht aus Nukleinsäuren und etwa 80 Proteinen und hat eine Molekülmasse von etwa 4.200.000 Da. Etwa zwei Drittel dieser Masse bestehen aus ribosomaler RNA und ein Drittel aus etwa 50+ verschiedenen ribosomalen Proteinen.

Ribosomen kommen in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen in Mitochondrien, Chloroplasten und Bakterien vor. Die in Prokaryoten gefundenen sind im Allgemeinen kleiner als die in Eukaryoten. Ribosomen in Mitochondrien und Chloroplasten haben eine ähnliche Größe wie in Bakterien. Es gibt etwa 10 Milliarden Proteinmoleküle in einer Säugetierzelle und Ribosomen produzieren die meisten davon. Eine schnell wachsende Säugerzelle kann etwa 10 Millionen Ribosomen enthalten. [Eine einzelne Zelle von E. coli enthält etwa 20.000 Ribosomen und dies macht etwa 25 % der gesamten Zellmasse aus].

Die Proteine ​​und Nukleinsäuren, die die Ribosomen-Untereinheiten bilden, werden im Nukleolus hergestellt und durch Kernporen in das Zytoplasma exportiert. Die beiden Untereinheiten sind ungleich groß und existieren in diesem Zustand, bis sie zur Verwendung benötigt werden. Die größere Untereinheit ist etwa doppelt so groß wie die kleinere.

Die größere Untereinheit hat hauptsächlich eine katalytische Funktion, die kleinere Untereinheit hauptsächlich eine dekodierende. In der großen Untereinheit übernimmt ribosomale RNA die Funktion eines Enzyms und wird als Ribozym bezeichnet. Die kleinere Einheit verbindet sich mit mRNA und bindet dann an eine größere Untereinheit. Einmal gebildete Ribosomen sind keine statischen Einheiten. Wenn die Produktion eines bestimmten Proteins beendet ist, trennen sich die beiden Untereinheiten und werden dann normalerweise abgebaut. Ribosomen haben nur eine vorübergehende Existenz.

Manchmal lassen Ribosomen-Untereinheiten mRNA zu, sobald die mRNA aus dem Zellkern austritt. Wenn viele Ribosomen dies tun, wird die Struktur als Polysom ​​bezeichnet. Ribosomen können im Zytoplasma in einem „freien“ Zustand funktionieren, aber sie können sich auch auf dem endoplasmatischen Retikulum „ansiedeln“ und ein „raues endoplasmatisches Retikulum“ bilden. Bei einem rauen endoplasmatischen Retikulum erleichtert die Assoziation zwischen Ribosom und endoplasmatischem Retikulum (ER) die Weiterverarbeitung und Überprüfung neu gebildeter Proteine ​​durch das ER.

Die Proteinfabrik: Standort und Dienstleistungen.

Alle Fabriken benötigen Dienstleistungen wie Gas, Wasser, Abwasser und Kommunikation. Damit diese bereitgestellt werden können, muss ein Standort oder Standort vorhanden sein.

Die Proteinproduktion braucht auch Serviceanforderungen. Eine Stelle, die die Bereitstellung von Diensten erfordert, wird in einer kleinen Ribosomen-Untereinheit erzeugt, wenn ein mRNA-Strang durch einen selektiven Spalt und ein Initiator-tRNA-Strang durch einen anderen eintritt. Diese Aktion bewirkt, dass sich die kleine Untereinheit an eine große Untereinheit des Ribosoms bindet, um ein vollständiges und aktives Ribosom zu bilden. Der erstaunliche Prozess der Proteinproduktion kann jetzt beginnen.

Damit Translation und Proteinsynthese stattfinden können, sind viele Initiator- und Freisetzungschemikalien beteiligt, und es finden viele Reaktionen unter Verwendung von Enzymen statt. Es gibt jedoch allgemeine Anforderungen, die erfüllt werden müssen. Die folgende Liste zeigt die wichtigsten Anforderungen und wie sie bereitgestellt werden:

  • Erfordernis: Eine sichere (kontaminationsfreie) und geeignete Anlage für den Proteinproduktionsprozess.
  • Bestimmung: diese Einrichtung wird von den beiden ribosomalen Untereinheiten bereitgestellt. Wenn die beiden Untereinheiten zusammenschließen, um das vollständige Ribosom zu bilden, können Moleküle ein- und austreten nur durch selektive Spalten oder Tunnel in der Molekülstruktur.
  • Erfordernis: Ein Informationsangebot in einer Form, die das Ribosom mit hoher Genauigkeit übersetzen kann. Die Translation muss genau sein, damit die richtigen Proteine ​​produziert werden.
  • Bestimmung: Die Informationen werden vom Kern geliefert und in Form eines mRNA-Strangs an das Ribosom geliefert. Wenn mRNA im Kern gebildet wird, werden Introns (nicht kodierende Abschnitte) herausgeschnitten und Exons (kodierende Abschnitte) durch einen Prozess namens Spleißen miteinander verbunden.
  • Erfordernis: Ein Vorrat an Aminosäuren, aus dem der ribosomale Mechanismus die spezifischen benötigten Aminosäuren gewinnen kann.
  • Bestimmung: Aminosäuren, die hauptsächlich über die Nahrung zugeführt werden, sind im Zytoplasma normalerweise frei verfügbar.
  • Erfordernis: Ein System, das eine Aminosäure im Zytoplasma selektieren und daran ankoppeln und sie an die Translations- und Synthesestelle im Ribosom abgeben kann.
  • Bestimmung: Kurze Stränge von Transfer-Ribonukleinsäure (tRNA), die im Zellkern hergestellt und im Zytoplasma verfügbar sind, fungieren als „Adapterwerkzeuge“. Wenn sich ein tRNA-Strang an eine Aminosäure gebunden hat, wird die tRNA als „geladen“ bezeichnet. tRNA diffundiert in die kleinere Ribosomen-Untereinheit und jeder kurze tRNA-Strang liefert EINER Aminosäure.
  • Erfordernis: Ein Mittel zur Freisetzung in das Zytoplasma: (ein) ein neu gebildetes Polypeptid, (B) mRNA, die beim Translationsprozess verwendet wurde, und (C) tRNA, die die darin enthaltene Aminosäure geliefert hat und nun „ungeladen“ ist.
  • Bereitstellung: (a) Wenn eine neu gebildete Peptidkette tief im Inneren der großen Untereinheit des Ribosoms gebildet wird, wird sie entlang eines Tunnels oder einer Spalte in das Zytoplasma geleitet. (B) „Gebrauchte“ mRNA verlässt die kleinere Ribosomen-Untereinheit durch einen Tunnel auf der dem Eintrittspunkt gegenüberliegenden Seite. Die Bewegung durch das Ribosom wird durch eine nur in eine Richtung gerichtete, intermittierende Bewegung des Ribosoms entlang und in Richtung des ankommenden mRNA-Strangs bewirkt. (C) tRNA im „ungeladenen“ Zustand verlässt über einen Tunnel in der molekularen Architektur der großen Untereinheit des Ribosoms.

Die Proteinfabrik: Was passiert im Inneren?
– Ein Blick auf die Proteinproduktionslinie, die Aminosäuren mit einer Geschwindigkeit von 200 pro Minute verbinden kann!

Nachdem wir nun die Voraussetzungen und Vorkehrungen für den Betrieb der Proteinproduktionsmaschine bedacht haben, können wir uns das Innenleben ansehen.

Wie bereits erwähnt, finden viele detaillierte biochemische Reaktionen im Ribosom statt, und hier wird nur ein kurzer Umriss gegeben, um das Konzept zu veranschaulichen.
(Siehe auch „Schema des Ribosoms“ am Ende des Abschnitts)

Im Ribosom gibt es DREI STUFEN und DREI Betriebsstätten, die an der Proteinproduktionslinie beteiligt sind.

Die Drei STUFEN sind (1) Initiierung, (2) Verlängerung und (3) Beendigung.

Die drei operativen oder verbindlichen SEITEN sind A, P und E Lesen von der mRNA-Eintrittsstelle (konventionell die rechte Seite).

Standorte A und P überspannen beide Ribosomen-Untereinheiten, wobei ein größerer Teil in der großen Untereinheit des Ribosoms und ein kleinerer Teil in der kleineren Untereinheit residiert. Standort E, die Austrittsstelle, befindet sich in der großen Ribosomen-Untereinheit.

Tabelle der Bindungsstellen, Positionen und Funktionen in einem Ribosom
(siehe auch schematisches Ribosom am Ende des Abschnitts)

Bindungsseite

mRNA strand entry site

Biological term

Main processes

Admission of codon of mRNA & ‘charged’ strand of tRNA. Checking and decoding and start of ‘handing over’ one amino acid molecule

Peptide synthesis, consolidation, elongation and transfer of peptide chain to site A

SiTe E

Preparation of ‘uncharged’ tRNA for exit

The Three stages:

  1. Einleitung. During this stage a small ribosome sub-unit links onto the ‘start end’ of an mRNA strand. ‘Initiator tRNA’ also enters the small sub-unit. This complex then joins onto a ribosome large sub-unit. At the beginning of the mRNA strand there is a ‘start translating’ message and a strand of tRNA ‘charged’ with one specific amino acid, enters site A of the ribosome. Production of a polypeptide has now been initiated.For the tRNA not to be rejected the three letter code group it carries (called an anti-codon) must match up with the three letter code group (called a codon) on the strand of mRNA already in the ribosome. This is a very important part of the Übersetzung process and it is surprising how few ‘errors of translation’ occur. [In general the particular amino acid it carries is determined by the three letter anticodon it bears, e.g. if the three letter code is CAG (Cytosine, EINdenine, guanine) then it will select and transport the amino acid Glutamine (Gln)].
  1. Elongation.This term covers the period between initiation and termination and it is during this time that the main part of the designated protein is made. The process consists of a series of cycles, the total number of which is determined by the mRNA. One of the main events during elongation is translocation. This is when the ribosome moves along the mRNA by one codon notch and a new cycle starts.During the ‘start-up’ process the ‘initiation tRNA’ will have moved to site P (see schematic of ribosome at end of section) and the ribosome will have admitted into site A, a new tRNA ‘charged’ with one amino acid.The ‘charged’ tRNA resides in site A until it has been checked and accepted (or rejected) and until the growing peptide chain attached to the tRNA in site P, has been transferred across by enzymes, to the ‘charged’ tRNA in site A. Here one new amino acid is donated by the tRNA and added to the peptide chain. By this process the peptide chain is increased in length by increments of one amino acid. [The peptide bond formation between the growing peptide chain and the newly admitted amino acid is assisted by peptidyl transferase and takes place in the large ribosome sub-unit. The reaction occurs between tRNA that carries the nascent peptide chain, peptidyl-tRNA and the tRNA that carries the incoming amino acid, the aminoacyl-tRNA]. When this has taken place the tRNA in site P, having transferred its peptide chain, and now without any attachments, is moved to site E the exit site.Next, the tRNA in site A, complete with a peptide chain increased in length by one amino acid, moves to site P. In site P riboproteins act to consolidate the bonding of the peptide chain to the newly added amino acid. If the peptide chain is long the oldest part will be moved out into the cytoplasm to be followed by the rest of the chain as it is produced.The next cycle
    Mit site A now empty Translokation stattfinden. The ribosome moves on by a distance of one (three letter) codon notch along the mRNA to bring a new codon into the processing area. tRNA ‘charged’ with an attached amino acid now enters site A, and provided a satisfactory match of the mRNA codon and tRNA anti-codon is made, the cycle starts again. This process continues until a termination stage is reached.
  2. Termination. When the ribosome reaches the end of the mRNA strand, a terminal or ‘end of protein code’ message is flagged up. This registers the end of production for the particular protein coded for by this strand of mRNA. ‘Release factor’ chemicals prevent any more amino acid additions, and the new protein (polypeptide) is completely moved out into the cytoplasm through a cleft in the large sub-unit. The two ribosome sub-units disengage, separate and are re-used or broken down.

  • Nearly all the proteins required by cells are synthesised by ribosomes. Ribosomes are found ‘free’ in the cell cytoplasm and also attached to rough endoplasmic reticulum.
  • Ribosomes receive information from the cell nucleus and construction materials from the cytoplasm.
  • Ribosomes translate information encoded in messenger ribonucleic acid (mRNA).
  • Sie link together specific amino acids to form polypeptides and they export these to the cytoplasm.
  • A mammalian cell may contain as many as 10 million ribosomes, but each ribosome has only a temporary existence.
  • Ribosomes can link up amino acids at a rate of 200 per minute.
  • Ribosomes are formed from the locking of a small sub-unit on to a large sub-unit. The sub-units are normally available in the cytoplasm, the larger one being about twice the size of the smaller one.
  • Each ribosome is a complex of ribonucleoproteins with two-thirds of its mass is composed of ribosomal RNA and about one-third ribosomal protein.
  • Protein production takes place in three stages: (1) initiation, (2) elongation, and (3) termination.
  • During peptide production the ribosome moves along the mRNA in an intermittent process called translocation.
  • Antibiotic drugs such as streptomycin can be used to attack the translation mechanism in prokaryotes. This is very useful. Unfortunately some bacterial toxins and viruses can also do this.
  • After they leave the ribosome most proteins are folded or modified in some way. This is called ‘post translational modification’.

An overview diagram of protein production, including a note about protein modification.


Neuroendocrinology: The Normal Neuroendocrine System

Vladimir Stanišić , . Bert W. O’Malley , in Progress in Brain Research , 2010

Regulation of steroid hormone receptor availability by modulation of steroid receptor mRNA stability and translation

Regulation of steroid receptor mRNA stability and translation occurs primarily through binding of specific mRNA-binding proteins or micro-RNAs (miRNA) to 3′UTR regulatory elements. Two regulatory elements are most prominent, AU-rich elements (AREs) and C-rich elements. AREs containing multiple copies of a 5′-AUUUA-3′ motif destabilize mRNAs, while C-rich elements are recognized and differentially regulated by poly(C)-binding proteins. The miRNAs are a class of regulatory modalities that interact with specific complementary sequences present in the 3′ UTR region of the receptor’s mRNA. All steroid hormone receptors contain an unusually long 3′UTR and a large number of ARE sequences in the 3′UTR, and allow steroid hormones to auto-regulate the mRNA expression levels of their cognate receptors ( Ing, 2005 ).

The ERα mRNA is 4.3 kb long and has a steady-state half-life of approximately five hours ( Fig. 4 ). The mRNA contains an extensive 3′ UTR which is three times as long as its open reading frame. The ERα 3′UTR is known to contain several regulatory elements including 14 putative class I AREs ( Green et al., 1986 Keaveney et al., 1993 Kenealy et al., 2000 ), but its stability can be altered in response to different stimuli ( Kenealy et al., 2000 ). Proteins such as AUFp45 bind ERα mRNA and increase its stability by protecting it from RNases ( Ing et al., 2008 ). Recently, several miRNAs – miR18a, miR22, miR206 and miR221/222 – have been shown to bind and negatively affect ERα mRNA stability and/or translation ( Adams et al., 2007 Liu et al., 2009 Pandey and Picard, 2009 Zhao et al., 2008b ). Functionally, the expression of miRNAs leads to a decrease in the cellular receptor pool and subsequently to attenuated cellular responses to estrogen stimulation.

Androgen receptor mRNA spans 7 kbs and is extensively regulated post-transcriptionally ( Waltering et al., 2006b ). Towards the 5′ end of the AR 3′UTR, the RNA-binding protein HuR binds and stabilizes mRNA by interacting with AREs. HuR belongs to the Elav/Hu family of RNA-binding proteins, which in addition to being a regulator of mRNA stability also has a function in shuttling AR mRNA from the nucleus to the cytoplasm. Two proteins bind the C-rich elements in the AR mRNA-CP1 and -CP2 both affect AR mRNA stability and the rate of translation ( Wilce et al., 2002 ). Recently, a new regulator of AR mRNA translation, hnRNP-K, has been identified in prostate cancer cells. The hnRNP-K can bind to both the 5′ and 3′ UTR regions as well as the coding region of the AR mRNA to inhibit its translation ( Mukhopadhyay et al., 2009 ). Overall, androgens and progestins generally increase the stability of AR and PR mRNA in prostate and endometrial cancers, respectively ( Ing, 2005 ).

Human GR mRNA contains numerous ARE elements and is subject to post-transcriptional regulation ( Schaaf and Cidlowski, 2002 ). In addition to its regulation by a protein binding to an ARE element in the GR 3′UTR, GR mRNA is also negatively regulated by two miRNAs – miR18 and miR124a. Interestingly, while miR18 is broadly expressed in many tissues, miR124a is exclusively expressed in the brain, suggesting a probable tissue-specific regulatory requirement for controlling GR mRNA expression in the nervous system ( Vreugdenhil et al., 2009 ). Generally, glucocorticoids tend to decrease the stability of GR mRNA in the kidney, liver and colon cells ( Ing, 2005 ).


Engineering RBS issues

Efficiency

Different RBSs bind ribosomes with different efficiencies. While the overall efficiency of translation may not be directly proportional to this RBS-binding efficiency, it is an important variable. In the future, we expect that this data book will have a table such as the following:

Standard BioBrick Ribosome Binding Sites

Part Number Binding Efficiency Reihenfolge
BBa_B0030 0.6 att aaa gag gag aaa
BBa_B0031 0.07 tca cac agg aaa cc
BBa_B0032 0.3 tca cac agg aaa g


A BioBrick engineer, armed with this table, could perform a first-order re-engineering of the transfer function by measuring a component with BBa_B0031 and then selecting a more appropriate RBS.

In order to allow for easy variation in the RBS, some BioBrick parts have their RBSs and their protein coding regions implemented as separate parts. For convenience, the combined, normalized part is also available. In order to divide the BioBrick part into its RBS and coding region, a set of BioBrick restriction sites must be designed.

Standard Assembly and the RBS

Die RBS is physically near the start codon. (In BioBricks, this will always be ATG.) The "sequence logo", similar to a consensus sequence, for the RBS is shown below. The size of each letter is proportional to the frequency of that base in the RBS part.

This figure shows the RBS as an A/G-rich region about 10 bases upstream of the start codon. This leaves little room for a BioBrick restriction enzyme site. The standard assembly method of BioBricks normally results in an 8-base region containing a 6-base mixed SpeI/XbaI restriction site surrounded by a base on each end as shown below. If a start codon followed this sequence, the RBS would be significantly disturbed.

This problem is solved by changing the rightmost base from a G to a T. This results in the sequence shown below and limits the impact of the BioBrick overhead to six bases.


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