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Einheit 9: Bakterienwachstumsmuster – Aufbau Ihrer Stammkulturen und Beobachtung von Kulturmerkmalen – Biologie

Einheit 9: Bakterienwachstumsmuster – Aufbau Ihrer Stammkulturen und Beobachtung von Kulturmerkmalen – Biologie


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Einheit 9: Bakterienwachstumsmuster – Aufbau Ihrer Stammkulturen und Beobachtung der Kulturmerkmale

Einheit 9: Bakterienwachstumsmuster – Aufbau Ihrer Stammkulturen und Beobachtung von Kulturmerkmalen – Biologie

Nataliya, eine 24-jährige schwangere Frau im zweiten Trimester, besucht eine Klinik mit Beschwerden über hohes Fieber, 38,9 ° C (102 ° F), Müdigkeit und Muskelschmerzen – typische grippeähnliche Anzeichen und Symptome. Nataliya macht regelmäßig Sport und befolgt eine nahrhafte Ernährung mit Schwerpunkt auf Bio-Lebensmitteln, einschließlich Rohmilch, die sie auf einem lokalen Bauernmarkt kauft. Alle ihre Impfungen sind auf dem neuesten Stand. Der Arzt, der Nataliya sieht, ist jedoch besorgt und ordnet an, dass eine Blutprobe zur Untersuchung durch das mikrobiologische Labor geschickt wird.

Wir werden auf Nataliyas Beispiel auf späteren Seiten zurückkommen.

Der bakterielle Zellzyklus beinhaltet die Bildung neuer Zellen durch die Replikation von DNA und die Aufteilung der Zellbestandteile in zwei Tochterzellen. Bei Prokaryoten ist die Fortpflanzung immer asexuell, obwohl eine umfangreiche genetische Rekombination in Form eines horizontalen Gentransfers stattfindet, wie in einem anderen Kapitel untersucht wird. Die meisten Bakterien haben ein einzelnes zirkuläres Chromosom, es gibt jedoch einige Ausnahmen. Zum Beispiel, Borrelien burgdorferi, der Erreger der Lyme-Borreliose, hat ein lineares Chromosom.


Wie man Bakterien und mehr anbaut

Wenn Sie lernen möchten, wie man Bakterien anbaut, lesen Sie weiter.

Bakterienübersicht

Bakterien sind einzellige oder einzellige Mikroorganismen. Sie unterscheiden sich von Pflanzen- und Tierzellen, weil sie keinen eigenen, membranumschlossenen Zellkern haben, der genetisches Material enthält. Stattdessen schwebt ihre DNA in einem Gewirr innerhalb der Zelle. Sind Viren Protisten?

Einzelne Bakterien sind nur mit einem Mikroskop zu sehen, aber sie vermehren sich so schnell, dass sie oft Kolonien bilden, die wir sehen können. Bakterien vermehren sich, wenn sich eine Zelle durch einen Prozess namens Binärspaltung in zwei Zellen aufspaltet. Die Spaltung erfolgt schnell in nur 20 Minuten. Unter perfekten Bedingungen könnte ein einzelnes Bakterium in nur 10 Stunden zu über einer Milliarde Bakterien heranwachsen! (Es ist gut, dass die natürlichen Bedingungen selten perfekt sind, sonst würde die Erde von Bakterien begraben!)

Das Züchten und Testen von Bakterien ist ein unterhaltsames Projekt zu jeder Zeit oder ein großartiges wissenschaftliches Projekt. Bakterien sind überall und da sie sich schnell vermehren, sind sie mit wenigen einfachen Materialien leicht zu untersuchen. Alles, was Sie brauchen, sind Petrischalen, Agar und sterile Tupfer oder eine Impfnadel. Agar ist ein gelatinöses Medium, das Nährstoffe und eine stabile, kontrollierte Umgebung für das Bakterienwachstum bereitstellt (Agarlösung). Die meisten Bakterien wachsen gut mit Nähragar, aber einige anspruchsvollere Bakterien (solche mit komplexeren Nährstoffanforderungen wie Bacillus stearothermophilus, Branhamella catarrhalis, und Bacillus coagulans) bevorzugen tryptischen Soja-Agar.

Sie brauchen auch eine Quelle für Bakterien, und diese ist nicht schwer zu finden! Sie können Ihren Mund oder Ihre Haut, Haustiere, Erde oder Haushaltsoberflächen wie das Spülbecken oder die Toilettenschüssel abwischen. Wenn Sie eine bestimmte Bakterienart untersuchen möchten, können Sie in unserer Rubrik Mikrobiologie für Kinder auch Lebendkulturen erwerben. Lesen Sie weiter, um vier Experimente mit Bakterien und weitere Ideen für wissenschaftliche Projekte zu sehen (denken Sie auch an dieses praktische Bakterienzuchtset)! Aufsicht durch Erwachsene wird empfohlen bei der Arbeit mit Bakterien.

Wie können Bakterien uns helfen?

Was wären wir ohne Bakterien? Nun, wir bekommen vielleicht keine bakteriellen Krankheiten, aber es wäre immer noch viel schlimmer! Bakterien erfüllen alle möglichen sehr wichtigen Funktionen, sowohl in unserem Körper als auch in der Welt um uns herum. Hier sind nur einige.

Verdauung. Unser Dickdarm ist voll von nützlichen Bakterien, die Nahrung abbauen, die unser Körper nicht selbst verdauen kann. Sobald die Bakterien es abgebaut haben, kann unser Darm es aufnehmen und uns mehr Nährstoffe aus unserer Nahrung geben.

Vitamine. Bakterien in unserem Darm produzieren und sezernieren tatsächlich Vitamine, die für unsere Gesundheit wichtig sind! Zum Beispiel, E coli Bakterien in unserem Darm sind eine wichtige Quelle für Vitamin K. (Die meisten E coli ist gut für uns, aber es gibt eine schädliche Art, die eine Lebensmittelvergiftung verursacht.)

Essen. Bakterien werden verwendet, um Milch in Joghurt, Käse und andere Milchprodukte zu verwandeln.

Sauerstoff. Cyanobakterien (früher Blaualgen genannt) leben im Wasser und betreiben Photosynthese, wodurch ein Großteil des Sauerstoffs produziert wird, den wir zum Atmen benötigen.

Aufräumen. Ölverschmutzungen, Abwasser, Industrieabfälle – Bakterien können uns helfen, all das zu beseitigen! Sie „fressen“ das Öl oder die Giftstoffe und wandeln sie in weniger schädliche Substanzen um.

Bakterien sind erstaunliche Kreaturen, nicht wahr? Sie können so gefährlich und gleichzeitig so wichtig sein. Lesen Sie weiter, um ein Experiment zu sehen, das gute Bakterien verwendet!

Wie können Bakterien uns schaden?

Einige Arten von Bakterien verursachen Krankheiten und Beschwerden. Diese Bakterien werden als Krankheitserreger bezeichnet. Sie vermehren sich, wie alle Bakterien, sehr schnell. Diese treten in vielen Formen auf und können Krankheiten von einer Ohrenentzündung über eine Halsentzündung bis hin zu Cholera verursachen. Sie können über Mund und Nase oder durch Schnitte und Kratzer in unseren Körper gelangen. Einige werden in der Luft übertragen, andere werden in Lebensmitteln gefunden, was zu einer Lebensmittelvergiftung führt. Bakterien sind auch die Ursache für Plaqueablagerungen auf unseren Zähnen, die zu Karies und Zahnfleischerkrankungen führen können.

Vor der Entdeckung von Antibiotika waren viele schwere bakterielle Erkrankungen nicht heilbar und führten in der Regel zum Tod. Antibiotika wirken, indem sie Bakterien zerstören oder ihre Vermehrung hemmen, während die körpereigenen Zellen unversehrt bleiben. Einige Bakterien entwickeln nach einiger Zeit eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, das gegen sie nicht mehr wirksam ist. Aus diesem Grund forschen Wissenschaftler immer wieder an neuen Antibiotika. (Viele Krankheiten wie Windpocken, Hepatitis oder Polio werden eher durch Viren als durch Bakterien verursacht. Antibiotika haben keine Wirkung gegen diese Krankheiten.)

Bakterielle Infektionen sind häufig, aber viele von ihnen können durch gute Koch-, Reinigungs- und Händewaschpraktiken vermieden werden.

Was sind antibakterielle Wirkstoffe?

Wie verhindern Menschen, dass Bakterien wachsen und sich ausbreiten? Sie kontrollieren es auf zwei Arten: indem sie die Bakterienzellen abtöten und die Bakterien daran hindern, sich zu vermehren. Ein Agent ist eine Lösung oder Methode, die die Fortpflanzung entweder abtötet oder stoppt. Bakterizide sind Mittel, die Bakterienzellen abtöten. Statische Mittel hemmen das Zellwachstum und die Reproduktion.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Bakterien abzutöten oder deren Vermehrung zu verhindern.

  • Sterilisation. Die Anwendung von Hitze, um Bakterien abzutöten. Umfasst Verbrennung (Verbrennen), Kochen und Kochen.
  • Pasteurisierung. Die Verwendung von milder Hitze, um die Anzahl der Bakterien in Lebensmitteln zu reduzieren.
  • Kalte Temperaturen. Kühlen und Einfrieren sind zwei der gebräuchlichsten Methoden, die in Haushalten verwendet werden, um die Lebensdauer von Lebensmitteln zu erhalten.
  • Antiseptika. Diese Mittel können direkt auf lebendes Gewebe, einschließlich der menschlichen Haut, aufgetragen werden.
  • Desinfektionsmittel. Diese Mittel sind für lebende Gewebe nicht sicher. Desinfektionsmittel werden verwendet, um Toiletten, Waschbecken, Böden usw.
  • Konservierungsstoffe. Diese werden in fast allen verarbeiteten Lebensmitteln verwendet, die heute erhältlich sind. Sie hemmen das Bakterienwachstum in Lebensmitteln.
    • Einige Konservierungsstoffe für Lebensmittel sind Natriumbenzoat, Mononatriumglutamat (MSG), Schwefeldioxid, Salze, Zucker und Holzrauch.
    • Amoxycillin und Ampicillin – hemmen Schritte der Zellwandsynthese (Aufbau)
    • Penicillin – hemmt Schritte der Zellwandsynthese
    • Erythromycin – hemmt die RNA-Translation für die Proteinsynthese

    SICHERHEITSHINWEIS

    Während die meisten Umweltbakterien für gesunde Personen nicht schädlich sind, können sie, sobald sie in Kolonien konzentriert sind, gefährlich sein.

    Um das Risiko zu minimieren, tragen Sie beim Umgang mit Bakterien Einweghandschuhe und waschen Sie Ihre Hände vorher und nachher gründlich. Essen oder trinken Sie während der Bakterienuntersuchungen nie und atmen Sie keine wachsenden Kulturen ein oder nehmen Sie sie ein. Arbeiten Sie in einem zugfreien Raum und reduzieren Sie den Luftstrom so weit wie möglich. Halten Sie Petrischalen mit Kulturmedium geschlossen – vorzugsweise mit Klebeband –, es sei denn, es wird eine Probenahme oder Desinfektion durchgeführt. Entfernen Sie selbst dann die Petrischale nur so weit, dass Sie Ihr Gerät einsetzen oder das Medium mit Bleichmittel oder 70%igem Isopropylalkohol bedecken.

    Wenn Sie mit dem Experimentieren fertig sind, versiegeln Sie das Geschirr in einer Plastiktüte und entsorgen Sie es. Bedecken Sie versehentliche Brüche oder Verschüttungen 10 Minuten lang mit Bleichmittel oder Alkohol, kehren Sie sie dann vorsichtig auf, verschließen Sie sie in einer Plastiktüte und entsorgen Sie sie.

    Zubereitung von Kulturgerichten

    Bevor Sie Bakterien züchten können, müssen Sie sterile Kulturschalen vorbereiten. Eine 125-ml-Flasche Nähragar enthält genug, um etwa 10 Petrischalen zu füllen.

    Wasserbadmethode – Lösen Sie den Verschluss der Agarflasche, aber entfernen Sie ihn nicht vollständig. Stellen Sie die Flasche in heißes Wasser bei 170-190 ° F, bis der gesamte Agar flüssig ist. Um ein Umkippen der Flasche zu verhindern, halten Sie den Wasserstand mit dem Agar-Niveau.

    • Lassen Sie den Agar auf 110-120 ° F abkühlen (wenn sich die Flasche noch warm anfühlt, aber nicht zu heiß zum Anfassen), bevor Sie ihn in Petrischalen gießen.
    • Schieben Sie den Deckel der Petrischale gerade so weit auf, dass Agar in die Schale gegossen wird. Gießen Sie genug Agar, um 1/2 bis 2/3 des Bodens der Schale zu bedecken (ca. 10-13 ml). Lassen Sie den Flaschenmund das Gericht nicht berühren. Decken Sie die Schale sofort ab, um eine Kontamination zu vermeiden, und kippen Sie sie vorsichtig hin und her, bis der Agar den gesamten Boden der Schale bedeckt. (Füllen Sie so viele Schalen, wie Sie Agar haben: Sie können die Extras kopfüber aufbewahren, bis Sie sie verwenden können.)
    • Lassen Sie die Petrischalen eine Stunde stehen, damit sich der Agar verfestigt, bevor Sie sie verwenden.

    Experiment #1: Wangenzellenabstrich

    Bereiten Sie eine Kulturschale wie oben beschrieben vor. Sobald die Kulturschale vorbereitet ist, verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen oder eine Impfnadel und wischen Sie die Innenseite Ihrer Wange ab. Reiben Sie den Tupfer in wenigen Zickzackstrichen sehr vorsichtig über den Agar und setzen Sie den Deckel wieder auf die Schale. Sie müssen die Schüssel 3-7 Tage an einem warmen Ort stehen lassen, bevor Bakterienwachstum auftritt. Notieren Sie das Wachstum jeden Tag mit einer Zeichnung und einer schriftlichen Beschreibung. Die einzelnen Bakterien sind zu klein, um sie ohne Hochleistungsmikroskop zu sehen, aber Sie können Bakterienkolonien sehen. Unterscheiden Sie verschiedene Bakterienarten durch die Farbe und Form der Kolonien.

    Experiment #2: Testen antibakterieller Wirkstoffe

    Vorbereiten von Empfindlichkeitsquadraten

    Eine Methode zum Testen der antibakteriellen Wirksamkeit einer Substanz ist die Verwendung von ‘Empfindlichkeitsquadraten’. Schneiden Sie kleine Quadrate aus Löschpapier (oder anderem saugfähigem Papier) und tränken Sie sie dann in einer beliebigen Substanz, die Sie testen möchten: Jod, Ethylalkohol, antibakterielle Seife, Antiseptika, Knoblauch usw. Verwenden Sie eine saubere Pinzette, um die Quadrate zu handhaben, damit Sie sie nicht kontaminieren. Beschriften Sie sie mit permanenter Tinte, tränken Sie sie in der gewählten Substanz und tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem Papiertuch ab.

    Sammeln von Bakterien

    Entscheiden Sie sich für eine Quelle zum Sammeln von Bakterien. Stellen Sie bei der Verwendung von Empfindlichkeitsquadraten sicher, dass es nur eine Quelle gibt, und halten Sie jedes Gericht so einheitlich wie möglich. Quellen können ein Spülbecken, eine Badezimmertheke, ein Mobiltelefon oder eine andere Oberfläche sein, die Sie testen möchten. Reiben Sie einen sterilen Tupfer über die gewählte Oberfläche und reiben Sie ihn dann leicht im Zickzackmuster über die vorbereitete Agarschale. Drehen Sie das Gericht und wiederholen Sie den Vorgang.

    Ein Experiment einrichten

    Jedes Experiment sollte eine Kontrollschale haben, die das Bakterienwachstum unter normalen Bedingungen zeigt und eine oder mehrere Testschalen, in denen Sie bestimmte Variablen ändern und die Ergebnisse überprüfen. Beispiele für zu testende Variablen sind die Temperatur oder das Vorhandensein von Antiseptika. Wie wirken sich diese auf das Bakterienwachstum aus?

    • Beschriften Sie eine Schale mit ‘Control.’. Geben Sie dann in Ihre Testschale mit einer Pinzette die Empfindlichkeitsquadrate ein, die in eine Substanz getränkt wurden, die Sie auf antibakterielle Eigenschaften testen möchten. Es ist eine gute Idee, ein einfaches Quadrat Löschpapier hinzuzufügen, um zu sehen, ob das Papier selbst einen Einfluss auf das Bakterienwachstum hat. Um beste Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie mehrere Testschalen und kontrollieren Sie die Variablen so, dass die Bedingungen für jede Schale identisch sind: Bakterien am selben Ort gesammelt, derselben Menge antibakterieller Substanz ausgesetzt, bei derselben Temperatur gelagert usw. Je mehr Tests Sie durchführen , desto mehr Daten werden Sie sammeln und desto sicherer können Sie Ihre Schlussfolgerungen ziehen.
    • Stellen Sie alle Gerichte an einen dunklen Ort mit Raumtemperatur wie einen Schrank.

    Warten Sie 3-7 Tage und untersuchen Sie das Bakterienwachstum in den Schalen, ohne die Deckel zu entfernen. Sie werden mehrere runde Wachstumspunkte sehen, dies sind Bakterienkolonien. Je nachdem, wo Sie Ihre Bakterienproben gesammelt haben, wachsen möglicherweise mehrere Arten von Bakterien (und sogar einige Schimmelpilze!) in Ihrem Geschirr. Verschiedene Arten von Kolonien haben unterschiedliche Farben und Texturen. Wenn Sie ein zusammengesetztes oder Stereomikroskop haben, versuchen Sie, die Kolonien aus der Nähe zu betrachten, um mehr von den Unterschieden zu sehen.

    Vergleichen Sie die Anzahl der Bakterien in der Kontrollschale mit der Menge in den Testschalen. Vergleichen Sie als Nächstes die Menge des Bakterienwachstums um jedes Papierquadrat. Welche Bakterien wachsen am nächsten? Welcher hat die wenigsten Bakterien, die in seiner Nähe wachsen? Wenn Sie mehr als ein Testgericht zubereitet haben, sind die Ergebnisse bei allen Testgerichten ähnlich? Wenn nicht, welche Variablen könnten Ihrer Meinung nach zu unterschiedlichen Ergebnissen geführt haben? Wie wirkt sich dies auf Ihre Schlussfolgerungen aus?

    Testen Sie für eine Variation dieses Experiments den Einfluss der Temperatur auf das Bakterienwachstum, anstatt Empfindlichkeitsquadrate zu verwenden. Stellen Sie eine Kontrollschale auf Raumtemperatur und stellen Sie andere Gerichte in dunkle Bereiche mit unterschiedlichen Temperaturen.

    Experiment #3: Seifen-Umfrage

    Jedes Mal, wenn Sie etwas berühren, nehmen Sie wahrscheinlich neue Bakterien auf und lassen einige zurück. So verbreiten sich viele Infektionskrankheiten – wir teilen unsere Bakterien mit allen um uns herum! Sogar Bakterien, die sicher auf unserer Haut leben, können uns krank machen, wenn sie durch unseren Mund oder Schnitte und Kratzer in unseren Körper gelangen. Auch deshalb ist es so wichtig, dass wir uns regelmäßig und gut die Hände waschen.

    Welche Seife eignet sich am besten, um die Bakterien an unseren Händen zu reduzieren? Sie können dies testen, indem Sie einige Bakterienkulturen mit Agar und Petrischalen züchten.

    • Zwei (oder mehr) Petrischalen oder anderes saugfähiges Papier oder Pinzetten
    • Verschiedene Arten von Handreinigern: normale Seife, antibakterielle Seife, Spülmittel, Handdesinfektionsmittel
    1. Bereiten Sie den Agar gemäß den Anweisungen auf dem Etikett vor und gießen Sie dann genug ein, um den Boden jeder Petrischale zu bedecken. Decken Sie die Schalen ab und lassen Sie sie etwa eine Stunde stehen, bis sich der Agar wieder verfestigt hat. (Wenn Sie sie nicht sofort nach dem Abkühlen verwenden möchten, bewahren Sie sie verkehrt herum im Kühlschrank auf.)
    2. Wenn Ihre Petrischalen fertig sind, sammeln Sie einige Bakterien von Ihrer Hand oder der Hand eines Freiwilligen. (Stellen Sie sicher, dass sich die Person nicht zu lange die Hände gewaschen hat!) Reiben Sie dazu den sterilen Tupfer im Zickzackmuster über die Handfläche.
    3. Entfernen Sie den Deckel von der Petrischale und reiben Sie den Tupfer leicht im Zickzackmuster auf dem Agar hin und her. Drehen Sie das Gericht um eine Vierteldrehung und wieder im Zickzack. Decken Sie die Schale ab und wiederholen Sie die Schritte zwei und drei für die andere Schale mit einem neuen sterilen Tupfer. Beschriften Sie die Gerichte mit “Test” und “Control.” (Möglicherweise möchten Sie mehr als ein Testgericht zubereiten, damit Sie die Ergebnisse vergleichen können.)
    4. Schneiden Sie das Löschpapier in kleine “Empfindlichkeits-Quadrate.” Verwenden Sie permanente Tinte, um die Quadrate für die verschiedenen Arten von Handreinigern zu beschriften, die Sie testen möchten, z. B. “R” für normale Seife, “A” für antibakterielle Seife und “S” für Händedesinfektionsmittel. Tauchen Sie jedes Quadrat mit einer Pinzette in den entsprechenden Reiniger. Tupfen Sie den überschüssigen Reiniger auf einem Papiertuch ab und legen Sie dann die Quadrate auf den Agar in der “Test”-Schale. (Verteilen Sie die Quadrate so, dass ein Abstand zwischen ihnen besteht.) Fügen Sie ein Quadrat einfaches Löschpapier hinzu, um zu testen, ob Löschpapier allein einen Effekt hat. Legen Sie keine Quadrate in die “Control”-Schale –, diese zeigt Ihnen, wie das Bakterienwachstum ohne Seife aussehen wird.
    5. Stellen Sie das Geschirr an einen dunklen, zimmerwarmen Ort wie einen Schrank und lassen Sie es einige Tage ungestört.

    Was ist passiert

    Die Geschwindigkeit des Bakterienwachstums in Ihrem Geschirr hängt von der Temperatur und anderen Faktoren ab. Überprüfen Sie Ihre Kulturen nach ein paar Tagen, aber Sie werden wahrscheinlich 5-7 Tage warten wollen, bevor Sie Ihre Daten aufzeichnen. Sie werden mehrere runde Wachstumspunkte sehen, dies sind Bakterienkolonien. Im Geschirr können verschiedene Bakterienarten wachsen. Verschiedene Arten von Kolonien haben unterschiedliche Farben und Texturen.

    Zählen und notieren Sie für jeden Seifentest die Anzahl der Bakterienkolonien in jeder Schale. Um zu sehen, wie effektiv jede Seife war, dividiere die Anzahl der Kolonien in der Testschale durch die Anzahl der Kolonien in der Kontrollschale, subtrahiere dann das Ergebnis von 1 und schreibe die Antwort in Prozent. Wenn Ihre Kontrollschale beispielsweise 100 Kolonien hatte und Ihre Seifentestschale 30, eliminierte die Seife 70 % der Bakterien: 1 — (30 ÷ 100) = 0,7 = 70 %

    Welche Seife war nach Ihren Ergebnissen am effektivsten bei der Eliminierung von Bakterien? Funktioniert “antibakterielle” Seife wirklich besser als normale Seife? Wie gut hat das Händewaschen in Wasser ohne Seife funktioniert? Welche weiteren Tests könnten Sie durchführen, um festzustellen, welche Seifen und Handwaschmethoden Bakterien am effektivsten eliminieren?

    Experiment #4: Bakterien in der Luft

    Für dieses Experiment benötigen Sie zwei Kulturschalen, in denen Sie demonstrieren, wie antibakterielle Wirkstoffe (wie Antibiotika und Haushaltsreiniger) das Bakterienwachstum beeinflussen.

    Lassen Sie das Geschirr ohne Deckel an einem Ort mit Raumtemperatur. Lassen Sie die Kulturschalen etwa eine Stunde lang exponiert.

    Während Sie warten, schneiden Sie kleine Papierquadrate aus (Löschpapier funktioniert gut), beschriften Sie sie mit den Namen der antibakteriellen Mittel, die Sie testen möchten (z. B. ‘L’ für Lysol, ‘A’ für Alkohol usw. ) und tränken Sie jede in einer anderen Haushaltschemikalie, die Sie auf ihre antibakteriellen Eigenschaften testen möchten. Wenn Sie Zeit haben, können Sie auch mit natürlichen antibakteriellen Mitteln wie Teebaumöl oder rotem Pfeffer experimentieren. Wischen Sie überschüssige Flüssigkeit ab und setzen Sie jedes der Quadrate mit einer Pinzette an einer anderen Stelle in einer der Kulturschalen. Die zweite Kulturschale ist Ihre ‘control.’ Sie zeigt Ihnen, wie eine Luftbakterienkultur ohne chemische Mittel aussieht.

    Bewahren Sie das Geschirr (mit Deckel) an einem dunklen Ort wie einem Schrank auf, wo es einige Tage ungestört ist. Nehmen Sie nach 3-7 Tagen beide Kulturschalen und beobachten Sie sorgfältig das Bakterienwachstum in jeder Schale, lassen Sie die Deckel auf. Die Bakterien werden in kleinen, farbigen Clustern sichtbar. Notieren Sie Ihre Beobachtungen und machen Sie Zeichnungen. Sie könnten auch die folgenden Fragen beantworten.Wie viel von der Schale ist in der Kontrollkultur mit Bakterien bedeckt? Haben die Bakterien in der Sensitivitäts-Quadrat-Testkultur diese Schale im gleichen Maße bedeckt wie die Kontrollkultur? Welche Wirkung haben die einzelnen Chemikalien auf das Bakterienwachstum gehabt? Hat eine bestimmte Chemikalie die Bakterien abgetötet oder nur ihr Wachstum gehemmt?

    • Für weitere Studien können Sie ein Antibiotika-Scheibenset verwenden, um zu sehen, was verschiedene Antibiotika gegen Bakterien tun können.
    • Erfahren Sie für ein fortgeschritteneres Projekt, wie die Gram-Färbung mit der Verwendung von Antibiotika zusammenhängt.

    Experiment #5: Hausgemachter Joghurt

    Wenn Menschen an „Bakterien“ denken, denken sie im Allgemeinen an schädliche Keime. Allerdings sind nicht alle Formen von Bakterien schlecht!
    Sie können ein leckeres Produkt aus guten Bakterien genießen, indem Sie zu Hause eine Portion Joghurt herstellen.

    Sie müssen einen Starter (erhältlich in Lebensmittelgeschäften oder Reformhäusern) oder eine Tasse einfachen, nicht aromatisierten Joghurt mit lebenden Kulturen verwenden. (Wenn es lebende Kulturen enthält, wird dies auf dem Container angegeben.)

    Erhitze langsam vier Tassen Milch, bis sie heiß ist, aber nicht kocht oder verbrüht. Die Temperatur sollte etwa 95-120 Grad betragen, um einige der schädlichen Bakterien abzutöten. Leicht abkühlen lassen, bis die Milch warm ist, und dann eine Tasse aktiven Joghurt oder den Starter hinzufügen.

    Die Mischung in eine große Schüssel (oder Gläser) geben und abdecken. Stellen Sie sicher, dass die Schüssel oder Gläser vor der Verwendung sterilisiert sind, indem Sie sie entweder durch die Spülmaschine laufen lassen oder mit sehr heißem Wasser waschen.

    Es gibt zwei verschiedene Methoden, um die Joghurtmischung zu kultivieren: Sie können die abgedeckte Schüssel oder Gläser in einen sauberen Plastikkühler stellen und den Kühler bis knapp unter den oberen Rand der Kulturbehälter mit heißem Wasser füllen. Bei dieser Methode müssen Sie den Kühler gelegentlich mit heißem Wasser nachfüllen, damit die Temperatur des Joghurts konstant bleibt. Die andere Methode besteht darin, die Behälter in ein Heizkissen und Handtücher zu wickeln und das Heizkissen auf niedrige bis mittlere Hitze einzustellen.

    Überprüfen Sie die Mischung nach dem Erhitzen für 3 1/2 bis 4 Stunden. Es sollte „angerichtet“ sein und eine glatte, cremige Konsistenz haben, ähnlich wie im Laden gekaufter Joghurt. Wenn die Mischung noch nicht fertig ist, erhitzen Sie sie weitere 1-2 Stunden. Wenn es die richtige Konsistenz hat, fügen Sie etwas Aroma hinzu – wie Vanilleextrakt, Schokoladensirup oder Beeren – und bewahren Sie den Joghurt im Kühlschrank auf. Es sollte ein paar Wochen haltbar sein. Aus Sicherheitsgründen empfehlen wir Ihnen, keinen Joghurt zu essen, der sich abgetrennt hat oder eine untypische Konsistenz hat.


    Klassifizierung bakterieller Nährmedien nach Zweck/ funktioneller Verwendung/ Anwendung

    Nährstoff-Agar

    Viele Spezialmedien werden benötigt, um die Erkennung, Auszählung und Isolierung bestimmter Bakterienarten zu erleichtern. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, stehen zahlreiche Medien zur Verfügung.

    Allgemeiner Zweck Medien

    Basale Medien, auch Allzweckmedien genannt, sind im Grunde einfache Medien, die das Wachstum der meisten nicht anspruchsvollen Bakterien unterstützen. Peptonwasser, Nährbrühe und Nähragar (NA) gelten als Basalmedien. Diese Medien werden im Allgemeinen zur Primärisolierung von Mikroorganismen verwendet.

    Angereicherte Medien

    Die Zugabe zusätzlicher Nährstoffe in Form von Blut, Serum, Eigelb usw. zum Grundmedium ergibt ein angereichertes Medium. Angereicherte Medien werden verwendet, um ernährungsphysiologisch anspruchsvolle (anspruchsvolle) Bakterien zu züchten. Blutagar, Schokoladenagar, Loeffler-Serum-Steigung usw. sind einige Beispiele für angereicherte Medien. Blutagar wird hergestellt durch Zugabe von 5-10% (bezogen auf das Volumen) Blut zu einer Blutagarbasis. Schokoladen-Agar wird auch als erhitzter Blutagar oder lysiert bezeichnet Blutagar.

    Selektive und Anreicherungsmedien

    Diese Medien wurden entwickelt, um unerwünschte kommensale oder kontaminierende Bakterien zu hemmen und helfen, Krankheitserreger aus einem Bakteriengemisch zu gewinnen. Während selektive Medien auf Agar basieren, haben Anreicherungsmedien eine flüssige Konsistenz. Beide Medien dienen demselben Zweck. Alle Agarmedien können durch Zugabe bestimmter Hemmstoffe, die den interessierenden Krankheitserreger nicht beeinflussen, selektiv gemacht werden. Verschiedene Ansätze, um ein Medium selektiv zu machen, umfassen die Zugabe von Antibiotika, Farbstoffen, Chemikalien, Änderung des pH-Werts oder eine Kombination davon.

    Selektiv Medien

    Prinzip: Differentielle Wachstumsunterdrückung
    Das selektive Medium wurde entwickelt, um das Wachstum einiger Mikroorganismen zu unterdrücken, während es das Wachstum anderer ermöglicht. Das selektive Medium ist ein (festes) Medium auf Agarbasis, so dass einzelne Kolonien isoliert werden können.

      verwendet, um sich zu erholen Neisseria gonorrhoeae enthält die Antibiotika Vancomycin, Colistin und Nystatin.
  • Mannit-Salz-Agar und Salz-Milch-Agar verwendet, um sich zu erholen S. aureusenthält 10 % NaCl.
  • Kaliumtellurit-Medium, das zur Rückgewinnung verwendet wird C.diphtherie enthält 0,04% Kaliumtellurit.verwendet für EnterobakterienMitglieder enthält Gallensalz, das die meisten grampositiven Bakterien hemmt. verwendet, um sich zu erholen Pseudomonas aeruginosa enthält Cetrimid (Antiseptikum).
  • Kristallvioletter Blutagar, der zur Erholung verwendet wird S. pyogenes enthält 0,0002% Kristallviolett. verwendet, um sich zu erholen M.tuberkulose wird durch den Einbau von Malachitgrün selektiv gemacht.
  • Wilson und Blair’s Agar zur Erholung S. typhi wird durch Zugabe des Farbstoffs Brillantgrün selektiv gemacht.
  • Ausgewählte Medien wie TCBS-Agarzum Isolieren verwendet Vibrio cholerae aus Stuhlproben haben einen erhöhten pH-Wert (8,5-8,6), der die meisten anderen Bakterien hemmt.
  • Anreicherungsmedien

    Anreicherungsmedium wird verwendet, um die relative Konzentration bestimmter Mikroorganismen in der Kultur vor dem Ausplattieren auf festes selektives Medium zu erhöhen. Im Gegensatz zu selektiven Medien wird die Anreicherungskultur typischerweise als Nährmedium verwendet. Anreicherungsmedien sind flüssige Medien, die auch zur Hemmung von Kommensalen in der klinischen Probe dienen. Selenit-F-Brühe, Tetrathionat-Brühe und alkalisches Peptonwasser (APW) werden verwendet, um Krankheitserreger aus Stuhlproben zu gewinnen.

    Differenzial-/ Anzeigemittelein

    Bestimmte Medien sind so konzipiert, dass unterschiedliche Bakterien anhand ihrer Koloniefarbe erkannt werden können. Verschiedene Ansätze umfassen den Einbau von Farbstoffen, Stoffwechselsubstraten usw., so dass die Bakterien, die sie verwenden, als verschiedenfarbige Kolonien erscheinen. Solche Medien werden Differenzmedien oder Indikatormedien genannt. Differentielle Medien ermöglichen das Wachstum von mehr als einem interessierenden Mikroorganismus, jedoch mit morphologisch unterscheidbaren Kolonien.

    Beispiele für Differenzmedien sind:

      (Mannitol-Fermentation = gelb) (verschiedene Hämolysearten, d. h. α-, β- und γ-Hämolyse)
    1. Mac Conkey-Agar(Laktose-Fermenter, rosa Kolonien, während Nicht-Laktose-Fermenter blasse oder farblose Kolonien produzieren.
    2. TCBS(Vibrio cholerae erzeugt durch Fermentation von Saccharose gelbe Kolonien)

    Transportmedien

      und Venkatraman Ramakrishnan (VR)-Medium werden verwendet, um Fäkalien von Patienten mit Verdacht auf Cholera zu transportieren.
    • Die gepufferte Glycerin-Kochsalzlösung von Sach wird verwendet, um Fäkalien von Patienten zu transportieren, bei denen der Verdacht auf Bakterienruhr besteht.
    • Hecht-Medium wird verwendet, um Streptokokken aus Rachenproben zu transportieren.

    Anaerobe Medien:

    Anaerobe Bakterien benötigen für ihr Wachstum spezielle Medien, da sie einen geringen Sauerstoffgehalt, ein reduziertes Oxidations-Reduktions-Potential und zusätzliche Nährstoffe benötigen.

    Medien für Anaerobier müssen möglicherweise mit Nährstoffen wie Hämin und Vitamin K ergänzt werden. Solche Medien müssen möglicherweise auch physikalisch oder chemisch reduziert werden. Das Sieden des Mediums dient dazu, jeglichen gelösten Sauerstoff auszutreiben. Die Zugabe von 1 % Glucose, 0,1 % Thioglykolat, 0,1 % Ascorbinsäure, 0,05 % Cystein oder glühenden Eisenspäne kann ein Medium reduzieren. Vor der Verwendung muss das Medium in einem Wasserbad gekocht werden, um gelösten Sauerstoff zu entfernen und dann mit sterilem flüssigem Paraffin versiegelt werden.

    Robertson gekochtes Fleisch (RCM) Medium, das üblicherweise zum Wachsen verwendet wird Clostridium spp enthält eine 2,5 cm lange Säule mit Ochsenherzfleisch und 15 ml Nährbrühe. Thioglycollat-Brühe enthält Natriumthioglycolat, Glucose, Cystin, Hefeextrakt und Caseinhydrolysat.

    Methylenblau oder Resazurin ist ein Indikator für das Oxidations-Reduktions-Potential, der in das Medium eingebaut wird. Methylenblau ist unter reduzierten Bedingungen farblos.


    Bakteriophagen-Plaque-Assay: Prinzip, Verfahren, Ergebnisse

    Da die Welt mit den Problemen der Zunahme der Antibiotikaresistenz zu kämpfen hat, werden verschiedene Forschungen durchgeführt, um die Anwendungen von Phagen zur Behandlung bakterieller Infektionen (als Ersatz für eine Antibiotikatherapie) zu bewerten.

    Die Verwendung von Phagen zur Behandlung bakterieller Infektionen wurde bereits in den 1920er und 1930er Jahren in Osteuropa und der Sowjetunion entwickelt.

    Der Plaque-Assay ist einer der weit verbreiteten Ansätze zur Bestimmung der Menge an infektiösem Virus in einer Probe. Nur Viren, die Zellen sichtbar schädigen, können auf diese Weise untersucht werden. Der Plaque-Assay wurde zuerst entwickelt, um die Titer von Bakteriophagenvorräten zu berechnen. Derzeit wird das modifizierte Verfahren auch zur Titerbestimmung vieler verschiedener Tierviren eingesetzt.

    Prinzip des Phagen-Plaque-Assays

    Wenn eine Suspension eines infektiösen Phagen (z.B. T4-Phagen) über den Rasen anfälliger Bakterienzellen (z.B. Escherichia coli), der Phagen bindet die Bakterienzelle, repliziert sich darin und tötet sie während ihrer lytischen Freisetzung. Die Lyse des Bakteriophagen wird durch die Bildung einer Klärungszone oder Plaque innerhalb des Bakterienrasens angezeigt. In Abwesenheit von lytischen Phagen bilden die Bakterien einen konfluenten Wachstumsrasen.

    Jeder Plaque entspricht der Stelle, an der ein einzelner Bakteriophage als infektiöse Einheit fungierte und seinen lytischen Zyklus einleitete. Die Ausbreitung infektiöser Phagen von der anfänglich infizierten Bakterienzelle auf die umgebenden Zellen führt zur Lyse der Bakterien in der Umgebung und schließlich zur Bildung des Plaques, der groß genug ist, um mit bloßem Auge sichtbar zu sein. Plaques breiten sich nicht unbegrenzt weiter aus. Die Größe der gebildeten Plaque hängt vom Virus, dem Wirt und den Kulturbedingungen ab.

    Die Anzahl der sich entwickelnden Plaques und die entsprechenden Verdünnungsfaktoren können verwendet werden, um die Anzahl der Bakteriophagen zu berechnen, d.h.
    Plaque-bildende Einheiten (PFU) in einer Probe.

    Das in Phagen-Plaque-Assays verwendete Medium hat einen relativ geringen Anteil an Agar und wird daher als weicher Agar es erlaubt die Diffusion von Phagen zu nahegelegenen nicht infizierten Zellen, erlaubt jedoch nicht, dass sich neue Phagen zu entfernten Teilen der Platte bewegen.

    Verfahren für den Bakteriophagen-Plaque-Assay

    Bakteriophagen-Plaque-Assay

    Vorbereitung der Stammlösung durch serielle Verdünnung

    1. Legen Sie acht sterile Kochsalzlösungsröhrchen (je 0,9 ml) in Ihr Reagenzglasgestell.
    2. Beschriften Sie ein Röhrchen mit „Kontrolle“ und beschriften Sie die restlichen fünf Röhrchen nacheinander von 10 -1 bis 10 -7.
    3. Beschriften Sie sechs Nähragarplatten genauso wie die Röhrchen.
    4. Mit einer sterilen 1-ml-Pipette 0,1 ml der mitgelieferten Bakteriophagen-Suspension aseptisch in das mit 10 -1 beschriftete Kochsalzröhrchen überführen.
    5. Mischen Sie das Röhrchen gut durch, indem Sie es zwischen Ihren Handflächen rollen.
    6. Übertragen Sie mit einer weiteren 1 ml-Pipette 0,1 ml aus dem 10 -1-Röhrchen in das 10 -2-Röhrchen. Mischen Sie das Rohr.
    7. Mit einer frischen Pipette für jede Übertragung 0,1 ml der Suspension aus dem 10 -2 Röhrchen in das 10 -3 Röhrchen überführen und dieses Verdünnungsverfahren nacheinander für die verbleibenden Kochsalzlösungsröhrchen fortsetzen. Vergessen Sie nicht, jedes Röhrchen vor und nach dem Verdünnen gut zu mischen.

    Überlagerungsplatte mit Phagen-Agar-Mischung

    1. (Hinweis: Sie müssen hier schnell arbeiten) Besorgen Sie sich sechs Röhrchen mit geschmolzenem Soft-Overlay-Agar aus dem Wasserbad. 0,3 ml einer Bouillonkultur von . pipettieren E coli in jedes der Weichagarröhrchen geben. Mischen Sie jedes Röhrchen gut durch, indem Sie es zwischen Ihren Handflächen rollen. Beschriften Sie jedes Röhrchen mit Ihren Initialen und geben Sie es so schnell wie möglich ins Wasserbad zurück. Lassen Sie den Agar nicht erstarren.
    2. (Wieder schnell arbeiten) Ein beimpftes Röhrchen Weichagar aus dem Wasserbad nehmen. Wischen Sie das gesamte Wasser von der Oberfläche des Röhrchens ab. Mit einer 1 ml Pipette aseptisch transferieren 0,1 ml der 10 -1 salzhaltigen Phagenverdünnung in das Weichagarröhrchen. Mischen Sie das Agarröhrchen, indem Sie es zwischen Ihren Händen rollen.
    3. Gießen Sie den Weichagar sofort aseptisch auf die Oberfläche der Nähragarplatte, die entsprechend mit 10 -1 gekennzeichnet ist. Setzen Sie den Deckel wieder auf und drehen Sie die Platte, ohne die Platte aufzunehmen, vorsichtig in einem 6 bis 8-Zoll-Kreis auf der Tischoberfläche, um den Agar gleichmäßig zu verteilen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2 jedes Mal mit einer frischen 1-ml-Pipette und arbeiten Sie schnell.
    5. Verwenden Sie für jedes Verdünnungsröhrchen die entsprechend gekennzeichnete Nähragarplatte.
    6. Lassen Sie den Weichagar fest werden.
    7. Platten umdrehen und bei 35 °C bis 37 °C für 24 Stunden inkubieren.

    Ergebnisse

    1. Untersuchen Sie nach der Inkubation jede Platte und zählen Sie die Anzahl der Plaques auf jeder Platte, die deutlich differenzierte Plaques aufweist.
    2. Notieren Sie Ihre Zählungen. Platten, bei denen Plaques die gesamte Platte bedeckt haben und bei denen Plaques nicht klar voneinander zu unterscheiden sind (mehr als 300 Plaques), sollten als TNTC (zu zahlreich zum Zählen) erfasst werden.
    3. Berechnen Sie die Anzahl der lytischen Phagen pro Milliliter, die sich in der ursprünglichen Bakteriophagensuspension befanden, unter Verwendung der oben genannten Formel.

    Ergebnisse des Bakteriophagen-Plaque-Assays

    Wenn 48 Plaques mit einem Verdünnungsfaktor von 10 –5 beobachtet werden, wenn 0,1 ml Virus hinzugefügt werden, betragen die Plaque-bildenden Einheiten/ml 4,8 × 10 7 .


    Was kann auf einer Nähragarplatte wachsen?

    Bakterien

    Jede einzelne kreisförmige Kolonie sollte eine einzelne Bakterienzelle oder -gruppe darstellen, die sich wiederholt geteilt hat. An einem Ort aufbewahrt, haben sich die resultierenden Zellen zu einem sichtbaren Fleck angesammelt. Die meisten Bakterienkolonien haben eine weiße, cremefarbene oder gelbe Farbe und eine ziemlich kreisförmige Form.

    Bacillus subtilis(3)
    Proteus vulgaris(4)
    Staphylococcus aures(5)
    Streptococcus pyogenes(6)

    Hefen

    Hefe, eine Pilzart (Plural für Pilz), findet sich vielerorts in der Natur, in Forschungslaboren und sogar in Alltagsküchen zum Backen. Hefekolonien sehen im Allgemeinen Bakterienkolonien ähnlich. Einige Arten, wie z Kandidat, kann als weiße Flecken mit glänzender Oberfläche wachsen.

    Candida albicans) ist eine Hefeart, die auf der Hautoberfläche wachsen kann(7)
    Runde Hefekolonien(8)
    Rosa Hefekolonien(9)

    Formen

    Schimmelpilze sind eigentlich Pilze und erscheinen oft weißlich-grau mit unscharfen Rändern. Sie nehmen normalerweise von der Mitte nach außen eine andere Farbe an. Nachfolgend sind zwei Beispiele für Formen aufgeführt:

    Grüner Schimmel (Trichoderma harzianum)(10)
    Schwarzer Schimmel (Aspergillus nidulaus)(11)

    Andere Pilze

    Moosgrüne Kolonien, eine weiße Wolke oder ein Sporenring können auf das Wachstum von . zurückgeführt werden Aspergillus, die bei Pilzinfektionen wie Fußpilz häufig vorkommt. Hier ist ein Beispiel für was Aspergillus sieht aus wie:


    Arten von Medien:

    Das Wachstum von Mikroorganismen benötigt Nährstoffe und Umgebungsbedingungen. Im Labor hergestellte Nährpräparate, die für das Wachstum des Organismus verwendet werden, werden als Medien (Singular: Medium) bezeichnet. Drei physikalische Formen werden verwendet: flüssige Medien oder Brühe, halbfeste Medien und feste Medien. Flüssige Medien wie Nährbrühe, tryptische Sojabrühe oder Hirn-Herz-Infusionsbrühe können verwendet werden, um eine große Anzahl von Mikroorganismen in Fermentationsstudien und für biochemische Tests zu vermehren. Halbfeste Medien können auch in Fermentationsstudien, zur Bestimmung der bakteriellen Motilität und zur Förderung des anaeroben Wachstums verwendet werden. Feste Medien wie Nähragar oder Blutagar werden für das Oberflächenwachstum von Mikroorganismen verwendet, um das Aussehen von Kolonien zu beobachten, (2) für Reinkulturisolierungen, (3) Chargenlagerung von Kulturen und (4) zur Beobachtung spezifischer biochemischer Reaktionen. Im verflüssigten Zustand können feste Medien entweder in ein Reagenzglas oder eine Petrischale (Schale) gegossen werden, und wenn der Agar in eine Petrischale gegossen wird, wird die Platte als Agarplatte bezeichnet.


    Protokoll

    1. Bereiten Sie einen sicheren und sterilen Arbeitsplatz vor

    Machen Sie sich mit allen Laborregeln und Sicherheitsvorkehrungen vertraut, die beim Arbeiten mit Mikroorganismen zu treffen sind. Unabhängig von der Einstufung als Biogefährdung gelten alle Materialien, die mit Mikroorganismen in Kontakt kommen, als infektiöser Abfall und müssen vor der Entsorgung dekontaminiert werden. Befolgen Sie die Sicherheitsrichtlinien in Übereinstimmung mit denen, die von den institutionellen Abteilungen für Umwelt, Gesundheit und Sicherheit bereitgestellt werden, und richten Sie geeignete Abfallbehälter für die sofortige und ordnungsgemäße Entsorgung potenziell kontaminierter Materialien (Biogefahren) ein.

    Sterilisieren Sie alle Instrumente, Lösungen und Medien, bevor Sie sie für Plattierungsverfahren verwenden.

    Entfernen Sie alle Materialien, die Ihren Arbeitsbereich auf dem Labortisch überladen.

    Arbeitsbereich mit Desinfektionsmittel reinigen, um mögliche Kontaminationen zu minimieren.

    Stellen Sie einen Bunsenbrenner auf und arbeiten Sie langsam, vorsichtig und bewusst im sterilen Feldbereich, der durch den Aufwind der Flamme entsteht.

    Wenn Sie mit BSL-2-Organismen arbeiten, richten Sie Ihren Arbeitsplatz in einem Biosicherheitsschrank ein. Ein Bunsenbrenner kann nicht im Schrank verwendet werden, da die Hitze der Flamme den für seine Funktionsfähigkeit wesentlichen Luftstrom stört.

    Ordnen Sie alle für das Verfahren benötigten Materialien auf dem Labortisch in der Nähe des sterilen Feldes an. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien richtig gekennzeichnet sind. Die Organisation des Arbeitsbereichs, um die Arbeitseffizienz zu maximieren und unnötige Bewegungen zu vermeiden, minimiert die Expositionszeit von experimentellen Materialien gegenüber luftgetragenen Verunreinigungen.

    Stellen Sie den Bunsenbrenner rechts von Ihnen auf die Werkbank.

    Platzieren Sie Agarplatten oder Petrischalen zu Ihrer Linken.

    Ordnen Sie Zellkulturen, Röhrchen, Flaschen und Flaschen in der Mitte der Bank an.

    Lösen Sie die Kappen von Röhrchen, Flaschen und Flaschen, damit sie bei späteren Manipulationen leicht mit einer Hand geöffnet werden können.

    Vor dem Umgang mit Mikroorganismen Hände gründlich mit antiseptischer Seife und warmem Wasser waschen.

    2. Streak-Plate-Verfahren: Isolierung von Bakterienkolonien mit der Quadranten-Methode

    Das Streak-Plate-Verfahren wurde entwickelt, um Reinkulturen von Bakterien oder Kolonien aus gemischten Populationen durch einfache mechanische Trennung zu isolieren. Einzelne Kolonien bestehen aus Millionen von Zellen, die in einem Cluster auf oder innerhalb einer Agarplatte wachsen (Abbildung 1). Eine Kolonie ist im Gegensatz zu einer einzelnen Zelle mit bloßem Auge sichtbar. Theoretisch stammen alle Zellen in einer Kolonie von einem einzigen Bakterium ab, das ursprünglich auf der Platte abgelagert wurde, und werden daher als Klon oder Cluster genetisch identischer Zellen bezeichnet.

    Bakterien existieren in einer Vielzahl von Formen und Größen. Zum Beispiel individuell Escherichia coli Zellen sind stäbchenförmig mit einer durchschnittlichen Länge von 2 μm und einer Breite von 0,5 μm, während Streptokokken Zellen sind kugelförmig mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1 μm. Einige Bakterien (wie z E coli) existieren als einzelne Zellen, während andere unterschiedliche Assoziationsmuster bilden. Streptokokken, zum Beispiel paarweise wachsen oder Ketten oder Zellhaufen bilden. Es wird allgemein angenommen, dass eine einzelne Kolonie aus einer einzelnen Zelle entsteht, die einer binären Spaltung unterliegt. Diese Annahme gilt jedoch nicht für Bakterien, die natürlicherweise als Paare, Ketten oder Cluster existieren oder sich durch andere Mechanismen teilen. Wenn alternativ zu viele Bakterien ausplattiert werden, kann es zu einer Überlappung der Zellen kommen und die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass zwei oder mehr Bakterien eine scheinbar einzelne Kolonie bilden. Um diese Komplikationen bei der Beschreibung oder Auszählung von Bakterienkulturen, die auf einem festen Medium wachsen, zu vermeiden, werden Kolonien als Koloniebildende Einheiten (KBE).

    Beim Streak-Plate-Verfahren wird ein Zellgemisch auf der Oberfläche eines halbfesten Nährmediums auf Agarbasis in einer Petrischale so verteilt, dass immer weniger Bakterienzellen an weit voneinander entfernten Stellen auf der Oberfläche des Mediums abgelagert werden und entwickeln sich nach der Inkubation zu Kolonien. Das Quadrantenverfahren zur Isolierung einzelner Kolonien aus einem Zellgemisch wird hier beschrieben.

    Streak-Plating kann mit verschiedenen Instrumenten durchgeführt werden (Figur 2). Eine Metallschlaufe kann mehrfach wiederverwendet werden und wird für das Streak-Plating von Routinelaborstämmen verwendet. Einweg-Kunststoffschlaufen sind im Handel erhältlich und werden häufiger verwendet, wenn mit BSL-2-Stämmen in einer Biosicherheitswerkbank gearbeitet wird. Viele Forscher ziehen es vor, vorsterilisierte Einweg-Holzstäbchen oder flache Zahnstocher für die Streifenbeschichtung zu verwenden. Diese sind eine kostengünstige Alternative zu Einweg-Kunststoffschlaufen und können besonders nützlich sein, wenn Sie mit einer Umweltprobe wie Boden arbeiten, die wahrscheinlich sporenbildende Bakterien enthält.

    Vorsterilisierte Einwegstäbchen und Zahnstocher müssen nicht mit dem Bunsenbrenner abgeflammt werden, wodurch eine unnötige Aerosolisierung von sporenbildenden Bakterien und eine Kreuzkontamination von Laboroberflächen oder Agarplatten mit Sporen vermieden wird.

    Beschriften Sie den Rand des Bodens (nicht den Deckel) einer Agarplatte mit mindestens Ihrem Namen, dem Datum, der Art des Wachstumsmediums und der Art des Organismus, der auf dem Medium ausplattiert werden soll.

    Die Platten müssen ohne Kondensation am Deckel vollständig trocken und vor dem Streak-Plating auf Raumtemperatur vorgewärmt sein. Wenn die Platten bei 4 ଌ gelagert werden, entfernen Sie sie mehrere Stunden oder sogar einen Tag zuvor. Verteilen Sie sie in kleinen, versetzten Stapeln von nicht mehr als 2-3 Tellern und lassen Sie sie trocknen.

    Die Probe, aus der die Streak-Platte beimpft wird, kann entweder eine Zellsuspension in Brühe oder eine bestehende Kolonie von einer anderen Agarplatte sein. Zu Beginn wird empfohlen, nur eine Probe zum Beimpfen einer einzelnen Platte zu verwenden. Um Zeit und Material zu sparen, kann eine einzelne Platte für mehrere Proben verwendet werden, jedoch erst, wenn Sie mit dem Ausstreichen einer Probe auf einer Platte vertraut sind.

    Für den ersten Quadranten wird die Probe aufgenommen und mit einer schnellen, glatten Hin- und Herbewegung über etwa ein Viertel der Oberfläche des Mediums verteilt (Tafel A von Figur 3). Heben Sie die untere Hälfte einer umgedrehten Platte von der Bank. Bewegen Sie die Schlinge, den Stab oder den Zahnstocher viele Male über die Agaroberfläche vom Rand zur Mitte der Platte hin und her.

    Wenn das Inokulum eine Zellsuspension ist, eine Schlinge voll mit einer Metallschlinge oder 5 bis 10 μl mit einer Mikropipette entnehmen. Achten Sie darauf, die Zellsuspension zu schwenken oder zu verwirbeln, bevor Sie ein Aliquot zum Ausplattieren entnehmen. Verwenden Sie bei diesem Schritt eine aseptische Technik, und brennen Sie nicht nur die Schlaufe, sondern auch den Rand der Flasche oder des Röhrchens vor und nach dem Entfernen des Inokulums. Berühren Sie auch nicht die Seiten des Röhrchens oder der Flasche mit der Schlaufe oder dem Zylinder der Mikropipette. Beim Pipettieren des Inokulums die Zellsuspension auf die entsprechende Stelle auf der Platte verteilen und dann mit einer Schlaufe, einem Stäbchen oder einem Zahnstocher über den ersten Quadranten der Platte verteilen.

    Wenn das Inokulum eine Kolonie von einer anderen Platte ist, berühren Sie die Kolonie vorsichtig mit der Schlinge, dem Stab oder dem Zahnstocher und verteilen Sie es dann über den ersten Quadranten der Platte. Stellen Sie sicher, dass die Metallschlaufe abgekühlt ist, bevor Sie die Kolonie berühren. Um sicherzustellen, dass die Schlinge nicht zu heiß ist, berühren Sie sie leicht auf der Agarplatte in einem dafür vorgesehenen Bereich, wo keine Streifen entstehen. Von der Kolonie werden nur wenige Zellen benötigt, nicht die gesamte Kolonie.

    Wenn Sie eine Metallschleife verwenden, flammen Sie diese mit einem Bunsenbrenner ab, bevor Sie das Inokulum für die Platte erhalten (Tafel B von Figur 3). Beginnen Sie etwa 3-4 Zoll von der Schlaufe entfernt, mit dem Draht in der Spitze des blauen Kegels, dem heißesten Teil der Flamme. Das Metall sollte rotglühend werden. Bewegen Sie den Draht so, dass sich die Flamme der Schlaufe nähert. Diese Manipulation verhindert die Aerosolisierung von Bakterien, die von der vorherigen Verwendung auf der Schleife zurückgeblieben sind.

    Flammen tötet die Bakterien (jedoch keine Sporen) ab und Konvektionsströme aus der erhitzten Luft verhindern, dass sich andere luftgetragene Verunreinigungen bei nachfolgenden Manipulationen auf dem Metalldraht absetzen.

    Wenn Sie einen sterilen flachen Zahnstocher verwenden, halten Sie das schmale Ende vorsichtig zwischen Daumen und Ringfinger in einem Winkel von 10 bis 20° zum Medium und verwenden Sie das breite Ende, um die Quadranten auszustreichen. Wenn Sie eine Schlaufe oder einen Holzstab verwenden, halten Sie ihn wie einen Bleistift im gleichen Winkel. Drücken Sie nicht so fest, dass sich die Schlinge, der Stab oder der Zahnstocher in den Agar eingraben.

    Nachdem Sie den ersten Quadranten fertiggestellt haben, drehen Sie die Platte um und legen Sie sie wieder in den Deckel auf der Bank. Entsorgen Sie den Stock oder Zahnstocher oder entzünden Sie die Metallschlaufe erneut, wie in Schritt 4 beschrieben.

    Drehen Sie die Petrischale um 90 °, um den zweiten Quadranten auszustreichen. Heben Sie die untere Hälfte einer umgedrehten Platte von der Bank und berühren Sie dann die Schlaufe, den Stock oder den Zahnstocher am ersten Quadranten nahe dem Ende des letzten Streifens. Verwenden Sie das Hin- und Her-Muster, überqueren Sie die letzte Hälfte der Streifen im ersten Quadranten und bewegen Sie sich dann in den leeren zweiten Quadranten. Drehen Sie die Platte um und legen Sie sie wieder in den Deckel auf der Bank ab, sobald der zweite Quadrant gefüllt ist.

    Die Schlinge, der Stab oder der Zahnstocher sollten niemals in die erste Hälfte der Streifen im ersten Quadranten zurückkehren, wo der größte Teil des ursprünglichen Inokulums abgelagert wurde.

    Für jeden Quadranten sollte eine neue Plastikschlaufe, Holzstab oder Zahnstocher verwendet werden.

    Wiederholen Sie Schritt #6 zweimal für den dritten und vierten Quadranten.

    Stellen Sie sicher, dass Sie den Stock oder Zahnstocher entsorgen oder die Metallschlaufe zwischen jedem Quadranten erneut entzünden.

    Vermeiden Sie es, in den ersten Quadranten zu gehen, wenn Sie den vierten Quadranten streichen.

    Inkubieren Sie die Platte kopfüber, damit sich auf dem Deckel ansammelndes Kondenswasser nicht auf die Kolonien tropft.

    3. Plattengießverfahren: Auszählung von Bakterienzellen in einer gemischten Probe

    Dieses Verfahren wird häufig verwendet, um die Anzahl der Mikroorganismen in einer gemischten Probe zu zählen, die vor der Verfestigung zu einem geschmolzenen Agarmedium gegeben wird. Das Verfahren führt zu Kolonien, die gleichmäßig über das gesamte feste Medium verteilt sind, wenn die entsprechende Probenverdünnung ausplattiert wird. Diese Technik wird verwendet, um lebensfähige Plattenzählungen durchzuführen, bei denen die Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten innerhalb des Agars und auf der Oberfläche des Agars auf einer einzelnen Platte gezählt wird. Die Zählung lebensfähiger Platten bietet Wissenschaftlern ein standardisiertes Mittel zur Erstellung von Wachstumskurven, zur Berechnung der Zellkonzentration in dem Röhrchen, aus dem die Probe ausplattiert wurde, und zur Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Umgebungen oder Wachstumsbedingungen auf das Überleben oder die Wachstumsrate von Bakterienzellen.

    Beschriften Sie den Rand des Bodens (nicht den Deckel) einer sterilen, aber leeren Petrischale mit mindestens Ihrem Namen, dem Datum, der Art des Nährmediums und der Art des Organismus, der dem geschmolzenen Agar-Medium hinzugefügt werden soll.

    Berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor beim Plattieren serielle Verdünnungen, oder eine Reihe wiederholter Verdünnungen, was zu einer systematischen Verringerung der Zellkonzentration in der Probe führt. Die Herstellung von Verdünnungsreihen ist erforderlich, wenn die Zellzahl in der Probe die Kapazität der Agarplatte überschreitet, wobei der statistisch signifikante Bereich 30 bis 300 KBE beträgt. Bei mehr als 300 KBE auf einem Teller sind die Kolonien überfüllt und überlappen sich.

    Besorgen Sie sich ein Röhrchen mit 18 ml geschmolzenem Agarmedium.

    Das Agarmedium sollte in Teströhrchen abgefüllt und in einem Autoklaven vorsterilisiert werden. Am selben Tag, an dem es für ein Experiment benötigt wird, sollte der Agar 30 Minuten in einem Dampfgarer geschmolzen und dann in ein 55 °C warmes Wasserbad überführt werden. Es sollte nur so viel Agar aufgeschmolzen werden, wie für den Versuch benötigt wird, da dieser nicht wiederverwendet werden kann.

    Zehn Minuten vor dem Gießen der Platten sollten die Röhrchen mit geschmolzenem Agar aus dem 55 °C warmen Wasserbad in einen auf 48 °C eingestellten Wärmeblock auf dem Labortisch überführt werden. Sobald der Agar diese Temperatur erreicht hat, kann er gegossen werden. Wenn der Agar zu heiß ist, können die Bakterien in der Probe abgetötet werden. Wenn der Agar zu kühl ist, kann das Medium nach dem Erstarren klumpig sein.

    Besorgen Sie sich Ihre Probe, die entweder eine Brühekultur oder eine Zellsuspension sein sollte, die durch Mischen von Zellen aus einer Kolonie in Puffer oder Kochsalzlösung hergestellt wird.

    Die Proben können aus einer Verdünnungsreihe einer einzelnen Probe stammen.

    Das zu plattierende Probenvolumen sollte zwischen 0,1 und 1,0 ml liegen.

    Öffnen Sie den Deckel der leeren Petrischale und geben Sie Ihre Probe in die Mitte der Platte (Panel A von Figur 4). Mach den Deckel zu.

    Verwenden Sie während dieses Verfahrens eine aseptische Technik.

    Verwenden Sie entweder eine serologische Pipette oder eine Mikropipette, um Ihre Probe auf die Platte zu übertragen. Kontrollieren Sie den Probenfluss, damit sie nicht aus der Platte herausspritzt.

    Entfernen Sie die Kappe vom Röhrchen des geschmolzenen Agars und führen Sie den Rand des offenen Röhrchens durch die Flamme des Bunsenbrenners.

    Öffnen Sie den Deckel der Petrischale mit Ihrer Probe und gießen Sie den Agar vorsichtig hinein (Tafel B von Figur 4). Schließen Sie den Deckel und mischen Sie die Probe mit dem Agar, indem Sie die Platte vorsichtig schwenken.

    Lassen Sie den Agar vollständig erstarren, bevor Sie die Platte zur Inkubation umdrehen.

    4. Plattenausbreitungsverfahren: Bildung diskreter Bakterienkolonien für Plattenzählung, Anreicherung, Selektion oder Screening

    Diese Technik wird typischerweise verwendet, um Mikroorganismen zu trennen, die in einem kleinen Probenvolumen enthalten sind, das über die Oberfläche einer Agarplatte verteilt wird, was zur Bildung von diskreten Kolonien führt, die gleichmäßig über die Agaroberfläche verteilt sind, wenn die entsprechende Konzentration an Zellen ausplattiert wird. Zusätzlich zur Verwendung dieser Technik für die Zählung lebensfähiger Platten, bei der die Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten auf einer einzelnen Platte gezählt und zur Berechnung der Zellkonzentration in dem Röhrchen verwendet wird, aus dem die Probe ausplattiert wurde, wird routinemäßig das Ausstreichen verwendet in Anreicherungs-, Selektions- und Screening-Experimenten. Das gewünschte Ergebnis für diese drei Experimente ist normalerweise das gleiche wie bei der Plattenzählung, bei der sich eine Verteilung diskreter Kolonien über die Oberfläche des Agars bildet. Das Ziel ist jedoch nicht, sicherzustellen alle lebensfähige Zellen bilden Kolonien. Stattdessen sollten nur diejenigen Zellen innerhalb einer Population wachsen, die einen bestimmten Genotyp aufweisen. Das Plattenausbreitungsverfahren kann für ein Auszählungsexperiment gegenüber der Gießplattentechnik verwendet werden, wenn das Endziel darin besteht, Kolonien für die weitere Analyse zu isolieren, da Kolonien zugänglich auf der Agaroberfläche wachsen, während sie beim Gießplattenverfahren in den Agar eingebettet werden.

    Es gibt zwei hier beschriebene Strategien für das Streuplattenverfahren. Die erste (Methode A) beinhaltet die Verwendung eines Plattenspielers und einer Glas- oder Metallstange in Form eines Hockeyschlägers. Bei der zweiten Methode (Methode B), die als "Copacabana-Methode" bezeichnet wird, werden vorsterilisierte Glasperlen geschüttelt. Beide erleichtern die gleichmäßige Verteilung der Zellen über die Agaroberfläche.

    Methode A: Auftragen mit einem Drehteller und einem Glas- oder Metallstab

    Beschriften Sie den Rand des Bodens (nicht den Deckel) einer Agarplatte mit mindestens Ihrem Namen, dem Datum, der Art des Wachstumsmediums und der Art des Organismus, der auf dem Medium ausplattiert werden soll.

    Berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor beim Plattieren serielle Verdünnungen.

    Die Platten müssen ohne Kondensation am Deckel vollständig trocken und vor dem Streichen auf Raumtemperatur vorgewärmt sein. Wenn die Platten bei 4 ଌ gelagert werden, entfernen Sie sie mehrere Stunden oder sogar einen Tag zuvor. Verteilen Sie sie in kleinen, versetzten Stapeln von nicht mehr als 2-3 Tellern und lassen Sie sie trocknen.

    Zentrieren Sie die Platte auf dem Drehteller (Abbildung 5).

    Besorgen Sie sich Ihre Probe, bei der es sich um eine Kulturbrühe oder eine Zellsuspension handeln sollte, die durch Mischen von Zellen einer Kolonie in Puffer oder Kochsalzlösung hergestellt wird.

    Die Proben können aus einer Verdünnungsreihe einer einzelnen Probe stammen.

    Das zu plattierende Probenvolumen sollte zwischen 0,1 und 0,2 ml liegen.

    Öffnen Sie den Deckel der Petrischale und geben Sie Ihre Probe auf die Mitte des Agars. Mach den Deckel zu.

    Verwenden Sie während dieses Verfahrens eine aseptische Technik.

    Verwenden Sie eine Mikropipette, um Ihre Probe auf die Platte zu übertragen. Kontrollieren Sie den Probenfluss, damit sie nicht aus der Platte herausspritzt.

    Tauchen Sie den Glasstab oder Metallstab (auch Spreizer genannt) in ein Becherglas mit 70 % (v/v) Ethanol.

    ACHTUNG: Tauchen Sie niemals einen heißen Streuer in ein Becherglas mit Alkohol.

    Das Ethanol darf nur den unteren Teil des Streuers und den ersten Zoll des Stiels berühren.

    Lassen Sie überschüssiges Ethanol ab und entzünden Sie es, indem Sie es durch die Flamme eines Bunsenbrenners führen.

    Die Flamme sollte sich über die Länge des Streuers und des Stiels erstrecken, die mit dem Ethanol in Kontakt gekommen sind, und dann schnell erlöschen.

    Sollte der Ethanolbecher Feuer fangen, keine Panik! Legen Sie eine Glasabdeckung über den Becher, die das Feuer schnell löschen wird.

    Öffnen Sie den Deckel der Agarplatte, indem Sie den Deckel mit Daumen und Zeigefinger in der linken Hand halten. Kühlen Sie den Streuer ab, indem Sie ihn am Rand in der Nähe des Randes mit dem Agar berühren.

    Berühren Sie nicht den Agar, wo die Zellen hinzugefügt wurden. Der heiße Spreizer tötet die Zellen ab.

    Drehen Sie mit der linken Hand (während Sie immer noch den Deckel der Agarplatte halten) den Drehteller langsam.

    Obwohl es am besten zu vermeiden ist, legen Sie den Deckel, wenn Sie ihn ablegen müssen, mit der Vorderseite nach unten auf eine desinfizierte Oberfläche im sterilen Bereich des Bunsenbrenners. Bei einem nach oben gerichteten Deckel besteht eine größere Wahrscheinlichkeit einer Kontamination durch Bewegungen von Gegenständen oder Händen, wodurch Luftströme entstehen, die dazu führen, dass Mikroorganismen und Staubpartikel auf die Innenseite des Deckels absinken.

    Halten Sie den Streuer mit der rechten Hand leicht auf die Oberfläche des Agars und verteilen Sie die Probe nach und nach gleichmäßig über die gesamte Platte. Bewegen Sie den Spreizer über die Platte hin und her, während sich der Drehteller dreht.

    Lassen Sie die Probe gründlich absorbieren (mindestens 5 Minuten), bevor Sie die Platte zur Inkubation umdrehen.

    Methode B: Streichplattieren mit Glasperlen: die "Copacabana-Methode"

    Beschriften Sie den Rand des Bodens (nicht den Deckel) einer Agarplatte mit mindestens Ihrem Namen, dem Datum, der Art des Wachstumsmediums und der Art des Organismus, der auf dem Medium ausplattiert werden soll.

    Berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor beim Plattieren serielle Verdünnungen.

    Öffnen Sie den Deckel der Agarplatte, indem Sie den Deckel mit Daumen und Zeigefinger in der linken Hand halten. Öffnen Sie dann das Glasröhrchen oder die Flasche mit den vorsterilisierten Glasperlen. Flammen Sie mit der rechten Hand den Rand des Röhrchens oder der Flasche ab und geben Sie dann vorsichtig 10-12 sterile Glasperlen auf eine Agarplatte (Abbildung 6). Schließen Sie den Deckel des Tellers und flammen Sie den Rand des Röhrchens oder der Flasche erneut ab, bevor Sie den Verschluss aufsetzen und beiseite legen.

    Gießen Sie die Kügelchen vorsichtig einige Zentimeter über dem Agar aus dem Röhrchen oder der Flasche, damit die Kügelchen nicht aus der Petrischale herausspringen.

    Verwenden Sie Glasperlen mit einem Durchmesser von 4 mm. Sterilisieren Sie sie in Glasflaschen oder Reagenzgläsern im Autoklaven bei 121 °C im Trockenzyklus (Schwerkrafteinstellung) für 30 Minuten.

    Ein Vorteil der Verwendung von Perlen anstelle eines Streuers besteht darin, dass keine offenen Behälter mit Ethanol zum wiederholten Abflammen erforderlich sind.

    Öffnen Sie den Deckel der Agarplatte und geben Sie Ihre Probe auf die Mitte des Agars. Mach den Deckel zu.

    Verwenden Sie während dieses Verfahrens eine aseptische Technik.

    Aliquot 100 bis 150 μl Probe pro Platte. Dieses Volumen erleichtert die gleichmäßige Verteilung der Zellen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um Ihre Probe auf die Platte zu übertragen. Kontrollieren Sie den Probenfluss, damit sie nicht aus der Platte herausspritzt.

    Verteilen Sie die Probe, indem Sie die Perlen 6 bis 7 Mal vorsichtig über die Oberfläche des Agars schütteln. Um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig verteilen, verwenden Sie eine horizontale Schüttelbewegung.

    Verwirbeln Sie die Perlen nicht, sonst landen alle Zellen am Plattenrand.

    HINWEIS: Bei richtiger Ausführung klingt die Prozedur wie "Maracas schütteln".

    Drehen Sie die Platte um 60° und schütteln Sie sie dann noch einmal 6 bis 7 Mal horizontal.

    Drehen Sie die Platte ein zweites Mal um 60° und schütteln Sie sie erneut horizontal. Inzwischen sollten Sie eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Agaroberfläche erreichen.

    Nach Beendigung des Ausstreichens sollte die Probe absorbiert werden und die Oberfläche des Agars sollte trocken sein. Gießen Sie die kontaminierten Perlen in einen gekennzeichneten Sammelbecher mit 10 % Chlorbleiche.

    Werfen Sie die Perlen nicht in den Müll! Die gebrauchten Kügelchen werden gespült und autoklaviert, um sie für die wiederholte Verwendung erneut zu sterilisieren.

    HINWEIS: Wenn die Agaroberfläche nach dreimaligem Schütteln noch feucht ist, lassen Sie die Platte einige Minuten ruhen, damit die Flüssigkeit vom Agar absorbiert werden kann, und wiederholen Sie dann die Schritte #4-6, bis die Plattenoberfläche trocken erscheint.

    Drehen Sie die Platte zur Inkubation um.

    5. Weichagar-Overlay-Verfahren: Bildung von Plaques zur Isolierung und Auszählung von Phagen (Plaque-Assay)

    Diese Technik wird häufig verwendet, um Bakteriophagen (Phagen) oder bakterielle Viren mit einer Größe von 100 bis 200 nm nachzuweisen und zu quantifizieren. Ein Elektronenmikroskop wird benötigt, um einzelne Phagenpartikel zu sehen. Das Vorhandensein von infektiösen Phagenpartikeln kann jedoch als Plaketten auf einer Agarplatte (Abbildung 7A). Phagen können sich außerhalb ihrer bakteriellen Wirtszellen nicht replizieren, daher erfordert die Vermehrung und der Nachweis das Zusammenmischen von Phagen und Wirtszellen vor dem Ausplattieren. Für das Weichagar-Overlay-Verfahren wird ein kleines Volumen, im Allgemeinen im Bereich von 50 μl bis 200 μl, einer Phagensuspension in ein Röhrchen gegeben, das etwa 10 8 Bakterien (Wirtszellen) enthält, die gleichmäßig in 2,5 Zoll dispergiert sind -3,0 ml weicher (0,5 bis 0,7% [w/v]), geschmolzener Nähragar. Die resultierende Mischung wird über die Oberfläche einer harten (1,5 bis 1,9% [w/v]) Nähragarplatte gegossen. Die Platte wird ausreichend geschüttelt, um sicherzustellen, dass der Weichagar die gesamte Oberfläche des Hartagars bedeckt. Anschließend wird die Platte auf eine ebene Unterlage gestellt, bis die oberste Agarschicht erstarrt ist und anschließend in den Brutschrank gestellt werden kann.

    Im Laufe der Zeit bildet sich eine trübe Suspension von Bakterienzellen, die als a . bezeichnet wird Rasen, wird im gesamten Weichagarmedium sichtbar (Abbildung 7B). Plaques bilden sich, wenn ein Phagen eine der Bakterienzellen infiziert, sich innerhalb der Zelle repliziert, dann die Zelle lysiert und bis zu 100 Nachkommen-Phagen (auch bekannt als die Burstgröße). Die neuen Phagenpartikel diffundieren in den Weichagar und infizieren Bakterien in der Umgebung der lysierten Bakterienzelle. Nach mehreren Infektions- und Lysezyklen verschwindet die trübe Bakterienzellsuspension im Weichagar und hinterlässt eine Ablagerungszone, die als Plaque bezeichnet wird. Jeder Plaque enthält mehr als 10 9 Phagenpartikel, die alle genetisch identisch mit dem ursprünglichen infektiösen Phagenpartikel sind. Da ein Plaque aus einem einzelnen Phagenpartikel entsteht, ist die resultierende Anzahl von Plaquebildende Einheiten (pfu) gezählt werden und die ursprüngliche Konzentration, oder Titer, der Phagensuspension berechnet werden. Diese Art von Experiment, genannt Plaque-Assay, bietet Wissenschaftlern auch ein standardisiertes Mittel, um einstufige Wachstumskurven zu erstellen, die Spezifität des Wirtsbereichs zu untersuchen und Bakterienzellen für genetische Experimente zu transduzieren.

    Bereiten Sie die Indikatorbakterien vor: Für das Weichagar-Overlay-Experiment muss eine exponentiell wachsende Kultur des bakteriellen Wirtsstamms hergestellt werden. Jeder Wirt hat seine eigenen Wachstumsanforderungen. Für jede Platte werden zwischen 0,3 ml und 0,5 ml einer Suspension von Indikatorbakterien benötigt. Wenn ein Kolben mit Indikatorbakterien vorbereitet wird (z. B. 25 ml), sollte die Kultur in kleinere Aliquots (z. B. 5-ml-Aliquots in sterile Röhrchen mit Schraubverschluss) aufgeteilt werden, um die Möglichkeit einer Kreuzkontamination zu minimieren.Die Röhrchen können bis zur Verwendung im Experiment auf Eis (bei 4 °C) aufbewahrt werden. Sterile Nährbrühe unter aseptischen Bedingungen beimpfen und dann gemäß den Spezifikationen des Bakterienstamms inkubieren. Restkulturen sollten am Ende des Tages verworfen werden.

    Adsorptionsröhrchen vorbereiten: Legen Sie zwei sterile Mikrozentrifugenröhrchen in ein Gestell. Beschriften Sie den Deckel des ersten Röhrchens mit „Phage“ und den Deckel des zweiten Röhrchens mit „Control“.

    Normalerweise serielle Verdünnungen von Phagenlysaten werden hergestellt und ausplattiert, wobei in diesem Fall zusätzliche Mikrozentrifugenröhrchen zum Gestell hinzugefügt und mit dem Verdünnungsfaktor gekennzeichnet werden.

    Phagenvorräte sollten frisch aus einzelnen Plaques hergestellt und bei 4 °C gelagert werden. Um Phagenpartikel aufzulösen, sollten die Vorräte vor der Durchführung eines Experiments auf Umgebungstemperatur erwärmt werden.

    Phagenbestände sollten vorsichtig gehandhabt werden - nicht kräftig vortexen oder pipettieren.

    Geben Sie 50 μl Ihrer Phagenprobe in das erste Röhrchen und dann 50 μl Phagenpuffer in das zweite Röhrchen, das als Negativkontrolle für den Plaque-Assay dient.

    Verwenden Sie bei allen Manipulationen von Phagen und Bakterien eine aseptische Technik.

    Geben Sie als nächstes 500 μl Indikatorbakterien in jedes Adsorptionsröhrchen.

    Bakterienzellen setzen sich am Boden eines Röhrchens ab, wenn Sie längere Zeit auf Eis oder der Bank sitzen. Wenn die Kultur vor der Entnahme eines Aliquots für das Experiment nicht gemischt wird, werden nicht genügend Bakterienzellen in das Adsorptionsröhrchen übertragen. Es muss eine ausreichende Anzahl von Bakterienkolonien im Weichagar (d. h. einem Rasen) zum Nachweis von Plaques gebildet werden. Verwenden Sie einen Vortex-Mischer, um die Indikatorbakterien vorsichtig zu einer homogenen Suspension zu resuspendieren, bevor Sie Aliquots in die Adsorptionsröhrchen überführen.

    Mischen Sie die Bakterienzellen und den Phagen, indem Sie die Röhrchen vorsichtig bewegen.

    Inkubieren Sie das Phagen/Bakterien-Gemisch für 15-20 Minuten (nicht länger als 30 Minuten) bei einer Temperatur, die für den Indikatorstamm geeignet ist.

    Nährweichagar und Hartagarplatten vorbereiten: Stellen Sie während der Adsorption zwei Weichagarröhrchen (zuvor geschmolzen und bei 55 °C gelagert) in einen Heizblock an Ihrem Labortisch, der auf 46-48 °C eingestellt ist.

    Der geschmolzene Weichagar muss für 10-15 Minuten an die Temperatur des Heizblocks angeglichen werden. Wenn der geschmolzene Weichagar länger als 15 Minuten ruht, beginnt er sich zu verfestigen und verklumpt, wenn er auf den Hartagar gegossen wird. Wenn der geschmolzene Weichagar weniger als 10 Minuten ruht, wird er zu heiß, wenn er dem Phagen/Bakterien-Gemisch zugesetzt wird, wodurch die Wirtszellen vor dem Ausplattieren abgetötet werden. Folglich kann es sein, dass sich kein Rasen bildet und wenige oder keine Plaques nachweisbar sind.

    Bereiten Sie zusätzliche Weichagarröhrchen vor, wenn Sie serielle Verdünnungen des Phagenlysats plattieren.

    Beschriften Sie den Bodenrand (nicht den Deckel) von zwei Nähr-Hartagar-Platten mit mindestens Ihrem Namen, dem Datum, der Art des Nährmediums und "Phage" oder "Kontrolle" entsprechend den Adsorptionsröhrchen.

    Fügen Sie zusätzliche Platten hinzu, die mit dem Verdünnungsfaktor gekennzeichnet sind, wenn Sie Reihenverdünnungen ausplattieren.

    Die Hartagarplatten müssen vor der Zugabe des Weichagars vollständig trocken ohne Kondensation am Deckel und auf Raumtemperatur vorgewärmt sein. Wenn die Platten bei 4 ଌ gelagert werden, entfernen Sie sie mehrere Stunden oder sogar einen Tag zuvor. Verteilen Sie sie in kleinen, versetzten Stapeln von nicht mehr als 2-3 Tellern und lassen Sie sie trocknen. Übermäßige Feuchtigkeit in der Hartagarschicht führt zu einer Verdünnung des Weichagars, wodurch Phagen während der Plaquebildung leichter durch den Weichagar diffundieren können. Folglich nimmt die Plaquegröße zu.

    Platten eines Adsorptionsröhrchens nacheinander wie folgt: Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um die Phagen/Bakterien-Mischung (sollte ungefähr 550 μl) aseptisch in ein Weichagarröhrchen zu überführen und dann schnell zwischen den Handflächen zu drehen, um den Inhalt zu mischen. Schütteln Sie das Röhrchen NICHT, damit Luftblasen entstehen. Halten Sie das Röhrchen in der linken Hand, öffnen Sie mit der rechten Hand den Deckel einer Hartagarplatte und sofort Gießen Sie den gesamten Inhalt des Röhrchens auf die Oberfläche einer Hartagarplatte. Schütteln Sie die Platte vor dem Schließen des Deckels leicht, aber schnell, um den geschmolzenen Weichagar über die gesamte Oberfläche der Platte zu verteilen, bevor er Zeit zum Erstarren hat. Vermeiden Sie es, den geschmolzenen Weichagar auf die Seiten der Petrischale zu spritzen. Mach den Deckel zu.

    Wiederholen Sie Schritt 9 für alle Adsorptionsröhrchen, ein rohr auf einmal.

    Stellen Sie die Platten auf eine ebene Fläche und lassen Sie sie ungestört stehen, bis der Weichagar verfestigt ist.

    In der Regel sind 30 Minuten ausreichend.

    Drehen Sie die Platten für die Inkubation um.

    Mehrere Platten können gestapelt und zusammengeklebt und dann zur Inkubation umgedreht werden.

    Nach der Inkubation können die Platten auf Plaques untersucht werden. Die Negativkontrolle sollte nur einen Bakterienrasen aufweisen (keine Löcher, die auf Plaques hinweisen). Plaketten unterscheiden sich in Größe, Form und Gesamterscheinung. Ein bestimmter Phagentyp kann aus einem heterogenen Gemisch von Plaques isoliert werden, indem die Mitte eines Plaques vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher ausgestanzt und das Inokulum in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 bis 1000 µl Brühe oder Phagenpuffer überführt wird. Dieses Lysat kann unter Verwendung des gleichen oben beschriebenen Verfahrens plattiert werden. Mindestens 3 bis 6 aufeinanderfolgende Einzelplaque-Isolierungen sind erforderlich, um sicherzustellen, dass ein reiner Phagen erhalten wurde. Oft muss das Lysat über einen großen Bereich (10 –1 bis 10 –10 ) verdünnt werden, um einen Titer zu finden, der nicht überlappende Plaques auf einer Platte erzeugt. Die Anzahl variiert je nach Größe der Plakette.

    6. Replikatplattenverfahren: Transfer von Zellen zum Screening von Mutanten und Auxotrophen

    Diese Technik ermöglicht den Vergleich des Zellwachstums auf einer Primärplatte mit Sekundärplatten, wodurch ein Mittel zum Screenen von Zellen auf einen selektierbaren Phänotyp erzeugt wird. Zuerst wird eine Primär- oder Masterplatte mit Zellen beimpft, entweder durch Ausstreichen einer Verdünnung, die einzelne Kolonien erzeugt, oder indem sie in einem durch Gittermarkierungen spezifizierten räumlichen Muster auf eine Platte übertragen werden. Sekundärplatten, die Medien mit Wachstumsinhibitoren oder Medien enthalten, denen ein bestimmter Nährstoff fehlt, werden mit Zellen aus Kolonien auf der Primärplatte beimpft. Das räumliche Muster der Kolonien wird zuerst reproduziert, indem ein Stück Samt auf die Primärplatte gedrückt wird. Bakterienzellen haften am Samt, weil sie eine größere Affinität zum Samt haben als zum Agar. Der Abdruck der Zellen auf dem Samt wird dann auf mehrere Sekundärplatten übertragen, wobei das Zellwachstum das gleiche Koloniemuster wie das der Primärplatte widerspiegelt. Mit anderen Worten, es ist wie mit einem Stempel, der das Wachstumsmuster von einer Platte zur anderen reproduziert. Diese Technik ist vorteilhaft, da sie es ermöglicht, eine relativ große Anzahl von Kolonien gleichzeitig auf viele Phänotypen in einem einzigen Experiment zu durchmustern.

    Primärplatte vorbereiten: Beschriften Sie den Rand des Bodens (nicht den Deckel) einer Agarplatte mit mindestens Ihrem Namen, dem Datum und der Art des Nährmediums.

    Markieren Sie auf der Unterseite der Platte ein Raster mit mindestens zwei gleichmäßig verteilten vertikalen Linien und mindestens zwei gleichmäßig verteilten horizontalen Linien. Nummeriere die resultierenden Quadrate.

    Verwenden Sie einen vorsterilisierten Zahnstocher, um jedes Quadrat mit einer Zellprobe zu beimpfen. Tupfen Sie für jede Probe die Mitte des Quadrats ab. Bedecken Sie nicht das gesamte Quadrat mit Zellen (Abbildung 8) oder die Probe wird beim Inkubieren überwachsen und die umliegenden Quadrate kontaminieren.

    Jedes Quadrat wird mit einer anderen Probe beimpft, die entweder aus Brühenkulturen oder Kolonien auf einer anderen Platte stammt.

    Die Primärplatte, die zum Beimpfen verschiedener Sekundärmedien verwendet wird, umdrehen und inkubieren.

    Sekundärplatten beimpfen: Stapeln Sie die Primärplatte und alle Sekundärplatten. Machen Sie mit einem Marker eine Orientierungsmarkierung an der Seite der Platten. Stellen Sie sicher, dass sich die Markierung auf der Unterseite jedes Tellers befindet, nicht auf dem Deckel.

    Besorgen Sie sich ein steriles Samttuch und legen Sie es auf den zylindrischen Block (Abbildung 9). Verriegeln Sie das Samttuch mit dem Halter. Beachten Sie die Orientierungsmarkierung auf dem Block.

    Der Block sollte die gleiche Größe wie der Boden einer Petrischale haben (10,2 cm Durchmesser). Es sollte mit einem Sicherungsring geliefert werden, der das Samttuch während der Replikatbeschichtung am Block festklemmt.

    Das Samttuch (15,2 x 15,2 cm im Quadrat) muss vorsterilisiert werden. Stapeln Sie 10 oder 12 saubere Quadrate, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie ein und legen Sie sie dann bei 121 °C im Trockenzyklus (Schwerkrafteinstellung) für 30 Minuten in den Autoklaven. Bevor Sie sie in einem Replika-Plattierungsexperiment verwenden, stellen Sie sicher, dass sie vollständig trocken sind, indem Sie sie mehrere Stunden in einen warmen Ofen stellen. Beachten Sie, dass Velourteen-Quadrate vor der Sterilisation möglicherweise mit Abdeckband entfilzt werden müssen.

    Samtquadrate können wiederverwendet werden. Nach der Dekontamination der gebrauchten Samtquadrate im Autoklaven sollten diese mit klarem Wasser gespült und wie oben beschrieben erneut sterilisiert werden.

    Der zylindrische Block und die Klemme sollten zwischen den Anwendungen mit einer kurzen Spülung in 70 % (v/v) Ethanol oder 10 % Chlorbleiche desinfiziert werden.

    Entfernen Sie den Deckel und drehen Sie die Primärplatte um. Richten Sie die Orientierungsmarkierung auf der Platte mit der Markierung auf dem Block aus. Senken Sie die Platte so ab, dass die Oberfläche des Agars das Samttuch des zylindrischen Blocks berührt. Drücken Sie mit den Fingerspitzen leicht, aber gleichmäßig auf die Rückseite der Primärplatte und heben Sie die Primärplatte dann vorsichtig vom Block ab. Setzen Sie den Deckel auf den Teller.

    Mit dem Samtabdruck von Zellen aus der Primärplatte können ca. 7-8 Sekundärplatten beimpft werden, bevor eine Abformung mit einem neuen Samt angefertigt werden muss.

    Wiederholen Sie Schritt #7 mit jeder der Sekundärplatten.

    Als Positivkontrolle sollte die letzte Platte in der Serie ein Agarmedium sein, in dem alle getesteten Stämme wachsen sollten. Auf diese Weise können Sie bestätigen, dass Zellen auf alle Sekundärplatten der Serie übertragen wurden. Andernfalls kann ein Mangel an Wachstum auf einem bestimmten Testmedium eher auf einen unzureichenden Zelltransfer als auf einen Phänotyp des Stamms zurückgeführt werden.

    Um Fehlalarme zu vermeiden, sollten die Sekundärplatten vom am wenigsten zum günstigsten Substrat bestellt werden. Andernfalls könnten Nährstoffe zwischen den Platten übertragen werden, wodurch Zellen auf einem ungünstigen Medium wachsen können.

    Platten umdrehen und inkubieren.

    Hinweis: Bei der Bewuchskontrolle der Sekundärplatten unbedingt zwischen Bewuchs und Abdruck unterscheiden. Letzteres ist ein negatives Ergebnis.

    7. Aufräumen des Arbeitsplatzes

    Schalten Sie den Bunsenbrenner aus und verstauen Sie dann alle Vorräte, einschließlich Kulturen auf Platten oder in Röhrchen, zusätzliche Medien und andere Reagenzien.

    Alte Kulturen, weder auf Platten noch in Röhrchen, auf dem Labortisch oder in Lagerräumen ansammeln lassen. Diese Proben, die notorische Kontaminationsquellen wie Schimmelpilze und unerwünschte Bakterienarten darstellen, sollten verworfen werden, sobald sie nicht mehr benötigt werden.

    Kontaminierte Laborgeräte (Handschuhe, Pipettenspitzen, Kimwipes), Glasgeräte (Röhrchen, Kolben, Flaschen) und gefährliche Abfälle (bakterielle Kulturen oder Phagenlösungen, gebrauchte Platten) in den entsprechenden Entsorgungsbehälter geben. Bei der Arbeit mit einem nicht-pathogenen E coli Stamm (BSL-1) wird nur nicht infektiöser Sondermüll erzeugt. Bei der Durchführung derselben Verfahren mit pathogenen Organismen (BSL-2 oder höher) wird infektiöser Sondermüll erzeugt. Unabhängig von der Einstufung als Biogefährdung müssen gefährliche Abfälle vor der Entsorgung autoklaviert oder desinfiziert werden. Befolgen Sie die im BMBL (5. Aufl.) beschriebenen Richtlinien sowie die Richtlinien Ihres Instituts für Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutz zur sofortigen und ordnungsgemäßen Entsorgung von Biogefährdungen, die während eines Experiments entstehen.

    Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionsmittel.

    Vor Verlassen des Labors Hände gründlich mit antiseptischer Seife und warmem Wasser waschen.

    8. Repräsentative Ergebnisse

    Streak-Plate-Technik. Eine Beispielanwendung für Streak-Plating ist in . gezeigt Abbildung 1. Dieses Verfahren wird zur Isolierung von Bakterienkolonien aus gemischten Zellkulturen verwendet und ist mit Abstand eine der wichtigsten Techniken, die es in der Mikrobiologie und Molekulargenetik zu beherrschen gilt. Jede Kolonie repräsentiert eine Population von Zellen, die genetisch identisch sind. Für viele nachgelagerte Anwendungen ist es zwingend erforderlich, entweder mit einer einzelnen Kolonie oder einer reinen Bakterienkultur zu beginnen, die durch Beimpfung von Medien mit Zellen einer einzelnen Kolonie erzeugt wird. Beispielsweise kann die Morphologie einzelner Zellen innerhalb einer Kolonie mit einem Lichtmikroskop untersucht werden. Die genetische Identität kann durch Sequenzieren des Gens der kleinen ribosomalen RNA-Untereinheit aus genomischer DNA, die aus einer Zellkultur isoliert wurde, die mit einer einzelnen Kolonie begonnen wurde, zugeordnet werden. Und metabolische Eigenschaften können beschrieben werden, indem Zellen verschiedenen biochemischen und physiologischen Assays unterzogen werden. Nur wenn man solche Versuche mit Reinkulturen durchführt, kann man sicher sein, welche Eigenschaften einem bestimmten Mikroorganismus zugeschrieben werden. Die Ergebnisse werden nicht durch die Möglichkeit einer Kontamination der Kultur getrübt. Technische Fehler können auftreten, wenn die Sterilität des zum Ausstreichen der Zellen auf der Platte verwendeten Instruments während des gesamten Verfahrens nicht aufrechterhalten wird. Wenn Sie vergessen, zwischen den Quadranten eine Schleife abzuflammen oder einen frischen Zahnstocher zu holen, ist es schwierig, einzelne Kolonien zu erhalten. Einige Bakterienarten können in Reinkultur nicht isoliert werden, da sie für bestimmte Wachstumsanforderungen auf eine kooperative Assoziation mit einer anderen Bakterienart angewiesen sind. Diese Organismen, die als Syntrophe bezeichnet werden, dürfen nur unter Co-Kulturbedingungen gezüchtet werden, so dass Kolonien (sofern gebildet) immer aus zwei oder mehr Arten bestehen. Eine weitere Herausforderung im Labor bei der Durchführung des Streak-Plate-Verfahrens mit Bakterien aus Umweltproben besteht darin, dass Zellen Wachstumsmerkmale aufweisen, die von herkömmlichen Laborstämmen abweichen, wie z E coli. Solche Bakterienstämme können filamentöse Kolonien (im Gegensatz zu dichten Zellhaufen) mit Verzweigungen bilden, die sich über einen großen Abschnitt einer Agarplatte ausbreiten, verkalkt und somit resistent gegen das Eindringen eines Streak-Platten-Instruments oder von einer klebrigen Kapsel umgeben sind so dass einzelne Kolonien nicht zu erkennen sind. Diese Eigenschaften machen es schwierig, einzelne Kolonien durch die Streak-Plate-Technik zu reinigen.

    Pour-Plate-Technik. Bei der Gießplattentechnik bilden sich die Kolonien sowohl innerhalb des Agars als auch auf der Oberfläche des Agarmediums, wodurch ein bequemes Mittel zum Zählen der Anzahl lebensfähiger Zellen in einer Probe bereitgestellt wird. Dieses Verfahren wird in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen verwendet. Zum Beispiel ist es für eine Kläranlage, die für die Reinigung von flüssigen Abfällen (z Proben nach dem aufwendigen Reinigungsprozess. Aufbereitetes Abwasser (Nicht-Trinkwasser) wird auf vielfältige Weise wiederverwendet - zur Bewässerung von Non-Food-Pflanzen in der Landwirtschaft, zur Sanitärspülung in Wohnhäusern und in industriellen Kühltürmen - und muss daher frei von chemischer und mikrobieller Kontamination sein. Trinkwasser (Trinkwasser) muss nach EPA-Standards gereinigt werden und wird mit mikrobiologischen Plattierungsverfahren getestet, die eine Zählung bestimmter humanpathogener Erreger ermöglichen. Gezeigt in Abbildung 10 sind Bakterienkolonien, die aus Bakterienzellen resultieren, die in einer Wasserprobe aus einem öffentlichen Trinkbrunnen vorhanden sind. Es ist unwahrscheinlich, dass bakterielle Krankheitserreger diese Kolonien angesichts der Reinigungsmaßnahmen für Trinkwasser produziert haben, aber Mikroben sind überall und eine Kontamination auch durch nicht-pathogene Stämme kann nur minimiert, nicht vollständig beseitigt werden. Als weiteres Beispiel muss ein Pharmaunternehmen den Grad der mikrobiellen Kontamination oder Keimbelastung eines neuen Arzneimittels während der Herstellung, Lagerung und des Transports beurteilen. Durch Probennahme des Arzneimittels während verschiedener Phasen des Prozesses und Plattieren von Proben unter Verwendung des Gießplattenverfahrens kann die mikrobielle Belastung oder die Anzahl der kontaminierenden Bakterien leicht bestimmt werden. Dann können Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um eine mikrobielle Kontamination zu minimieren oder zu beseitigen. Einer der häufigsten technischen Fehler, die bei der Durchführung der Plattengusstechnik auftreten, ist eine unzureichende Vermischung der Probe mit dem geschmolzenen Agar, wodurch Kolonien verklumpen und die Plattenzählungen ungenau werden. Ein weiterer häufiger Fehler besteht darin, den geschmolzenen Agar zu heiß zu gießen, wodurch viele der Bakterienzellen in der Probe abgetötet werden. Dieser Fehler wirkt sich auch auf die Genauigkeit der Plattenzählung aus, die Zahlen ergibt, die die Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten in der Probe unterrepräsentieren.

    Spread-Plate-Technik. Die Plattenausbreitungstechnik ist in ihrer Nützlichkeit als Mittel zum Durchführen von lebensfähigen Plattenzählungen analog zum Gießplattenverfahren. Da jedoch die Kolonien, die sich mit der Spread-Plate-Technik bilden, gleichmäßig über die Oberfläche des Agarmediums verteilt sind, können Zellen aus einzelnen Kolonien isoliert und in nachfolgenden experimentellen Manipulationen verwendet werden (z. B. als Inokulum für eine Ausstrichplatte oder a Brühekultur). Drei gängige Anwendungen, bei denen die Spread-Plate-Technik ein wichtiger Bestandteil ist, sind Anreicherungs-, Selektions- und Screening-Experimente. Bei allen drei Anwendungen kann der gewünschte Zelltyp aus dem Gemisch abgetrennt und später beliebig vielen biochemischen, physiologischen oder genetischen Tests unterzogen werden.

    Ein Anreicherungsexperiment beinhaltet das Ausplattieren einer Mischkultur auf einem Medium oder das Inkubieren von Platten unter Umgebungsbedingungen, die das Wachstum derjenigen Mikroorganismen in der Probe begünstigen, die die gewünschten metabolischen Eigenschaften, Wachstumseigenschaften oder Verhaltensweisen zeigen. Diese Strategie hemmt nicht das Wachstum anderer Organismen, führt jedoch zu einer Erhöhung der Anzahl der gewünschten Mikroorganismen im Vergleich zu anderen in der Kultur. Somit weisen die Kolonien, die sich auf einer Anreicherungsplatte bilden, wahrscheinlich phänotypische Eigenschaften auf, die den gewünschten Genotyp widerspiegeln. Wenn Ihr Ziel beispielsweise darin besteht, stickstofffixierende Bakterien aus einer Umgebungsprobe zu kultivieren, die eine Mischung aus mehr als 1000 verschiedenen Bakterienarten enthält, dann wird das Ausplattieren der Probe auf einem stickstoffarmen Medium die Bakterien anreichern, die diese Verbindung aus dem Atmosphäre mit metabolischen Fähigkeiten, die von einer Reihe von Genen bereitgestellt werden, die für die Stickstofffixierung erforderlich sind.

    EIN Auswahlexperiment beinhaltet das Ausplattieren einer Mischkultur auf einem Medium, das nur den Zellen erlaubt, die ein bestimmtes Gen oder einen bestimmten Satz von Genen enthalten, zu wachsen. Diese Art von Experiment ist in molekularbiologischen Labors üblich, wenn Bakterienstämme mit Plasmiden transformiert werden, die Antibiotikaresistenzgene enthalten. Wenn Ihr Ziel darin besteht, nur rekombinante Zellen zu kultivieren oder solche, die das Plasmid erfolgreich aufgenommen haben, werden durch Ausplattieren der Probe auf einem Medium, das mit einer geeigneten Konzentration des Antibiotikums ergänzt wurde, diejenigen Zellen selektiert, die gegen dieses spezielle Medikament resistent sind.

    EIN Screening-Experiment beinhaltet das Ausplattieren einer Mischkultur auf einem Medium, das allen lebensfähigen Zellen das Wachstum ermöglicht, jedoch können die Zellen mit dem gewünschten Genotyp von anderen Zellen anhand ihres Phänotyps unterschieden werden. Auch hier ist diese Art von Experiment in molekularbiologischen Laboratorien üblich, wenn Mutagenese-Assays durchgeführt oder Gene in Plasmide kloniert werden.Ein klassisches Beispiel, wie in . gezeigt Abbildung 11, nutzt die lacZ Gen, das für β-Galactosidase kodiert Dieses Enzym ermöglicht es Zellen, X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), ein Substratanalogon seines natürlichen Substrats Lactose, zu metabolisieren. Die Spaltung von X-Gal durch β-Galactosidase führt zu einem unlöslichen blauen Produkt. Wenn also ein Medium X-gal enthält und eine Probe Zellen mit entweder einem Wildtyp (funktionell) oder einer Mutante (nichtfunktionell) enthält lacZ Gen werden auf diesem Medium ausplattiert, dann nach der Inkubation Wildtyp-Zellen, die eine funktionelle lacZ Gen erscheint als blau pigmentierte Kolonien, während mutierte Zellen mit einem nicht-funktionellen lacZ Gen erscheint als unpigmentierte ("weiße") Kolonien.

    Ein technisches Problem, das am häufigsten beim ersten Erlernen der Plattenausbreitungstechnik auftritt, ist die ungleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Agaroberfläche. Bei Verwendung von Drehteller und Glasstab kann die Probe zu schnell aufgenommen werden, so dass sich die Kolonien nur in der Mitte der Platte bilden. Bei der "Copacabana-Methode" werden die Glasperlen über die Agaroberfläche geschwenkt und nicht geschüttelt. Folglich wachsen viele Kolonien entlang des äußeren Plattenrandes. In beiden Fällen nutzt die resultierende Verteilung der Kolonien nicht die gesamte verfügbare Oberfläche aus, so dass Zellen zusammenklumpen und zu überlappenden Kolonien wachsen können, was die Plattenzählungen ungenau oder die Unterscheidung der Zelltypen unmöglich macht.

    Weichagar-Overlay-Technik. Ein Verfahren ähnlich der Spread-Plate-Technik, die zum Zählen von Bakterienkolonien verwendet wird, kann verwendet werden, um die Anzahl der Phagen zu bestimmen. Während bei der Plattenzählung (KBE/ml) zwischen 30 und 300 Bakterienzellen auf der Agaroberfläche verteilt werden, werden bei der Plaquezählung (pfu/ml) innerhalb einer Schicht zwischen 100 und 400 infektiöse Phagenpartikel mit 10 8 bis 10 9 Wirtszellen gemischt von Weichagar auf der Oberfläche des harten Nähragars verteilt. Sofern nicht anders nachgewiesen, wird im Allgemeinen davon ausgegangen, dass sich eine einzelne Bakterienzelle teilt und eine große Anzahl genetisch identischer Zellen in einem einzigen Cluster, einer Kolonie genannt, anhäuft. Wie zuvor diskutiert, ist diese Annahme nicht gültig, wenn Zellen in Bündeln (d. h. Paaren, Tetraden, Ketten oder Clustern) wachsen oder Wachstumsmerkmale wie Kapseln aufweisen, die die Einzelkoloniebildung behindern. Eine ähnliche Annahme wird für die Plaquebildung getroffen, da jeder Plaque die Aktivität eines einzelnen Phagen repräsentiert. Diese Aussage trifft nur zu, wenn ein Phagen ein Bakterium infiziert. Was passiert, wenn mehrere Phagenpartikel ein einzelnes Bakterium infizieren? Dieses Problem bezieht sich auf einen wichtigen statistischen Parameter, der bei der Durchführung von Experimenten mit Phagen berücksichtigt werden muss – die Multiplizität der Infektion (MOI) – die das Verhältnis von infektiösen Phagenpartikeln zur Anzahl der Wirtszellen in einer Probe beschreibt. Da einige Zellen mehr als einen Phagen adsorbieren, während andere Zellen nur einen oder keinen Phagen adsorbieren, sollte eine Population von Wirtszellen mit einer niedrigen MOI (𢙁) infiziert werden, um die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass eine Zelle von mehr als einem Phagen infiziert wird Partikel. Die Verwendung der Plaque Forming Unit (pfu) als funktionelle Definition vermeidet diese Komplikationen bei der Durchführung von Plaquezählungen zur Berechnung des Titers eines Phagenstocks.

    Wie gezeigt in Abbildung 12, die Plaquemorphologie variiert für verschiedene Phagen. Einige Phagen erzeugen kleine Plaques (Tafel A), während andere zu großen Plaques führen (Tafel B). Eine Reihe von Variablen beeinflusst die Plaquegröße. Es gibt technische Gründe, die zu dieser Variabilität beitragen. Zum Beispiel unterstützen vollständige Medien und dicker Hartagar die Entwicklung größerer Plaques, da Wirtszellen das Phagenwachstum über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten können. Eine hohe Plattierungsdichte von Wirtszellen (㸐 9 KBE pro Platte) führt zu einer Verringerung der Plaquegröße. Die Verwendung niedrigerer Konzentrationen von Weichagar erhöht die Geschwindigkeit der Phagenpartikeldiffusion im Weichagar und erhöht dadurch die Größe der Plaques. Denken Sie daran, dass diese erhöhte Diffusionsrate unbeabsichtigt auftreten kann, wenn die Hartagarplatten nicht vollständig trocken sind, sodass Kondensation oder übermäßige Feuchtigkeit in der Schale den Weichagar in der Auflage verdünnt. Diese technische Überwachung führt zu inkonsistenten Ergebnissen in Bezug auf die Plaquegröße für einen bestimmten Phagen.

    Die Plaquegröße hängt auch mit einer Reihe von Wirtszellereignissen zusammen, darunter die Effizienz der Adsorption, die Dauer der Latenzzeit (die Zeitspanne von der Phagenadsorption bis zur Lyse der Wirtszelle) und die Burstgröße (die Anzahl der Nachkommen, die von eine einzige Infektion). Eine heterogene Mischung von Plaquegrößen kann beobachtet werden, wenn Phagenpartikel Wirtszellen in verschiedenen Phasen des Bakterienwachstums infizieren. Zum Beispiel erzeugen diejenigen, die während der frühen exponentiellen Phase adsorbieren, größere Plaques mit mehr Phagen-Nachkommen als diejenigen, die in der späten exponentiellen Phase adsorbieren. In der Regel produzieren lytische Phagen klare Plaques, während lysogene Phagen trübe Plaques bilden. Einige lytische Phagen produzieren jedoch interessante Muster wie die in Abbildung 12B. Diese klaren Plaques sind von einem trüben Halo umgeben, da diese Zellen am Rand der Plaque nicht vollständig lysiert werden oder gegen eine Phageninfektion resistent sein können. Ein mit gemäßigten Phagen beobachtetes "Bull's Eye"-Muster ist eine Plaque mit einem trüben Zentrum, das von einem klaren Ring umgeben ist. Diese Morphologie spiegelt das MOI und die Physiologie der Wirtszelle in Bezug auf die Lyse-Lysogenie-Entscheidung wider. Wenn Zellen zum ersten Mal mit Phagen infiziert werden, ist das MOI niedrig und die Zellen wachsen schnell, da die Nährstoffe reichlich vorhanden sind, was das lytische Wachstum erleichtert. Da immer mehr Zellen lysiert werden, steigt das MOI und es bildet sich eine klare Plaque. Lysogene im Zentrum des Plaques wachsen jedoch weiter, da sie gegen Lyse immun sind, was zu einem klaren Plaque mit einem trüben Zentrum führt.

    Die Overlay-Technik kann für Plaque-Assays mit eukaryontischen Viren modifiziert werden. Ebenso bilden Bakteriophagen Plaques auf einem Rasen von Bakterienzellen in Weichagar, eukaryotische Viren bilden Plaques auf einer mit einem Gel bedeckten Monoschicht von Zellen. Ein Monolayer ist eine konfluente Zellschicht, die nebeneinander auf der Oberfläche einer Kulturschale wächst, sich gegenseitig berührt, aber nicht übereinander wächst. Um diese Art von Plaque-Assay durchzuführen, werden Virus-Aliquots zu anfälligen Monoschichten eukaryontischer Zellen gegeben. Anschließend wird der Monolayer mit einem Nährmedium auf Agarose-Basis bedeckt – dieses Gel schränkt die Ausbreitung von Nachkommenviren, die von infizierten Zellen freigesetzt werden, auf benachbarte Zellen im Monolayer ein. Dementsprechend wird ein kugelförmiger Bereich oder Plaque erzeugt, der Zellen enthält, die durch die Freisetzung von Virionen beschädigt wurden. Um die Sichtbarmachung der Plaques zu unterstützen, können Farbstoffe, die lebende Zellen färben, auf die Zellkultur aufgebracht werden, um einen Kontrast zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen zu schaffen.

    Die Soft-Agar-Overlay-Technik wird für andere Experimente als Plaque-Assays verwendet. Zunächst ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Hartnährstoff-Agar eine unterstützende Matrix ist, die das Wachstum von Bakterien ermöglicht. Zweitens kann der für das Overlay verwendete Weichagar eine andere Nährstoffzusammensetzung aufweisen als der Hartagar. Auf diese Weise kann der Weichagar als Mittel dienen, um Bakterienstämme auf verschiedene Wachstumseigenschaften oder Stoffwechseleigenschaften zu untersuchen. Beispielsweise wird die Overlay-Technik verwendet, um Bakterien auf ihre Fähigkeit zum Abbau von Zellulose zu untersuchen (Teather und Wood 1982). Einzelne Kolonien werden auf einem nicht-selektiven Hartagarmedium gezüchtet, dann wird Weichagar, der 0,1% (w/v) Carboxymethylcellulose (CMC) enthält, über die Oberfläche des Hartagars verteilt. Nach der Inkubation werden die Platten mit Farbstoff überflutet, der die Sichtbarmachung von Klärungszonen um die Kolonien im Weichagar ermöglicht. Die Klärung wird durch hydrolytische Enzyme verursacht, die von den Bakterien sezerniert werden, die die Zellulose im Medium abbauen. In jüngerer Zeit wurde die Overlay-Technik verwendet, um Bakterien zu erkennen, die das Wachstum methanogener Archaeen hemmen, die im Pansen von Nutztieren vorkommen (Gilbert et al. 2010). Bakterielle Isolate aus Umweltproben werden auf einem Hartagar-Nährmedium gezüchtet, dann werden Kolonien mit Weichagar überschichtet, der eine Kultur von Methanogenen enthält. Nach der Inkubation werden die Platten auf Wachstumshemmungszonen um die Kolonien herum untersucht. Diese Methode identifiziert Bakterienstämme, die Inhibitoren der Methanogene im Weichagar produzieren.

    Die häufigsten technischen Fehler, die bei der Soft-Agar-Overlay-Technik auftreten, sind das Gießen des geschmolzenen Soft-Agars, wenn er zu heiß oder zu kalt ist. Wenn es zu heiß ist, werden die in das Medium gemischten Bakterienzellen vor dem Plattieren abgetötet. Wenn es zu kühl ist, bildet der Weichagar beim Aufgießen auf den Hartagar Klumpen. In jedem Fall sind die Ergebnisse mehrdeutig oder bestenfalls unlesbar.

    Replikatplattenverfahren. Die Übertragung von Kulturen von einer Art von Nährmedium auf eine andere, um die Wachstumsanforderungen zu testen, wird ziemlich mühsam, wenn mehr als nur wenige Stämme vorhanden sind. Das Replica-Plating ist ein Verfahren, das ein gleichzeitiges Screening einer großen Anzahl von Mikroorganismen ermöglicht. Zum Beispiel kann man nach der Mutagenisierung einer Kultur von Wildtyp-Zellen Verdünnungen der Kultur auf Platten verteilen, um Platten mit einzelnen Kolonien zu erhalten. Die Primärplatten enthalten ein Medium, das das Wachstum aller Zellen unterstützt, einschließlich Wildtyp-Prototrophen, die alle für das Wachstum erforderlichen Verbindungen synthetisieren, und mutierten Auxotrophen, die eine genetische Mutation in einem Biosyntheseweg tragen, die sie unfähig macht, bestimmte für das Wachstum essentielle Verbindungen zu synthetisieren. Durch Ausplattieren des Zellgemisches auf ein Vollmedium können die fehlenden Nährstoffe aus der Umgebung aufgenommen werden. Um zwischen Prototrophen und Auxotrophen zu unterscheiden, können die Kolonien auf einem Minimalmedium repliziert werden. Nur Prototrophe können wachsen. Da das räumliche Muster der Primärplatte erhalten bleibt, ermöglicht ein Vergleich der Sekundärplatte mit der Primärplatte die Identifizierung mutierter Kolonien. Um zu bestimmen, welche Verbindung die Mutanten nicht mehr synthetisieren können, können die Kolonien auf Minimalmedien repliziert werden, die mit spezifischen Verbindungen (z. B. Aminosäuren, Kohlenstoffquellen, Vitaminen usw.) ergänzt sind. Auf diese Weise können Hunderte von Kolonien gleichzeitig mit dem Replika-Platten-Verfahren gescreent werden. Ein technischer Fehler, der auftreten kann, ist die Verwendung von zu nassen Agarplatten, die dazu führen, dass Kolonien verschmieren und alle Kulturen auf der Platte kontaminieren. Dies führt zu Ergebnissen, die völlig unzuverlässig sind. Ein weiterer technischer Fehler ist, dass beim Übertragen der Zellen vom Samt auf die Sekundärplatten zu viel Druck ausgeübt wird. Auch hier können sich nach der Inkubation der Sekundärplatten die resultierenden Kolonien überlappen und Wachstumsphänotypen erzeugen, die eher auf Kontamination als auf Auxotrophie zurückzuführen sind.

    Nicht alle mikrobiellen Wildtyp-Spezies sind prototroph, daher kann das Replika-Platten-Verfahren verwendet werden, um gleichzeitig verschiedene Wildtyp-Stämme auf charakteristische Wachstumsanforderungen zu screenen. Wie gezeigt in Abbildung 13, "Tupfer" von Zellen aus vier verschiedenen Pseudomonas Bakterienstämme wurden in zweifacher Ausführung auf einer mit einem Gitter markierten Platte ausplattiert, die vollständiges Medium namens YTA enthielt (Feld A). Die Stämme wurden dann auf drei Sekundärplatten (Felder B, C und D) repliziert, die aus Minimalmedium (MSA) bestanden, das mit einer anderen Kohlenstoffquelle (Acetamid, Laktose bzw. Glycin) ergänzt war. Die Ergebnisse zeigen, dass zwei der vier Pseudomonas Stämme (P. aeruginosa und P. stutzeri) sind nicht in der Lage, auf diesen drei Kohlenstoffquellen zu wachsen. Als Kontrolle wurden die Stämme auf einer vierten Platte mit YTA-Medium repliziert, um zu bestätigen, dass die Zellen während des gesamten Verfahrens übertragen wurden. Da alle vier Stämme auf der YTA-Kontrollplatte wachsen, sind die Wachstumsdefizite der vorherigen drei Platten der Serie zuverlässig. Die Replika-Plattierungsergebnisse sind in tabellarisiert Tabelle 1. Ein häufig gemachter Fehler besteht darin, einen Wachstumsabdruck auf einer Sekundärplatte als positives Ergebnis zu interpretieren. Vergleichen Sie zum Beispiel den Phänotyp von P. aeruginosa zu dem von P. stutzeri auf MSA + Acetamid (Feld B). Letztere zeigt einen Wachstumseindruck, der ein negatives Ergebnis ist und auftreten kann, wenn Nährstoffe von der vorherigen Platte mit den Elternzellen übertragen werden. Es findet kein neues Zellwachstum statt, da die fehlenden Nährstoffe den Nachkommenzellen nicht zur Verfügung stehen. Es ist leicht, einen Abdruck mit einem tatsächlichen Wachstum zu verwechseln. Im Zweifelsfall sollte das Experiment mit einer alternativen Methode wiederholt werden, z. B. durch Streak-Plating von Zellen von der Primärplatte auf Sekundärmedien.

    Abbildung 1. Beispiel für einzelne Kolonien auf einer Platte. Die rosa Kugeln in der Nähe der Plattenmitte sind Kolonien von Serratia marcescens, ein Gram-negatives, stäbchenförmiges Proteobacterium aus der Familie Enterobacteriaceae. Aufgrund seiner Vorliebe für feuchte Umgebungen findet man diesen Mikroorganismus häufig in Badewannenecken, in Waschbecken, in Fliesenmörtel und auf Duschvorhängen. S. marcescens ist leicht zu erkennen, da es ein rötliches Pigment namens Prodigiosin produziert. Die Kolonien auf dieser Platte wurden unter Verwendung der Streak-Plate-Technik erzeugt, wobei einzelne Kolonien im vierten Quadranten nach einer Inkubation bei 30 °C für 24 Stunden erschienen. Die anderen drei Quadranten zeigen konfluentes Wachstum, bei dem sich auf der Agaroberfläche abgelagerte Zellen zu überlappenden Kolonien entwickelten.

    Figur 2. Instrumente für die Streak-Plate-Technik. Von oben nach unten sind Zahnstocher (abgeflacht, nicht rund), eine Drahtschlaufe, eine Einweg-Kunststoffschlaufe und Holzstäbchen abgebildet. Zahnstocher werden normalerweise mit dem breiten Ende nach unten in ein kleines Becherglas überführt und dann beim Autoklavieren mit Folie bedeckt, um sie vor der Verwendung zu sterilisieren. Holzstäbchen werden in 18-mm-Teströhrchen überführt und dann autoklaviert, um sie vor der Verwendung zu sterilisieren.

    Figur 3. (A) Streak-Plate-Technik mit der Quadrantenmethode. Eine vorsterilisierte Schlinge, ein Stäbchen oder ein Zahnstocher wird verwendet, um die Probe mit einer schnellen, glatten Hin- und Herbewegung vom Rand zur Mitte der Platte über ein Viertel der Agaroberfläche zu verteilen. Dieser Vorgang wird für jeden der vier Quadranten der Platte wiederholt. Nach der Inkubation tritt Zellwachstum entlang des Wegs des Instruments auf, das verwendet wird, um die Zellen auf der Platte abzulegen. Die mechanische Trennung von Zellen in einer gemischten Probe mit dieser Technik sollte zu einzelnen Kolonien im vierten Quadranten führen (siehe Abbildung 1 zum Beispiel). Einzelne Kolonien werden als koloniebildende Einheiten (KBE) bezeichnet. (B) Wenn eine Metallöse zum Streak-Plating verwendet wird, muss sie vor dem Kontakt mit dem Inokulum oder dem Agarmedium mit der Flamme eines Bunsenbrenners sterilisiert werden. Denken Sie daran, dass der heißeste Teil der Flamme die Spitze des blauen Kegels ist. Halten Sie den Griff des Instruments und legen Sie den Draht etwa 3-4 Zoll von der Schlaufe in die Flamme. Lassen Sie es lang genug, damit der Draht glühend heiß wird. Bewegen Sie den Draht so, dass sich die Flamme der Schlaufe nähert. Stellen Sie sicher, dass die Metallschlaufe abgekühlt ist, bevor Sie das Inokulum berühren.

    Figur 4. Pour-Plate-Technik. (A) Ein kleines Probenvolumen (zwischen 0,1 bis 1,0 ml) wird unter Verwendung einer 5,0 ml serologischen Pipette aseptisch in eine leere, aber sterile Petrischale gegeben. (B) Geschmolzener Agar, der auf eine Temperatur von ungefähr 48 °C äquilibriert wurde, wird dann mit der Probe in die Petrischale gegossen. Nach dem Schließen des Deckels wird die Platte vorsichtig geschwenkt, um die Probe und den geschmolzenen Agar zu mischen. Der Agar wird etwa 30 Minuten lang verfestigen gelassen, dann werden die Platten zur Inkubation umgedreht.

    Abbildung 5. Streuplattentechnik mit Drehscheibe und Glasstreuer. Nachdem die Agarplatte auf einem Drehteller platziert wurde, wird ein kleines Probenvolumen (0,1 bis 0,2 ml) mit einer Mikropipette aseptisch auf die Mitte der Platte verteilt. Der Streuer wird sterilisiert, indem er in ein Becherglas mit Ethanol getaucht und dann durch die Flamme des Bunsenbrenners geführt wird, um überschüssiges Ethanol zu entzünden. Vor dem Kontakt mit der Probe sollte der Streuer durch Berühren des Agars in der Nähe des Plattenrandes abgekühlt werden. Der Spreizer wird sanft durch die Probe über die Platte hin- und herbewegt, während sich der Drehtisch langsam dreht. Diese Aktion ermöglicht eine allmähliche, aber gleichmäßige Verteilung der Probe über die Agaroberfläche. Nach dem Schließen des Deckels sollte die Platte mindestens 5 Minuten lang ungestört auf der Tischplatte stehen, damit die Probe vollständig in den Agar absorbiert werden kann, bevor die Platte zur Inkubation umgedreht wird.

    Abbildung 6. Spread-Plate-Technik mit Glasperlen (Copacabana-Methode). In einem Autoklaven vorsterilisierte Glasperlen werden auf die Oberfläche einer auf der Tischplatte sitzenden Agarplatte gegossen. Ein kleines Probenvolumen (100 bis 150 μl) wird mit einer Mikropipette aseptisch auf die Mitte des Agars verteilt. Bei geschlossenem Plattendeckel werden die Kügelchen mit einer horizontalen Schüttelbewegung 6- bis 7-mal vorsichtig über die Platte hin- und herbewegt, wodurch die Probe verteilt wird. Dieser Vorgang wird nach dem Drehen der Platte um 60° wiederholt. Die Schüttelbewegung wird nach einer weiteren 60° Drehung ein drittes Mal wiederholt. Sobald die Probe vollständig in das Agarmedium absorbiert ist, werden die Kügelchen in ein Becherglas mit 10 % Bleichmittel gegossen. Die Platten werden dann zur Inkubation umgedreht.

    Abbildung 7. Soft-Agar-Overlay-Technik zur Isolierung und Zählung von Phagen basierend auf der Bildung von Plaques (auch Plaque-Assay genannt). (A) Das Vorhandensein von Phagen kann als Klärungszonen oder Plaques auf einer konfluenten Suspension von Bakterienkolonien, die in dem Weichagar wachsen, nachgewiesen werden. Phage T4 ist ein virulenter, doppelsträngiger DNA-Phagen, der seinen Wirt infiziert, Escherichia coli, was bewirkt, dass die Wirtszellen lysieren und nachkommende Phagen freisetzen. Nach mehreren Infektions- und Lyse-Runden werden die benachbarten E coli Zellen in der unmittelbaren Umgebung der ursprünglich infizierten Wirtszelle verschwinden und hinterlassen einen Plaque, der Milliarden von T4-Phagenpartikeln enthält. Der Phage T4 produziert Plaques mit einem Durchmesser von etwa 1 mm. In diesem Experiment wurden 200 μl einer 10 -5-Verdünnung einer 2 x 10 8 pfu/ml-Stammlösung von Phage T4 mit ungefähr 300 μl E coli Indikatorzellen, hergestellt als exponentiell wachsende, belüftete Kultur bei 37 °C. Sowohl der Phagen als auch die Bakterien wurden in ein EHA-Weichagarröhrchen gegeben, gemischt und dann auf die Oberfläche einer EHA-Hartagarplatte gegossen. Beachten Sie, dass es in diesem Fall nicht erforderlich war, Phagen und Bakterien vor dem Plattieren adsorbieren zu lassen. Nachdem der Weichagar 20 Minuten lang ungestört erstarren ließ, wurden die Platten umgedreht und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. (B) In Abwesenheit infizierender Phagenpartikel führt das Bakterienwachstum zu einer trüben Suspension von Zellen im Weichagar, in der einzelne Kolonien nicht sichtbar sind. Stattdessen ein ebener Rasen aus Bakterienzellen, in diesem Fall E coli, bildet sich über die gesamte Weichagarschicht.

    Abbildung 8. Vorbereitung der Primärplatte (Master) mit Bakterienproben. Um die Proben organisiert zu halten, kann der Boden der Platte in einem Raster markiert und die resultierenden Quadrate nummeriert werden. Jeder Probe kann ein Quadrat im Raster zugewiesen werden. Gezeigt sind Beispiele für richtige und falsche Impfmuster.Idealerweise wird eine kleine Anzahl von Zellen unter Verwendung eines sterilen Impfwerkzeugs wie eines Zahnstochers in die Mitte des Quadrats übertragen, um die Probe zu "tupfen" (Zelle Nr. 4). Häufige Inokulationsfehler, wie die in Zelle #5 ("Patch") und Zelle #6 ("Füllen") dargestellten, führen nach der Inkubation zu einem Überwachsen von Bakterienproben, wodurch benachbarte Quadrate kontaminiert werden.

    Abbildung 9. Replika-Platten-Technik zur Übertragung von Zellen von Primär- auf Sekundärplatten für Phänotyp-Screenings. Die Markierung auf der Primärplatte wird mit der Markierung auf dem mit Samt bedeckten Block ausgerichtet und dann abgesenkt, damit die Agaroberfläche das Tuch berühren kann. Die Zellen werden von der Platte auf den Samtstoff übertragen, indem mit den Fingerspitzen leicht, aber gleichmäßig auf die Primärplatte gedrückt wird. Dieser Vorgang hinterlässt einen Abdruck der Zellproben auf dem Samt in demselben räumlichen Muster wie die Primärplatte. Das gleiche Verfahren wird verwendet, um Zellen vom Samt auf eine Sekundärplatte zu übertragen. Es können bis zu 7-8 Sekundärplatten mit dem gleichen Primärplattenabdruck auf dem Samt beimpft werden. Die letzte mit Samt beimpfte Platte sollte als Positivkontrolle dienen. Es sollte ein Medium sein, das das Wachstum aller getesteten Stämme unterstützt und sicherstellt, dass während der gesamten Plattenserie ein ausreichender Zelltransfer stattfindet. Nach der Inkubation können Sekundärplatten inspiziert und auf Wachstum im Vergleich zu keinem Wachstum bewertet werden. Somit können mehrere Bakterienstämme gleichzeitig auf mehreren Wachstumsmedien in einem einzigen Experiment gescreent werden.

    Abbildung 10. Beispielergebnis mit Gießplattentechnik. Eine 1,0 ml Wasserprobe, die aus einem öffentlichen Trinkbrunnen gesammelt wurde, wurde in eine sterile leere Petrischale gegeben. Dann wurde geschmolzenes, aber abgekühltes YTA in die Schale mit der Probe gegossen. Der Agar enthielt außerdem 100 μg/ml Cycloheximid, um das Wachstum von Hefen und Schimmelpilzen zu verhindern, die möglicherweise in der Wasserprobe vorhanden waren. Nach leichtem Schwenken zum Mischen wurde die Platte auf eine flache Oberfläche gestellt und der Agar wurde vollständig verfestigen gelassen. Die Platte wurde 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Gezeigt ist das Ergebnis dieses Experiments. Beachten Sie den Unterschied im Aussehen von Oberflächenkolonien, die groß und kreisförmig sind, gegenüber unterirdischen Kolonien, die sehr klein und unregelmäßig geformt sind, da das verfestigte Medium die Ausbreitung der Kolonien unter der Oberfläche verhindert.

    Abbildung 11. Beispielergebnis mit Spread-Plate-Technik. Die "Copacabana-Methode" wurde verwendet, um eine Mischung von E. coli-Zellen für ein Screening-Experiment auszuplattieren. In diesem Fall enthält das Wachstumsmedium (LB) X-Gal, sodass Zellen, die ein funktionelles β-Galactosidase-Enzym exprimieren, blaue Kolonien bilden, während Zellen mit einer Mutation im lacZ Gen und daher nicht in der Lage, ein funktionsfähiges β-Galactosidase-Enzym zu exprimieren, bilden weiße Kolonien. Oft als "blau/weißer Bildschirm" bezeichnet, können die beiden Arten von Kolonien auf derselben Platte leicht voneinander unterschieden werden.

    Abbildung 12. Beispielergebnis eines Plaque-Assays unter Verwendung der Soft-Agar-Overlay-Technik. Gezeigt sind Plaques, die auf dem Wirtsstamm gebildet wurden Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (ATCC 700084) durch zwei verschiedene Phagen: (A) Mycobacteriophage Destroyers und (B) Mycobacteriophage MSSS. Diese Phagen wurden im Frühjahr 2010 von Studenten des UCLA-Laborkurses MIMG 103L isoliert. M. smegmatis ist ein nicht pathogenes Actinobacterium und gehört zu einer Familie von Mykobakterien, zu der einige Krankheitserreger gehören, von denen bekannt ist, dass sie schwere Krankheiten wie Tuberkulose verursachen (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) und Lepra (M. leprae). Ungefähr 50 μl einer 10 -2 Verdünnung von Destroyers und eine 10 -3 Verdünnung von MSSS wurden jeweils mit 500 μl von . inkubiert M. smegmatis 20 Minuten bei 37 °C, dann mit MBTA (Weichagar) gemischt und auf MHA (Hartagar)-Platten gegossen. Nachdem der Weichagar 20 Minuten lang ungestört erstarren ließ, wurden die Platten umgedreht und 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Beachten Sie die unterschiedlichen Plaque-Morphologien, die von jedem Phagen produziert werden. Zerstörer (A) bilden kleine (durchschnittlicher Durchmesser von etwa 1 mm), klare Plaques, die für einen lytischen Phagen charakteristisch sind, während MSSS (B) große "Stieraugen" -Plaques mit klaren Zentren entwickelt, die von einem trüben Halo umgeben sind (durchschnittlicher Durchmesser von etwa 3,2 mm) . Der Trübungsring kann aus Bakterien bestehen, die gegen eine Phageninfektion resistent sind. Dieses Muster unterscheidet sich von dem, das von lysogenen Phagen gebildet wird, die trübe Plaques produzieren.

    Abbildung 13. Beispielergebnis unter Verwendung des Replika-Platten-Verfahrens. Vier Pseudomonas Stämme (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens und P. stutzeri) wurden zweifach auf Wachstum auf drei verschiedenen Kohlenstoffquellen getestet: Acetamid, Lactose und Glycin. (A) Die Primärplatte ist ein vollständiges Medium (YTA), das mit den vier Stämmen wie angegeben beimpft wurde. Nach einer Inkubation bei 30 °C für 24 Stunden wachsen alle vier Stämme auf YTA. Die Primärplatte wurde verwendet, um die Platte auf Minimalmedium (MSA) zu replizieren, das mit einer einzelnen Kohlenstoffquelle ergänzt war: Acetamid (B), Lactose (C) und Glycin (D). Die letzte Platte in der Reihe war eine positive Kontroll-YTA-Platte (E). Wie gezeigt, zeigen die Stämme nach der Inkubation auf den Sekundärplatten variable Wachstumsmuster. Beachten Sie, dass es manchmal schwierig ist, zwischen Wachstum und einem Abdruck von Zellen zu unterscheiden. Vergleichen Sie zum Beispiel das Impressum von P. stutzeri auf den drei MSA-Platten zu keinem Wachstum auf denselben drei Platten um P. aeruginosa. Beides sind negative Ergebnisse im Vergleich zu den Wachstumsmustern von P. putida und P. fluoreszenz. Jedoch wachsen alle Stämme auf der positiven Kontrollplatte, was bestätigt, dass die Zellen auf alle Sekundärplatten in der Serie übertragen wurden. Die Ergebnisse dieses Experiments sind tabellarisch in Tabelle 1.

     YTA (primär)MSA + AcetamidMSA + LaktoseMSA + GlycinYTA (Kontrolle)
    P. aeruginosa+---+
    P. putida+++++
    P. fluoreszenz+++++
    P. stutzeri+---+

    Tabelle 1. Zusammenfassung der Ergebnisse der Replikatbeschichtung. Wachstum wird als Pluszeichen (+) angezeigt und kein Wachstum wird als Minuszeichen (-) dargestellt. YTA ist ein Vollmedium (Hefetrypton-Agar) und MSA ist ein Minimalmedium (Minimalsalz-Agar). Die MSA-Platten wurden wie angegeben mit einer einzelnen Kohlenstoffquelle ergänzt.


    Typ 2: Exponentielle Wachstumskurve

    Die zweite Wachstumsart ist exponentiell.

    Exponentielle Wachstumskurven steigen am Anfang langsam an, aber die Gewinne nehmen schnell zu und werden mit der Zeit leichter. Im Allgemeinen sieht exponentielles Wachstum in etwa so aus:

    Sie werden auch im täglichen Leben exponentielle Wachstumschancen finden (obwohl ich denke, dass sie weniger verbreitet sind).

    • Investitionen und Vermögen: Dank der Macht des Zinseszinses beginnt Ihre Altersvorsorge in den ersten Jahren als kleiner Schatz, wird aber in den letzten ein oder zwei Jahrzehnten des Sparens immer größer.
    • E-Mail-Abonnenten und Website-Traffic: Neue Websites erhalten hier und da nur ein Rinnsal an Verkehr, aber im Laufe der Wochen und Monate können sich diese Rinnsal zu einem rasenden Strom von Besuchern und Abonnenten entwickeln.
    • Unternehmertum und Unternehmenswachstum: Die Vermögenswerte, die Sie für Ihr Unternehmen aufbauen, stapeln sich übereinander und die Einnahmen summieren sich während der gesamten Lebensdauer eines erfolgreichen Unternehmens.
    • Social-Media-Follower: Wenn Sie nur 100 Follower haben, kann es sechs Monate dauern, weitere 100 Follower zu bekommen. Sobald Sie jedoch 1.000 Follower haben, dauert es möglicherweise nur einen Monat, die nächsten 100 zu erhalten. Sobald Sie 100.000 Follower haben, dauert es wahrscheinlich einen Tag, um weitere 100 zu bekommen. Ihre Wachstumsrate Schneebälle.

    Nichtgenetische Kategorien für Medizin und Ökologie

    In der Medizin werden Mikroorganismen durch Morphologie, Physiologie und andere Merkmale in der Ökologie nach Lebensraum, Energie und Kohlenstoffquelle identifiziert.

    Lernziele

    Umreißen Sie die Merkmale, die zur Klassifizierung verwendet werden: Bakterien, Viren und Mikroorganismen in der Ökologie

    Die zentralen Thesen

    Wichtige Punkte

    • Ein Krankheitserreger verursacht bei seinem Wirt eine Krankheit. In der Medizin gibt es mehrere breite Arten von Krankheitserregern: Viren, Bakterien, Pilze, eukaryotische Parasiten und Prionen.
    • Bei der Identifizierung von Bakterien im Labor werden folgende Merkmale verwendet: Gramfärbung, Form, Vorhandensein einer Kapsel, Bindungstendenz, Motilität, Atmung, Wachstumsmedium und ob intra- oder extrazellulär.
    • Viren werden hauptsächlich nach phänotypischen Merkmalen wie Morphologie, Nukleinsäuretyp, Replikationsweise, Wirtsorganismus und Art der von ihnen verursachten Krankheit klassifiziert.
    • In der Ökologie werden Mikroorganismen nach der Art des Lebensraums, den sie benötigen, oder der trophischen Ebene, der Energiequelle und der Kohlenstoffquelle klassifiziert.
    • Biologen haben herausgefunden, dass mikrobielles Leben eine erstaunliche Flexibilität besitzt, um in extremen Umgebungen zu überleben, die für komplexe Organismen, die als Extremophile bezeichnet werden, völlig unwirtlich wären, und es gibt viele Arten.
    • Verschiedene Arten von Mikroorganismen nutzen eine Mischung aus verschiedenen Energie- und Kohlenstoffquellen. Dies können Wechsel zwischen Photo- und Chemotrophie, zwischen Litho- und Organotrophie, zwischen Auto- und Heterotrophie oder eine Kombination davon sein.

    Schlüsselbegriffe

    • verpflichten: Kann nur in einer bestimmten Umgebung existieren oder überleben oder indem er eine bestimmte Rolle übernimmt: ein obligater Parasit ein obligater Anaerobier.
    • Erreger: Jeder Organismus oder jede Substanz, insbesondere ein Mikroorganismus, der Krankheiten verursachen kann, wie Bakterien, Viren, Protozoen oder Pilze. Mikroorganismen gelten erst dann als pathogen, wenn sie eine Populationsgröße erreicht haben, die groß genug ist, um Krankheiten auszulösen.
    • extremophil: Ein Organismus, der unter extremen Bedingungen von Temperatur, Salzgehalt usw. lebt. Sie sind kommerziell wichtig als Quelle für Enzyme, die unter ähnlichen Bedingungen arbeiten.

    Klassifizierung von Mikroorganismen in der Medizin

    Ein Krankheitserreger (umgangssprachlich als Keim bezeichnet) ist ein Infektionserreger, der bei seinem Wirt Krankheiten verursacht. In der Medizin gibt es mehrere breite Arten von Krankheitserregern: Viren, Bakterien, Pilze, eukaryotische Parasiten und Prionen.

    BAKTERIEN

    Obwohl die meisten Bakterien harmlos, ja sogar nützlich sind, sind nicht wenige pathogen. Jede pathogene Spezies hat ein charakteristisches Spektrum an Interaktionen mit ihren menschlichen Wirten.

    Bedingt sind pathogene Bakterien nur unter bestimmten Bedingungen pathogen, beispielsweise bei einer Wunde, die den Eintritt ins Blut ermöglicht, oder einer Abnahme der Immunfunktion. Bakterielle Infektionen können auch nach ihrer Lokalisation im Körper klassifiziert werden, zum Beispiel Vagina, Lunge, Haut, Rückenmark und Gehirn sowie Harnwege.

    Bei der Identifizierung von Bakterien im Labor werden folgende Merkmale verwendet: Gramfärbung, Form, Vorhandensein einer Kapsel, Bindungstendenz (einzeln oder paarweise), Motilität, Atmung, Wachstumsmedium und ob intra- oder extrazellulär.

    Kulturtechniken wurden entwickelt, um bestimmte Bakterien zu züchten und zu identifizieren, während das Wachstum der anderen in der Probe eingeschränkt wird. Häufig sind diese Techniken für bestimmte Proben bestimmt: Beispielsweise wird eine Sputumprobe behandelt, um Organismen zu identifizieren, die eine Lungenentzündung verursachen. Sobald ein pathogener Organismus isoliert wurde, kann er weiter durch seine Morphologie, Wachstumsmuster (aerob oder anaerob), Hämolysemuster und Färbung charakterisiert werden.

    VIREN

    Ähnlich wie bei den Klassifikationssystemen für zelluläre Organismen ist die Virusklassifizierung aufgrund ihres pseudo-lebenden Charakters Gegenstand einer anhaltenden Debatte. Im Wesentlichen handelt es sich um unbelebte Partikel mit einigen chemischen Eigenschaften, die denen des Lebens ähneln, daher passen sie nicht genau in ein etabliertes biologisches Klassifizierungssystem.

    Viren werden hauptsächlich nach phänotypischen Merkmalen klassifiziert, wie zum Beispiel:

    • Morphologie
    • Nukleinsäuretyp
    • Replikationsmodus
    • Wirtsorganismen
    • Art der Krankheit, die sie verursachen

    Derzeit werden zwei Hauptschemata für die Klassifizierung von Viren verwendet: (1) das System des International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) und (2) das Klassifizierungssystem von Baltimore, das Viren in eine von sieben Gruppen einteilt. Bis heute wurden sechs Aufträge vom ICTV eingerichtet:

    • Caudovirales
    • Herpesvirales
    • Mononegavirales
    • Nidovirales
    • Picornavirales
    • Tymovirales

    Diese Ordnungen umfassen Viren mit unterschiedlichen Wirtsbereichen, von denen nur einige menschliche Wirte infizieren.

    Die Baltimore-Klassifikation ist ein System, das Viren in eine von sieben Gruppen einteilt, abhängig von einer Kombination von:

    • ihre Nukleinsäure (DNA oder RNA)
    • Strandung (einfach oder doppelt)
    • Sinn
    • Replikationsmethode

    Andere Klassifikationen werden durch die durch das Virus verursachte Krankheit oder seine Morphologie bestimmt, von denen keine zufriedenstellend ist, da verschiedene Viren entweder die gleiche Krankheit verursachen oder sehr ähnlich aussehen können. Zudem sind virale Strukturen unter dem Mikroskop oft schwer zu bestimmen. Die Klassifizierung von Viren nach ihrem Genom bedeutet, dass sich alle Viren in einer bestimmten Kategorie ähnlich verhalten, was einen Hinweis auf das weitere Vorgehen bei der Forschung bietet.

    Andere Organismen verursachen beim Menschen unweigerlich Krankheiten, wie z. B. obligate intrazelluläre Parasiten, die nur in den Zellen anderer Organismen wachsen und sich vermehren können.

    KATEGORIEN VON MIKROORGANISMEN IN DER ÖKOLOGIE

    In der Ökologie werden Mikroorganismen nach der Art des Lebensraums, den sie benötigen, oder der trophischen Ebene, der Energiequelle und der Kohlenstoffquelle klassifiziert.

    Lebensraumtyp

    Biologen haben herausgefunden, dass mikrobielles Leben eine erstaunliche Flexibilität besitzt, um in extremen Umgebungen zu überleben, die für komplexe Organismen völlig unwirtlich wären. Einige kamen sogar zu dem Schluss, dass das Leben auf der Erde in hydrothermalen Schloten weit unter der Meeresoberfläche begonnen haben könnte.

    Ein extremophil ist ein Organismus, der unter physikalisch oder geochemisch extremen Bedingungen gedeiht, die für das meiste Leben auf der Erde schädlich sind. Die meisten bekannten Extremophilen sind Mikroben. Die Domäne Archaeen enthält bekannte Beispiele, aber Extremophile kommen in zahlreichen und unterschiedlichen genetischen Abstammungslinien von Bakterien und Archaeen vor. Im Gegensatz dazu können Organismen, die in gemäßigteren Umgebungen leben, als . bezeichnet werden Mesophile oder Neutrophile.

    Es gibt viele verschiedene Klassen von Extremophilen, die jeweils der Art und Weise entsprechen, wie sich ihre Umweltnische von mesophilen Bedingungen unterscheidet. Viele Extremophile fallen unter mehrere Kategorien und werden als . bezeichnet polyextremophile. Einige Beispiele für Arten von Extremophilen:

    • Acidophil: ein Organismus mit optimalem Wachstum bei pH 3 oder darunter
    • Xerophil: ein Organismus, der unter extrem trockenen, austrocknenden Bedingungen wachsen kann, am Beispiel der Bodenmikroben der Atacama-Wüste
    • Halophil: ein Organismus, der zum Wachstum mindestens 0,2 M Salzkonzentrationen (NaCl) benötigt
    • Thermophil: ein Organismus, der bei Temperaturen zwischen 45–122 °C gedeihen kann

    Trophisches Niveau, Energiequelle und Kohlenstoffquelle

    Die Ernährungsweisen eines Organismus: Ein Flussdiagramm, um zu bestimmen, ob eine Art autotroph, heterotroph oder ein Untertyp ist.

    • Phototrophen: Photoneneinfang durchführen, um Energie zu gewinnen. Sie nutzen die Energie des Lichts, um verschiedene zelluläre Stoffwechselprozesse durchzuführen. Sie sind nicht zwingend photosynthetische. Die meisten der bekannten Phototrophen sind Autotrophe, auch bekannt als photoautotrophe, und kann Kohlenstoff reparieren.
    • Photoheterotrophe: ATP durch Photophosphorylierung herstellen, aber aus der Umwelt gewonnene organische Verbindungen zum Aufbau von Strukturen und anderen Biomolekülen verwenden.
    • Photolithoautotroph: ein autotropher Organismus, der Lichtenergie verwendet, und ein anorganischer Elektronendonor (z. B. H2OH2, H2S) und CO2 als seine Kohlenstoffquelle.
    • Chemotrophien: erhalten ihre Energie durch die Oxidation von Elektronendonatoren in ihrer Umgebung.
    • Chemoorganotrophe: Organismen, die die chemischen Bindungen in organischen Verbindungen als ihre Energiequelle oxidieren und die Kohlenstoffmoleküle gewinnen, die sie für die Zellfunktion benötigen. Diese oxidierten organischen Verbindungen umfassen Zucker, Fette und Proteine.
    • Chemoorganoheterotrophe (oder Organotrophe) nutzen kohlenstoffreduzierte Verbindungen als Energiequellen, wie Kohlenhydrate, Fette und Proteine ​​aus Pflanzen und Tieren. Chemolithoheterotrophe (oder littrophischheterotrophe) verwenden anorganische Substanzen zur Herstellung von ATP, einschließlich Schwefelwasserstoff und elementarem Schwefel.
    • Lithoautotroph: bezieht Energie aus reduzierten Verbindungen mineralischen Ursprungs. Kann auch bezeichnet werden als Chemolithoautotrophe, was ihre autotrophen Stoffwechselwege widerspiegelt. Lithoautotrophe sind ausschließlich Mikroben und die meisten sind Bakterien. Für lithoautotrophe Bakterien können nur anorganische Moleküle als Energiequellen verwendet werden.
    • Mixotrop: Kann eine Mischung aus verschiedenen Energie- und Kohlenstoffquellen verwenden. Dies können Wechsel zwischen Photo- und Chemotrophie, zwischen Litho- und Organotrophie, zwischen Auto- und Heterotrophie oder eine Kombination davon sein. Kann entweder eukaryotisch oder prokaryotisch sein.

    Unterschiedliche Morphologie bei verschiedenen Herpesviren: Verschiedene Viren aus der Familie der Herpesviridae, die anhand einer elektronenmikroskopischen Aufnahme gesehen werden. Zu diesen Mitgliedern gehören Varicella-Zoster (Windpocken) und Herpes simplex Typ 1 und 2 (HSV-1, HSV-2).


    Schau das Video: Cultural characteristics u0026 Colony morphology of Bacterial colony (Januar 2023).