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Wie lange kann man die Probe für die DNA-Extraktion im Lysepuffer belassen?

Wie lange kann man die Probe für die DNA-Extraktion im Lysepuffer belassen?


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ich bin versuche eine DNA-Extraktion durchzuführen für meinen Professor, und ich mache ein Lysepuffer mit Proteinase K. Ich hatte keine Zeit, das Verfahren fortzusetzen, also Haare und Puffer liegen seit etwa 12 Tagen bei Raumtemperatur zusammen. Mein Professor sagte, es wäre "in Ordnung", mit meinem DNA-Isolationsverfahren fortzufahren, aber ich habe meine Zweifel.

Soll ich meine DNA-Extraktion fortsetzen?(Vortexen, Kochen, Zentrifugieren und Sammeln des Überstands, Lagerung bei -20 Grad Celsius) oder wäre das jetzt sinnlos? Mein Ziel ist es, eine PCR und dann ein Gel durchzuführen.

BEARBEITEN:

Hier ist die Zusammensetzung des Lysepuffers:

In 20 ml Lysepuffer:

Endkonzentrationen sind $0.1 M$ TAE, $0.5M$ $ce{NaCl}$, 0.2% SDS.

Zu 800 ul$ Lysispuffer fügte ich 5 ul$ Proteinase K in einer Konzentration von 250 ug/ml$ hinzu.

(Proteinase K wurde hergestellt über: 0,0025 g$ bis zu 10 ml$ TAE-Puffer ($ 1 Mio.))

Dies war in einem $ 1,5 ml $ Zentrifugenröhrchen, das jetzt seit 12 Tagen steht.


Es sollte in Ordnung sein. Sofern sie nicht mit DNase kontaminiert wurden, wird keine der Komponenten DNA beschädigen oder denaturieren. Ich habe gereinigte Plasmid-DNA wochenlang ohne sichtbaren Abbau auf der Bank gelassen, also Sie sollen in Ordnung sein (nicht, dass ich empfehle, das regelmäßig zu tun). Ich würde mit der Reinigung nach Empfehlung Ihres Professors fortfahren, weil Sie schon so weit gekommen sind. Im schlimmsten Fall bekommen Sie nichts und müssen nachreinigen. Allerdings sind die Chancen, dass Sie etwas sind ziemlich hoch, also können Sie auch damit gehen.


Ihre EDTA-Konzentration scheint ziemlich hoch zu sein. Wenn ich eine Lyse für die DNA-Extraktion durchführe, verwende ich normalerweise 1 mM EDTA im Lysepuffer. Zu hohe Konzentrationen können später zu einer Hemmung der PCR-Reaktion führen, es sei denn, die DNA wird vorher gereinigt.

Dies könnte ein Grund dafür sein, dass Ihre Reaktion fehlgeschlagen ist.


QIAzol Lyse-Reagenz

QIAzol Lysis Reagent ist für die Lyse von Fettgewebe optimiert. Das Standardprotokoll von QIAzol bietet ein einfach zu befolgendes Verfahren, das die QIAzol-Lyse mit Standardhomogenisierungsmethoden und Isopropanolfällung kombiniert.

Leistung

Siehe Abbildungen

Prinzip

Das QIAzol Lysis Reagent auf Phenol/Guanidin-Basis kann zur Lyse aller Gewebeklassen verwendet werden, ist jedoch für die Lyse von Fettgewebe wie Gehirn- und Fettgewebe optimiert. Die Kombination aus organischer Extraktion und chaotropem Aufschluss trägt zu einer effizienten Lyse und höheren Ausbeuten an Gesamt-RNA bei. Der organische Extraktionsschritt entfernt sowohl Proteine ​​als auch DNA, wodurch die Effizienz weiterer Reinigungsschritte, beispielsweise Fällung oder Spin-Säulen, verbessert wird. QIAGEN bietet mehrere Lösungen für eine effiziente RNA-Aufreinigung, die QIAzol-Lyse und RNeasy Silica-Membran-Aufreinigungstechnologien in einzelne, optimierte Protokolle integrieren (z. B. RNeasy Plus Universal Kits für jede Art von Gewebe).

Verfahren

Das Standardprotokoll von QIAzol bietet ein einfach zu befolgendes Verfahren, das die QIAzol-Lyse mit Standardhomogenisierungsmethoden und Isopropanolfällung kombiniert. Gewebeproben werden in QIAzol Lysis Reagent homogenisiert. Nach Zugabe von Chloroform wird das Homogenisat durch Zentrifugation in wässrige und organische Phase getrennt. RNA verteilt sich auf die obere, wässrige Phase, während DNA auf die Zwischenphase verteilt und Proteine ​​auf die untere, organische Phase verteilt sind. Aus der wässrigen Phase wird durch Zugabe von Isopropanol RNA präzipitiert. Das Pellet wird dann mit Ethanol gewaschen und in RNase-freiem Wasser wieder aufgelöst. Für eine hohe Leistung in Downstream-Anwendungen wird eine anschließende Aufreinigung der RNA mit dem RNeasy MinElute Cleanup Kit empfohlen, um kontaminierendes Phenol zu entfernen und die RNA zu konzentrieren.

Anwendungen

Das QIAzol Lysis Reagent auf Phenol/Guanidin-Basis ist für alle Gewebe geeignet und für die Lyse von Fettgewebe wie Gehirn- und Fettgewebe optimiert. Wir empfehlen die Reinigung des RNA-Produkts mit einem RNeasy Plus Universal Kit oder dem RNeasy MinElute Cleanup Kit, um eine hohe Leistung in jeder nachgelagerten Anwendung zu erzielen.

Unterstützende Daten und Zahlen

Hochwertige RNA.

Gesamt-RNA wurde aus 200 mg Rattenfettgewebe unter Verwendung des RNeasy Lipid Tissue Midi Kits (mit QIAzol) isoliert. Die hohe Qualität der RNA zeigt sich beim Scannen mit dem Agilent 2100 BioAnalyzer.


Zwischen Nanodrop light, Qubit und QIAGEN Qiaxpert können Sie ein beliebiges Instrument auswählen. Einige Labore bevorzugen jedoch sowohl Nanodrop Light als auch Qubit.

Die folgende Abbildung zeigt den allgemeinen Aufbau des DNA-Extraktionslabors.

Außerhalb des DNA-Extraktionslabors:

Bevor die Probe in das DNA-Extraktionslabor gelangt, muss die Probe gekennzeichnet und im Labormanagementsystem erfasst werden.

Generieren Sie dazu den eindeutigen Code für das Labor oder den eindeutigen Barcode für das Labor.

Außerdem verfügt das Labor über Einrichtungen zur Probenentnahme, falls ein Patient das Labor direkt aufsucht. Dafür haben wir eine Spritze, Nadel, Watte, Blutentnahmeröhrchen und Spiritus außerhalb des Labors.

Handelt es sich bei der Probe um Blut, muss die Probe im EDTA-Fläschchen gesammelt werden.

Die feuersichere Einrichtung muss außerhalb des Labors vorhanden sein.

Außerdem muss das Labor mit den wesentlichen Etiketten gekennzeichnet sein.
Beginnend mit der Probenvorbereitung muss die Probe für das DNA-Extraktionslabor noch einmal gekennzeichnet werden. Dieser Ort ist der Probenvorbereitung und der Zugabe anderer Chemikalien gewidmet.

Danach Zentrifuge, Wasserbad und Scheitel neben dem Probenvorbereitungsbereich platzieren (siehe Abbildung).

Danach in die nächste Seite des Labors stellen, zuerst die Waage, gefolgt von dem Ofen, der Elektrophoreseeinheit und dem UV-Transilluminator.

Hier an dieser Station wird die entnommene DNA-Probe der Elektrophorese unterzogen. Das Gel wird vorbereitet und die DNA wird auf der Agarosegelelektrophorese laufen gelassen, die DNA wird unter dem UV-Transilluminator analysiert.

Daneben ist die DNA-Quantifizierung.

Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, wird die Probe zur Quantifizierung geschickt. Hier wird die Reinheit und Menge der extrahierten DNA überprüft und anschließend an die nächste Station geschickt.

Jetzt ist unsere Probe bereit für die PCR und andere nachgelagerte Anwendungen. Die DNA wird zur Lagerung geschickt (Einfrieren oder Tiefkühlen). Aus der Probe wird unsere DNA extrahiert, nun kann die DNA an die nächste Abteilung unseres genetischen Labors gesendet werden.

Der allgemeine Satz des genetischen Labors ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Das DNA-Extraktionslabor ist ein wesentlicher Bestandteil des genetischen Labors. Beginnend mit dem DNA-Extraktionslabor öffnet es sich in den Lagerraum.

Der Lagerraum enthält Gefrier-, Tiefkühl- und Utility-Racks. Sobald die DNA aus dem DNA-Extraktionslabor extrahiert wurde, wird die DNA quantifiziert und für die Kurzzeitlagerung eingefroren und für die Langzeitlagerung tiefgefroren.

Der Lagerraum mündet in den Reaktionsvorbereitungsraum. Der Reaktionsvorbereitungsraum enthält den PCR-Arbeitsplatz, an dem die PCR-Reaktionen vorbereitet werden.

Der Reaktionsvorbereitungsraum öffnet sich in den Template-Additionsraum, in dem das DNA-Template zur PCR-Reaktion hinzugefügt und in die PCR-Maschine platziert wird.

Der beschriebene Aufbau für das Extraktionslabor entspricht der NABL-Richtlinie für das Genlabor. Hier benötigte das Genlabor gemäß NABL-Richtlinie im Wesentlichen einen eigenen Vorlagenzugaberaum.

Denn im Reaktionsvorbereitungslabor und im DNA-Extraktionslabor ist die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination sehr hoch.

Hinweis: Der Nachverstärkungsbereich wird in der obigen Abbildung nicht angezeigt.


Probenbereinigung

Normalerweise ist es nicht notwendig, Proben vor der 1-D-Gelelektrophorese zu behandeln, aber bei 2D-Gelelektrophoreseanwendungen ist dies sehr wichtig. Wenn jedoch bei der Trennung Probleme auftreten, wie beispielsweise verschwommene Banden, kann die Probenreinigung die Leistung verbessern, indem potenziell störende Verbindungen wie Nukleinsäuren, Polysaccharide und Salze entfernt werden. Durch die Zugabe von DNase kann beispielsweise Viskositätsproblemen durch die Freisetzung von Nukleinsäuren entgegengewirkt werden. Tabelle 4 enthält eine Liste der häufigsten Schadstoffe und Möglichkeiten, damit umzugehen.

Probenreinigungsprodukte

Das SDS-PAGE Clean-Up Kit wurde für die Vorbereitung von Proben entwickelt, die aufgrund des Vorhandenseins von Salzen oder einer niedrigen Proteinkonzentration schwer zu analysieren sind (Abbildung 1). Dieses Kit verwendet eine Kombination aus einem Fällungsmittel und einem Co-Fällungsmittel, um die Probenproteine ​​quantitativ auszufällen, während störende Substanzen wie Detergenzien, Salze, Lipide, Phenole und Nukleinsäuren in Lösung bleiben. Proteine ​​werden durch Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wird weiter gewaschen, um Nicht-Protein-Verunreinigungen zu entfernen, und erneut zentrifugiert. Das resultierende Pellet wird resuspendiert, mit SDSPAGE-Probenpuffer gemischt und erhitzt. Die Probe ist dann für die SDS-PAGE bereit. Das Verfahren kann in weniger als 2 Stunden abgeschlossen werden.

Abbildung 1. Vergleich des SDS-PAGE Clean-Up Kit mit der Ethanolfällung. (A) Urin-Protein, das mit 10 Volumina Ethanol ausgefällt wurde. (B) Urinprotein präzipitiert mit SDS-PAGE Clean-Up Kit. Gel: 8 × 9 cm, 12,5% Acrylamid, 0,1% SDS, Lauf auf SE 260 Mini-Vertical Unit. Färbung: Coomassie** Blau R-250.

2-D-Reinigungsset wurde entwickelt, um Proben für die 2-D-Gelelektrophorese vorzubereiten (Figur 2), kann aber auch in Western-Blotting-Anwendungen verwendet werden. Die Reagenzien fällen Proteine ​​quantitativ aus, während störende Substanzen wie Detergenzien, Salze, Lipide, Phenole und Nukleinsäuren in Lösung bleiben. Die Behandlung der Probe mit dem 2D-Clean-Up-Kit verbessert die Qualität der 2D-Gelelektrophoreseergebnisse erheblich und reduziert Schlieren, Hintergrundfärbung und andere Artefakte. Weitere Informationen zum 2-D-Reinigungskit finden Sie im 2-D-Elektrophorese-, Prinzipien- und Methodenhandbuch von Cytiva (2).

Figur 2. Das 2-D Clean-Up Kit beseitigt die meisten horizontalen Streifen, die durch verbleibende SDS verursacht werden. Probe: Rattenleber extrahiert mit 4% SDS, 40 mM Tris-Base. Erste Dimension: Etwa 20 µg Rattenleberprotein, Immobiline™ DryStrip (pH 4-7, 7 cm). Ettan™ IPGphor™ 3 Isoelektrische Fokussiereinheit 17,5 kVh. Zweite Dimension: SDS-PAGE (12,5%), Lauf auf SE 260 Mini-Vertical Unit (8 × 9 cm Gel). Färben: PlusOne™ Silberfärbekit, Protein.

Abreicherung von Proteinen mit hoher Konzentration aus Serum- oder Plasmaproben

Bei der Untersuchung von Plasma oder Serum durch Western-Blotting können reichlich vorhandene Plasmaproteine ​​wie Albumin und IgG die Signale weniger reichlich vorhandener Proteine ​​verschleiern. Vorgepackte Säulen wie HiTrap™ Albumin & IgG Depletion wurden entwickelt, um Proben dieser potenziell problematischen Proteine ​​zu entziehen, indem >95% Albumin bzw. >90% IgG entfernt werden.

HiTrap Albumin & IgG Depletion 1 ml Säule ist für die Depletion von Albumin und IgG aus Probenvolumina von ca. 150 µl unverdünntem Humanplasma oder Serum mit normalen Albuminspiegeln (

15mg/ml). Der Entleerungsvorgang dauert ungefähr 35 Minuten und kann mit einem Flüssigchromatographiesystem der ÄKTA™-Designplattform, einer peristaltischen Pumpe oder manuell mit einer Spritze durchgeführt werden. Wenn mit kleineren Volumina gearbeitet wird, ist Albumin & IgG Depletion SpinTrap™ für Volumina von

50 µl Humanplasma oder -serum werden empfohlen.

Entsalzen und Konzentrieren von Proben

Bevor Sie Ihre Probe auf ein Elektrophoresegel aufbringen, ist es wichtig, dass das Lösungsmittel keine übermäßige Konzentration an Salzen oder anderen Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht enthält. Hohe Salzgehalte in Proben können dazu führen, dass die Proteine ​​in inkonsistenten und unvorhersehbaren Mustern wandern. Die Entsalzung kann in einem einzigen Schritt basierend auf Gelfiltration und gleichzeitigem Überführen der Probe in den gewünschten Puffer erreicht werden. Jedoch führen Entsalzungs- und Pufferaustauschverfahren häufig zu einer Probenverdünnung. Bei Elektrophoreseanwendungen ist für gute Ergebnisse eine relativ hohe Probenkonzentration erforderlich und daher kann eine Probenkonzentration erforderlich sein. Eine Probe kann durch Membran-Ultrafiltration effizient und einfach konzentriert werden.

Einige Entsalzungs- und Konzentrierungsprodukte von Cytiva sind zusammengefasst in Tabelle 5.


Diskussion

Es wurden große Anstrengungen unternommen, um schnelle, durchsatzstarke und kostengünstige Verfahren zur Coextraktion von viralen Nukleinsäuren zu entwickeln. Die wichtigsten chemischen Bestandteile für die Co-Extraktion von RNA und DNA sind GTC, DTT, Natriumdodecylsulfat (SDS) und β-Mercaptoethanol 12,13,15 . In den 1990er Jahren etablierte I. Casas, L. die Extraktionsmethode „GuSCN-DNA/RNA“, um virale RNA und DNA aus Liquor zu extrahieren. Diese Methode war die Grundlage für die meisten nachfolgenden Co-Extraktionsmethoden 15 . Wir extrahierten DNA oder RNA effizienter aus Sputum, indem wir diese chemischen Bestandteile mit magnetischen Kügelchen kombinierten. In unserer vorherigen Studie verwendeten wir auch SDS und β-Mercaptoethanol, um den viralen Lysepuffer herzustellen. SDS kann jedoch leicht Kristalle bilden, was bei der Probenverarbeitung zu Unannehmlichkeiten führt, und β-Mercaptoethanol hat einen unangenehmen Geruch und ist ein Risiko für die menschliche Gesundheit und einen Umweltschadstoff. Daher haben wir festgestellt, dass GTC, DTT, Glykogen und Natriumcitrat ausreichende und geeignete Komponenten eines Lysepuffers sind, um gleichzeitig DNA und RNA aus Sputum zu extrahieren.

GTC ist ein starkes Denaturierungsmittel, das RNase- und DNase-Aktivitäten hemmen und Nukleinsäuren und Nukleoprotein trennen kann, wodurch die RNA- und DNA-Integrität bewahrt wird 12,15 . Mehrere Studien haben gezeigt, dass weder DNA noch RNA an den Oberflächen von Magnetbeads adsorbiert, wenn dem Lysepuffer GTC fehlt 12 . Diese Studie zeigte, dass die höchste Extraktionseffizienz bei einer 2,0 M GTC-Konzentration auftrat, basierend auf den DNA- und RNA-Coextraktionsausbeuten. Die unterschiedlichen GTC-Konzentrationen hatten wenig Einfluss auf die Extraktionseffizienz. Bemerkenswerterweise kristallisierte GTC, wenn seine Konzentration 6,0 M betrug, was zu Unannehmlichkeiten bei der Probenverarbeitung führte. DTT führt nicht nur dazu, dass Proteine ​​zusätzliche Aktivität verlieren, sondern hat auch die bekannte Fähigkeit, Sputum zu verflüssigen 19,23 . Daher erforderte das Sputum keine Vornahme, wenn DTT in das Nukleinsäureextraktionsverfahren eingeschlossen wurde. Glykogen wurde verwendet, um die Nukleinsäurefällung zu erleichtern 15 . Die Automatisierung traditioneller Nukleinsäure-Extraktionsverfahren ist aufgrund der Zentrifugalschritte 24 schwierig zu implementieren. Die Entwicklung magnetischer Bionanopartikel hat den Automatisierungsprozess der Nukleinsäureextraktion stark gefördert 12,25 . Eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass magnetische Kügelchen die Fähigkeit haben, DNA und RNA zu absorbieren 12,26,27, und ihre Adsorptionskapazität kann mit den entsprechenden Konzentrationen einiger Lösungsmittel, einschließlich GTC, stark verbessert werden. Die Gründe für diese Verstärkung können folgende sein 28,29 : Anionen sind auf den Oberflächen der magnetischen Beads und Nukleinsäuren vorhanden, und GTC oder Ammonium können als Brücke zwischen den Nukleinsäuren und magnetischen Beads fungieren 30 die hohe Konzentration an Salzionen dehydratisieren die Wasserschicht auf den Oberflächen sowohl von Nukleinsäuren als auch magnetischen Beads, indem hydratisierte Ionen gebildet werden, die die magnetischen Beads veranlassen, Nukleinsäuren zu adsorbieren, und GTC macht die doppelsträngige DNA einzelsträngig, da die basische Gruppe der einzelsträngigen DNA und die Hydroxylgruppe auf der Oberfläche der Magnetkügelchen bildet eine chemische Bindung, die die Haftung verstärkt. Daher werden DNA und RNA ohne GTC kaum an der Oberfläche der magnetischen Beads adsorbiert.

Obwohl magnetische Beads bei dieser Extraktionsmethode eine unersetzliche Rolle spielen, steigt die Extraktionseffizienz nicht unbedingt mit der Zunahme der magnetischen Beads. Die in dieser Studie verwendeten magnetischen Beads wurden mit großen Mengen an Hydroxyl modifiziert. In einer Umgebung mit hohem Salzgehalt können magnetische Beads Nukleinsäuren absorbieren, indem sie sie von Proteinen und anderen Verunreinigungen trennen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Extraktionseffizienz durch die Zugabe eines Überschusses an magnetischen Beads verringert wurde die eluierte Nukleinsäure im letzten Schritt. In dieser Studie waren 20 µl Magnetbeads ausreichend, um eine hohe Extraktionseffizienz zu gewährleisten.

Viele Nukleinsäure-Extraktionsverfahren werden bei Raumtemperatur 12,31 durchgeführt, während andere Studien gezeigt haben, dass bei erhöhten Temperaturen mehr DNA und RNA freigesetzt wurden. Unsere experimentellen Daten zeigten, dass der RNA-Abbau bei 60–100 °C nicht offensichtlich war, während die Inkubation bei Raumtemperatur zu einer geringeren Effizienz der RNA-Extraktion führte. Der pH-Wert der Mischung spielt bei der Nukleinsäureextraktion eine wichtige Rolle. Wie unsere Daten zeigen, wurden unter alkalischen Bedingungen nur wenige Unterschiede in der Adsorptionskapazität der magnetischen Beads beobachtet, während die Adsorptionskapazität unter sauren Bedingungen dramatisch abnahm, insbesondere wenn der pH-Wert unter 5 lag Säuren hafteten an den Oberflächen der Magnetkügelchen, die eine positive Ladung tragen, wenn der pH zu niedrig war, was die Nukleinsäurebindung an die Magnetkügelchen beeinträchtigte.

Diese Co-Extraktionsmethode basierend auf magnetischen Beads ohne Träger-RNA erfüllte die Anforderungen eines multiplen RT-qPCR-Assays, jedoch war die Extraktionseffizienz geringer als die Extraktionseffizienz der kommerziellen Kits. Die Zugabe von RNA-Träger verbesserte die Extraktionseffizienz stark und erreichte ein höheres Niveau als die Extraktionseffizienzen für die kommerziellen Kits sowohl für RNA als auch für DNA, möglicherweise weil der RNA-Träger eine gute Wirkung auf die Nukleinsäurefällung hatte.


Ein neuartiger Direkt-PCR-Lysepuffer kann die PCR aus Fleischmatrizen verbessern

Auf PCR basierende molekulare Technologien sind in vielen biologischen Analysebereichen weit verbreitet, insbesondere für die genetische Analyse und das DNA-Barcoding. In dieser Studie wurde eine schnelle DNA-Lyseflüssigkeit ohne Reinigungsschritt aus frischem und verarbeitetem Fleisch formuliert, die für die konventionelle PCR-Amplifikation geeignet ist. Drei verschiedene Lyseflüssigkeitsformeln wurden zur Auswahl und weiteren Optimierung für die direkte PCR entwickelt und die Absorptionsspektren DNA-Konzentration und Leistung in der PCR wurden verwendet, um die Wirkung jeder Formel zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Rezeptur mit NaOH, EDTA, SDS, Tween 20 und Tris-HCl die besten Ergebnisse erzielte und die optimierte Rezeptur die Anforderungen praktischer PCR-Anwendungen erfüllte. Das Protokoll lieferte einen schnellen Lysepuffer für die DNA-Replikation aus beliebigen Fleischproben. Die Leistung der endgültigen Formel führte zu einer hohen DNA-Lyse-Effizienz für alle getesteten Fleischproben und die PCR-Amplifikationseffizienz war ähnlich der isolierten DNA-Matrize unter Verwendung eines kommerziellen Kits. Der gesamte Vorgang kann in 30 Minuten abgeschlossen sein. Daher bietet diese Studie eine einfache, alternative und kostengünstige schnelle Lösung für die molekulare Analyse von Fleisch auf DNA-Basis.

Dies ist eine Vorschau der Abonnementinhalte, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


AAVpro Extraktionslösung

Erhöhen Sie die AAV-Ausbeute um mindestens das Dreifache mit AAVpro Extraction Solution, einem Reagenzienset zur Extraktion von AAV-Partikeln aus 293T-Produzentenzellen. Die Isolierung von AAV-Partikeln wird typischerweise unter Verwendung von Gefrier-Auftau- oder Beschallungsverfahren durchgeführt. Diese Verfahren sind jedoch zeitaufwendig und erfordern eine spezielle Ausrüstung. Die AAVpro-Extraktionslösung verwendet eine verbesserte Methode zur Isolierung von AAV-Partikeln. Geben Sie einfach die Extraktionslösung zu virusproduzierenden Zellen und gewinnen Sie virale Partikel durch Zentrifugation.

Erhöhen Sie die AAV-Ausbeute um mindestens das Dreifache mit AAVpro Extraction Solution, einem Reagenzienset zur Extraktion von AAV-Partikeln aus 293T-Produzentenzellen. Die Isolierung von AAV-Partikeln wird typischerweise unter Verwendung von Gefrier-Auftau- oder Beschallungsverfahren durchgeführt. Diese Verfahren sind jedoch zeitaufwendig und erfordern eine spezielle Ausrüstung. Die AAVpro-Extraktionslösung verwendet eine verbesserte Methode zur Isolierung von AAV-Partikeln. Geben Sie einfach die Extraktionslösung zu virusproduzierenden Zellen und gewinnen Sie virale Partikel durch Zentrifugation. Neben einem einfachen Protokoll reduziert die Extraktionslösung die Kontamination von Wirtsproteinen und Nukleinsäuren und liefert Viruspartikellösungen, die für eine Zellinfektion oder weitere Reinigung mit dem AAVpro Purification Kit bereit sind.


Wie lange kann man die Probe für die DNA-Extraktion im Lysepuffer belassen? - Biologie

DNA kann aus jeder Blut- oder Gewebeprobe extrahiert werden. Die Qualität und Quantität der gewonnenen DNA hängt von der Größe, dem Alter und der Zellzahl der Probe ab. In der Regel genügen 3 ml Blut in EDTA. Die DNA wird aus allen kernhaltigen Zellen extrahiert und wird als genomische DNA bezeichnet.

Im Zellkern ist die DNA eng mit vielen verschiedenen Proteinen als Chromatin verbunden. Es ist wichtig, diese sowie andere zelluläre Proteine ​​zu entfernen, um die DNA zu extrahieren. Dies wird durch den Einsatz von organischen Lösungsmitteln oder Salzfällung erreicht. Man erhält eine wässrige DNA-Lösung, aus der die DNA durch Ethanolfällung weiter gereinigt wird.

Eine Reihe von DNA-Extraktionskits sind jetzt im Handel erhältlich. Diese können den Zeitaufwand für die DNA-Extraktion deutlich reduzieren, die Verwendung organischer Lösungsmittel umgehen und eine gute Qualitätskontrolle der verwendeten Reagenzien ermöglichen. Die Verwendung von Kits in allen Aspekten der Molekularbiologie kann jedoch die Entwicklung von Verbesserungen hemmen.

Protokoll: Extraktion genomischer DNA (Das hier beschriebene Protokoll ist eine manuelle Methode)

Bitte beachten Sie, dass für alle Puffer und Lösungen empfohlen wird, durchgängig Reagenzien der höchsten verfügbaren Qualität und doppelt destilliertes entionisiertes Wasser zu verwenden.

  • NaCl 5 mol/l. 146,1 g NaCl in ein Becherglas einwiegen und mit Wasser auf 500 ml auffüllen und rühren bis es gelöst ist.
  • Tris-HCl, 1 mol/l, pH 8,5. 60,5 g Trizma-Base (Tris[hydroxy]methylaminomethan) in 350 ml Wasser lösen, konzentrierte HCl zugeben, bis der pH-Wert auf 8,5 fällt, mit Wasser auf 500 ml auffüllen.
  • Tris-HCl, 1 mol/l, pH 7,4. Bereiten Sie wie oben beschrieben vor, reduzieren Sie jedoch den pH-Wert mit HCl auf 7,4.
  • NaOH, 5 mol/l. 200 g NaOH in 800 ml Wasser geben und rühren, bis es gelöst ist, mit Wasser auf 1 Liter auffüllen.
  • EDTA, 0,5 mol/l, pH 8,0. 93 g EDTA-Dinatriumsalz (Dihydrat) einwiegen und in 400 ml Wasser rühren, bis sich das meiste aufgelöst hat. 0,5 mol/l NaOH zugeben, bis der pH-Wert auf 8,0 ansteigt, wenn der Rest des Feststoffs in Lösung gehen sollte. Mit Wasser auf 500 ml auffüllen.
  • Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,3.
  • Nonidet P-40 (NP40), 10 %. 10 ml NP40 auf 90 ml Wasser geben und gut mischen.
  • Natriumdodecylsulfat (SDS, Laurylsulfat), 20%. Wiegen Sie 100 g SDS und geben Sie 350 ml Wasser hinzu. Rühren und auf 65°C erhitzen, bis es in Lösung ist und mit Wasser auf 500 ml auffüllen.

Vorsicht: SDS ist ein Reizmittel für die Atemwege. Tragen Sie eine Gesichtsmaske und wiegen Sie in einem Abzug.

  • PBS + 0,1% NP40. 5 ml 10 % NP40 zu 495 ml PBS hinzufügen.
  • Zehnfach konzentriert (吆) Lysepuffer). 60 ml 5 mol/l NaCl, 20 ml 0,5 mol/l EDTA, 10 ml 1 mol/l Tris pH 7,4 und 10 ml Wasser zu 100 ml 3 mol/l NaCl, 100 mmol/l . mischen EDTA und 100 mmol/l Tris.
  • Lyse-Lösung. Bereiten Sie eine geeignete Menge dieser Lösung jedes Mal frisch zu. Für 50 ml 21 g Harnstoff (7 mol/l) abwiegen, 5 ml 吆 Lysepuffer hinzufügen und mit Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml auffüllen.
  • Chloroform/Isoamylalkohol (24:1). Fügen Sie 20 ml Isoamylalkohol zu 480 ml Chloroform hinzu.
  • Ethanol 70%. 30 ml Wasser zu 70 ml absolutem Ethanol hinzufügen.
  • Tris-EDTA (TE) (10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA). 5 ml 1 mol/l Tris pH 7,4 und 1 ml 0,5 mol/l Na2 EDTA in 494 ml Wasser geben.
  • TE-äquilibriertes Phenol. Der Zustand des Phenols ist entscheidend für die Qualität der erhaltenen DNA. DNA ist in saurem wassergesättigtem Phenol löslich und muss daher auf einen neutralen pH-Wert eingestellt werden.

  1. Nehmen Sie 500 ml wassergesättigtes Phenol. Bereiten Sie 500 ml 0,5 mol/l Tris pH 8,5 vor, geben Sie 150 ml davon zum Phenol und mischen Sie 2𔃁 min durch Umdrehen. Stehen lassen, bis sich wässrige und organische Phase getrennt haben.
  2. Entfernen und verwerfen Sie die obere wässrige Schicht. Weitere 125 ml 0,5 mol/l Tris zugeben, mischen, stehen lassen, die wässrige Schicht wie zuvor entfernen und dann wiederholen.
  3. Zu den restlichen 100 ml 0,5 mol/l Tris werden 400 ml Wasser gegeben, um 500 ml 0,1 mol/l Tris zu erhalten. 150 ml davon zum Phenol geben und dann mischen, stehen lassen und entfernen. Wiederholen Sie dies noch zweimal.
  4. Zu den restlichen 50 ml 0,1 mol/l Tris werden 449 ml Wasser und 1 ml 0,5 mol/l EDTA hinzugefügt, um 500 ml TE zu erhalten. Fügen Sie dies wie zuvor in drei Schritten hinzu, mischen Sie, stellen Sie es und entfernen Sie es. Das Phenol hat während dieses Verfahrens sein Volumen reduziert, ist aber jetzt TE-äquilibriert und gebrauchsfertig.
  1. Frieren Sie eine antikoagulierte Blutprobe bei -20°C ein. EDTA ist das bevorzugte Antikoagulans. Es ist praktisch, das Blut in einem zentrifugierbaren Röhrchen zu sammeln, beispielsweise einem 25 ml-Universalbehälter aus Kunststoff. Jede Probengröße von 2 bis 20 ml ist zufriedenstellend. Blut kann bei Raumtemperatur an ein Referenzlabor versandt werden, vorzugsweise innerhalb weniger Tage nach der Entnahme. Die Probe kann mehrere Wochen bei -20°C gelagert werden. Eine längere Lagerung ist bei -80°C besser.
  2. Blut auftauen und 15 min bei 700 g zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig abgießen. Das Pellet ist in diesem Stadium schwer zu sehen und kann ziemlich locker sein.
  3. Resuspendieren Sie das Pellet in 1𔃀 ml PBS + 0,1% NP40 durch Auf- und Abmischen in einer Standard-Kunststoff-Transferpipette mit großem Durchmesser. Die Suspension mit PBS + 0,1% NP40 auf das ursprüngliche Volumen auffüllen.
  4. Zentrifugieren Sie erneut bei 700 g für 15 min und gießen Sie den Überstand ab. Wiederholen Sie dies ggf., bis das Pellet die meiste rote Farbe verloren hat.
  5. Fügen Sie 2𔃁 Tropfen Lyselösung hinzu. Brechen Sie das Pellet mit einem nicht benetzbaren sterilen Stäbchen (z. B. einer Einweg-Impföse aus Kunststoff) oder einem sauberen silikonisierten Glasstab in diese Lösung auf. Die Lösung wird viskos. Machen Sie es so homogen wie möglich.
  6. Nacheinander 0,5 ml der Lyselösung zugeben und dabei jedes Mal mischen, bis die Viskosität so hoch ist, dass die Lösung problemlos auf- und abpipettiert werden kann. Das Endvolumen hängt von der Größe, Art und Qualität der Blutprobe ab. Für 10 ml frisch gefrorenes normales Blut verwenden Sie 2𔃁 ml Lyselösung.
  7. Fügen Sie 1/10 Volumen von 20 % SDB hinzu. Vorsichtig mit einer Transferpipette mischen und bei 37&176 °C für mindestens 15 Minuten inkubieren. Die Proben können in diesem Stadium über Nacht belassen werden.
  8. Übertragen Sie die Probe in ein verschlossenes Polypropylenröhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform/Isoamylalkohol und ein gleiches Volumen Phenol hinzu. 5 min durch Umdrehen vorsichtig mischen. 15 min bei 1300 g zentrifugieren.
  9. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Polypropylenröhrchen. Lassen Sie die weiße Proteingrenzfläche und die organische Phase zurück. Dies kann schwierig sein, wenn die Lösung zu viskos ist, in diesem Fall ist eine weitere Verdünnung mit Lyselösung erforderlich.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 8 und 9 mindestens noch einmal und fahren Sie fort, bis die Schnittstelle frei ist. Fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform/Isoamylalkohol hinzu und mischen Sie vorsichtig 5 Minuten lang durch Umdrehen. Zentrifugieren Sie wie zuvor und überführen Sie die wässrige Phase erneut in ein universelles oder verschlossenes 10-ml-Röhrchen.
  11. Fügen Sie 2,5 Volumen absolutes Ethanol hinzu. Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Die DNA sollte als Kugel aus “Baumwolle” ausfallen. Übertragen Sie die DNA mit einer Mikropipettenspitze in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 70%igem Ethanol.
  12. Zentrifugieren Sie in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 g für 5 min. Gießen Sie das restliche Ethanol ab und entfernen Sie alles mit einer Mikropipette.
  13. 10 min auf der Bank trocknen lassen.
  14. Je nach Größe des Pellets 50� μl TE hinzufügen. Ziel ist eine DNA-Konzentration von ca. 0,5 mg/ml. Mindestens eine Nacht resuspendieren lassen. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen bewegen, niemals vortexen. Die DNA kann für längere Zeit bei 4°C gelagert oder bei -20°C eingefroren werden.

Extraktion von DNA aus anderen Quellen
Für die Analyse von Ig- und TCR-Genumlagerungen ist es notwendig, vor der DNA-Extraktion eine periphere Blutprobe auf Lymphozyten anzureichern. Dies wird durch die Trennung mononukleärer Zellen auf Ficoll/Hypaque (oder Lymphoprep) erreicht. Nach dem Waschen des Zellpellets in PBS kann die Lyse und DNA-Extraktion ab Schritt 5 erfolgen.

DNA wird aus Knochenmarkaspiraten auf die gleiche Weise wie aus peripherem Blut extrahiert, außer dass sie vor dem Einfrieren in mindestens 5 Volumina PBS verdünnt werden.

Gewebebiopsien variieren stark in Art, Größe und Zellgehalt und damit auch in Qualität und Quantität der daraus gewonnenen DNA. Um ausreichende Mengen an DNA mit hohem Molekulargewicht für die Southern-Blot-Analyse zu erhalten, muss die Biopsie mehrere mm3 groß und frisch eingefroren sein. Wenn eine solche Biopsie verfügbar ist, können ausreichend Zellen gewonnen werden, indem sie zunächst mechanisch in PBS zerkleinert werden, indem sie mit einer sauberen Klinge fein zerkleinert und dann mit dem stumpfen Ende eines 5 ml-Spritzenkolbens aufgebrochen werden. Die Suspension wird zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten, aus dem DNA wie zuvor (aus Schritt 5) extrahiert wird. Bei kleineren Biopsien ist es besser, die Probe vor der Extraktion wie folgt mit Proteinase K zu behandeln:

  1. Legen Sie das Gewebe in 700 μl 50 mmol/l Tris-HCl, pH 8,0, 100 mmol/l NaCl, 1% (w/v) SDS mit 100 μg/ml Proteinase K.
  2. Schneiden Sie das Gewebe mit einer feinen Schere auf und inkubieren Sie es über Nacht bei 50°C.
  3. Fahren Sie mit der Phenol/Chloroform-Extraktion und der DNA-Präzipitation wie bei Schritt 8 oben fort.

Bestimmung der DNA-Konzentration
Nehmen Sie 5 µl der DNA-Lösung und verdünnen Sie sie in 245 µl Wasser. Durch Vortexen gut mischen. (Diese DNA ist zu verwerfen und kann daher auf diese Weise behandelt werden.) Lesen Sie die Extinktion (A) in einem Spektrometer bei 260 nm gegen einen Wasserleerwert ab. Aus einer DNA-Lösung mit einer Konzentration von 50 µg/ml wird ein A von 1,0 erhalten. Multiplizieren Sie daher den erhaltenen A-Wert mit 2500, um die Konzentration der ursprünglichen DNA-Lösung in μg/ml zu erhalten. Das Verhältnis von A260 zu A280 gibt einen Hinweis auf die Reinheit der DNA-Lösung. Dieses Verhältnis sollte im Bereich von 1,7𔃀.0 liegen.


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Discussion and conclusions

Sample acquisition and preparation is becoming the most time consuming step in large scale genomic analyses of solid tumors. We have therefore designed, implemented and validated an automated method for the serial extraction of DNA and RNA molecules from tissues of various types, with a particular view to using this method in cancer genomic and transcriptomic studies. The automation solution proposed here enables a high-throughput, cost-effective preparation of samples with minimal hands-on time.

Tissue extraction presents a distinct set of problems not applicable to blood or body fluids. Most extraction methods, in particular with regard to RNA, require a titration of input material to determine the optimal input, to avoid overloading the binding capacity [1]. Here we describe a method that can extract uniformly from a similar amount (approximately 25 mg each) of a variety of input tissue types. The technique produces, on a large scale, nucleic acids of high quality suitable for many downstream processes. The process is suited to a wide variety of tissue types, and has successfully been used to extract more than ten different tumor and normal tissues, including those of the liver, prostate, tonsil, colon, breast, thymus, kidney, skin, uterus and lung (data not shown). The extraction yield and purity is identical with manual extraction using the same chemistry [5]. The method presented here performs well when compared to other established extraction techniques, despite the omission of extensive tissue homogenization steps. (Using a standard phenol-chloroform extraction technique with an overnight Proteinase K digestion on 25 mg of colon tissue resulted in a DNA yield of 0.8 – 1.2 μg as measured on the Nanodrop).

The quality of the extracted biomolecules was validated by several different methods, commonly employed in cancer genetics. The extracted DNA was of high molecular weight with no apparent fragmentation, which is essential in whole genome sequencing approaches. The OD 260:280 ratio (measured by Nanodrop), frequently used as an indication of protein contamination, was within a range suitable for DNA analysis [9]. The OD 260:230 ratio (Nanodrop), used as a measure of the purity of DNA, is slightly low, likely due to the absorbance of residual guanidine at 230 nm [10]. This is inherent to methods using chaotropic lysis buffers. However, the performance of extracted DNA in any of the downstream applications tested was not affected, even when using microarrays known to be sensitive to low OD 260:230 ratios [11]. The concentration of double stranded DNA measured by the fluorometric Qubit method, proved to be a more useful measurement of amplifiable DNA, and compared well with real time PCR amplification of LINE1 elements (data not shown) [12]. The differences between Qubit and Nanodrop measurements may be explained by the fact that the Nanodrop instrument measures both single and double stranded DNA, as well as single nucleotides, giving an overall higher DNA yield than the Qubit method [10]. The performance and uniformity in next-generation sequencing applications was validated by targeted enrichment and sequencing of the exons of 540 genes in 192 tumor and normal colorectal tissue samples (Figure 4). RIN values for RNA extracted from tissue can be variable and depend greatly on the sectioning process and storage conditions prior to extraction [13]. The extracted RNA had RIN values near 7, which is suitable for many techniques used to study RNA, e.g. cDNA generation by RT-PCR and microarray analyses. In fact, values above 5.5 are sufficient for most applications [13]. We noted during development of the process that prior recovery of DNA facilitates RNA recovery, thereby contributing to increased quality of the RNA obtained [5].

Future developments include adapting the method to extraction of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues. In addition, in light of the finding that sample mix up is a common problem in cancer genetic studies (here illustrated by two mismatched pairs out of 96), we have recognized the need for robust and scalable identification methods. An automatable genotyping method for possible incorporation to the process, targeting insertion and deletion polymorphisms has also been developed [14]. Taken together, we have developed a walk-away automation solution to process fresh-frozen tissue specimens to high quality biomolecules ready for use in cancer research and diagnostics. This novel technology enables the simultaneous processing of many different types of tissue samples in the pathology biobank workflow with a time and cost reduction for the user.


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