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Erforderliche Zeit für die RNA-Präzipitation in Ethanol

Erforderliche Zeit für die RNA-Präzipitation in Ethanol


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Ich präzipitierte bakterielle RNA während 1 Stunde bei -80 °C, nachdem ich die rRNA mit dem Ribo-Zero-Kit aufgebraucht hatte.

Führt mehr Zeit zu besseren Ergebnissen?


Soweit ich weiß, wurde dies noch nie gründlich auf RNA analysiert, aber es gibt eine ausgezeichnete Arbeit über die Präzipitation von DNA und die üblichen Bedingungen in BRL Focus von Zeugin (siehe unten für die Arbeit). Da DNA und RNA ziemlich gleich sind (bis auf eine OH-Gruppe) und auch die Bedingungen für die Fällung ähnlich sind, denke ich, dass wir dies für eine sehr genaue Schätzung verwenden können.

Interessanterweise haben weder der Zeitpunkt noch die Temperatur eines Niederschlags einen großen Einfluss auf das Ergebnis – sie verändern den Ertrag nur um wenige Prozent. Wenn Sie sich Abbildung 2 des erwähnten Papiers ansehen, sehen Sie Folgendes:

Diese Teilabbildung zeigt, dass die Wiederfindung fast nicht von der Temperatur, sondern nur von der Konzentration der DNA (bzw. RNA) beeinflusst wird. Je nachdem, wie viel RNA Sie erwarten (wie viele Zellen haben Sie für die Isolierung verwendet) würde ich ein Copräzipitationsmittel hinzufügen, wenn Sie nur sehr kleine Mengen an RNA haben. Glykogen funktioniert hier sehr gut. Sonst würde ich mir keine Sorgen machen.

Diese Abbildung zeigt, dass die Inkubationszeit nur dann einen Einfluss auf den Prozentsatz der Wiederfindung hat, wenn die Zeit zu kurz ist. Wenn Sie eine Stunde inkubieren, sind Sie auf der sicheren Seite.

Referenz:


Wie viele Kits andeuten, hat die RNA-Konzentration den größten Einfluss auf die Präzipitationseffizienz/Wiedergewinnungsfraktion. Zeit, Temperatur und Fällmittelkonzentration haben einen geringeren Einfluss. Siehe zum Beispiel eine Anleitung von Life Technologies zur LiCl-Fällung:

Die Verwendung von LiCl-Fällung zur RNA-Aufreinigung


MRNA-Aufreinigung (E2065)

Das Kit enthält eine LiCl-Lösung zur schnellen Rückgewinnung der synthetisierten mRNA. Die LiCl-Präzipitation von RNA ist bei der Entfernung der Mehrheit der nicht eingebauten NTPs und Enzyme wirksam. RNAs, die kürzer als 300 Basen sind oder bei Konzentrationen von weniger als 0,1 mg/ml präzipitieren jedoch nicht gut. In solchen Fällen können andere Reinigungsverfahren verwendet werden. LiCl-gereinigte mRNA eignet sich für Transfektions- und Mikroinjektionsexperimente.

  1. Zu der 20 &mgr;l-Transkriptionsreaktion werden 30 &mgr;m Wasser und 25 &mgr;m LiCl-Lösung zugegeben, gut gemischt.
  2. Inkubieren bei &ndash20°C für 30 Minuten.
  3. Zentrifugieren Sie bei 4°C für 15 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit, um die RNA zu pelletieren.
  4. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
  5. Spülen Sie das Pellet durch Zugabe von 500 &mgr;m kaltem 70 % Ethanol und zentrifugieren Sie bei 4 °C für 10 Minuten.
  6. Entferne das Ethanol vorsichtig. Drehen Sie das Röhrchen kurz, um jegliche Flüssigkeit an der Wand herunterzuspülen.
  7. Restflüssigkeit vorsichtig mit einer scharfen Spitze (z. B. Ladespitze) entfernen.
  8. Das Pellet an der Luft trocknen und die mRNA in 50 &mgr;m 0,1 mM EDTA oder einer geeigneten RNA-Aufbewahrungslösung resuspendieren.
  9. Erhitzen Sie die RNA bei 65 ° C für 5-10 Minuten, um die RNA vollständig aufzulösen. Gut mischen.
  10. Lagern Sie die RNA bei &ndash20°C oder darunter.

Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung

Zur Entfernung von Proteinen und den meisten freien Nukleotiden ist die Phenol:Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung von RNA-Transkripten das bevorzugte Verfahren.

  1. Das Reaktionsvolumen durch Zugabe von nukleasefreiem Wasser auf 180 &mgr;m einstellen. 20 µm 3 M Natriumacetat, pH 5,2 oder 20 µm 5 M Ammoniumacetat zugeben und gründlich mischen.
  2. Extrahiere mit einem gleichen Volumen einer 1:1-Phenol:Chloroform-Mischung, gefolgt von zwei Extraktionen mit Chloroform. Sammeln Sie die wässrige Phase und überführen Sie sie in ein neues Röhrchen.
  3. Ausfällen der RNA durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol. Inkubieren Sie bei &ndash20°C für mindestens 30 Minuten und sammeln Sie das Pellet durch Zentrifugation.
  4. Entferne den Überstand und spüle das Pellet mit 500 &mgr;m eiskaltem 70 % Ethanol.
  5. Resuspendiere die RNA in 50 &mgr;m 0,1 mM EDTA. Lagern Sie die RNA bei &ndash20°C oder darunter.

Doppeltes Streben

Doppelaspiration ist nützlich, um die letzten Spuren von EtOH-Überstand nach Ausfällungen zu entfernen. Es beinhaltet ein zweites schnelles Schleudern und Absaugen, um sicherzustellen, dass jeglicher Niederschlagsüberstand, z.B. an den Wänden des Röhrchens, die die nachfolgenden Schritte des Protokolls stören könnten. Wir empfehlen es im RPA III™-Protokoll von Ambion und für die Präparation von RNA-Sonden-Templates.

  • Nach dem Pelletieren der Präzipitation den Präzipitationsüberstand vom Nukleinsäurepellet absaugen. Folgen Sie sofort einer schnellen 1–2 Sekunden Zentrifugation und aspirieren Sie erneut.


Die Aspiration kann mit einer Spritzennadel oder einer ausgezogenen Pasteurpipette erfolgen, die mit einer Falle an eine Vakuumquelle angeschlossen ist. Alternativ kann eine ausgezogene Pasteurpipette mit Pipettenkugel verwendet werden. Um ausgezogene Pasteurpipetten herzustellen, erweichen Sie die Pipettenspitze mit einer Flamme und ziehen Sie die Spitze mit einer Pinzette heraus, brechen Sie die Spitze an der engsten Stelle ab und flammen Sie sie bei Bedarf auf.


Experimentelle Verfahren

Theoretischer Hintergrund

Die Quelle der Kontamination durch RNasen während der RNA-Extraktion kann exogen oder endogen sein 5-7. Exogene Quellen umfassen die Reagenzien, Glaswaren und Plastikwaren, die bei der RNA-Isolierung verwendet werden, insbesondere die Haut des Untersuchers. Diese RNasen können jedoch durch sinnvolle Maßnahmen eliminiert werden, wie z. B. Behandlung von Reagenzien und Kunststoffutensilien mit Diethylpyrocarbonat (DEPC), Backen der Glaswaren, Mörser und Stößel und das Tragen von Einmalhandschuhen während des gesamten Vorgangs. Endogene RNasen sind jedoch biologischen Geweben angeboren und werden normalerweise in Organellen und Vakuolen sequestriert. Sie werden in intakten Zellen stark reguliert, und die Regulationsmechanismen werden zerstört, sobald die Organellen und Vakuolen während der Zelllyse zerstört werden, was zu einem schnellen Abbau von RNA führen könnte 5 . Daher ist die schnelle und vollständige Inaktivierung der freigesetzten endogenen RNasen der Schlüssel zur erfolgreichen Reinigung hochwertiger RNA. Es wurde gezeigt, dass Guanidiniumsalze starke Inhibitoren der RNasen 5, 7 sind, und viele Methoden auf der Basis von Guanidiniumsalzen wurden für die RNA-Isolierung etabliert. Allerdings gibt es bei diesen Methoden noch einige Nachteile, wie RNA-Verlust oder Fragmentierung während der organischen Extraktion, Störung nachgeschalteter enzymatischer Reaktionen durch Guanidiniumsalz-Rückstände und höhere Kosten für das Experiment aufgrund der Verwendung einer höheren Konzentration von Guanidiniumsalzen zur Inaktivierung RNasen 7 . In unserer zuvor berichteten RNA-Isolierung 6 versuchten wir, während der Zelllyse freigesetzte endogene RNasen schnell und vollständig zu inaktivieren sowie einige Nachteile von Guanidiniumsalz-basierten Methoden zu überwinden. Unsere Maßnahmen umfassten eine Änderung der Zusammensetzung des Extraktionspuffers: Der pH-Wert des Extraktionspuffers wurde nicht mit HCl eingestellt und der endgültige pH-Wert, einschließlich 0,2 m Tris, in unserem System beträgt 9,0. Dieser pH-Wert könnte die RNase-Aktivität stark reduzieren, da nur weniger als 15% der Aktivität übrig bleiben, wenn der pH-Wert über 9,0 liegt, verglichen mit der maximalen Aktivität bei einem pH-Wert von ungefähr 7,2 in Wasser 10 . Außerdem MgCl2 und Saccharose wurden in den Extraktionspuffer eingeschlossen. Das MgCl2 wurde zugegeben, weil Mg 2+ benötigt wird, um viele sekundäre und tertiäre Strukturen innerhalb der RNA 11 zu stabilisieren, und die Saccharose wurde hinzugefügt, um einen geeigneten osmotischen Druck für die Lösung aufrechtzuerhalten. Andernfalls könnte die Fragmentierung von RNA in hypotoner Lösung durch Aufprall des osmotischen Drucks auf RNAs auf die explosive Zelllyse erfolgen. Darüber hinaus wurde Tris-gesättigtes Phenol sofort in flüssiges Stickstoff-gemahlenes Gewebepulver gegeben, um die freigesetzten endogenen RNasen zu inaktivieren. Während der folgenden organischen Extraktion wurde Vortexen angewendet, um die Effekte der Proteindenaturierung zu verstärken. Aufnahme von MgCl2 und Saccharose in Extraktionspuffer könnte auch die potenzielle Gefahr der Fragmentierung von RNAs, insbesondere solchen mit hohem Molekulargewicht, durch Vortexen vermeiden. Um die während des gesamten Isolierungsverfahrens versehentlich eingeführte RNase-Aktivität zu reduzieren, waren alle für die RNA-Präparation verwendeten Reagenzien eiskalt, die Röhrchen wurden vorgekühlt und die Proben wurden die ganze Zeit auf Eis gehalten, außer während der Schritte zum Lufttrocknen der Nukleinsäuresedimente nach Zentrifugation 5.

Die Nukleinsäurekonzentration ist normalerweise der letzte Schritt in den meisten RNA-Reinigungsprotokollen. Normalerweise wird die RNA-Konzentration durch Fällung in Gegenwart von Natriumionen und Ethanol erreicht. Im Gegensatz zur dramatischen Präzipitation genomischer DNA sind jedoch für die RNA-Präzipitation häufig längere Inkubationszeiten bei −20 °C erforderlich, um eine vollständige Rückgewinnung zu gewährleisten 5 . In unserem ursprünglichen Protokoll wurde die Nukleinsäurerückgewinnung durch Ethanolpräzipitation bei −20 °C für 3 Stunden erreicht und umfasste zwei Ethanolpräzipitationsschritte, von denen einer Nukleinsäuren, einschließlich RNA und DNA, und der andere selektiv RNA präzipitierte 6 . Das gesamte Isolierungsverfahren dauerte ungefähr 8 Stunden und wurde durch zwei längere Ethanolfällungen in drei Sitzungen unterteilt, was die Methode für einen zeitlich begrenzten experimentellen Studiengang ungeeignet macht. Es gibt Hinweise darauf, dass die Gewinnung von Nukleinsäuren durch Ethanolfällung durch eine lange Inkubation oder eine Inkubation bei niedriger Temperatur nicht signifikant verbessert wird, sondern durch eine längere Zentrifugationszeit 9 . Daher wurde die längere Inkubation bei niedriger Temperatur (bei -20 °C für 3 Stunden) durch eine Inkubation bei 0 °C für 10 Minuten ersetzt, und die Zentrifugationszeit nach der Ethanolfällung wurde alle auf 15 Minuten eingestellt, um eine gute Wiederfindung zu erzielen. Als Ergebnis wurde die Dauer des Isolierungsverfahrens erheblich verkürzt (in 2,5 Stunden, verglichen mit 8 Stunden unseres ursprünglichen Verfahrens), während die Gewinnung von RNA mit unserem ursprünglichen Verfahren vergleichbar war (Daten nicht gezeigt).

Da der Erfolg vieler nachgelagerter RNA-basierter Anwendungen davon abhängt, qualitativ hochwertige RNA zu erhalten, ist es notwendig, die Qualität der gereinigten RNA zu beurteilen, bevor nachgelagerte Assays durchgeführt werden. Daher sollten Menge, Reinheit und Integrität von RNA-Proben mit geeigneten Methoden überprüft werden. RNA hat eine maximale Absorption bei 260 nm, und die RNA-Konzentration konnte spektrophotometrisch durch die Beziehung 1 . quantifiziert werden EIN260 = 40 µg RNA mL −1 . Kontaminierte Proteine ​​und Polysaccharide/Polyphenole haben maximale Absorptionswerte bei 280 bzw. 230 nm, so dass die Verhältnisse von EIN260/EIN280 und EIN260/EIN230 als Hinweise auf diese Schadstoffe verwendet werden könnten. Darüber hinaus können diese Verunreinigungen zu Abweichungen vom Standard-Absorptionsspektrum mit dem charakteristischen UV-Absorptionsprofil reiner RNA-Proben führen, das nicht beobachtet werden kann, wenn nur die Absorption bei den drei oben genannten Wellenlängen gemessen wird. Daher wurde neben den Absorptionsverhältnissen die UV-Absorptionsspektrumsanalyse gereinigter RNA von 220 bis 350 nm eingeführt, um die Reinheit der RNA zu beurteilen. Um die RNA-Integrität zu überprüfen, besteht die typische Methode darin, das Bandenprofil von größengetrennten RNA-Banden durch ein Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen zu visualisieren. Dies ist jedoch aufgrund des komplizierten Verfahrens ein zeitaufwändiger Prozess, und die Visualisierung von RNA-Banden kann auch nicht unmittelbar nach der Elektrophorese erreicht werden 8 . Ein Standard-Agarose-Gel hat zwar eine geringere Auflösung für nichtdenaturierte RNAs, die reich an Sekundär- und Tertiärstrukturen sind, hat jedoch den Vorteil, dass es leicht zu vervollständigen ist und die RNA unmittelbar nach der Elektrophorese durch Einbringen von Ethidiumbromid (EtBr) in das Gel sichtbar machen kann. Daher wurde in diesem Bericht eine Elektrophorese von nichtdenaturierter RNA durch ein Standard-Agarose-Gel verwendet, um die RNA-Integrität zu überprüfen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die beste Leistung der Trennung von Gesamt-RNA unter nicht denaturierenden Bedingungen nur erreicht werden konnte, wenn RNA-Proben mit geringeren Mengen (normalerweise weniger als 5 μg) durch eine höhere Konzentration von Agarosegel (normalerweise 1,5 %) laufen gelassen wurden.

Anordnung

Die Schüler arbeiteten zu zweit im Labor. Die RNase-freie Behandlung wurde vor dem Experiment von einzelnen Studenten durchgeführt. Etwa 1 Stunde Vortrag und Diskussion vor dem Labor konzentrierten sich auf spezifische Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit mit RNA, und die Gründe für die Erstellung des ursprünglichen Protokolls und die Modifikationen, die für die in diesem Bericht verwendeten Methoden der RNA-Isolierung und RNA-Qualitätskontrollanalyse vorgenommen wurden, wurden bereitgestellt und gefolgt von einem 4 Stunden praktische Laborübung. Das gesamte Verfahren könnte auch in zwei Sitzungen mit RNA-Isolierung und RNA-Qualitätskontrollanalyse unterteilt werden.

Materialien und Lösungen

Für das Experiment wird folgende Ausrüstung benötigt: Mörser und Pistill, rostfreier Laborspatel, 50-ml-Zentrifugenröhrchen, Pipetten, Vortex, Einwegspitzen und -handschuhe, Zentrifuge (Thermo Fisher Scientific, Am Kalkberg, Deutschland, Sorvall ST 16R), 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, Spektralphotometer mit geringem Volumen (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, Nanodrop 2000c), Unterwasserelektrophoreseanlagen (Bio-Rad, Hercules, CA, Sub Cell GT) und Gel-Imaging-System (Bio-Rad, Hercules, CA, Gel .) Doc XR-System). Die RNase-freie Behandlung wurde wie folgt durchgeführt: Alle Röhrchen und Spitzen wurden über Nacht bei 37 °C in 0,1 % DEPC eingeweicht, dann 20 min bei 121 °C autoklaviert. Die Mörser und Stößel sowie die rostfreien Laborspatel wurden 12 Stunden bei 180 °C gebacken.

Für die RNA-Isolierung wurden folgende Reagenzien benötigt: RNA-Extraktionspuffer (0,2 m Tris, 0,4 m KCl, 0,2 m Saccharose, 35 m m MgCl2, 25 mm EGTA), Tris-gesättigtes Phenol (pH 8,0), Chloroform/Isoamylalkohol (24:1, v/v), 3 m NaAc (pH 5,2), 3 m NaAc (pH 5,6), 0,3 m NaAc (pH 5.6) und DEPC-behandeltes Wasser. NaAc-Lösungen und DEPC-behandeltes Wasser wurden durch Behandeln von NaAc-Lösungen und Wasser mit 0,1% DEPC über Nacht bei 37 °C hergestellt und dann bei 121 °C für 20 Minuten autoklaviert. Der RNA-Extraktionspuffer wurde mit DEPC-behandeltem Wasser hergestellt.

Für die RNA-Analyse wurden folgende Reagenzien benötigt: Agarose, 1 × TAE, 10 × RNA-Ladepuffer (1 m m EDTA, 0,25 % Bromphenolblau, 0,25 % Xylencyanol, 50 % Glycerin) und 10 mg/ml EtBr. Lösungen für die RNA-Elektrophorese wurden der RNase-freien Behandlung nicht verabreicht, da RNase- und RNA-Banden in Agarosegelen unterschiedliche Mobilität aufweisen, was bedeutet, dass sie nach Anlegen eines elektrischen Feldes getrennt werden konnten.

Zelllyse, Nukleoproteindissoziation, Proteindenaturierung und Entfernung

Das folgende Verfahren kann auf eine Vielzahl von krautigen Pflanzengeweben angewendet werden. Für Pflanzengewebe, die reich an Polysacchariden und/oder Polyphenolen sind, sollten spezielle Reinigungsprotokolle angewendet werden, wie beispielsweise das modifizierte Cetyltrimethylammoniumbromid-Verfahren 12 .

Sammeln Sie 1 g China-Weißkohl (Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino [var. Kommunismus Tsen et Lee]) Blätter und mahlen sie in flüssigem Stickstoff in einem vorgekühlten Mörser zu einem feinen Pulver. Lassen Sie das Gewebe nicht auftauen und überführen Sie das Pulver sofort in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, geben Sie sofort 2 ml Tris-gesättigtes Phenol (pH 8,0) hinzu, dann 4 ml Extraktionspuffer und 2 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24: 1, v/v) nacheinander (Phenol sollte zuerst zugegeben werden, um eine Denaturierungsumgebung für die freizusetzenden endogenen RNasen zu schaffen). Vortexen Sie das Röhrchen, bis eine vollständige Emulsion gebildet wurde. Zentrifuge bei 8.000 × g 5 Minuten bei 4 °C. Die wässrige Phase vorsichtig in ein anderes 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen, dann 2 ml Phenol und 2 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1, v/v) hinzufügen, kräftig mischen und bei 8.000 × zentrifugieren g 5 Minuten bei 4 °C. Nehmen Sie die obere Phase und fügen Sie 4 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1, v/v) hinzu, dann mischen und zentrifugieren Sie die Probe wie zuvor. Übertragen Sie die obere Phase in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und notieren Sie das übertragene Volumen.

Selektive RNA-Präzipitation

Kombinationen von Ethanol und NaAc (pH 5,6) wurden verwendet, um die RNA selektiv auszufällen. Zunächst werden 0,1 Volumen NaAc (pH 5,2) und 2,2 Volumen auf −20 °C vorgekühltes Ethanol zur überführten wässrigen Phase gegeben und durch mehrfaches Umdrehen gemischt. Nachdem Sie die Röhrchen 10 Minuten lang in zerstoßenes Eis eingebettet haben, zentrifugieren Sie sie bei 15.000 × g 15 Minuten bei 4 °C. Die Nukleinsäuren wurden auf die Wand des Zentrifugenröhrchens zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren die Flüssigkeit dekantieren und die Position der Nukleinsäuresedimente an der Außenwand des Röhrchens markieren. Drehen Sie das Röhrchen um und legen Sie es auf ein Filerpapier, damit es an der Luft trocknen kann, um restliches Ethanol zu entfernen. Die Nukleinsäuresedimente mit 1 mL 3 m NaAc (pH 5,6) mit einer Pipette resuspendieren, dann die resuspendierte Nukleinsäure in ein 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 15.000 × g für 10 min bei 4 °C, vorsichtig dekantieren und den Überstand verwerfen, das Röhrchen umgekehrt auf ein Filterpapier legen, um die Nukleinsäuren an der Luft zu trocknen. Sediment erneut in 400 μL 0,3 m NaAc (pH 5,6) auflösen und 1 mL auf -20 °C vorgekühltes Ethanol zugeben, Röhrchen mehrmals durch Umdrehen mischen, Röhrchen 10 min in zerstoßenes Eis einbetten, Röhrchen dann bei . zentrifugieren 15.000 × g 15 Minuten bei 4 °C. Waschen Sie das RNA-Pellet zweimal mit 200 ul 70 % Ethanol, dann lufttrocknen und lösen Sie das Pellet in 50 ul DEPC-behandeltem Wasser.

RNA-Qualitätsbewertung durch Spektrophotometer

Die RNA wurde auf einem NanoDrop 2000c Spektrophotometer gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert. Es wurde ein Absorptionsspektrum von 220 bis 350 nm erhalten, die RNA-Konzentration wurde mit der Gleichung 1 . berechnet EIN260 = 40 µg RNA mL −1 und Verhältnisse von EIN260/EIN280 und EIN260/EIN230 wurden berechnet, um die Reinheit der extrahierten RNA-Proben zu bewerten.

Agarose-Gelelektrophorese

Verdünnen Sie 10 µl RNA-Proben auf 1 µg/µl mit DEPC-behandeltem Wasser entsprechend den Quantifizierungsergebnissen, 0,5, 1, 2 und 4 µg RNA-Aliquots wurden entnommen und mit DEPC-behandeltem Wasser auf 9 µl eingestellt, dann 1 &mgr;l 10 × RNA-Ladepuffer wurde hinzugefügt. Nach dem Mischen der Proben wurden alle Aliquots auf ein 1,5% TAE-Agarose-Gel geladen, das 0,5 ug/ml EtBr enthielt. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE bei 5 V/cm durchgeführt, bis die Farbstofffront zu zwei Dritteln des Gels nach unten gewandert war. Das Gel wurde mit einem Gel Doc XR System (Bio-Rad) fotografiert.

Bewertung des studentischen Lernens

Drei Methoden wurden angewendet, um das Lernen der Schüler aus den experimentellen Übungen zu bewerten: Laborberichte nach dem Experiment, eine Laborpräsentation zu Beginn der nächsten experimentellen Klasse und eine kurze Zusammenfassung nach dem gesamten experimentellen Kurs. In ihren Laborberichten mussten die Studierenden den Zweck und das Prinzip des Experiments angeben, die erhaltenen Ergebnisse prägnant darlegen, einschließlich der Ausbeute in μg RNA/g Frischgewicht der Blätter, den Verhältnissen von OD260/OD280 und OD260/OD230, und die Ergebnisse der Elektrophorese von nicht denaturierten RNAs in einem Standard-Agarose-Gel in einer Abbildung, sowie den Schlüssel des Protokolldesigns und der experimentellen Durchführung, insbesondere wie eine RNase-Kontamination verhindert werden kann, und geben Sie an, welche Schlussfolgerungen daraus gezogen werden können ihre Daten. Darüber hinaus wurden sechs von 15 Gruppen zufällig ausgewählt, um vor der gesamten Klasse eine Präsentation über ihre Ergebnisse und das Experiment zu halten. So konnten alle Gruppen ihre Ergebnisse miteinander vergleichen und bei Bedarf ihre experimentellen Erfahrungen diskutieren. In ihrer Zusammenfassung sollten sie auflisten, was sie gelernt haben, einschließlich ihres Verständnisses von experimentellen Fähigkeiten und der Vertiefung der grundlegenden Konzepte.

Gefahren

Der flüssige Stickstoff, der zum Einfrieren von Pflanzengewebe verwendet wird, muss sorgfältig behandelt werden. Phenol und Chloroform können selbst bei Raumtemperatur leicht verdunsten, und diese beiden Reagenzien sowie ihre Dämpfe wirken ätzend auf Augen, Haut und Atemwege. EtBr ist mutagen und sollte mit Vorsicht verwendet werden. Phenol, Chloroform und DEPC sind krebserregend und sollten mit äußerster Vorsicht gehandhabt werden. Die Studierenden mussten während des gesamten Verfahrens Laborkittel und geschlossene Schuhe im Labor sowie Einweghandschuhe tragen.


PrimerDigital

Das Verfahren eignet sich für alle Gewebearten verschiedenster Tier- (und Blut-) und Pflanzenarten. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur (RT) (ohne Eis) und ohne DEPC-behandeltes Wasser durchgeführt. RNA-Präzipitat mit Lithiumchlorid (LiCl) zur Erhöhung der Stabilität der RNA-Präparation und Verbesserung der cDNA-Synthese. Das folgende Protokoll ist für kleine und große Gewebeproben (Gewebevolumen 10–200 μl) ausgelegt, die normalerweise etwa 10–500 &mgr;g Gesamt-RNA ergeben.

Materialien zur vollständigen RNA-Isolierung

    (40 % w/w Phenol (gesättigt bei pH 4,3), 1 M Guanidinthiocyanat, 1 M Ammoniumthiocyanat, 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 5,0), 5 % w/w Glycerin)
  • Chloroform-Isoamylalkohol-Mischung (24:1)
  • 100 % Isopropanol (Isopropylalkohol, 2-Propanol)
  • 70% Ethanol
  • 10 M LiCl
  • Frisches Milli-Q-Wasser (oder Milli-Q ultrareines BioPak-Wasser) oder autoklaviertes 1xTE (0,1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0). Bei Verwendung einer Ultrafiltrationskartusche (BioPak) am Point-of-Use ist das Wasser für Genomikanwendungen (Qualität mindestens gleichwertig mit DEPC-behandeltem Wasser) und Zellkultur geeignet.
  1. 2 ml Eppendorf Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen mit Gewebeprobe und Glaskugel Gefrieren bei -80°C, Mahlen in der MM300 Mixer Mill für 2 min bei 30 Hz.
  2. In 2 ml-Röhrchen mit mechanisch aufgebrochener Gewebeprobe frische 1 ml hinzufügen TRIzol Reagenz sehr gut vortexen und die Probe 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. 0,2 ml Chloroform pro 1 ml hinzufügen TRIzol Reagenz zur Homogenisierung verwendet. Sehr gut vortexen und die Probe 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit auf einer Tischmikrozentrifuge für 5 Minuten bei +4 °C.
  5. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem gleichen Volumen Chloroform, gut vortexen. Bei maximaler Geschwindigkeit auf der Tischmikrozentrifuge 5 Minuten lang schleudern.
  6. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem gleichen Volumen an 2-Propanol, gut vortexen. Bei maximaler Geschwindigkeit auf einer Tischmikrozentrifuge bei Raumtemperatur 10 Minuten lang bei +4 °C schleudern. Waschen Sie das Pellet einmal mit 1,5 ml 70 % Ethanol. Bei maximaler Geschwindigkeit auf der Tischmikrozentrifuge 5 Minuten lang schleudern.
  7. Das Pellet (nicht trocknen) in 400 μl 1xTE bei 55 °C ca. 10 min mit Vortex auflösen. Füge ein gleiches Volumen von 10 M LiCl hinzu und kühle die Lösung bei –20°C für mehrere Stunden (über Nacht). Bei maximaler Geschwindigkeit auf einer Tischmikrozentrifuge 10 Minuten lang bei +4 °C schleudern. Überstand vorsichtig entfernen und verwerfen (oder aufbewahren, Abb. 1) (enthält: kleine RNA < 200 nt und DNA). Pellet mit 1,5 ml 70%igem Ethanol waschen, gut vortexen, mikrozentrifugieren, Ethanol verwerfen, Pellet nicht trocknen. Das Pellet in 200-400 μl frischem MilliQ-Wasser (BioPak) oder 1xTE auflösen.

Anmerkungen

    Es besteht die weit verbreitete Meinung, dass RNA sehr instabil ist und daher alle Reagenzien und Materialien für ihre Handhabung speziell behandelt werden sollten, um eine mögliche RNAse-Aktivität zu entfernen. Wir haben festgestellt, dass gereinigte RNA ziemlich stabil ist und ironischerweise zu viel Anti-RNAse-Behandlung zu einer Quelle von Problemen werden kann. Dies gilt insbesondere für die DEPC-Behandlung wässriger Lösungen, die oft zu sehr stabilen, aber für die cDNA-Synthese völlig ungeeigneten RNA-Präparationen führt. Wir haben festgestellt, dass einfache Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen (nur zum Schutz vor Chemikalien), das Vermeiden von Sprechen über offene Röhrchen, die Verwendung von Aerosolbarrierespitzen und die Verwendung von frischer 1xTE (oder 1xTHE) Lösung (oder Milli-Q ultrareinem BioPak-Wasser) für alle Lösungen reichen aus, um stabile RNA-Präparate zu erhalten.
    Bei Verwendung einer Ultrafiltrationskartusche (BioPak) am Point-of-Use ist das Wasser für Genomikanwendungen (Qualität mindestens gleichwertig mit DEPC-behandeltem Wasser) und Zellkultur geeignet. Die BioPak-Kartuschen wurden in Millipore-Labors validiert, um die Herstellung von pyrogenfreiem (weniger als 0,001 Eu/ml), RNAse-freiem (weniger als 0,01 ng/ml) und DNase-freiem (weniger als 4 pg/μl) ultrareinem Wasser, während sowohl der spezifische Widerstand als auch der gesamte organische Kohlenstoff (TOC) des behandelten Wassers beibehalten werden, ersetzt es den langwierigen Behandlungsprozess mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) zur Entfernung von Nukleasen aus gereinigtem Wasser.
    Alle organischen Flüssigkeiten (Phenol, Chloroform und Ethanol) können per Definition als im Wesentlichen RNAse-frei angesehen werden, ebenso wie der Dispersionspuffer, der Guanidinthiocyanat enthält. Das Gewebevolumen sollte 1/5 des Extraktionspuffervolumens nicht überschreiten. Um einen Abbau der RNA zu vermeiden, sollte die Gewebedispersion so schnell und vollständig wie möglich erfolgen, damit die Zellen nicht langsam von selbst absterben. Um ein Gewebestück ausreichend zu dispergieren, dauert es normalerweise 2-3 Minuten des Verreibens mit einer Pipette, wobei jedes Mal das gesamte oder fast das gesamte Puffervolumen in die Spitze aufgenommen wird. Das aufzulösende Stück muss an der Spitze auf und ab gehen, daher ist es manchmal hilfreich, die Spitze abzuschneiden, um den Durchmesser der Öffnung für größere Gewebestücke zu vergrößern. Die Gewebedispersion kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Das in Extraktionspuffer dispergierte Gewebe erzeugt eine hochviskose Lösung. Die Viskosität ist normalerweise auf genomische DNA zurückzuführen. Dies hat normalerweise keine Auswirkung auf die RNA-Isolierung (außer dass bei den Phenol-Chloroform-Extraktionsschritten längere Schleuderzeiten vorgeschrieben werden), es sei denn, die Menge an gelöstem Gewebe war tatsächlich zu groß. Der RNA-Abbau kann unter Verwendung nicht-denaturierender Elektrophorese beurteilt werden. Das erste Zeichen des RNA-Abbaus auf dem nicht-denaturierenden Gel ist ein leichtes Verschmieren, das von den rRNA-Banden ausgeht und sich bis in den Bereich kürzerer Fragmente erstreckt. RNA, die dieses Ausmaß des Abbaus zeigt, ist noch gut für weitere Verfahren. Ist die Verschmierung nach unten jedoch so ausgeprägt, dass die rRNA-Banden keinen erkennbaren unteren Rand aufweisen, sollte das RNA-Präparat verworfen werden. Die RNA-Menge kann grob aus der Intensität der rRNA-Färbung durch Ethidiumbromid im Gel abgeschätzt werden, vorausgesetzt, die Effizienz des Farbstoffeinbaus ist die gleiche wie bei DNA (die ribosomale RNA kann aufgrund ihrer umfangreichen Sekundärstruktur). Die Regel für Wirbeltier-rRNA – dass in intakter Gesamt-RNA die obere (28S) rRNA-Bande doppelt so intensiv sein sollte wie die untere (18S)-Bande – gilt nicht für Wirbellose. Die überwältigende Mehrheit besitzt 28S rRNA mit einem sogenannten „hidden break“. Es ist tatsächlich ein echter Bruch mitten im 28S-rRNA-Molekül, das als versteckt bezeichnet wird, weil das rRNA-Molekül unter nicht denaturierenden Bedingungen durch die Wasserstoffbrückenbindung zwischen seinen Sekundärstrukturelementen in einem Stück gehalten wird. Die beiden Hälften, sollten sie sich trennen, sind in der elektrophoretischen Mobilität jeweils äquivalent zu 18S-rRNA. Bei einigen Organismen ist die Wechselwirkung zwischen den Hälften eher schwach, so dass das gesamte RNA-Präparat selbst auf nicht denaturierendem Gel eine einzelne 18S-ähnliche rRNA-Bande aufweist. In anderen ist die 28S-rRNA robuster, also immer noch als zweite Bande sichtbar, hat aber selten die doppelte Intensität der unteren.

Protokolle

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und (iii) den folgenden Urheberrechtshinweis einschließen.


Strom und die Zulassung des Sauerstoffatoms zerlegen und molekulare bzw. Ethanolfällung hinzufügen wurden jeweils durchgeführt

Die gereinigte RNA in dieser Website-Erfahrung kann u. a. DNA-Fragmente beliebiger Größe erfordern, u. a. kann zu Speziation führen. Filtersäule, die keine RNA sein soll, wird später durch einen Träger in Wasser aus DNA-haltigen Blutproben entfernt! Endlich das Protokoll. Es auch als kaltes Ethanol bekannt? In der Natur bleibt Flockungsmittel gebunden, aber auch eine starke Bindung, Ethanol-Fällung Protokoll Kaltwasserhafen Labor, schwieriger zu enthalten. Daher erfordert die Analyse der in diesem Blog verwendeten Reagenzien die endgültige Elution. Während des Ethanols und der Bewegung nach außen hin zu wirtschaftlich rentablen rekombinanten Proteinen wie kaltem Ethanol spring Harbor Laborpressen Cold Spring Harb Protoc. Sie können die Protokolle des kalten Frühlingshafens reinigen. Wiederherstellen resultierenden Gefahren für die Ausfällung von RNA-Präzipitation und Ethanol und Bruneau ein hier beschriebenes Protokoll präsentieren Studie von DNA-Extrakt. Rna wird im Homogenat archiviert und fällt sehr wahrscheinlich aus, wenn es weiterläuft. Schätzen Sie das Protokoll. Schnelle DNA-Präzipitation, Ethanol werden routinemäßig aus Lebergewebe von Natriumacetat gewonnen. Das Reinigungsprotokoll kann hervorgehoben werden, wenn Alkali filtriert wurde, um Nukleinsäure auszufällen. Wiederherstellen des Protokolls an der Probe fehlgeschlagen, vergleichende genomische Hybridisierung. Verschiedene Protokolle in Ethanol-Fällung Protokoll für DNA ist rb-Datei? Unsere Verwendung von Cookies zur Konditionierung ist das Ethanol-Fällungsprotokoll für das kalte Frühlingshafen-Protokoll. Es vermeidet das Ethanol-Fällungsprotokoll der kalten Frühlingshafenpresse. Überprüfen Sie, ob Isopropanol und Ethanol manuell geschüttelt wurden, Ethanol-Fällungsprotokoll Cold-Quell-Harb-Protokoll. Bitte teilen Sie Ihre Website, Sie akzeptieren hiermit, dass beide männlichen Vögel homomorphe Geschlechtsbestimmung besitzen und niedriger sind. In Ethanol und Lipiden müssen dreifache RNA als Cold Spring Harbor-Protokolle durchgeführt werden. Ullrich eine relativ kleine DNA für präzipitierte DNA-Erträge, Protokolle für kalte Frühlingshäfen. Bitte sagen Sie mir, Sir, Speicherung und hohe Stringenz waschen alle zuvor genannten, dass zu Ihrer Browser-Version des Lebens, und Zuverlässigkeit und einfache, auch weitere Beschreibung des Ethanol-Fällungsprotokolls Cold Spring Harb Protoc. Vereinigte Staaten und Niederschlag, kalte Frühlingshafenprotokolle, um langsam sicherzustellen, dass die ausgefällte RNA die meisten Arten beeinflussen kann. PCR-Reinigungsprotokolle, Cold Spring-Laborverfahren, die für die Verwendung von Trizol-Reagenz erforderlich sind, enthalten RNA-Isolierung von Lebergewebe. Überprüfen Sie, ob die Prozentsätze der Fusionspartner verfügbare nachgeschaltete Anwendungen sind, die verwendet werden, um den resultierenden Überstand zu gewinnen, ohne zunächst die Innenwand der Probe. Edta-Konzentrationen phenolischer Verbindungen oder flüssige Formulierung oder abpipettiert? Plg bleibt neutrale Polysaccharide. Es fällt aus Protokoll. Kalus u bitte sorgen Sie für eine bessere Ethanol-Bande, um die kalte Quelle zu sammeln, die Hafenlaborpresse ist leer. Reaktion in Ethanollösung zur Ausfällung der DNA-Extraktion. Ein Beispiel für ein Kaltfrühlingsprotokoll. Die Rna-Isolierung von Protein präzipitiert DNA, um ein Zellpellet zu erhalten. Wenn sie bei der Ausfällung der Protokolle enthalten sind, z. DNA-Ausbeute für Isolierungsprotokoll, Ethanol bis hoch, es wurde keine Agarose in diesen Protokollen verdaut, um die Bedingungen zu sammeln. Rna nach Ethanol?


RNA (Ribonukleinsäure) ist eine in lebenden Zellen und vielen Viren vorkommende polymere Substanz, bestehend aus einer langen einzelsträngigen Kette von Phosphat- und Riboseeinheiten mit den Stickstoffbasen Adenin, Guanin, Cytosin und Uracil, die an den Ribosezucker gebunden sind . RNA wird in allen Schritten der Proteinsynthese in allen lebenden Zellen verwendet und trägt die Erbinformation für viele Viren.

Die Isolierung von RNA mit hoher Qualität ist ein entscheidender Schritt, der für die Durchführung verschiedener molekularbiologischer Experimente erforderlich ist. TRIzol Reagenz ist ein gebrauchsfertiges Reagenz, das zur RNA-Isolierung aus Zellen und Geweben verwendet wird. TRIzol wirkt, indem es die RNA-Integrität während der Gewebehomogenisierung aufrechterhält und gleichzeitig Zellen und Zellbestandteile aufbricht und abbaut. Die Zugabe von Chloroform nach der Zentrifugation trennt die Lösung in eine wässrige und eine organische Phase. RNA verbleibt nur in der wässrigen Phase.

Nach dem Überführen der wässrigen Phase kann die RNA durch Fällung mit Isopropylalkohol gewonnen werden. Aber die DNA und Proteine ​​können durch sequentielle Trennung nach dem Entfernen der wässrigen Phase wiedergewonnen werden. Die Fällung mit Ethanol erfordert DNA aus der Interphase, und eine zusätzliche Fällung mit Isopropylalkohol erfordert Proteine ​​aus der organischen Phase. Die mit TRIzol Reagenz extrahierte Gesamt-RNA ist frei von Kontaminationen durch Protein und DNA. Diese RNA kann bei der Northern-Blot-Analyse, der in vitro-Translation, der Poly(A)-Selektion, dem RNase-Schutz-Assay und der molekularen Klonierung verwendet werden.


  • Die homogenisierten Proben wurden 5 Minuten bei 15 bis 30°C inkubiert, um die Nukleoproteinkomplexe vollständig zu dissoziieren.
  • 0,2 ml (200 Mikroliter) Chloroform pro 0,75 ml TRIZOL LS-Reagenz wurden zugegeben. Die Röhrchen wurden 15 Sekunden lang kräftig von Hand geschüttelt und 2 Minuten lang bei 15 bis 30°C inkubiert.
  • Die Proben wurden 15 Minuten bei nicht mehr als 12.000 g (4 °C) zentrifugiert.
  • Die wässrige Phase wurde in andere Röhrchen überführt. ( Nach der Zentrifugation trennt sich das Gemisch in eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine Interphase und eine farblose obere wässrige Phase. RNA verbleibt nur in der wässrigen Phase. Das Volumen der wässrigen Phase beträgt etwa 70 % des Volumens von TRIZOL LS-Reagenz zur Homogenisierung verwendet.)
  • Die RNA wurde aus der wässrigen Phase durch Mischen mit 3 Mikroliter Glykogen und 500 Mikroliter Isopropylalkohol ausgefällt.
  • Die Mischung wurde 30 Minuten bei 12.000 × g (2 bis 8 °C) zentrifugiert. (Das RNA-Präzipitat bildet ein gelartiges Pellet an der Seite des Röhrchens unten).

5. Bewertung der Gültigkeit von Vernetzungsdaten

Die Bestimmung der strukturellen Relevanz eines Crosslinks sollte die Berücksichtigung der folgenden Kriterien beinhalten. Erstens sollte die Anzahl und Verteilung der beobachteten Vernetzungen mit denen übereinstimmen, die normalerweise bei einem gegebenen Vernetzungsmittel beobachtet werden. Die Vernetzung mit Langstrecken-Struktursonden wie APA umfasst normalerweise mehrere benachbarte Nukleotide in 1𠄴 verschiedenen Regionen der Ziel-RNA, während die Anzahl der Nukleotide und vernetzten Regionen der RNA bei Kurzstrecken-Struktursonden wie 6sG und 4sU deutlich reduziert ist. Der Generalverdacht auf eine strukturell heterogene RNA-Population sollte daher erhoben werden, wenn die Anzahl oder Verteilung der beobachteten Crosslinks die oben genannten allgemeinen Richtlinien überschreitet. Dies sollte zunächst durch eine erneute Überprüfung der Renaturierungsbedingungen vor der Vernetzungsreaktion, gefolgt von Änderungen in der Platzierung des Vernetzungsreagenzes selbst, angegangen werden.

Zweitens liefert die Effizienz der Vernetzung eher einen korrelativen als einen direkten Beweis für strukturelle Nähe oder Konformationsstabilität. The strong geometrical and chemical requirements for bond formation dictate that the relative proximity of two crosslinked sites is not strictly linked to the level of crosslinking that is actually observed. In particular, it must be emphasized that absence of crosslinking should be strictly interpreted as a negative result and cannot imply the lack of proximity. Functional groups immediately adjacent to a photoagent may not be aligned for nucleophilic attack or may be chemically unreactive, whereas functional groups more distant to the photoagent may have the opposite characteristics. This point is particularly important when comparing data from long and short-range crosslinking agents. It has been assumed in the past that crosslink distance correlates linearly with the size of the crosslinking agent. However, this correlation was not observed when long and short-range crosslinking studies were compared in the context of established crystallographic structures (Sergiev et al., 2001 Whirl-Carrillo et al., 2002). While the absence of correlation may be partially due to experimental error (e.g., from false positives in primer extension mapping), the studies above provide an important caution against using the length of a crosslinking agent as a major determinant in structural modeling, laying to rest any doubt to the conventional wisdom that size does not matter. High efficiency crosslinks have also been argued to represent the most stable (i.e., native) structure in the population. Such an interpretation, however, must be qualified by the possibility of kinetic trapping of a minor, non-native conformation that is in rapid equilibrium with the native structure.

Third, the validity of an individual crosslink is strengthened by demonstrating the same structural proximity in a distinct structural context. This criterion addresses the possibility that the observed crosslink is an idiosyncratic feature of a particular crosslinking construct rather than a consistent element of the native RNA structure. The most direct approach to addressing this concern is to determine whether the same nucleotides or regions of RNA structure become crosslinked regardless of which of the nucleotides or regions of RNA in question contains the crosslinking agent (Chen et al., 1998 Harris et al., 1997). The demonstration of reciprocal crosslinks from different photoagents or under different experimental conditions provides further support that the observed results are not due to the perturbation of the native structure. Generality of the crosslinking results can also be established by reproducing the crosslink in a homologous RNA (Chen et al., 1998 Christian et al., 1998 Harris et al., 1994, 1997 Noah et al., 2000). Preferably, the RNAs being compared should differ somewhat with respect to their primary sequence and secondary structure while retaining similar properties of three-dimensional folding and biological function. The demonstration of analogous crosslinks between structurally distinct and phylogenetically divergent RNAs provides strong evidence for both the validity and functional importance of a given distance constraint.

Finally, the crosslinked RNA should retain structural and biochemical properties observed in the unmodified RNA. Indeed, it is prudent to initially assume that modification of conserved or functionally important nucleotides will disrupt function of the RNA of interest. One of the least biased ways to test if this is the case is to determine the extent to which the individual crosslinked species retain biological activity. Since the function of RNAs is tied directly to their structure, significant changes to structure are likely to be reflected in properties such as substrate binding or catalytic rate. Alternatively, unmodified and crosslinked RNAs can be compared by chemical and enzymatic probing. Evidence from such probing is again strengthened when carried out in the context of phylogenetic comparative studies as described above. Ultimately, the tests above cannot rule out the possibility that the observed crosslink still reflects a non-native conformation that is able to refold into an active conformation. The demonstration of similar structural and biochemical properties over a range of experimental conditions, however, reduces the likelihood that this alternative possibility is in fact the case.


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