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Kann ein gespaltenes Plasmid ohne exakt passende „klebrige Enden“ „schließen“?

Kann ein gespaltenes Plasmid ohne exakt passende „klebrige Enden“ „schließen“?


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Sagen wir, wenn Sie eine multiple Restriktionsschnittstelle haben und zwei Restriktionsenzyme darauf verwenden, um ein Plasmid zu spalten, kann es dann mit Ligase rekombinieren?

Meine Sorge ist, dass ohne die kleine Sequenz von Nukleotiden, die sich zwischen den beiden Restriktionsstellen befanden, die beiden Enden des Plasmids nicht kleben und anlagern. Würde es funktionieren, wenn die beiden klebrigen Enden in der Reihenfolge fast gleich sind - zwei bp entfernt statt alle fünf?


Das Plasmid religiert nicht effizient, wenn die Enden nicht kompatibel sind. Es ist jedoch möglich, dass Ihre Plasmide sehr selten erneut ligieren, möglicherweise aufgrund einer geringfügigen Kontamination mit Exonuklease, die die Enden stumpf zurückschneidet. Oder es kann zu spontanen stumpfen Brüchen oder anderen seltsamen Ereignissen kommen. Dies kann bei einem winzigen Bruchteil der Plasmide passieren, einem von Millionen, aber da Ihr Transformationsschritt sehr effizient nach zirkularisiertem Plasmid selektiert, können Sie es am Ende erkennen.

Beachten Sie, dass diese geretteten Plasmide oft abweichend sind, da sie unvorhersehbar an den Enden getrimmt werden oder auf andere Weise einem nicht entworfenen Weg zur Zirkularisierung folgen; Dies ist nicht etwas, auf das Sie sich beim Klonen verlassen sollten, es ist ein lästiges Nebenprodukt, das Sie vermeiden möchten.


Schau das Video: Plasmid DNA Technology (Januar 2023).