Information

1.11: Vaterschaftsfall mit Elektrophorese - Biologie

1.11: Vaterschaftsfall mit Elektrophorese - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Lernziele

Ziele:

  • Führen Sie eine Agarosegelelektrophorese an den Proben durch.
  • Erfahren Sie, wie Sie DNA-Fingerabdrücke analysieren.

Lernergebnisse der Schüler:

Nach Abschluss dieses Labs sind die Studierenden in der Lage:

  • Trennen Sie Moleküle durch Elektrophorese.
  • Analysieren Sie Banden, die aus der Gelelektrophorese resultieren.
  • Bestimmen Sie die Vaterschaft der Nachkommen mithilfe der DNA-Fingerabdruckanalyse.

Teil I: Agarose-Gelelektrophorese

Einführung

Die Gelelektrophorese ist eine sehr verbreitete und nützliche Technik zum Trennen von DNA-, RNA- und Proteinmolekülen auf der Grundlage von Molekülgröße und Ladung. Agarose ist ein Polysaccharid, das in Algen vorkommt und eine Gelmatrix (Maschenwerk aus Löchern unterschiedlicher Größe) bildet. Wenn ein elektrischer Strom durch den Puffer und das Gel geleitet wird, bewegen sich die Moleküle in der Probe mit der entgegengesetzten Ladung in Richtung der Elektrode. DNA-, RNA- und Proteinmoleküle haben typischerweise eine negative Gesamtladung und bewegen sich in Richtung der positiven Elektrode. Kleinere Moleküle können sich schneller durch die Matrix des Gels bewegen als größere Moleküle.

Beim DNA-Fingerprinting werden Bandenmuster verwendet, die aus einer spezifischen Behandlung von DNA-Proben resultieren, um die Beziehung einer Probe zu Referenzproben zu identifizieren. In diesem Lab führen Sie eine Simulation einer DNA-Fingerprinting-Aktivität durch, um sich mit diesem Prozess vertraut zu machen. Sie laden Proben auf ein Gel und trennen die Banden in jeder Probe, um mithilfe von Gelelektrophorese spezifische Muster zu erstellen.

Zubereitung von Agarose-Gelen

Es gibt verschiedene Laufpuffer, die verwendet werden können, um DNA zu trennen. Einige der am häufigsten verwendeten Puffer sind TAE (Tris Acetate EDTA), TBE (Tris Borate EDTA) und SB (Natriumborat). Verwenden Sie immer den gleichen Puffer, um das Agarosegel herzustellen und die Elektrophorese durchzuführen.

MATERIALIEN

  • Agarose-Pulver
  • Spatel
  • Boot wiegen
  • 20x Vorrat
  • Messzylinder
  • Pipettierhilfe
  • Serologische Pipette
  • Flasche mit belüfteter Kappe

AUSRÜSTUNG

  • Gleichgewicht
  • Mikrowelle

VERFAHREN

  1. Bereiten Sie 500 ml 1X Natriumboratpuffer aus einer 20X Stammlösung vor.
    1. Messen Sie 25 ml 20X Natriumborat-Puffervorrat in einem 25-ml-Meßzylinder und gießen Sie ihn in einen 500-ml-Behälter.
    2. 475 mL VE-Wasser in einen 500 mL Messzylinder abmessen und in das gleiche Gefäß füllen.
    3. Fest verschließen und mischen.
  2. Bereiten Sie 50 ml 0,8% (w/v) Agarose in 1X Natriumboratpuffer vor um vier Mini One Gele einzufüllen. Beachten Sie, dass Agarose (und Gelatine) zwei Substanzen sind, die auf besondere Weise zubereitet werden, da sie sich nur in kochenden Flüssigkeiten auflösen können. Daher geben wir NIEMALS Agarose- (und Gelatine-) Pulver in Messzylinder. Stattdessen gießen wir das Pulver in den letzten Behälter (Erlenmeyerkolben).
    1. 50 mL 1X Puffer mit einem 50 mL Messzylinder abmessen und in einen Erlenmeyerkolben gießen.
    2. 0,4 g Agarose-Pulver abmessen und in denselben Kolben gießen. Dies wird wie eine undurchsichtige Aufschlämmung aussehen.
    3. Verwenden Sie nach Möglichkeit eine belüftete Kappe (oder keine Kappe). Stellen Sie den Kolben in einen Mikrowellenherd und schalten Sie ihn (1 Minute lang) auf hoher Stufe ein. Passen Sie gut auf - Flüssigkeit nicht überkochen lassen!
    4. Achten Sie auf das Sprudeln der Flüssigkeit. Sobald die Flüssigkeit zu sprudeln beginnt, stoppen Sie die Mikrowelle, schwenken Sie die Flasche 2-3 Mal mit Handschuhen oder Silikon-Hot Hands.
    5. Dann ersetzen und die Mikrowelle für das zweite Kochen wieder einschalten.
    6. Sobald die Flüssigkeit zu sprudeln beginnt, stoppen Sie die Mikrowelle, halten Sie die Flasche mit Handschuhen oder „Hot Hands“ an die Deckenleuchte. Suchen Sie sorgfältig nach Flecken oder Kristallen in der Flüssigkeit. Wenn in der klaren Lösung keine Stippen mehr sichtbar sind, ist die Agarose vollständig geschmolzen.
    7. Die Flasche auf den Tisch stellen und auf 60 °C abkühlen lassen. Wenn Sie die Flasche zum ersten Mal mit bloßen Händen halten können, ist die Agarose kühl genug, um sie in Schalen zu füllen. Gießen Sie Agarose nicht zu heiß, da sich die Gießgele verziehen und knistern. Agarose nicht zu lange kühlen, da das Gel nicht gleichmäßig polymerisiert.
    8. Bereiten Sie die Gießschalen vor und üben Sie das Laden von Gelproben, während Sie warten.

Gießen von Agarose-Gelen (MINI ONE EMBITEC GEL SYSTEM)

  1. Legen Sie zwei klare Acrylgussschalen in den weißen Gussständer.
  2. Setzen Sie den 9-Well-Kamm in den richtigen Schlitz des Gießständers ein.
  3. Verwenden Sie am besten eine Pipettierhilfe und eine 25 ml serologische Pipette, um 12,5 ml geschmolzene Agaroselösung abzumessen und in jede Gießschale zu überführen. Oder gießen Sie die Agaroselösung bis zu 1/3 des Kamms ein.
  4. Bewegen oder platzen Sie Luftblasen schnell mit einer Pipettenspitze oder einem Gelkamm. Setzen Sie den Gelkamm in den richtigen Schlitz ein.
  5. Bewegen oder stoßen Sie die Gelschale nicht, bis sich das Gel in etwa 15 Minuten verfestigt hat.
  6. Bewahren Sie die zusätzliche Agaroselösung in einem Kolben, der mit Parafilm oder Kappe bedeckt ist, bei 4 °C zur späteren Verwendung auf.

Üben Sie das Laden von Gelproben

Das Laden von Gelproben ist eine Fähigkeit, die Übung erfordert! Das eigentliche Agarosegel, das Sie für die Elektrophorese verwenden werden, ist sehr empfindlich und kann leicht durchstochen werden. Das Übungsgel kann nicht punktiert werden, bietet jedoch gleich große Wells zum Dosieren Ihrer Proben. Da die DNA klar ist, wird den DNA-Proben normalerweise ein farbiger Ladefarbstoff zugesetzt. Dem Ladefarbstoff wird auch hochdichtes Glycerin zugesetzt, damit die DNA-Proben schnell auf den Boden der Vertiefung fallen.

Lab-Tipp: Drücken Sie beim Laden von Proben in die Gel-Wells den Kolben der Mikropipette nur bis zum ersten Anschlag, NICHT bis zum zweiten Anschlag. Halten Sie Ihren Daumen unbedingt auf den Kolben gedrückt, bis die Mikropipette vollständig aus dem Puffertank heraus ist.

  1. Besorgen Sie sich ein Übungs-Urethan-Gel.
  2. Bedecken Sie das Gel mit entionisiertem Wasser. Wenn sich in den Wells Blasen befinden, verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um die Blasen zu entfernen.
  3. Verwenden Sie eine Pipettenspitze an einer P20-Mikropipette und stellen Sie den Drehknopf auf 10,0 uL.
  4. Drücken und halten Sie den Kolben der Mikropipette bis zum ersten Anschlag.
  5. Nehmen Sie 10 µl des roten Übungsfarbstoffes auf und lassen Sie Ihren Daumen langsam los.
  6. Halten Sie die Mikropipette senkrecht (siehe Abbildung 1) über das Übungsgel, sodass sich die Spitze unterhalb des Wasserspiegels und knapp über der Vertiefung befindet. Es ist keine Spitze erforderlich, um in die Vertiefung einzudringen, da das schwere Glycerin die Probe in den Boden der Vertiefung zieht.
  7. Drücken Sie den Kolben nur bis zum ERSTEN STOP und halten Sie Ihren Daumen dort. (Optional: Versuchen Sie, bis zum zweiten Stopp zu drücken, um zu sehen, was passiert.)
  8. Bewegen Sie Ihren gesamten Arm nach oben, sodass sich die Mikropipette aus dem Wasser befindet, und lassen Sie dann Ihren Daumen vom Kolben fallen. (Optional: Versuchen Sie, Ihren Daumen loszulassen, während sich die Pipette noch im Wasser befindet, um zu sehen, was passiert).
  9. Üben Sie das Laden von 10,0 µL des roten Farbstoffs in drei oder mehr Vertiefungen des Übungsgels.
  10. Sie sollten sehen können, wie die farbige Probe auf den Boden der Wells fällt.

Lab-Tipp: Bei korrekter Ausführung verbleibt die gesamte Probe in der Vertiefung. Überprüfen Sie, ob farbiger Farbstoff von der Oberseite der Vertiefung wegschwimmt, was bedeutet, dass die Probe eine andere Vertiefung verunreinigen kann. Überprüfen Sie, ob am Boden der Vertiefung Farbstoff austritt, was bedeutet, dass Sie die Vertiefung durchbohrt haben und die Probe möglicherweise nicht in das Gel eindringt.

TEIL II: Vaterschaftsfall: Wer ist der Vater meiner Kätzchen?

Mary hat eine weiße Katze namens „Honey“, die vor etwa drei Monaten für zwei Tage verloren gegangen ist. Sie hat jetzt vier Kätzchen (Foto 1) und Mary möchte wissen, ob die beiden Nachbarkatzen „Tom“ oder „Butch“ der Vater jedes Kätzchens sein könnten. Um ihren DNA-Fingerabdruck zu analysieren, hat Mary Haarfollikel von jeder erwachsenen Katze und jedem Kätzchen gesammelt, DNA extrahiert und DNA mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert.

Hypothese

Füllen Sie mit Hilfe des Fotos Tabelle 1 mit Ihrer Vorhersage des Vaters jedes Kätzchens aus.

Tabelle 1. Hypothese zur Vaterschaft von Kätzchen

Kätzchen

Potenzieller Vater

Argumentation

Creme

Melasse

Ingwer

Zucker

Materialien

Reagenzien

  • Vorgefertigtes 0,8% Agarosegel
  • Sieben Proben in Mikrozentrifugenröhrchen. Eine für jede Katze
  • 135-150 ml 1X Natriumborat-Laufpuffer (genug, um das Agarosegel einzutauchen)

Ausrüstung und Versorgung

  • Elektrophoresesystem wie MiniOne oder andere Marke mit Gelkammer und Netzteil
  • P-20 Mikropipetten und passende Spitzen
  • Handy oder Kamera, um das Gel zu fotografieren, um die Ergebnisse zu dokumentieren

Verfahren

  1. HINWEIS: Das Folgende ist abgeschlossen, wenn die Elektrophoresekammer mit einem 0,8% Agarosegel und 1x Natriumboratpuffer in der Kammer vorbereitet wurde. Vergessen Sie nicht, Ihr Vorgehen in Ihrem Laborheft entsprechend zu dokumentieren.
  2. Besorgen Sie sich die „DNA-Proben“ – es gibt sieben Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung P-V.
  3. Mit einer P-20-Mikropipette und einer Pipettenspitze 10 µl aus Röhrchen P abmessen und in die erste Vertiefung des Agarosegels überführen. Achten Sie darauf, die in Spalte 1 angegebene Gelladereihenfolge einzuhalten – Brunnen.
  4. Mit einer neuen Spitze für jede Probe 10 µl jeder Probe in neue Wells des Gels überführen.
  5. Achten Sie darauf, Ihre Sample-Ladung im Auge zu behalten, wenn Sie die unten stehende Tabelle nicht befolgen. Bei Problemen mit der Beladung (durchstochenes Gel, zu wenig Probe) unbedingt in die Spalte HINWEIS schreiben.
Tabelle 2. Hinweise zum Laden: Nehmen Sie Abweichungen oder Notizen in Ihr Laborheft auf

Brunnen

Rohr

DNA-Probe 10µL

Hinweise zum Laden

1

P

Tom (männlich)

2

Q

Creme (Kätzchen)

3

R

Melasse (Kätzchen)

4

S

Honig (weiblich)

5

T

Ingwer (Kätzchen)

6

U

Zucker (Kätzchen)

7

V

Butch (männlich)

  1. Wenn Sie ein MiniOne-Elektrophoresesystem verwenden, lassen Sie das Gel 15 Minuten lang laufen, bis sich die Farbbanden trennen. Wenn Sie ein anderes Elektrophoresesystem verwenden, lassen Sie das Gel bei 135 V laufen, bis die Farbstofffront sichtbar ist.
  2. Um die Ergebnisse optimal zu sehen, nehmen Sie die Gießschale (mit Gel) aus dem Puffertank, schieben Sie das Gel auf ein weißes laminiertes Papier, beschriften Sie die Proben (und Ihren Teamnamen) und machen Sie ein Foto.
  3. Da DNA-Proben durch die Agarosegele diffundieren, sollten Sie die Ergebnisse immer schnell aufzeichnen, nachdem die Elektrophorese ausgeschaltet wurde.

ANALYSE

  1. Verwenden Sie Farbstifte, um die Streifenmuster (färben Sie die entsprechenden Blöcke) in der Datentabelle unten aufzuzeichnen.
Tabelle 3. Farbige „DNA“-Banden, getrennt durch Agarose-Gelelektrophorese

Rohr

P

Q

R

S

T

U

V

Band

Tom (Männlich)

Creme

Melasse

Schatz(Weiblich)

Ingwer

Zucker

Butch (Männlich)

Blau #1

Blau #2

Rosa #1

Lila #1

Gelb #1

Gelb #2

  1. Betrachten Sie jede Bande aller vier Kätzchenproben sorgfältig und stellen Sie fest, ob die Band zu Tom, Honey oder Butch passt. Schreiben Sie für die Kätzchenproben (Spalten QRTU) in Datentabelle 3 (innerhalb der farbigen Blöcke), wer zu dieser Gruppe passt – Tom, Honey oder Butch.
  2. Ziehen Sie Ihre Schlussfolgerungen basierend auf den „DNA-Beweisen“.
  3. Füllen Sie die 2. und 3. Spalte in Tabelle 4 unten aus. Vergleichen Sie Ihre Hypothese in Tabelle 1, in der Sie den Vater für jedes Kätzchen aufgrund des Aussehens erraten haben, mit Ihrer Schlussfolgerung bezüglich des Vaters aufgrund der DNA-Beweise. War Ihre Hypothese für jedes Kätzchen richtig?
  4. Was sind die spezifischen Beweise, die Ihre Schlussfolgerung rechtfertigen, dass der Vater jedes Kätzchens bestimmt wird? Tragen Sie Ihre Antworten auf diese Fragen in die folgende Tabelle ein.
Tabelle 4. Vergleich von Hypothese und Schlussfolgerung, gestützt durch experimentelle Beweise

KÄTZCHEN

VATER basierend auf visuellen

VATER basierend auf DNA

Beweis

Creme

Melasse

Ingwer

Zucker

Studienfragen

  1. Bei der Gelelektrophorese wandert DNA zu welcher Elektrode?
  2. Wenn Sie kleine, mittlere, lange und extralange DNA-Moleküle hätten, welche würden sich nach der Elektrophorese am nächsten zum Boden des Gels befinden?
  3. Was wissen Sie über das Muster von Banden, die aus einer Nachkommenschaft resultieren, wenn sie sich auf die Mutter und den Vater beziehen?
  4. Wenn Sie eine DNA-Fingerabdruckanalyse durchführen würden, aber das Bandenmuster für die Nachkommen nicht mit einem der Elternteile übereinstimmte, was würden Sie daraus schließen?


Schau das Video: Wie funktioniert DNA-Analyse? - Gel-Elektrophorese einfach erklärt! (September 2022).


Bemerkungen:

  1. Jessee

    Ich kann jetzt nicht an der Diskussion teilnehmen - es ist sehr besetzt. Aber ich werde veröffentlicht - ich werde unbedingt schreiben, was ich denke.

  2. Margit

    Ich denke, du hast nicht Recht. Treten Sie ein, wir besprechen es. Schreib mir per PN.

  3. Pearce

    Meiner Meinung nach haben Sie nicht Recht. Ich schlage vor, es zu diskutieren.

  4. Westen

    Maßgebliche Antwort



Eine Nachricht schreiben