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Bei welcher g-Kraft beginnen Bakterien, in einem Röhrchen zu pelletieren?

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ich arbeite mit C. elegans und Bakterien und ich möchte die Bakterien, die sie fressen, loswerden, indem ich die Würmer zentrifugiere, ohne die Bakterien zu zentrifugieren. Ich verwende eine g-Zahl von 600 und die Bakterien zentrifugieren manchmal noch nach unten. Welche g-Zahl wäre ideal, um die Würmer zu pelletieren, aber nicht die Bakterien? Hängt das von der Bakterienart ab?


Zentrifugation

Abstrakt

Zentrifugation ist ein Verfahren zum Trennen von Molekülen mit unterschiedlichen Dichten, indem sie in Lösung um eine Achse (in einem Zentrifugenrotor) mit hoher Geschwindigkeit gedreht werden. Es ist eine der nützlichsten und am häufigsten verwendeten Techniken im molekularbiologischen Labor. Zentrifugation wird verwendet, um Zellen zu sammeln, DNA auszufällen, Viruspartikel zu reinigen und feine Unterschiede in der Konformation von Molekülen zu unterscheiden. In diesem Kapitel wird die relative Zentrifugalkraft ( g Kraft), wie konvertiert man g Kraft in Umdrehungen pro Minute (rpm) und wie man die Sedimentationszeit eines Partikels während der Zentrifugation berechnet.


Bereiten Sie die Probenröhrchen vor

Sie verwenden 1,5-ml-Röhrchen, um die DNA-Proben aus dem Speichel zu extrahieren.

Bereiten Sie zunächst jedes Röhrchen vor, indem Sie es mit einem Permanentmarker beschriften.

Auch wenn Sie nur eine Probe haben, empfiehlt es sich, das Röhrchen deutlich zu beschriften. Wenn die Probe beispielsweise von einer Person stammt, können Sie deren Initialen verwenden. Es ist auch eine gute Idee, das Datum der Probe zu markieren.

Kochsalzlösung vorbereiten

Sie benötigen Salzwasser (Kochsalzlösung) als Mundwasser, um Ihre Wangenzellen zu sammeln.

Mischen Sie in einem kleinen Glas oder ähnlichem eine Prise Kochsalz mit Wasser. Ein Schnapsglas ist dafür perfekt. Die Maße müssen nicht exakt sein. Eine Prise Salz für einen kleinen Schluck Wasser ist eine gute Faustregel.

Sie müssen nicht viel machen – ein kleiner Schluck genügt.

Warum das Salzwasser? In diesem Protokoll besteht das Ziel darin, eine DNA-Probe aus Wangenzellen zu erhalten. Ihr Speichel enthält nach dem Spülen Ihres Mundes natürlich Wangenzellen, die während des Protokolls aufgebrochen werden, um die DNA freizusetzen. Das Salz, also Natriumchlorid, dient zur Stabilisierung der DNA, sobald sie freigesetzt wurde.

Mund ausspülen

Gießen Sie das Salzwasser in Ihren Mund. Verwenden Sie nicht zu viel, ein kleiner Schluck genügt. Spülen Sie Ihre inneren Wangen 30-60 Sekunden lang kräftig aus. Wenn Sie fertig sind, spucken Sie die Kochsalzlösung in ein neues Glas. (oder, wenn das Schnapsglas, das Sie zum Mischen des Salzwassers verwendet haben, leer ist, können Sie es wiederverwenden).

Das Ziel dieses Schrittes ist es, so viele Zellen wie möglich aus Ihrem Mund zu lösen. Sie können mit den Zähnen sanft über Wangen und Zunge kratzen, während Sie das Salzwasser in Ihrem Mund herumwirbeln. Sie können auch Ihre inneren Wangen mit der Zunge berühren. Passen Sie auf, dass Sie sich nicht verletzen – Sie brauchen kein Blut, nur Speichel mit vielen Wangenzellen.

Übertragen Sie Ihre Probe in das Mikrozentrifugenröhrchen

Für diesen Schritt verwenden Sie Ihre Speichelprobe (1), das Mikrozentrifugenröhrchen, das Sie am Anfang beschriftet haben (2), und eine Transferpipette (3).

Verwenden Sie die Transferpipette, um Ihre Speichelprobe in das Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Füllen Sie es bis zur 1,5-ml-Marke auf.

Zentrifuge

Es ist Zeit, die Zentrifuge zu verwenden. Dies wird die Schwerkraft verwenden, um die Probe zu konzentrieren.

Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen mit Ihrer Speichelprobe in die Zentrifuge. Achten Sie darauf, die Zentrifuge auszuwuchten mit einer anderen Probe oder mit einem anderen Gegengewicht.

Wenn Sie nur eine Probe haben, können Sie die Zentrifuge am einfachsten ausbalancieren, indem Sie ein weiteres Röhrchen mit Wasser füllen und als Ausgleichsröhrchen verwenden.

Eine unausgeglichene Verwendung der Zentrifuge ist gefährlich und führt zum Bruch des Geräts. Befolgen Sie hier unsere Tipps zum Auswuchten einer Zentrifuge im Handbuch. In diesem Fall können Sie beispielsweise entweder eine zweite Probe als Gegengewicht verwenden oder ein weiteres Röhrchen mit Wasser auffüllen. Rohre müssen immer mit einem anderen Rohr gleichen Gewichts ausbalanciert werden.

Sobald das Probenröhrchen im Zentrifugenrotor ausbalanciert ist, schließen Sie den Deckel und aktivieren Sie das Zentrifugenmodul. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 4.000 G ein und drehen Sie 90 Sekunden lang.

Rückgewinnung des Pellets

Überprüfen Sie das Probenröhrchen nach Beendigung der Zentrifugation. Alle Wangenzellen sollten sich nun in einer kleinen weißen Kugel am Boden des Röhrchens konzentrieren (1). Dies nennt man a Pellet. Die restliche Flüssigkeit (2), genannt die Überstand, sollte klar sein.

In diesem Schritt entfernen Sie den Überstand, sodass nur das weiße Pellet übrig bleibt.
Überprüfen Sie, ob Ihr Pellet fest am Boden des Röhrchens befestigt ist. Wenn dies der Fall ist, können Sie den Überstand vorsichtig weggießen.

Wenn das Pellet nicht fest mit dem Boden des Röhrchens verbunden ist, versuchen Sie erneut, die Probe in der Zentrifuge zu drehen, um es am Boden des Röhrchens zu befestigen. Bleibt es locker, können Sie den Überstand mit der Mikropipette mit frischer Spitze langsam aus dem Röhrchen herauslösen. Sie können auch versuchen, die zuvor verwendete Transferpipette zu verwenden, aber es könnte schwierig sein, das Pellet zu kontrollieren und das Pellet zu stören.

Resuspendieren des Pellets

Sie sollten jetzt ein weißes Pellet in Ihrem Probenröhrchen haben. Es sollte etwa die Größe eines Streichholzkopfes haben.

Wenn Ihr Pellet kleiner als ein Streichholzkopf ist, haben Sie möglicherweise nicht genügend Wangenzellen, um eine konzentrierte DNA-Probe zu erhalten. Gehen Sie in diesem Fall zu Schritt 2 zurück, um zusätzliche Wangenzellen aus dem Speichel zu konzentrieren. Sie können dasselbe Probenröhrchen verwenden und dem vorhandenen Pellet einfach mehr Probe hinzufügen.

Sobald Sie ein ausreichend großes Pellet haben, können Sie die Zellen in der verbleibenden Flüssigkeit, die sich noch im Röhrchen befindet, resuspendieren. Sie haben nun eine konzentrierte Zellprobe in einem kleinen Flüssigkeitsvolumen.
Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen geschlossen ist, und mischen Sie dann die Zellen aus dem Pellet in die Flüssigkeit, indem Sie das Röhrchen schnalzen. Die Zellen des Pellets werden nun in der Flüssigkeit resuspendiert.

Überweisen

In diesem nächsten Schritt verwenden Sie die Mikropipette (1) um die resuspendierte Probe zu übertragen (2) in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen (3), damit Sie es im Thermocycler erhitzen können.

Stellen Sie zunächst die einstellbare Pipette auf das maximale Volumen von 20 μl ein.

Stellen Sie sicher, dass die Pipette eine neue Pipettenspitze hat. Verwenden Sie dann die Pipette, um die Zellmischung der Probe in das 0,2-ml-PCR-Röhrchen zu überführen. Fahren Sie fort, bis das PCR-Röhrchen fast voll ist oder Sie keine Probe mehr haben. Geben Sie so viel Zellmischung wie möglich in das PCR-Röhrchen.

Etikettieren des PCR-Röhrchens

Klicken Sie abschließend den Deckel des PCR-Röhrchens zu und beschriften Sie das Röhrchen, um die Probe ähnlich wie beim Zentrifugenröhrchen zu identifizieren.

Beschriften Sie die Seite der PCR-Röhrchen, nicht den Deckel. Das PCR-Gerät verfügt über einen beheizten Deckel, sodass sich Tinte auf dem Röhrchendeckel lösen kann.

Erwärmen der Probe

In diesem Schritt verwenden Sie den Thermocycler als Wärmeblock, um die Zellen zu kochen und aufzuplatzen, um die DNA in die Lösung freizugeben.

Stellen Sie Ihr PCR-Röhrchen mit Ihrer Probenzelllösung in den Thermocycler-Block.

Stellen Sie den Thermocycler so ein, dass die Probe 10 Minuten lang auf 99 °C erhitzt wird.

Mischen der Probe

Nach 10 min Erhitzen der Probe bereiten wir sie erneut für die Zentrifugation vor.

Nehmen Sie zuerst das PCR-Röhrchen aus dem Thermocycler-Block.

Der Block und der Heizdeckel sind noch heiß, seien Sie also besonders vorsichtig.

Bewegen Sie das PCR-Röhrchen 5 Sekunden lang, um die Probe zu mischen.

Zentrifugieren der Probe

In diesem Schritt drehen Sie die Probe, um den Überstand von den Zelltrümmern zu trennen. Jetzt sind die Zellen dank des Erhitzens geplatzt, die DNA wird aus den Zellen freigesetzt und schwimmt im Überstand.

Das Molekulargewicht der DNA ist leichter als das andere Zellmaterial, wie Proteine ​​und Zellwände. Durch Zentrifugieren der Probe trennen wir das Zellmaterial von der DNA, wodurch wir eine sauberere DNA-Probe erhalten.

So drehen Sie das PCR-Röhrchen mit Ihrer Probe (3) in der Mikrozentrifuge des Bento Lab benötigen Sie den PCR-Röhrchenadapter (1) das in einem normalen Mikrozentrifugenröhrchen sitzt (2) und wandelt es so um, dass es in ein PCR-Röhrchen passt.

Denken Sie daran, Ihre Zentrifuge auszubalancieren. Wenn Sie also nur mit einer Probe arbeiten, bereiten Sie ein weiteres PCR-Röhrchen mit einer Wassermenge vor, die Ihrer Probe entspricht.

Stellen Sie die Zentrifuge so ein, dass sie 90 Sekunden lang bei 8 kG läuft.

Wenn Sie Hilfe bei der Bedienung der Bento Lab-Zentrifuge benötigen, schlagen Sie in der Bedienungsanleitung nach. Nachdem Sie den Deckel geschlossen haben, wählen Sie den Zeitmodus (1). Stellen Sie die Kraft (2) und die Zeit (3) ein, bevor Sie bestätigen.

Aufräumen der Probe für die Lagerung

Nach der Zentrifugation wurden alle Zelltrümmer auf den Boden des PCR-Röhrchens gedrückt (1), sodass nur die DNA im flüssigen Überstand zurückbleibt (2). Der Überstand sollte klar aussehen, wie Wasser.

Abschließend überführen Sie den Überstand mit der Mikropipette in eine neue PCR.

Stellen Sie die Mikropipette auf 20 μL ein und setzen Sie eine neue Spitze auf. Übertragen Sie 40 μL des klaren Überstands in das neue PCR-Röhrchen.

Achten Sie darauf, keine Zelltrümmer in das neue Röhrchen zu pipettieren. Sie sollten nur den klaren Flüssigkeitsüberstand übertragen. Das Vermeiden von Zelltrümmern verringert die Wahrscheinlichkeit einer Störung der DNA-Probe.

Kennzeichnung und Lagerung

Das neue Röhrchen enthält jetzt nur noch die DNA in der Flüssigkeit. Es heißt die Musterbeispiel, und kann nun mit Protokollen wie PCR weiter zur Analyse verwendet werden.

Beschriften Sie das Röhrchen erneut, damit Sie erkennen können, um welche Vorlagenprobe es sich handelt.

Wenn Sie die Vorlagenprobe nicht sofort in einem anderen Protokoll verwenden, bewahren Sie sie schließlich bei etwa -20°C im Gefrierschrank auf. Dadurch bleibt die Probe erhalten.

Obwohl die DNA selbst sehr stabil ist, können sich in der Probe noch einige andere Proteine ​​befinden, die sie im Laufe der Zeit abbauen. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Speichelprobe so weit wie möglich zu reinigen, während die DNA erhalten bleibt. Das Aufbewahren der Probe im Gefrierschrank verlangsamt alle Reaktionen von übrig gebliebenen Proteinen und daher wird die DNA-Matrizenprobe länger aufbewahrt.


II. Die Wirkung der Schwerkraft verstärken: die Zentrifuge.

Viele Partikel oder Zellen in einer flüssigen Suspension setzen sich mit der Zeit aufgrund der Schwerkraft (1 x g) am Boden eines Behälters ab. Die für solche Trennungen erforderliche Zeitdauer ist jedoch unpraktisch. Andere Partikel, die extrem klein sind, werden in Lösung überhaupt nicht getrennt, es sei denn, sie werden einer hohen Zentrifugalkraft ausgesetzt. Wenn eine Suspension mit einer bestimmten Geschwindigkeit oder Umdrehungen pro Minute (RPM) gedreht wird, bewirkt die Zentrifugalkraft, dass sich die Partikel radial von der Rotationsachse wegbewegen. Die Kraft auf die Teilchen (im Vergleich zur Schwerkraft) wird als Relative Zentrifugalkraft (RCF) bezeichnet. Ein RCF von 500 x g bedeutet beispielsweise, dass die ausgeübte Zentrifugalkraft 500-mal größer ist als die Erdanziehungskraft. Tabelle 1 zeigt gängige Zentrifugenklassen und ihre Anwendungen.

Tabelle 1. Zentrifugenklassen und ihre Anwendungen

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Zentrifugenklassen
Langsame Geschwindigkeit Schnelle Geschwindigkeit Ultra/Mikro-Ultra
Höchstgeschwindigkeit (U/min x10 3 ) 10 28 100/150
Maximaler RCF (x10 3 ) 7 100 800/900
Pelletierungsanwendungen
Bakterien
Jawohl Jawohl (Jawohl)
Tier- und Pflanzenzellen Jawohl Jawohl (Jawohl)
Kerne Jawohl Jawohl (Jawohl)
Niederschläge Etwas Die meisten (Jawohl)
Membranfraktionen Etwas Etwas Jawohl
Ribosomen/Polysomen - - Jawohl
Makromoleküle - - Jawohl
Viren - Die meisten Jawohl
Viren - Die meisten Jawohl

() = kann durchgeführt werden, wird aber normalerweise nicht für diesen Zweck verwendet.


Grundlagen der Zentrifugation

Zentrifugation ist eine Technik, die hilft, Mischungen durch Anwendung von Zentrifugalkraft zu trennen. Eine Zentrifuge ist eine im Allgemeinen von einem Elektromotor angetriebene Vorrichtung, die einen Gegenstand, z. B. einen Rotor, in eine Drehbewegung um eine feste Achse versetzt.

Eine Zentrifuge arbeitet nach dem Sedimentationsprinzip: Unter dem Einfluss der Schwerkraft (g-Kraft) trennen sich Stoffe nach ihrer Dichte. Es sind verschiedene Trennarten bekannt, darunter Isopyknik, Ultrafiltration, Dichtegradient, Phasentrennung und Pelletierung.

Pelletieren ist die häufigste Anwendung für Zentrifugen. Dabei werden Partikel als Pellet am Boden des Zentrifugenröhrchens aufkonzentriert und von der restlichen Lösung, dem sogenannten Überstand, abgetrennt. Bei der Phasentrennung werden Chemikalien aus einer Matrix oder einem wässrigen Medium in ein Lösungsmittel umgewandelt (zur zusätzlichen chemischen oder molekularbiologischen Analyse). Bei der Ultrafiltration werden Makromoleküle unter Verwendung einer Membran gereinigt, getrennt und konzentriert. Die isopyknische Zentrifugation wird unter Verwendung eines "selbsterzeugenden" Dichtegradienten durchgeführt, der durch Gleichgewichtssedimentation hergestellt wird. Diese Methode konzentriert die Analyse-Matches mit denen der umgebenden Lösung. Protokolle für die Zentrifugation geben typischerweise die relative Zentrifugalkraft (rcf) und den Grad der Beschleunigung in Vielfachen von g (g-force) an. Das Arbeiten mit der Drehzahl, beispielsweise Umdrehungen pro Minute (U/min), ist eher ungenau.

Wichtige Definitionen

Im Allgemeinen spezifizieren Anwendungen für die Zentrifugation eher den Grad der Beschleunigung, der auf die Probe ausgeübt werden soll, als eine spezifische Rotationsgeschwindigkeit wie etwa Umdrehungen pro Minute anzugeben. Die Beschleunigung wird typischerweise in Erdanziehung [× g] (oder Vielfachen von x g oder g-Kraft) angegeben, dem Standardwert der Erdbeschleunigung aufgrund der Erdanziehung (9,81 m/s 2 ). Die Unterscheidung zwischen rpm und rcf ist wichtig, da zwei Rotoren mit unterschiedlichen Durchmessern bei gleicher Drehzahl (rpm) zu unterschiedlichen Beschleunigungen (rcf) führen.

Da sich der Rotor kreisförmig bewegt, berechnet sich die Beschleunigungskraft als Produkt aus Radius und Quadrat der Winkelgeschwindigkeit. Historisch bekannt als „relative Zentrifugalkraft“ (rcf), ist dies die Messung der Beschleunigung, die auf eine Probe innerhalb einer Kreisbewegung ausgeübt wird. Dieser Vorgang wird in Einheiten der Schwerkraft gemessen
(× g).

Beispiel*

Rotor A Rotor B
Geschwindigkeit 14.000 U/min 14.000 U/min
Radius 5,98 cm9,50 cm
Schwere 13.100 × g20.817 × g

Wie erwähnt, bei der Verwendung
Rotoren mit unterschiedlichen Radien für die Zentrifugation, gleicher rcf
(g-Zahl) verwendet werden.

Beide Zentrifugen können einen Rotor mit 1,5/2-mL-Gefäßen mit der gleichen Geschwindigkeit (14.000 U/min) drehen, aber die auf die Proben ausgeübte Beschleunigung ist sehr unterschiedlich: 13.100 × g gegenüber 20.817 × g, was zu unterschiedlichen Ergebnissen führt. Um das Leben zu erleichtern und die Daten besser reproduzieren zu können, verfügen einige Zentrifugen über Schaltflächen direkt auf dem Bedienfeld zur automatischen Umrechnung zwischen U/min und rcf. Wenn Ihre Zentrifuge keinen rpm-rcf-Konverter hat, können Sie die Formel, den rpm-rcf-Konverter auf den Homepages der Zentrifugenlieferanten oder ein Nomogramm zur Umrechnung verwenden. Der k-Faktor ist ein Parameter für die Sedimentationsstrecke in einem Reagenzglas. Dieser Faktor wird auch Klärfaktor genannt und repräsentiert die relative Pelletiereffizienz eines Zentrifugiersystems bei maximaler Drehzahl. Im Allgemeinen wird der Wert des k-Faktors verwendet, um die Zeit t (in Stunden) abzuschätzen, die für die vollständige Sedimentation einer Probenfraktion mit einem bekannten Sedimentationskoeffizienten, gemessen in s (svedberg), erforderlich ist.

Ein kleiner k-Faktor bedeutet eine schnellere Trennung. Der Wert des k-Faktors wird hauptsächlich durch den Rotordurchmesser bestimmt. Im Vergleich zu rpm/rcf hat die Verwendung des k-Faktors für allgemeine Zentrifugationsverfahren an Bedeutung verloren. Insbesondere für die Ultrazentrifugation ist der k-Faktor nach wie vor relevant.

So wählen Sie die richtige Zentrifuge für Ihre Anwendung

Wenn Sie ein vorgegebenes Protokoll befolgen, stellen Sie sicher, dass Sie den gleichen Rotortyp verwenden und die angegebene relative Zentrifugalkraft (rcf) sowie die gleiche Temperatur und Laufzeit anwenden. Generell müssen für einen erfolgreichen Zentrifugationslauf folgende wesentliche Parameter bestimmt werden:

E: Bestimmung der gewünschten relativen Fliehkraft

F: Definierte Temperatur während der Zentrifugation

Festwinkel- oder Ausschwingrotoren

Die gebräuchlichsten Rotoren bei der Laborzentrifugation sind entweder Festwinkel- oder Ausschwingrotoren. Nur wenige Anwendungen erfordern spezielle Rotoren wie Durchlaufrotoren, Trommelrotoren und dergleichen. Durchflussrotoren ermöglichen eine kontinuierliche Durchflusssammlung von Niederschlägen. Diese Systeme werden z.B. in Erntefermentern oder zur Saftherstellung in der Lebensmittelindustrie eingesetzt. Spezielle kundenspezifische Ausführungen, optimiert für die jeweilige Anwendung, sind notwendig.

Festwinkelrotor

Der offensichtliche Vorteil ist das Fehlen beweglicher Teile im Rotor. Dies führt zu einer geringeren Metallbelastung (längere Lebensdauer), eine höhere maximale g-Zahl ist möglich und für viele Anwendungen können schnellere Zentrifugationszeiten realisiert werden. Einziges Manko ist die begrenzte Kapazität (weniger Flexibilität) des Festwinkelrotors. Die Position des Pellets hängt stark vom Winkel des Rohres ab, es befindet sich beim Spinnen von der Seite zum Boden des Rohres. Die meisten Rotoren haben einen 45°-Winkel für die Rohre. Je größer der Winkel für die Röhrchen ist, desto enger ist das Pellet. Kleinere Rotorwinkel führen zu mehr verteilten Pelletbereichen.

Ausschwingrotor

Dieser Rotortyp ist hochflexibel für den Einsatz unterschiedlicher Röhrchenformate, einschließlich Platten im SBS-Format, basierend auf einer breiten Palette von Adaptersystemen und einer hohen Probenkapazität. Die beweglichen Teile der Ausschwingschaufel führen zu einer erhöhten Metallbelastung für den Rotor und die Schaufeln, da das Schaufelgewicht die beiden Zapfen und Nuten belastet. Im Vergleich zu einem Festwinkelrotor ist ein Ausschwingrotor daher auf eine geringere maximale g-Zahl beschränkt, was zu längeren Zentrifugationszeiten führt. Die Pellets befinden sich nach dem Ausschwingprinzip im Boden des Rohres (waagerechte Position des Rohres während des Laufs). Die Rückgewinnung durch den Benutzer wird im Vergleich zu Pellets, die sich seitlich am Rohr befinden, erleichtert.


Methoden zur Abtrennung von Partikeln bei der Zentrifugation: 3 Methoden

Dieser Artikel beleuchtet die drei Methoden, die zur Trennung von Partikeln bei der Zentrifugation verwendet werden.

Die drei Verfahren sind: (1) Differentialzentrifugation (2) Zentrifugalelutriation und (3) Dichtegradientenzentrifugation. Die Dichtegradienten-Zentrifugationsmethode besteht aus zwei Techniken. Die zwei Techniken sind: (1) Rate Zonale Technik und (2) Isopycnic Zentrifugation Technik.

Methode # 1. Differentialzentrifugation:

Dies hängt von der Sedimentationsgeschwindigkeit von Partikeln unterschiedlicher Größe und Dichte ab. Zentrifugationen werden zunächst die größten Partikel sedimentieren.

Bei Partikeln gleicher Masse, aber unterschiedlicher Dichte, sedimentiert zuerst dasjenige mit der höchsten Dichte. Partikel mit ähnlicher Bandendichte können normalerweise durch Differentialzentrifugation oder Rate-Zone-Verfahren effizient voneinander getrennt werden, vorausgesetzt, dass ihre Massen mindestens 10-fach unterschiedlich sind.

Bei der Differentialzentrifugation wird das zu trennende Material zentrifugal in mehrere Fraktionen aufgeteilt, indem das angelegte Zentrifugalfeld erhöht wird. Das Zentrifugalfeld bei jedem Schritt wird so gewählt, dass sich eine bestimmte Materialart absetzt. Je nach Zeit und Geschwindigkeit der Zentrifugation und Größe und Dichte der Partikel kann jede Art von Partikel, die ursprünglich im Homogenisat vorhanden war, im Pellet oder im Überstand oder in beiden Fraktionen gefunden werden. Am Ende jeder Stufe werden das Pellet und der Überstand getrennt und das Pellet mehrmals durch Resuspension und erneute Zentrifugation in Homogenisierungsmedium gewaschen.

Anfänglich werden alle Homogenatpartikel homogen im Zentrifugenröhrchen verteilt. Während der Zentrifugation bewegen sich die Partikel mit ihren jeweiligen Sedimentationsraten in den Zentrifugenröhrchen nach unten und beginnen am Boden des Zentrifugenröhrchens ein Pellet zu bilden. Idealerweise wird die Zentrifugation ausreichend fortgesetzt, um die gesamte größte Klasse von Partikeln zu pelletieren, wobei der resultierende Überstand dann mit einer höheren Geschwindigkeit zentrifugiert wird, um mittelgroße Partikel usw. abzutrennen.

Da jedoch Partikel unterschiedlicher Größe und Dichte zu Beginn der Zentrifugation homogen verteilt waren, ist es offensichtlich, dass das Pellet nicht homogen ist, sondern eine Mischung aller sedimentierten Komponenten enthält, die mit am schnellsten sedimentierenden Partikeln angereichert ist. In der Zeit, die für die vollständige Sedimentation schwererer Partikel erforderlich ist, werden auch einige der leichteren und mittelgroßen Partikel, die ursprünglich in der Nähe des Bodens des Rohres suspendiert waren, ebenfalls sedimentieren und so die Fraktion verunreinigen.

Eine reine Herstellung des Pellets des schwersten Partikels kann daher nicht in einem einzigen Zentrifugationsschritt erhalten werden. Nur die am langsamsten sedimentierende Mischungskomponente, die im Überstand verbleibt, nachdem alle größeren Partikel sedimentiert wurden, kann durch einen einzigen Zentrifugationsschritt gereinigt werden.

Die durch Differentialzentrifugation erzielte Trennung kann durch wiederholtes Resuspendieren und erneutes Zentrifugieren unter ähnlichen Bedingungen verbessert werden. Eine weitere Zentrifugation des Überstands mit allmählich zunehmenden Zentrifugalfeldern führt zur Sedimentation von Zwischen- und schließlich kleinsten und am wenigsten dichten Partikeln. Trotz ihrer inhärenten Einschränkungen ist die Differentialzentrifugation wahrscheinlich die am häufigsten verwendete Methode zur Isolierung von Zellorganellen aus homogenisiertem Gewebe.

Methode # 2. Zentrifugale Auswaschung:

Bei dieser Technik kann die ’ Trennung und Reinigung einer Vielzahl von Zellen aus verschiedenen Geweben und Spezies durch eine sanfte “Waschwirkung” mit einem Elutriator-Rotor erreicht werden. Die Technik basiert auf den Unterschieden in der Anordnung in der Trennkammer des Rotors, zwischen dem entgegengesetzten zentripetalen Flüssigkeitsstrom und dem angelegten Zentrifugalfeld, das verwendet wird, um Partikel hauptsächlich aufgrund von Unterschieden in ihrer Größe zu trennen.

Die Technik verwendet keinen Dichtegradienten und hat den Vorteil, dass jedes mit den Partikeln vollständig kompatible Medium verwendet werden kann. Durch diese Trennung kann sehr schnell erreicht werden, was hohe Zellkonzentrationen und eine sehr gute Rückgewinnungsausbeute ergibt.

Methode # 3. Dichtegradientenzentrifugation:

Es gibt zwei Methoden der Dichtegradientenzentrifugation, die Rate-Zone-Technik und die isopyknische Technik (Isodichte oder gleiche Dichte), und beide können verwendet werden, wenn eine quantitative Trennung aller Komponenten des Partikelgemischs erforderlich ist. Sie werden auch zur Bestimmung von Auftriebsdichten und zur Abschätzung des Sedimentationskoeffizienten verwendet.

(a) Zonale Technik bewerten:

Die Partikeltrennung nach der Rate-Zonen-Technik basiert auf Unterschieden in der Größe, Form und Dichte der Partikel, der Dichte und Viskosität des Mediums und dem angelegten Zentrifugalfeld. Subzelluläre Organellen, die unterschiedliche Dichten haben, aber eine ähnliche Größe haben, können mit diesem Verfahren nicht effizient getrennt werden, aber die Trennung von Proteinen ähnlicher Dichten und einer nur dreifachen relativen Molekülmasse kann leicht erreicht werden.

Die Technik beinhaltet das sorgfältige Aufschichten einer Probenlösung auf einen vorgeformten Flüssigkeitsdichtegradienten, dessen höchste Dichte die des dichtesten zu trennenden Partikels nicht überschreitet. Die Funktion des Gradienten besteht in erster Linie darin, die Flüssigkeitssäule in der Röhre gegen die Bewegungen zu stabilisieren, die aus herkömmlichen Strömungen resultieren, und in zweiter Linie einen Gradienten zu erzeugen, der hilft, die Auflösung des Gradienten zu verbessern.

Anschließend wird die Probe zentrifugiert, bis der gewünschte Trenngrad erreicht ist. Da die Technik zeitabhängig ist, muss die Zentrifugation beendet werden, bevor eines der Pellets der abgetrennten Zone am Boden des Röhrchens auftritt. Die Technik wird zur Trennung von Enzymen, RNA-DNA-Hybriden, ribosomalen Untereinheiten, subzellulären Organellen usw. eingesetzt.

(b) Isopyknische Zentrifugationstechnik:

Die isopyknische Zentrifugation hängt ausschließlich von der Buyout-Dichte ab und nicht von ihrer Form, Größe und Zeit, wobei die Größe des Partikels nur die Geschwindigkeit beeinflusst, mit der es seine isopyknische Position im Gradienten erreicht. Die Technik wird verwendet, um Partikel ähnlicher Größe, aber unterschiedlicher Dichte zu trennen. Daher können lösliche Proteine ​​mit sehr ähnlichen Dichten normalerweise nicht durch dieses Verfahren getrennt werden, während subzelluläre Organellen effektiv getrennt werden können.

Die Verfahren sind eine Kombination aus Sedimentation und Flotation und beinhalten das Aufschichten der Probe auf einen Dichtegradienten, der den gesamten Bereich der zu trennenden Partikeldichten umfasst. Die maximale Dichte des Gradienten muss daher immer die Dichte des dichtesten Teilchens überschreiten. Während der Zentrifugation erfolgt eine Sedimentation des Partikels, bis die Auftriebsdichte des Partikels und die Dichte des Gradienten gleich sind.

An diesem Punkt der Isodichte tritt keine weitere Sedimentation auf, unabhängig davon, wie lange die Zentrifugation andauert, da die Partikel auf dem Materialkissen schwimmen, das eine größere Dichte als ihre eigene hat. Die isopyknische Zentrifugation ist im Gegensatz zur Geschwindigkeitszonentechnik eine Gleichgewichtsmethode, bei der die Partikel zu Zonen mit jeweils eigener charakteristischer Auftriebsdichte werden.

Falls nicht alle Komponenten in einem Partikelgemisch benötigt werden, kann ein Gradientenbereich gewählt werden, in dem unerwünschte Materialien am Boden des Röhrchens sedimentieren und die gesamten interessierenden Partikel an ihren jeweiligen isopynischen Positionen schwimmen. Eine solche Technik beinhaltet eine Kombination sowohl des ratenzonalen als auch des isopynischen Ansatzes.

Eigenschaften von Verlaufsmaterial:

Es gibt kein ideales Allzweck-Gradientenmaterial, die Wahl des gelösten Stoffes hängt von der Natur der zu fraktionierenden Partikel ab.

Das Verlaufsmaterial sollte:

ich. Erlaube die gewünschte Art der Trennung

iii. Seien Sie inert gegenüber biologischem Material und reagieren Sie nicht mit Zentrifuge, Rotor, Röhrchen oder Kappen:

NS. Kein Licht bei Wellenlängen absorbieren, die für die spektrophotometrische Überwachung geeignet sind (sichtbarer oder ultravioletter Bereich) oder die Testverfahren anderweitig stören

v. Sterilisierbar, ungiftig oder entflammbar sein

vi. Haben einen vernachlässigbaren osmotischen Druck und verursachen minimale Änderungen der Ionenstärke, des pH-Werts und der Viskosität

vii. Kostengünstig und in reiner Form leicht verfügbar sein und in der Lage sein, eine Lösung zu bilden, die den für eine bestimmte Anwendung erforderlichen Dichtebereich abdeckt, ohne den Rotor zu überfordern

viii. Ermöglichen eine einfache Trennung des Probenmaterials vom Gradientenmedium unter Verlust der Probe oder ihrer Aktivität.

Im Allgemeinen verwendete Gradientenmaterialien sind Salze von Alkalimetallen (z. B. Cäsium- und Rubidiumchlorid), kleine neutrale hydrophile organische Moleküle (z. B. Saccharose), hydrophile Makromoleküle (z. B. Proteine ​​und Polysaccharide) und eine Reihe verschiedener Verbindungen wie kolloidales Siliciumdioxid ( zB Percoll und Ludox) und nichtionische jodierte aromatische Verbindungen (zB Metrizamid, Nycodenz und Renograffin).

Saccharoselösung hat zwar den Nachteil, dass sie bei Dichten von mehr als 1,1 bis 1,2 g cm –3 sehr viskos ist und selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen sehr hohe osmotische Wirkungen ausübt, hat sich als das geeignetste Gradientenmaterial für die Geschwindigkeitszonentrennung erwiesen. Glycerin wird auch als Gradientenmaterial speziell für die Trennung von Enzymen verwendet, oder es können alternative Medien wie Ficoll-, Metrizamid- oder Percoll-Gradienten verwendet werden.

Nichtionische Medien wie Saccharose, Glycerin, Metrizamid, Ficoll und Percoll werden im Allgemeinen als ionische Salze wie Cäsiumchlorid und Kaliumbromid angesehen und erfordern geringere Zentrifugalfelder, um eine ausreichende Partikelabscheidung zu erreichen. Bei der isopyknischen Trennung hat sich kein einziges Medium zur Isolierung aller Arten von biologischen Partikeln bewährt.

Ficoll wurde erfolgreich für die Trennung ganzzelliger und subzellulärer Organellen durch zonale und isopyknische Zentrifugationen verwendet. Cäsium- und Rubidiumsalze werden ausschließlich für isopyknische Trennungen verwendet und wurden am häufigsten für die Trennung von gelösten Stoffen hoher Dichte wie Nukleinsäuren verwendet.

Bei hohen Konzentrationen neigt ihre hohe Ionenstärke und Osmolarität jedoch dazu, intra- und intermolekulare Bindungen zu zerstören. Im Allgemeinen wurden ionische Medien für die Trennung von Nukleinsäuren, Proteinen und Viren verwendet, und nichtionische jodierte aromatische Verbindungen wurden aufgrund ihrer erhöhten Vielseitigkeit für eine viel breitere Vielfalt von Anwendungen verwendet.


So funktioniert Sterben

Nachdem das Herz aufhört zu schlagen, wird der Körper sofort kalt. Diese Phase ist bekannt als algor mortis, oder der Todeskälte. Jede Stunde sinkt die Körpertemperatur um etwa 1,5 Grad Fahrenheit (0,83 Grad Celsius), bis sie Raumtemperatur erreicht. Zur gleichen Zeit beginnt das Blut ohne Kreislauf, um es durch den Körper zu bewegen, sich zu sammeln und sich abzusetzen. Totenstarre, oder eine Versteifung des Körpers, setzt etwa zwei bis sechs Stunden nach dem Tod ein [Quelle: Marchant, Middleton].

Während der Körper als Ganzes tot sein mag, sind kleine Dinge im Körper noch am Leben. Hautzellen zum Beispiel können bis zu 24 Stunden nach dem Tod lebensfähig geerntet werden [Quelle: Mims]. Aber manche Dinge, die noch am Leben sind, führen zum Fäulnis, oder Zersetzung des Körpers - wir sprechen von kleinen Organismen, die im Darm leben.

Einige Tage nach dem Tod beginnen diese Bakterien und Enzyme mit dem Abbau ihres Wirts. Die Bauchspeicheldrüse ist voll von so vielen Bakterien, dass sie sich im Wesentlichen selbst verdaut [Quelle: Macnair]. Während sich diese Organismen zu anderen Organen vorarbeiten, verfärbt sich der Körper und wird zuerst grün, dann violett und dann schwarz. Wenn Sie die Veränderung nicht sehen können, werden Sie sie früh genug riechen, denn die Bakterien erzeugen ein fürchterlich riechendes Gas. Dieses Gas riecht nicht nur den Raum, sondern führt auch dazu, dass der Körper aufbläht, die Augen aus den Höhlen quellen und die Zunge anschwillt und hervorsteht. (In seltenen Fällen hat dieses Gas nach einigen Wochen genügend Druck aufgebaut, um zu bewirken, dass schwangere Frauen den Fötus in einem Prozess ausstoßen, der als . bekannt ist Sarggeburt.)

Eine Woche nach dem Tod hat die Haut Blasen und die kleinste Berührung kann dazu führen, dass sie abfällt. Einen Monat nach dem Tod fallen Haare, Nägel und Zähne aus. Die Haare und Nägel, obwohl lange gemunkelt wird, dass sie nach dem Tod weiter wachsen, haben keine magischen Wachstumseigenschaften. Sie sehen nur größer aus, wenn die Haut austrocknet. Innere Organe und Gewebe haben sich verflüssigt, wodurch der Körper anschwellen wird, bis er aufplatzt. An diesem Punkt bleibt ein Skelett übrig.

Nun, die meisten von uns sehen diesen Prozess nicht, weil das Gesetz verlangt, dass wir etwas mit dem Körper tun. Es gibt unendlich viele Möglichkeiten: Wir können einen Sarg für unseren Körper oder eine Urne für unsere Asche wählen. Wir können einbalsamiert, mumifiziert oder eingefroren werden. Von einigen Kulturen wurde gemunkelt, dass sie sich an kannibalistischen Ritualen zum Verzehr der Toten beteiligen, während andere ihre Toten den Elementen aussetzten, damit die Tiere sie wegkarren konnten. Sie könnten Ihren Körper der Wissenschaft spenden oder um ein Begräbnis auf See bitten. Aber wenn sie nicht mumifiziert oder konserviert werden, zerfallen die Körper schließlich in dem oben beschriebenen Prozess. Die Bestattung in einem Sarg verlangsamt den Prozess jedoch enorm, selbst die Art des Bodens, in dem Sie begraben sind, kann einen Unterschied machen.

Die Entsorgung einer Leiche wird weitgehend durch kulturelle und religiöse Überzeugungen geregelt. Frühe Kulturen begruben die Toten mit ihren Lieblingsbesitztümern (und manchmal ihren Lieblingsmenschen) für das Jenseits. Manchmal wurden Krieger oder Diener stehend begraben, ewig einsatzbereit. Orthodoxe Juden hüllen ihre Toten ein und begraben sie am selben Tag wie der Tod, während Buddhisten glauben, dass das Bewusstsein drei Tage im Körper bleibt [Quelle: Mims]. Hindus werden eingeäschert, weil man glaubt, dass das Verbrennen die Seele vom Körper befreit, während Katholiken die Einäscherung aus Respekt vor dem Körper als Symbol des menschlichen Lebens missbilligen [Quellen: Mims Cassell et al].

Religion und Kultur werden immer mit dem Tod verwoben sein, und ein großer Einflussbereich betrifft die ethischen Fragen rund um den Sterbeprozess. Auf der nächsten Seite werden wir einige der Probleme betrachten.


Praktische Arbeit zum Lernen

Klasse praktisch

In frühen Studien der Biologie konzentrieren wir uns oft auf Verdauungsenzyme. Dies kann dazu führen, dass Schüler denken, dass Enzyme nur funktionieren, um Chemikalien auseinander zu brechen. Diese enzymkatalysierte Synthese bietet eine alternative Enzymreaktion, die zum Aufbau eines neuen Moleküls führt.

The aim of the investigation is to prepare an extract of potato tuber, remove starch from it, and then check for its ability to catalyse the synthesis of starch from different substrates.

Unterrichtsorganisation

The enzyme extraction takes about half an hour. The extract can be stored overnight at 4 °C, but it will turn brown. To complete the investigation in one session, prepare the substrate solutions and set up the colorimeter while making the enzyme extract. Different groups could be responsible for different parts of the experiment.

Geräte und Chemikalien

Für jede Schülergruppe:

Access to a water bath at 25 °C

Centrifuge, 3000 rpm/ RCF 1000 g (Notiz 3)

2 medium-sized potatoes (Hinweis 4)

Für die Klasse – Aufbau durch Techniker/Lehrer:

50 cm 3 of 1% glucose-1-phosphate, for up to 8 groups (Anmerkung 1)

50 cm 3 of 1% glucose, for up to 8 groups

50 cm 3 of 1% maltose, for up to 8 groups

50 cm 3 of 1% sucrose, for up to 8 groups

Iodine solution (Anmerkung 2)

Gesundheits- und Sicherheitshinweise und technische Hinweise

1 Glucose-1-phosphate: Make up the solution by dissolving 0.5 g of glucose-1-phosphate in 50 cm 3 of distilled water (a 1% solution). The compound is unstable in solution, hydrolysing quite rapidly to glucose and phosphoric acid at room temperature. Prepare just before use, or store in a refrigerator (at 4 °C) for up to 24 hours. This, and the other sugar solutions, are described on the CLEAPSS Hazcard as LOW HAZARD.

2 Iodine solution: Iodine is only sparingly soluble in water (0.3 g per litre). It is usual to dissolve iodine in potassium iodide solution (KI) to make a 0.01 M solution (by tenfold dilution of a 0.1 M solution) to use as a starch test reagent. Refer to CLEAPSS Recipe card 33. For 100 cm 3 of 0.1 M solution, measure 3.0 g of potassium iodide (KI) into an appropriate beaker. Moisten the potassium iodide with a few drops of water. Measure out 2.54 g of iodine (see Hazcard 54: iodine is harmful) and add to the moistened potassium iodide. Add a small volume of water and stir. When no more iodine appears to dissolve, add some more water and stir. Repeat until all the iodine has dissolved. Pour the solution into a measuring cylinder and dilute to the final volume. If there are any bits of iodine remaining, return the solution to the beaker and leave it on a magnetic stirrer for several minutes. Add the solution to a labelled bottle and mix well.

3 Centrifuge: You need enough ‘centrifuge space’ to produce around 25 cm 3 of potato extract for each working group. A speed of just under 3000 revolutions per minute, corresponding to a relative centrifugal force (RCF, ‘g-force’) of just under 1000 g is enough to spin down starch grains.

SAFETY: The CLEAPSS Laboratory Handbook gives detailed information about the requirements of the British and International Standard (BS EN 61010-2-020) for centrifuges. Use this information to assess your school’s centrifuges if your documentation does not clearly state that they conform to this standard. The DfEE has stated that: ”Existing centrifuges not conforming to the safety requirements of this standard should not be used after 1 January 1997.” (Von Safety in Science Education, HMSO, 1996, ISBN 011270915X). CLEAPSS advise that centrifuges which do not cut off the power to the rotor when the lid is raised, or have an exposed rotor, should be taken out of service. If using any centrifuge without a lock, users should not raise the lid until they can hören that the rotor has stopped.

4 Potatoes: Medium-sized potatoes are best. Large potatoes often have a poor yield of phosphorylase enzyme. Small new potatoes have such small grains of starch that they are difficult (or impossible) to spin down.

Verfahren

SAFETY: Ensure your centrifuge is safe to use and that students are briefed to use it correctly. Make eye protection available when iodine solution is dispensed.

Vorbereitung

ein Make up a 1% solution of glucose-1-phosphate in distilled water (Anmerkung 1).

B Make up iodine solution (Anmerkung 2).

C Prepare the colorimeter by putting a known volume of water (say 3 cm 3 ) into your colorimeter cuvettes or bottle. Add 0.5 cm 3 or 1 cm 3 of iodine solution (Anmerkung 2) and swirl to mix well. Make sure this liquid is deep enough in the vessel to provide an accurate reading in your colorimeter (by comparing with a full colorimeter vessel of the same solution). Use a yellow filter, as we will be following the formation of a blue starch-iodide complex (peak of absorption 580-600 nm). Record the reading from the iodine solution as the ‘zero’ reading for this procedure. Set up ‘clean’ cuvettes to follow the reaction with 2 cm 3 of water and 0.5 or 1.0 cm 3 of iodine solution. You will add 1.0 cm 3 of starchy solution to each of these.

Ermittlung

D Take two medium-sized potatoes, peel and cut into small pieces (Hinweis 4). Crush with a pestle and mortar or use a blender. Add water sparingly so that the resulting mash is just liquid enough to be poured from the container.

e Pour the crushed potato quickly through a single layer of muslin or nylon stocking.

F Transfer the extract to centrifuge tubes. Spin in a bench centrifuge for 5 minutes at the highest speed to separate the starch granules (Notiz 3).

g After spinning, take one drop of clear liquid from the top of each tube. Test each drop on a white tile with iodine solution. If the blue colour characteristic of starch appears, centrifuge for a further 5 minutes.

h Repeat the iodine test and, if necessary, continue to centrifuge until no starch is detectable in the samples of clear liquid. Once the liquid is free of starch, carefully pour the clear liquid from each centrifuge tube into a single container. If this is to be kept overnight, stopper and refrigerate the container.

ich Label 4 test tubes. Use a syringe to put 5 cm 3 of glucose-1-phosphate into a test tube. Place it in a water-bath at 25 °C. Use fresh syringes to measure 5 cm 3 of the other substrates into the other test tubes in the same water-bath. Record which substrate is in which tube.

J Use a syringe to measure four 5 cm 3 samples of the clear potato extract into each of four more test tubes, and place in the water bath at 25 °C.

k Add 5 cm 3 of potato extract from a tube in the water bath to each tube of substrate solution. Start the stopclock.

l After two minutes, take a single drop of the potato extract/ glucose-1-phosphate mixture. Mix it with a drop of iodine in one of the wells of a spotting tile. Look for a very slight colour change. If there is none, repeat at 2-minute intervals as recorded by the stopclock.

m As soon as the slightest trace of blue or grey colour appears on the tile, remove 1.0 cm 3 from the mixture into your colorimeter vessel containing 2 cm 3 of water and 0.5 cm 3 or 1.0 cm 3 of iodine solution. Gut mischen. Record the colorimeter reading and the time.

n Using fresh iodine solution, carry out similar measurements with the other three extract/ substrate mixtures.

Ö Check the amount of enzyme extract/ substrate mixture left. Arrange to take more samples at regular intervals. Try to take at least 8 readings for each extract/ substrate mix. If colorimeter readings are changing rapidly from one sample to the next with a particular substrate, concentrate on that mixture and take samples as often as possible. Then return to the other extract/ substrate mixtures.

P For each measurement, record the substrate, time, apparent colour (to your eye) and colorimeter reading.

Q Convert the meter readings into starch concentrations using a calibration curve. (See associated practical on this site.)

Unterrichtsnotizen

After dealing with the digestion of starch, it is appropriate to ask how starch is formed in the first place. The tissue of potato tubes is a good source of the enzyme(s) responsible for the synthesis of starch.

Digestion of starch yields first maltose and then glucose, so synthesis could be a simple reversal of this process. Alternatively, the best substrate could be one of the compounds inside cells which is closely related to simple sugars an example is glucose-1-phosphate. This demonstration shows that an anabolic pathway need not be the simple reversal of the catabolic pathway. The hydrolysis of the glucose-1-phosphate provides the energy necessary to synthesise the starch.

The starch in potato tubers is stored inside cells in large granules which sediment on centrifugation. If you examine a drop of the glucose-1-phosphate/ enzyme mixture under a microscope at the end of the investigation, you may see starch granules 4 to 10 ?m in diameter.

The ‘lag phase’ at the beginning of the process suggests that the reaction is autocatalytic. CS Hanes (1940) demonstrated this by including small amounts of soluble starch to the reaction mixture this reduced the length of the lag phase. Your students are unlikely to come up with the idea of autocatalysis on their own however it is worth discussing as an example of the way in which graphs can be used to suggest and develop hypotheses.

Health & Safety checked, May 2009

Downloads

Download the student sheet Enzyme-catalysed synthesis (73 KB) with questions and answers.


Part 3: How do you choose a centrifuge?

Centrifuge speed

Centrifuges may be classified based on maximum speeds, measured as revolutions per minute (RPM). Speeds range from 0-7,500 RPM for low-speed centrifuges, all the way to 20,000 RPM or higher.

Centrifuge rotor speed is often expressed as RCF in units of gravity (x g) for various procedures. However, many centrifuges display speed as revolutions per minute (RPM), necessitating conversion to ensure the correct experimental conditions. The following formula is used to convert RPM to RCF, where R is the rotor radius (cm) and S is the speed (RPM):

Centrifuge size

Centrifuges are available as various benchtop or floor-standing models.

Floor-standing models offer greater sample capacity and can achieve high speeds. Superspeed centrifuges can achieve a maximum g-force (relative centrifugal force, RCF) of over 70,000 x g, and ultracentrifuges often used for DNA or RNA fractionation, can achieve up to 1,000,000 x g. For large-capacity, low-speed applications, low-speed centrifuges reaching approximately 7000 x g stehen zur Verfügung.

Benchtop models have a smaller footprint, and general-purpose models are ideal for a wide range of applications. There are many benchtop models available, including high-speed, microcentrifuge, clinical, and cell washer models. Clinical benchtop models and cell washers typically operate at lower speeds, and are suited to diagnostic applications, and washing debris from red blood cells.

Centrifuges for different applications

It is essential to select a centrifuge that is suited to the specific application. When purchasing a centrifuge, it is important to consider the following questions:

  • What sample volumes are you working with? For processes involving large or varying volumes, a floor-standing model with higher capacity and different rotor configurations may be the best solution.
  • Are samples temperature sensitive? If so, a centrifuge with refrigeration and temperature control options is required.
  • Will the centrifuge be used for processing clinical or blood banking samples? Cell washers or clinical models are available for these specific applications.
  • How much laboratory space is available vs the centrifuge footprint?
  • What is the maximum g-force the centrifuge is capable of generating? Low-speed centrifuges are ideal for separating whole cells, while ultracentrifuges are necessary for separating DNA and RNA.

Centrifugation speeds for cells. - (Feb/05/2013 )

What speed do you guys use to spin down your cells? Is there a rule of thumb for the different types of cells in terms of centrifugation speed?

I am having a problem with my cell count and I am not sure if the spinning down process is shearing my cells. Last night I counted my cell suspension with a hemocytometer and it came out to 1.5*10^6 cells but the FACS analysis reported a much lower number (around 10^4 cells). I know I will lose cells during the staining process and during the analysis but going from 10^6 to 10^4 is huge loss. Any advice will be appreciated.

Hm, I spin my cells down with 1300rpm for 3 min. Later during the FACS staining process I spin them down with 2400 rpm for 3 min, but be careful as this can harm the cells. Interestingly I also observe huge cell loss during the staining process although I never quantified it like you did. Do some of your cell stick to the wall of the reaction tube perhaps ?

Tabaluga on Tue Feb 5 19:12:56 2013 said:

Working with epithelia cells I use 3000 rpm for 3mins and working with HSCs the protocol calls for 1500 rpm for 5mins. I don't think my cells are sticking to the wall of the reaction tube but I don't know for sure. I don't know if it is pipetting error, cell count error or the speed of spinning.

For spinning live cells do not exceed 300 RCF (relative centrifugal forces also known as "g"), it is best to do it as low as possible, I routinely use 100 RCF for 5-10 min and it works fine for all the cancer cell lines that I work with.

When working with centrifuges, rpm is a relative measure that has no reference unless you also provide the rotor radius so Wek's 3000 rpm may in fact be lower RCF than Tabaluga's 2400, but we will never know.

Spinning too fast can cause a "smear" of cells up the wall of the tube that you may be missing when resuspending the cells.

Just looked it up, my 2400 rpm correspond to 600 g, apparently.

I will try 100, 200, and 300 RCF for 5 mins and see if there is any significant loss of cells. My 3000 rpm equals to 800 RCF.
I have actually noticed the line smear on the wall of the tube when using compensation beads but haven't really noticed it when spinning down cells.

Dear Guys,
I know this is out of ur discussion, but regarding converting RPM into G or vice verse, I just measure the radius of my centrifugal ring, not the whole machine, just the rotor radius with a ruler or something, put the data on RPM-G converter like these website:
http://www.endmemo.com/bio/grpm.php
http://www.geneinfinity.org/sp/sp_rotor.html

then I got the required number in G or in RPM

great links, thanks. Some centrifuges have also got the advantage that you can switch between both values on the display, thereby detemining very quickly the relation between their rpm and g.

Just to throw in my 2 cents. In a neuro lab we spin at 90g for glia, and 160g for neurons in 15ml falcon tubes for 3 minutes.

Considering neurons are pretty small I doubt you'd need to go much faster.


Schau das Video: GForce - KID GIRL Band AMAZING!! Americas Got Talent 2019 Audition (September 2022).


Bemerkungen:

  1. Nikokus

    Ich würde lieber nichts sagen

  2. Nikolas

    I understand this issue. I invite you to a discussion.

  3. Both

    Stimmen Sie zu, ein nützliches Stück

  4. Meshura

    Und der Schweizer und der Schnitter und im Allgemeinen haben es versaut. Das Erstaunlichste an Pop -Sängern ist, dass sie auf die gleiche Weise mit dem Mund singen ... frisches Essen, aber es ist schwer, gegen das zu kämpfen, was Sie auf Ihrer Brust warm, es wird Ihr ganzes Leben lang brutzeln. Es ist sehr einfach, eine Frau glücklich zu machen. Nur teuer. Nichts wärmt die Seele wie kaltes Bier ...

  5. Mujahid

    Es scheint mir, du hast nicht Recht

  6. Lex

    Ich meine, du liegst falsch. Ich kann meine Position verteidigen. Schreiben Sie mir in PM, wir werden diskutieren.



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