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Können DNA-Ringe, also Plasmide, als Möbius-Streifen entstehen?

Können DNA-Ringe, also Plasmide, als Möbius-Streifen entstehen?


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Ich weiß, dass Plasmide in einer gewundenen Form vorliegen können, die die DNA-Stränge zusammenhält, wenn sie degenerieren, indem sie Catenasen bilden.

Ich habe mich jedoch gefragt, ob es dokumentiert ist, dass es auf natürliche Weise passiert oder ob jemals jemand erfolgreich ein Möbius-Streifen-Plasmid erzeugt hat. Technisch könnte sich eine solche Struktur leicht aus einem einzelnen zirkulären DNA-Strang bilden, aber die Literatur ist, soweit ich gesucht habe, stumm geblieben.


Knoten und nichtorientierbare Oberflächen in der chiralen Nematik

Knoten und verknotete Felder bereichern physikalische Phänomene, die von DNA und Molekularchemie bis hin zu Wirbeln von Flüssigkeitsströmen und Texturen geordneter Medien reichen. Flüssigkristalle bieten eine ideale Umgebung, um solche topologischen Phänomene durch die Kontrolle ihrer charakteristischen Defekte zu untersuchen. Die Verwendung von Kolloiden zur Erzeugung von Defekten und verknoteten Konfigurationen in Flüssigkristallen wurde für sphärische und toroidale Partikel demonstriert und ist vielversprechend für die Entwicklung neuartiger photonischer Bauelemente. In Erweiterung dieser bestehenden Arbeit beschreiben wir die vollständigen topologischen Implikationen von Kolloiden, die nichtorientierbare Oberflächen darstellen, und verwenden sie, um Torusknoten und Verbindungen vom Typ (P,2) um mehrfach verdrillte Möbiusstreifen.

Die Steuerung und Gestaltung komplexer 3D-Texturen in geordneten Medien ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung fortschrittlicher Materialien, photonischer Kristalle, abstimmbarer Geräte oder Sensoren und Metamaterialien (1 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –10) sowie für die Förderung unseres grundlegenden Verständnisses der Mesophasen (11 ⇓ –13). Insbesondere topologische Konzepte spielen eine immer wichtigere Rolle bei der Charakterisierung von Materialien über eine Vielzahl von Themen von Helizität in Fluidströmungen (14, 15) und Übergängen in Seifenfilmen (16) bis hin zu Molekularchemie (17), Knoten in DNA (18), Defekte in geordneten Medien (19, 20), Quantenberechnung (21, 22) und topologische Isolatoren (23). Topologische Eigenschaften sind robust, weil sie gegen alle kontinuierlichen Verformungen geschützt sind, und aus dem gleichen Grund flexibel, was eine Abstimmbarkeit ohne Funktionsverlust ermöglicht.

Einige der kompliziertesten und interessantesten Texturen in geordneten Medien beinhalten Knoten. Ausgehend von Lord Kelvins berühmter „Vortex-Atom“-Theorie (24), hat sich die Idee, verknotete Strukturen in kontinuierlichen Feldern zu kodieren, in der Magnetohydrodynamik (25), Fluiddynamik (15), Hochenergiephysik (26 ⇓ –28) und elektromagnetischen . fortgesetzt Felder (29, 30) und hat jüngste experimentelle Erkenntnisse in der Optik (31), Flüssigkristallen (32) und Fluidwirbeln (33) gesehen. Das Knüpfen von Knoten in einem kontinuierlichen Feld erfordert eine viel größere Komplexität als bei einer Krawatte, einem Seil oder sogar einem Polymer oder einem DNA-Strang. In einem Feld ist der Knoten von Material umgeben, das genau konfiguriert werden muss, um mit der Knotenkurve kompatibel zu sein. Diese Komplexität bringt jedoch ihre eigenen Vorteile mit sich, denn der volle Reichtum der mathematischen Knotentheorie drückt sich natürlich in den Eigenschaften des Knotenkomplements aus: alles, was nicht der Knoten ist. In diesem Sinne sind verknotete Felder ideal geeignet, um den vollen Umfang der modernen Knotentheorie direkt einzubeziehen und experimentell zu realisieren.

Flüssigkristalle sind orientierungsgeordnete Mesophasen, deren einzigartige Mischung aus weicher Elastizität, optischer Aktivität und flüssiger Natur einen fruchtbaren Rahmen für die Entwicklung neuartiger Metamaterialien und das Studium der niederdimensionalen Topologie in geordneten Medien bietet. Ein Großteil des aktuellen Fokus konzentriert sich auf kolloidale Systeme – kolloidale Partikel, die in einem Flüssigkristall-Wirt dispergiert sind –, die einen dualen Charakter haben. Einerseits vermittelt der Flüssigkristall langreichweitige elastische Wechselwirkungen zwischen Kolloiden und liefert den Mechanismus zur Bildung kolloidaler Strukturen und Metamaterialien (1 ⇓ –3, 10). Andererseits erzeugen die Kolloide durch die von ihren Oberflächen auferlegten Verankerungsbedingungen Defekte im Flüssigkristall und dienen so dazu, seine topologischen Eigenschaften zu induzieren und zu manipulieren. Mehrere Kolloide zeigen beispielsweise eine Vielzahl von verschränkten Defektkonfigurationen (34, 35), ebenso interessante Zustände ohne Defekte (36) und können sogar so manipuliert werden, dass sie beliebige Knoten und Verbindungen bilden (32, 37). In jüngerer Zeit wurde ein bedeutender Fortschritt in der Herstellung von Kolloiden mit unterschiedlicher Topologie (38)––Tori bis zur Gattung 5–––experimentell die Beziehung zwischen der Teilchentopologie und der begleitenden Defektladung verifiziert, und die Weiterentwicklung eines Programms zur topologischen Kontrolle von Materialien durch topologisches Design. Obwohl die von diesen Systemen gezeigten Phänomene in der Tat reichhaltig sind, stellen diese Kolloide (Kugeln, Tori usw.) als Oberflächen alle geschlossene, orientierbare Oberflächen dar.

In diesem Artikel erweitern wir diese Ideen, um eine vollständige topologische Charakterisierung aller kompakten kolloidalen Oberflächen in einem Flüssigkristallwirt bereitzustellen. Nichtorientierbare Oberflächen nutzen die nichtorientierbare Natur der flüssigkristallinen Ordnung vollständig aus (39). Auf allen nicht orientierbaren Flächen gibt es zwangsläufig geschlossene Bahnen, um die die Flächennormale ihre Orientierung umkehrt. Bei Flächen mit normaler Verankerung prägt dies eine entsprechende Umkehrung im Direktorenfeld, die verräterische Signatur einer Disklinationslinie. Auf diese Weise erzwingen nicht orientierbare Flächen die Bildung topologisch geschützter Dislzinationslinien. Durch Variation der Einbettungen der Oberfläche nutzen wir diese Topologie, um metastabile Disklinationsschleifen in Form von Torusknoten und Gliedern zu erzeugen, für alle P, um mehrfach verdrehte Möbiusbänder. Durch diese Kombination von Geometrie und Topologie verdeutlichen wir eine natürliche Umgebung für die Erzeugung und Kontrolle komplexer verknoteter Felder und die Integration der mathematischen Knotentheorie in die experimentelle Wissenschaft.


Einführung

Bakterielle Konjugation ist der Prozess, bei dem DNA unidirektional von einer Spenderzelle auf eine Empfängerzelle übertragen wird. Es spielt eine entscheidende Rolle beim horizontalen Gentransfer, dem wichtigsten Mittel, mit dem sich Bakterien entwickeln und sich an ihre Umgebung anpassen, und auch ein Prozess von immenser biomedizinischer Bedeutung, da die Konjugation der Hauptvektor für die Vermehrung von Antibiotikaresistenzgenen ist. Es wurde erstmals in den 1940er Jahren von Lederberg und Tatum beschrieben 1 . Seine Entdeckung läutete den Beginn der Molekularbiologie ein, als nachgewiesen wurde, dass die Übertragung genetischer Informationen unidirektional war und dass das gesamte Genom von Escherichia coli von einer Zelle zur anderen übertragen werden könnte, beginnend an einer definierten Stelle 2 . Tatsächlich folgten bahnbrechende Entdeckungen: die Kartierung der E coli Genom (kartiert in „Minuten“, dh die Zeit, die ein bestimmtes Gen benötigt, um vom Spender zum Empfänger zu übertragen, wobei der Zeitpunkt 0 der Paarungsbeginn ist – wenn Spender- und Empfängerzellen einander gegenübergestellt wurden) oder die Entdeckung von Genstruktur und Regulation (siehe die faszinierende Darstellung dieser Forschung in den Nobel-Vorträgen der Gründerväter der Molekularbiologie, Francois Jacob, Andre Lwoff und Jacques Monod im Jahr 1965 3 ).

Die verschiedenen Maschinen, die während der Konjugation zum Ausführen des DNA-Transfers verwendet werden, werden normalerweise von konjugativen Plasmiden oder anderen genetisch beweglichen Elementen wie integrierten konjugativen Elementen (ICE) kodiert. Plasmide sind in Bakterien allgegenwärtig und werden als eine Sammlung genetischer Module definiert, die in einem stabilen, normalerweise zirkulären, selbstreplizierenden Replikon organisiert sind, das normalerweise keine für Zellfunktionen essentiellen Gene enthält (Übersicht in Lit. 4). Mehrere dieser Module enthalten Gene, die Proteine ​​kodieren, die sich zu großen Komplexen zusammenfügen, die am häufigsten den eigenen Transfer des Plasmids auf eine bakterielle Empfängerzelle vermitteln, aber auch interessanterweise (aber selten) auf eine eukaryotische Zelle wie Hefe-, Pflanzen- oder menschliche Zellen 5-7 . Interessanterweise sind diese Module evolutionär mit Clustern verwandt, die auf genomischen Inseln einer begrenzten Anzahl bakterieller Pathogene wie Helicobacter pylori, Bordetella pertussis oder Legionella pneumophila wo sie eine wesentliche Rolle bei der Pathogenität spielen, indem sie Proteineffektoren in eukaryontische Wirte injizieren 8 (Abb. 1).

Abbildung 1. Die verschiedenen Prozesse, an denen T4S-Systeme beteiligt sind

Die Konjugation in Gram-negativen Bakterien wird durch drei große Komplexe vermittelt: eine DNA-Verarbeitungsmaschinerie, die „Relaxosom“ genannt wird, eine Membran-eingebettete Transportmaschinerie, die als „Typ-IV-Sekretionssystem (T4S)“ bezeichnet wird, und ein Pilus 9 .

Die Konjugation beginnt mit der Anordnung des Relaxosoms an einer bestimmten Stelle auf der Plasmid-DNA, die als „Ursprung des Transfers“ oder OriT bezeichnet wird. Das Relaxosom enthält ein Schlüsselprotein namens „Relaxase“ und eine Reihe von akzessorischen Proteinen. Die Relaxase spielt wesentliche Rollen: (i) Sie katalysiert eine Nicking-Reaktion an einem Einzelstrang der OriT-DNA am sogenannten nett -Stelle und reagiert kovalent mit dem 5'-Phosphat, das durch die Nicking-Reaktion erzeugt wird, und (ii) es bindet an das T4S-System durch Wechselwirkungen mit einem der Bestandteile der Transportmaschinerie, dem Kopplungsprotein (Übersicht in Lit. 10).

Das T4S-System ist eines von sechs Sekretionssystemen, die in beide Membranen gramnegativer Bakterien eingebettet sind 11 . Sie bestehen mindestens aus 12 Proteinen, die als „VirB1-11 und VirD4“ bezeichnet werden (um die Namensnomenklatur zu verwenden, die von der Agrobacterium tumefaciens T4S-System) 12 . Drei Komponenten, VirB7, VirB9 und VirB10, bilden den sogenannten Outer-Membran-Core-Komplex (OMCC), der in Gram-positiven T4S-Systemen fehlt, in denen kein OM vorhanden ist 13 . Die OMCC sind mit einem Inner-Membran-Komplex (IMC) verbunden, der aus VirD4, VirB4, VirB3, VirB6, VirB8 und einem Teil von VirB10 besteht. OMCC und IMC sind durch einen Stiel unbekannter Zusammensetzung verbunden, der vielleicht aus VirB2 und VirB5 14 oder VirB10 14-16 besteht. Mindestens zwei ATPasen (VirB4 und VirD4) oder manchmal drei (VirB4, VirD4 und VirB11) versorgen das System mit Energie.

Schließlich ist der konjugative Pilus gramnegativer Bakterien ein wesentliches Element bei der Konjugation. Jahrzehntelang war es das einzige Merkmal bei der Konjugation von Zellen, das beobachtet oder gereinigt werden konnte 17 . Es besteht aus einer Hauptkomponente, VirB2, und einer Nebenkomponente, VirB5. VirB2 assembliert zu einem großen helikalen Filament mit vielleicht VirB5 an seiner Spitze 18 . Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Pili entweder als Bindungsvorrichtungen dienen, die die Erkennung von und die Bindung an Empfängerzellen vermitteln, oder als eine Leitung für den Relaxase/ssDNA-Transport dienen oder beides. Einige konjugative Pili können sich zurückziehen, wodurch Spender- und Empfängerzellen 19 zusammengebracht werden, was zu einer engen Nachbarschaft führt. Tatsächlich wurden enge konjugative Verbindungen beobachtet, die zu der Annahme geführt haben, dass Zell-zu-Zell-Kontakte erforderlich sind, damit eine Konjugation stattfindet 20, 21 . Es wurde jedoch auch eine Übertragung beobachtet, wenn Zellen in einiger Entfernung voneinander sind (siehe ausführliche Diskussion unten) 22 .

In diesem Übersichtsartikel beschreibe ich zunächst den aktuellen Wissensstand zu jedem dieser Komplexe und diskutiere dann die verschiedenen und manchmal widersprüchlichen mechanistischen Erkenntnisse, die die neueste Forschung über die Mechanismen der Konjugation und Typ-IV-Sekretion gewonnen hat.


Aufbau der molekularbiologischen Plattform BOMB

Die wesentlichen Bestandteile einer magnetischen Bead-Plattform sind die Beads selbst und ein Magnet, der stark genug ist, um sie zu immobilisieren. Obwohl viele Life-Science-Forscher mit proprietären Beads vertraut sind (z. B. DynaBeads zum Einfangen von Antikörpern, AMPure-Beads zur Größenauswahl), wissen nur wenige, dass sie sowohl Beads als auch Magnetkomponenten selbst aus billigen Materialien zusammenbauen können. Dazu müssen jedoch einige möglicherweise unbekannte Konzepte erklärt werden.

Erstens gibt es für die Molekularbiologie üblicherweise verwendete magnetische Beads in zwei Hauptformen – entweder relativ kleine (50 nm bis 2 μm) Partikel, die aus einem festen Ferritkern aufgebaut sind, oder größere Ferrit-Polymer-Kombinationen (1–5 μm) [5]. Beide Bead-Typen eignen sich gut für die Aufreinigung und Manipulation von Nukleinsäuren, jedoch ändern ihre unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften ihr Verhalten. Zum Beispiel verringert das Polymer innerhalb der größeren Ferrit-Polymer-Kügelchen effektiv die Dichte der Kügelchen, so dass es weniger wahrscheinlich ist, dass sie sich während der Handhabungsschritte aus der Suspension absetzen. Die kleineren Ferritperlen mit festem Kern haben eine größere relative Oberfläche zum Binden und können auch leicht in einem molekularbiologischen Standardlabor hergestellt werden (siehe BOMB-Protokolle 1–3).

Ein wesentlicher Aspekt von Magnetbeads für die Molekularbiologie besteht darin, dass sie unabhängig von ihrer Größe chemisch beschichtet werden müssen. Der erste Grund dafür besteht darin, dem Wulst Stabilität zu verleihen. Ohne Beschichtung würde die Oxidation des Ferrits zu einer Kontamination potenziell empfindlicher Proben mit Eisenionen führen und die Beads würden mit der Zeit ihre magnetischen Eigenschaften verlieren. Darüber hinaus verleiht die chemische Beschichtung den magnetischen Beads eine zusätzliche Funktion. Am häufigsten werden beispielsweise Silica- oder Carboxyl-Polymer-Beschichtungen verwendet, da sie nicht nur die Beads stabilisieren, sondern auch chemisch relativ inert (Silica) oder negativ geladen (Carboxyl) sind, wodurch die Desorption der negativ geladenen Nukleinsäuren von den Beads erleichtert wird während der Elutionsschritte. Hier skizzieren wir ein einfaches Protokoll für die Herstellung von Silica- oder Carboxyl-beschichteten Beads in einem Standardlabor für Biowissenschaften und die Herstellung von Magnetgestellen, die für ihre Immobilisierung geeignet sind.


Wenn wir uns vorstellen, dass wir auf einem breiten Gehweg gehen und nicht über die Kante blicken können, weder auf die Seitenfläche noch auf die andere Seite, dann gibt es keine Möglichkeit, das zu sagen. Angenommen, der Gehweg hat einen Handlauf auf "beiden" Seiten, und Sie beginnen, den Handlauf zu markieren, während Sie Ihre rechte Hand darauf halten. Nachdem Sie eine vollständige Schleife abgeschlossen haben, befinden Sie sich unter dem Punkt auf der anderen Seite des Gehwegs, von dem aus Sie gestartet sind. Von dort aus sehen Sie noch keine Markierung, da Sie sich unterhalb des Pfades befinden, auf dem Sie gestartet sind. Wenn Sie weiterfahren, kehren Sie nach einer weiteren Schleife schließlich zum Ausgangspunkt zurück, und die einzige Markierung, die Sie sehen, befindet sich auf Ihrem Handlauf, nicht auf dem Handlauf auf der anderen Straßenseite zu Ihrer Linken.

Was hier passiert ist, wird klarer, wenn man bedenkt, was passiert, wenn wir einen Möbius-Streifen entlang seiner Mittellinie schneiden. Durch diesen Schnitt wird eine zweite Kante hinzugefügt, wodurch eine normale Schleife entsteht, von der eine Kante die ursprüngliche Kante des Mobius-Streifens ist und deren andere Kante durch den Schnitt erzeugt wird. Der im obigen Absatz beschriebene Spaziergang ist ein Spaziergang entlang einer Kante der resultierenden Schleife.

Wenn wir nach unten greifen und die seitliche Kante unseres Weges markieren können, gibt es eine Möglichkeit, dies zu erkennen. Wir machen regelmäßige Markierungen (oder eine durchgehende Markierung) entlang der Seitenkante zu unserer Rechten und überprüfen gelegentlich den Weg zu unserer Linken, um zu sehen, ob dort Markierungen an der Seitenkante des Weges sind. Auf halbem Weg der kompletten (2-Schleife) Wanderung würden Sie auf der linken Seite Markierungen bemerken, die von "unterhalb" des Weges gemacht wurden. Das wäre ein Beweis dafür, dass Sie auf einem Mobius-Pfad sind.


Die verworrene Komplexität der DNA entschlüsseln: Kombination von mathematischer Modellierung und experimenteller Biologie zum Verständnis von Replikation, Rekombination und Reparatur

Wie verändert die DNA, das Molekül, das die Erbinformation enthält, ihre dreidimensionale Form während der komplexen zellulären Prozesse der Replikation, Rekombination und Reparatur? Dies ist eine der Kernfragen der Molekularbiologie, die ohne mathematische Modellierung nicht beantwortet werden kann. Grundlegende Konzepte der Topologie und Geometrie können in die grundständige Lehre eingeführt werden, um den Studierenden zu helfen, kontraintuitive komplexe Strukturtransformationen zu verstehen, die in jeder lebenden Zelle auftreten. Topoisomerasen, eine faszinierende Klasse von Enzymen, die an der Replikation, Rekombination und Reparatur beteiligt sind, katalysieren eine Veränderung der DNA-Topologie durch eine Reihe hoch koordinierter mechanistischer Schritte. Biologie- und Mathematikstudenten im Grundstudium können die Prinzipien der Topoisomerase-Wirkung visualisieren und erforschen, indem sie leicht verfügbare Materialien wie Klettverschluss, Bänder, Telefonkabel, Reißverschlüsse und Schläuche verwenden. Diese einfachen Spielzeuge können als leistungsstarke Lehrmittel verwendet werden, um die Schüler in die praktische Erkundung einzubeziehen, mit dem Ziel, sowohl die Mathematik als auch die Biologie der DNA-Struktur zu lernen.


5. Proteine

Proteine ​​sind lineare Biopolymere, die aus verschiedenen Aminosäureresten bestehen, die durch Peptidbindungen kovalent miteinander verbunden sind. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei fast allen biologischen Prozessen, einschließlich der Zellsignalisierung, der Katalyse von Stoffwechselreaktionen und der strukturellen Unterstützung. Um ihre Funktion erfüllen zu können, müssen sich die meisten Proteine ​​zu einer kompakten 3D-Struktur (nativer Zustand) falten, die letztendlich durch ihre einzigartige Aminosäuresequenz bestimmt wird.

Viele tausend Proteine ​​mit den unterschiedlichsten Strukturen und Funktionen sind bekannt. Aufgrund ihrer strukturellen Variation und Komplexität wurde gezeigt, dass Proteine ​​ein breites Spektrum komplizierter topologischer Merkmale aufweisen (Abbildung 8). Intermolekulare nicht-kovalente Wechselwirkungen können zu verschränkten, oligomeren Ringen von Proteinuntereinheiten führen, wobei die beiden Ringe eine Hopf-Bindung bilden und daher untrennbar werden (Abbildung 8(a)) [133]. In anderen Fällen können kovalente Bindungen wie Disulfidbindungen oder Metall-Seitenketten-Wechselwirkungen auch zu kovalenten Verknüpfungen oder Knoten führen, die entweder während oder nach der Faltung gebildet werden. 8(b) veranschaulicht eine Hopf-Link-Struktur, die als Ergebnis intramolekularer Disulfidbindungen innerhalb jeder Untereinheit eines dimeren Proteins gebildet wird [134]. Darüber hinaus ist die kürzlich entdeckte Topologie des durchbohrten Lassobündels (PLB) ein Beispiel für ein knotenähnliches Motiv, bei dem die Disulfidbindung eine kovalente Schleife bildet, durch die ein Teil der Polypeptidkette gefädelt wird (Abbildung 8(c)) [135]. „Cysteinknoten“ können sich bilden, wenn eine Disulfidbindung zwischen zwei Segmenten einer Polypeptidkette einen Ring durchquert, der aus zwei anderen Disulfidbindungen und ihren verbindenden Rückgratsegmenten gebildet wird (Abbildung 8(d)). Beispiele sind die Cyclotid-Familie natürlich vorkommender pflanzlicher Miniproteine ​​und die Superfamilie der Wachstumsfaktoren und Toxine [136–138]. In all diesen Fällen wird die Verbindung oder der Knoten durch eine kovalente Bindung oder eine oligomere Struktur erzeugt.

Abbildung 8. Verschiedene Arten von topologisch komplexen Proteinstrukturen. In jedem Panel ist links die mit Pymol (www.pymol.org/) hergestellte Proteinstruktur dargestellt, rechts eine vereinfachte Darstellung der Topologie des Systems. (a) Die Kristallstruktur von bovinem mitochondrialem Peroxiredoxin III bildet eine Hopf-Verbindung, PDB-Code: 1ZYE. In der vereinfachten Darstellung stellen die blau und rot ausgefüllten Kreise eine einkettige Untereinheit dar, die sich zu einer oligomeren Ringstruktur höherer Ordnung assoziieren. (B) P. aerophilum dimere Citratsynthase ist topologisch durch zwei intramolekulare Disulfidbindungen (schwarze Balken) verknüpft, PDB-Code: 2IBP. Jede Proteinkette ist separat gefärbt, in diesem Fall blau oder blaugrün.(c) Eine durchbrochene Lassobündeltopologie der nativen Struktur von Leptin, bei der eine Disulfidbrücke (schwarze Balken) eine kovalente Schleife bildet, durch die ein Teil der Polypeptidkette gefädelt wird, PDB-Code: 1AX8. (d) Die Kristallstruktur des Nervenwachstumsfaktors enthält ein Cysteinknotenmotiv, das durch drei Disulfidbindungen (schwarze Balken) definiert ist, PDB-Code: 1BET. (e) Die Polypeptid-Rückgratkette von E coli Methyltransferase YbeA enthält einen Kleeblattknoten (31), PDB-Code: 1NS5. (f) Die Kristallstruktur der menschlichen Phosphatase hat eine Slipknotted-Topologie, PDB-Code: 1EW2. Für (c)–(f) sind sowohl Strukturen als auch reduzierte Darstellungen von blau (N-Terminus) nach rot (C-Terminus) gefärbt. Cysteinreste in (b)–(d) sind in der Struktur bzw. vereinfachten Darstellung als Stäbchen und Linien dargestellt.

Komplexe Topologien wie Linking oder Knoting können sich auch innerhalb der Proteinrückgratkette selbst manifestieren. Abbildung 8(e) veranschaulicht ein Beispiel für eine Klasse von Proteinen, die ein verknotetes topologisches Merkmal in ihren Strukturen aufweisen, die allein durch den Weg des Polypeptidrückgrats gebildet werden [13, 15, 139]. In einem anderen Fall entstehen Protein-Slipknot-Strukturen auch, wenn eine Proteinkette einen Knoten bildet, sich dann aber zurückfaltet, um den Knoten vollständig zu lösen, wodurch die Struktur in ihrer Gesamtheit entknotet wird (Abbildung 8(f)) [140–142] . Dieser Abschnitt des Aufsatzes konzentriert sich auf die Struktur, Funktion und insbesondere die Faltung dieser Arten von verknoteten und Slipknotted-Proteinen. Proteine, die durch kovalente Bindungen gebildete Knoten aufweisen, wie Disulfide, werden hier nicht diskutiert, und Leser, die sich für diese Strukturen interessieren, werden auf andere Veröffentlichungen zu diesen Systemen verwiesen [136, 137, 143–146].

5.1. Verknotete und Slipknotted Proteine

Lange Zeit hielt man es für sehr unwahrscheinlich, wenn nicht sogar unmöglich, dass sich eine Polypeptidkette zu einem funktionell gefalteten Protein „verknotet“. Dies lag zum Teil daran, dass zu diesem Zeitpunkt innerhalb der Proteindatenbank (PDB) keine Beispiele für tief verknotete Proteine ​​identifiziert wurden [147]. In dieser Studie wurde von Mansfield [147] ein sehr flacher Knoten in der Carboanhydrase entdeckt. Eine der Herausforderungen bei der Suche nach Proteinknoten war die Schwierigkeit festzustellen, ob ein Knoten in einer komplexen Struktur vorhanden ist. So blieben Knoten in Proteinstrukturen viele Jahre lang unentdeckt. Als verschiedene rechnerische und mathematische Werkzeuge entwickelt wurden, um Knoten zu erkennen und zu identifizieren, wurde klar, dass es topologisch verknotete Proteinstrukturen gibt, sogar einige mit extrem tiefen Knoten [24, 26, 148, 149]. Inzwischen gibt es einige Webserver, die die Knotenidentifikation in Proteinen vereinfacht haben und schnell feststellen können, ob eine Struktur einen Knoten enthält und wenn ja, welchen Typus [150, 151]. Darüber hinaus klassifiziert die kürzlich von Sulkowska und Mitarbeitern erstellte KnotProt-Datenbank (http://knotprot.cent.uw.edu.pl/) verknotete Proteine ​​und stellt ihre Verknotungskomplexität (Knotenart und Knotentiefe) als „Knoten“ dar Fingerabdruck' in Form eines Matrixdiagramms [142, 152, 153]. Matrixdiagramme, die eine hervorragende Methode zur Visualisierung von Knoten und Slipknots in Proteinen darstellen, wurden ursprünglich von der Yeates-Gruppe bei der Analyse von Slipknots in Proteinen verwendet [140].

Bis heute wurden über 750 verknotete Proteine ​​innerhalb der PDB entdeckt, was etwa 1% aller Einträge entspricht [152]. Eine aktuelle Liste von Beispielen dieser Strukturen ist in Tabelle 2 aufgeführt. Bemerkenswert ist, dass die KnotProt-Datenbank regelmäßig aktualisiert wird [152]. Im Laufe der Jahre wurde eine wachsende Zahl von verknoteten Proteinen in allen drei Lebensbereichen beobachtet [15, 142, 154]. Dazu gehören Strukturen, die ein Kleeblatt (31), Acht (41), Gordisch (52) und Stauer (61) Knoten mit drei, vier, fünf bzw. sechs projizierten Kreuzungen des Polypeptidrückgrats (Abbildung 9).

Tabelle 2. Beispiele für geknotete und Slipknotted Proteine. Für jede Faltung ist der PDB-Code für die Struktur des Proteins oder eines typischen Proteins in der Familie angegeben. + und − stehen für Rechts- und Linkshänderknoten bzw. Slipknots.

Proteinfamilie oder Protein PDB-Code Knotentyp
RNA-Methyltransferase (α/β Knoten) 1NS5 31 + Knoten
Carboanhydrase 1LUG 31 + Knoten
SAM-Synthetase 1FUG 31 + Knoten
Transcarbamylase-Faltung 1JS1 31 + Knoten
Natrium/Calcium-Austauschermembranprotein 3V5S 31 + Knoten
Zink-Fingerfalte 2K0A 31 − Knoten
Band-Helix-Helix-Superfamilie 2EFV 31 − Knoten
Künstlich verknotetes Protein 3MLG 31 − Knoten
Ketolsäurereduktoisomerase der Klasse II 1YVE 41 Knoten
Chromophor-Bindungsdomäne von Phytochrom 2O9C 41 Knoten
Ubiquitin C-terminale Hydrolasen (UCHs) 2ETL 52 − Knoten
α-Halogensäure-Dehalogenase I 3BJX 61 + Knoten
Alkalische Phosphatase 1ALK 31 + Slipknot
Thymidinkinase 1P6X 31 + Slipknot
Glutamat-Symport-Protein 2NWL 31 + Slipknot
Sulfatase 4TN0 31 + Slipknot
STIV B116 2J85 31 + Slipknot
Apoptose-induzierender Faktor 1GV4 31 − Slipknot
Natrium: Neurotransmitter-Symporter-Familie 2A65 31 + & 41 Slipknot
Betain/Carnitin/Cholin Transporter (BCCT)-Familie 4AIN 31 + & 41 Slipknot

Abbildung 9. Strukturen von verknoteten Proteinen, die die vier verschiedenen Arten von Knoten enthalten (31, 41, 52, 61) im Polypeptidrückgrat. (a) YbeA, ein kleeblattgeknüpfter (31) Methyltransferase aus E coli, PDB-Code: 1NS5. (B) E coli Klasse-II-Ketol-Säure-Reduktoisomerase, die die Acht (41) Knoten, PDB-Code: 1YRL. (c) Humane Ubiquitin-Carboxy-terminale Hydrolase L1 (UCH-L1), die einen Knoten mit fünf projizierten Kreuzungen (52), PDB-Code: 2ETL. (D) α-Halogensäure-Dehalogenase mit einem Stauer (61) Knoten, PDB-Code: 4N2X. Oberes Feld: Banddiagramme der mit Pymol hergestellten Polypeptidketten (www.pymol.org/). Unteres Panel: vereinfachte Ansicht der Proteinkette mit dem Knoten, erzeugt mit KnotPlot (http://knotplot.com/). Sowohl Strukturen als auch reduzierte Darstellungen sind von blau (N-Terminus) bis rot (C-Terminus) eingefärbt.

Kleeblattknoten sind die am weitesten verbreitete und einfachste Art von Knoten, die in Proteinen entdeckt wurden. Der erste identifizierte Protein-Kleeblattknoten wurde in der Carboanhydrase gefunden – einer Familie von Proteinen, die an der Katalyse der Reaktion von Kohlendioxid zu Hydrogencarbonat und H + beteiligt sind [147]. Dieses Kleeblatt ist jedoch eher flach, da sich der C-Terminus nur um wenige Reste durch eine breite Schleife erstreckt. Einige Jahre nach Mansfields Studie von 1994 wurde ein viel tieferer Kleeblattknoten in entdeckt E coli S-Adenosylmethioninsynthetase, ein Enzym, das die Reaktion zwischen Methionin und ATP katalysiert [155, 156]. Die mit Abstand größte und am besten untersuchte Familie tief verknoteter Proteine ​​ist das Kleeblatt α/β Knotenfalte – eine Klasse von Methyltransferasen (MTasen), die Mitglieder der SpoU-Familie sind [157, 158]. Diese verknoteten Proteine ​​haben gemeinsame Strukturmerkmale und es ist sehr wahrscheinlich, dass es sich bei allen um MTasen handelt, die die Übertragung der Methylgruppe von S-Adenosylmethionin (AdoMet) auf Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Sauerstoffatome in DNA, RNA, Proteinen und anderen kleinen Molekülen katalysieren [ 159]. In Lösung bilden alle Dimere, wobei die verknotete Region einen Teil der AdoMet-Bindungsstelle umfasst und einen großen Teil der Dimer-Grenzfläche bildet [157, 160–163]. Kleeblattknoten wurden auch in zwei Homologen der N-Succinylornithin-Transcarbamylase gefunden, der AOTCase aus X. campestris katalysiert die Reaktion von N-Acetylornithin und Carbamylphosphat zu Acetylcitrullin [164] und SOTCase aus B. fragilis fördert die Carbamylierung von N-Succinylornithin [165]. Kleeblattknoten wurden nicht nur in Enzymen gefunden, sondern auch in Rds3p, einem eukaryontischen metallbindenden Protein, das für das prä-mRNA-Spleißen essentiell ist [166] und neuerdings in der Familie der Natrium/Calcium-Austauschermembranproteine ​​[152].

Komplexere Knoten wurden auch in Proteinen identifiziert, die verschiedene enzymatische Reaktionen katalysieren. Bei pflanzlichen Ketolsäurereduktoisomerasen, die an der Biosynthese verzweigtkettiger Aminosäuren beteiligt sind, wurde ein tief eingebetteter Proteinknoten in Form einer Acht gefunden [167, 168]. Darüber hinaus wurde ein Gordischer Knoten in der Familie der Ubiquitin-Carboxyl-terminalen Hydrolasen (UCHs) von Säugetieren identifiziert sind am Ubiquitin-Proteasom-System beteiligt [169–171]. Der komplexeste bisher bekannte Proteinknoten ist der 61 Stauerknoten in DehI, a . entdeckt α-Halogensäure-Dehalogenase, die die Entfernung von Halogeniden aus organischen Halogensäuren katalysiert [154]. Abgesehen von diesen Enzymen wurde gezeigt, dass der Achterknoten auch in der Chromophor-Bindungsdomäne eines Rot/Far-Rot-Photorezeptor-Phytochroms aus Bakterium existiert D. radiodurans [172, 173].

Slipknotted-Strukturen wurden auch in einer Reihe von Proteinen gefunden (Abbildung 8(f)) [140]. Sie können mit den Standardmethoden zur Knotendetektion in Proteinen nicht identifiziert werden, da sich in diesen Fällen der Knoten auflöst, wenn die Kette an beiden Enden gezogen wird. Daher überrascht es nicht, dass diese Strukturen bis vor relativ kurzer Zeit übersehen wurden. 2007 entdeckten Yeates und Mitarbeiter erstmals eine Reihe von Protein-Slipknots, indem sie einen Ansatz verwendeten, der darauf beruhte, dass Slipknots irgendwann zu echten Knoten werden, wenn die Polypeptidketten verkürzt werden [140]. Gegenwärtig wurden über 450 Protein-Slipknots identifiziert [152] und eine Liste von Beispielen dieser Strukturen ist in Tabelle 2 aufgeführt. Es ist erwähnenswert, dass die KnotProt-Datenbank die erste und derzeit einzige Datenbank ist, die Details zu Slipknotted-Strukturen bereitstellt [152].

Alkalische Phosphatase ist die größte Familie von Proteinen, die tiefe Slipknots enthalten [15, 140, 152]. Im Falle des E coli alkalischer Phosphatase müssen 30 Reste vom C-Terminus entfernt werden, bevor eine verknotete Konformation entsteht. Ähnlich wie bei verknoteten Proteinen finden sich viele der bisher entdeckten Protein-Slipknots auch in anderen Enzymen wie Thymidinkinasen und Sulfatasen [15, 140, 152]. Interessanterweise wurden Slipknots auch in Transmembranproteinen gefunden, die sich über die gesamte Zellmembran erstrecken, in die sie dauerhaft eingebettet sind [15, 140, 152]. Beispiele sind die Familien der Natrium:Neurotransmitter-Transporter, Betain/Carnitin/Cholin-Transporter (BCCT) und Proton:Glutamat-Transporter [142].

Weitere Details zu verknoteten und Slipknotted-Proteinstrukturen finden sich in anderen neueren Übersichten [12, 13, 15, 174] und dem KnotProt-Server [152]. Anzumerken ist, dass die KnotProt-Datenbank auch umfangreiche Schlüsselinformationen zu den biologischen Funktionen von Proteinen mit Knoten und Slipknots liefert [152].

5.2. Mögliche Rollen und Auswirkungen von Knoten und Slipknot

Es wurde festgestellt, dass topologisch verknotete Proteine ​​in verschiedenen Familien konserviert sind [142], was darauf hindeutet, dass der Knoten selbst für die Funktion des Proteins vorteilhaft und wichtig sein kann. Es wurde spekuliert, dass eine verknotete Topologie eine Schlüsselrolle bei der Erhöhung der katalytischen Aktivität oder der Ligandenbindungsaffinität (möglicherweise durch abnehmende Dynamik) oder der Erhöhung der Stabilität (thermodynamisch, kinetisch und mechanisch) eines Proteins spielen könnte. Über die funktionellen Vorteile dieser komplexen Knotenstrukturen gegenüber ihren ungeknoteten Gegenstücken ist, wenn überhaupt, noch relativ wenig bekannt. Es wurden jedoch verschiedene experimentelle und rechnerische Studien durchgeführt, um diese Frage zu beantworten.

Viele Berichte haben gezeigt, dass die verknoteten Regionen verknoteter Proteine ​​eine entscheidende Rolle bei enzymatischen Aktivitäten und Ligandenbindung spielen. Wie in Abschnitt 5.1. diskutiert wurde, wurde beobachtet, dass die verknoteten Regionen der Proteine ​​in der α/β-knotted SpoU MTase-Familie umfasst einen Teil des aktiven Zentrums, an das der Ligand bindet (zwei Beispiele für α/β Knoten-MTasen sind in Abbildung 10(a)) dargestellt [159–162]. Im Fall der N-Succinylornithin-Transcarbamylase haben Virnau und Mitarbeiter durch eine Computerstudie gezeigt, dass das Vorhandensein des Knotens in der verknoteten homologen AOTCase sein aktives Zentrum strukturell modifizieren und anschließend seine enzymatische Aktivität verändern kann (in Bezug auf Substratspezifität) im Vergleich zu seinem ungeknotten Homologen OTCase (Abbildung 10(b)) [149]. Darüber hinaus werden Strukturstudien der D. radiodurans phytochrome zeigte, dass der tief eingebettete Knoten in der Chromophor-Bindungsdomäne mit dem Chromophor in Kontakt steht [172, 173]. Eine kürzlich durchgeführte Studie zur Konservierung von Knüpffingerabdrücken in UCHs zeigte auch, dass es eine Korrelation zwischen den Positionen der Reste des aktiven Zentrums und den Punkten gab, die seine geknotete Topologie (d. h. den geknoteten Kern) charakterisieren [142]. Trotz dieser Beispiele gibt es noch wenig direkte experimentelle Beweise dafür, dass eine verknotete Struktur die Aktivität eines Proteins beeinflussen kann.

Abbildung 10. Beispiele, die die potenziellen Rollen von Knoten und Slipknots hervorheben. (a) Dimere Strukturen der α/β-Knot MTasen YibK, PDB-Code: 1MXI (links) und YbeA, PDB-Code: 1NS5 (rechts), farbig, um die Knotenschlaufe in Cyan und die Knotenkette in Rot anzuzeigen. Als Stabmodell wird S-Adenosylhomocystein, ein MTase-Cofaktor, gezeigt. (b) Strukturen des verknoteten Abschnitts (Reste 171–278) von AOTCase mit dem Reaktionsprodukt N-Acetylcitrullin und wechselwirkenden Seitenketten als Stäbchen dargestellt, PDB-Code: 3KZK (links) und entsprechender (unverknoteter) Abschnitt (Reste 189–286 .) ) in OTCase mit dem Inhibitor L-Norvalin (analog zu seinem L-Ornithin-Liganden) und wechselwirkenden Seitenketten als Stäbchen dargestellt, PDB-Code: 1C9Y (rechts). Der Knoten enthält eine starre, prolinreiche Schlaufe (Reste 178–185, rot gefärbt), durch die die Kette gefädelt wird. (c) Linkes Feld: gentechnisch hergestellte verknotete und unverknotete („oberflächlich verknotete“) Polymere unter Verwendung von zwei verschiedenen Proteinkonstrukten. Rechtes Feld: Schmelzkurven der ersten Ableitung, die für die geknoteten und ungeknoteten Polymere erhalten wurden. Angepasst von [179], mit Genehmigung von Oxford University Press. (d) Strukturen der Transmembranproteine ​​LeuT(Aa), PDB-Code: 2A65 und Glt(Ph), PDB-Code: 2NWL, wobei die Slipknot-Schleife cyanfarben und die Slipknotted-Kette rot gefärbt ist. Helices werden als Zylinder dargestellt, um die Visualisierung zu erleichtern. Alle Strukturen werden mit Pymol (www.pymol.org/) hergestellt.

Auch die Frage, ob Knoten einen Einfluss auf die Konformationsdynamik von Proteinen haben, wurde aufgeworfen. Beim Phytochrom-Protein wurde festgestellt, dass der Achterknoten dort sitzt, wo eine erhöhte Steifigkeit wichtig sein könnte, um Konformationsänderungen voranzutreiben, die auftreten, wenn Lichtenergie vom Chromophor absorbiert wird [172, 175]. Neuere Computeransätze mit einfachen Gittermodellen haben ein schmales und weniger ausgedehntes natives Becken für ein 5 . gezeigt2-verknotete Struktur im Vergleich zu einer ähnlichen, aber nicht verknoteten, was auf eine erhöhte Steifigkeit hindeutet [176]. Experimentelle Studien von Andersson et al, die 15 N Spinrelaxationsparameter mit NMR-Experimenten für die 52-verknotetes UCH-L1 berichtete über keine signifikanten Unterschiede zwischen den Relaxationseigenschaften des verknoteten Proteins im Vergleich zu unverknoteten Proteinen ähnlicher Größe [177]. Somit bleibt insbesondere experimentell noch klar zu klären, ob verknotete Strukturen die Konformationsdynamik eines Proteins beeinflussen können.

Es wurden viele Forschungsanstrengungen unternommen, um die Frage zu beantworten, ob ein Knoten einer Proteinstruktur zusätzliche thermodynamische, kinetische oder mechanische Stabilität verleihen kann. Sulkowska et al führten grobkörnige Simulationen der thermischen und mechanischen Entfaltung der verknoteten (AOTCase) und unverknoteten (OTCase) Varianten der Transcarbamylase-ähnlichen Proteine ​​durch sowie ein synthetisches Konstrukt des verknoteten Elternproteins, das so umverdrahtet wurde, dass der Knoten entfernt wird [178] . In diesem Fall zeigte sich, dass die verknotete Struktur längere Entfaltungszeiten aufwies als die anderen beiden ungeknoteten Proteine, was auf topologische und geometrische Frustrationen zurückgeführt wurde [178]. Um die potenzielle thermische Stabilität von verknoteten Proteinen in einer experimentellen Studie zu untersuchen, konstruierten Yeates und Mitarbeiter ein verknotetes und ein ungeknotetes („oberflächlich verknotetes“) Polymer [179]. Sie zeigten, dass die verknotete Kette eine höhere thermische Stabilität aufwies als die unverknotete (Abbildung 10(c)), obwohl es wichtig zu beachten ist, dass die Entfaltung in beiden Fällen nicht vollständig reversibel war und daher nur scheinbare Schmelztemperaturen berichtet wurden. Computerstudien mit Monte-Carlo-Simulationen eines einfachen Gittermodells mit Gō-ähnlichen Potentialen zeigten jedoch, dass ein Kleeblattknoten keinen Einfluss auf die thermodynamische Stabilität einer einfachen Proteinstruktur hatte [180]. Stattdessen wurde festgestellt, dass der Knoten die kinetische Stabilität erhöht, da sich das geknotete Protein deutlich langsamer entfaltet als sein ungeknotetes Gegenstück [180]. Weitere Studien derselben Gruppe zeigten, dass ein topologisch komplexerer Proteinknoten, der 52 Knoten, die kinetische Stabilität des Proteins im Vergleich zu einem Protein mit einem 31 Knoten [176].

Die Widerstandsfähigkeit von verknoteten Proteinen gegenüber mechanischer Entfaltung wurde durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) untersucht. Das erste untersuchte System war die Carboanhydrase B mit flachen Kleeblattknoten. In diesem speziellen Fall wurde eine extrem hohe Entfaltungsresistenz beobachtet, wenn das Protein von seinen Termini gezogen wurde, im Gegensatz zu einem erheblich geringeren Widerstand, wenn das Molekül davon gezogen wurde andere Positionen, die zum Lösen des Knotens führen [181, 182]. Obwohl diese ersten Studien einen dramatischen Effekt eines Knotens auf die mechanische Stabilität nahelegten, wurden die Ergebnisse nicht in AFM-Studien anderer geknoteter Systeme beobachtet [175]. Im Fall der Carboanhydrase B haben neuere Simulationen die möglichen Gründe für ihre bemerkenswerte Mechanostabilität aufgeklärt [183]. Diese Studien zeigten, dass sich der Knoten nach einem anfänglichen, eher begrenzten Entfaltungsereignis um ein inneres β-Faltblattstruktur im Kern des Proteins. Somit wird der Knoten festgezogen, aber effektiv lokal von einem strukturellen Hindernis in der Kette eingefangen. Unterstützt wird dies durch die stabilisierende Wirkung eines Zinkions, das sich an den Bereich koordiniert, der sich durch den Knoten verheddert. Die Simulationen erklären, warum in den AFM-Experimenten die beobachtete Konturlänge so viel kleiner ist als die erwartete für eine vollständig gestreckte Polypeptidkette mit einem angezogenen Knoten. In einer interessanten Erweiterung ihrer anfänglichen Arbeit führten Ikai und Mitarbeiter eine Tandem-Wiederholung von Carboanhydrase B durch. Durch die Kombination von AFM mit biochemischen Aktivitäts- und Bindungsmessungen konnten sie nachweisen, dass die C-terminale Knotenregion für die Aktivität essentiell ist [ 184].

Die mechanische Stabilität des 41-verknotetes Phytochrom-Protein wurde auch von Bornschögl und Mitarbeitern mit AFM untersucht [175].In diesem Fall beobachteten sie jedoch keinen erhöhten Widerstand beim Anziehen des Knotens, da die Dehnungskraft zum Entfalten (73 pN) innerhalb des Bereichs lag, der für andere ungeknotete Proteine ​​gefunden wurde. Es scheint, dass die Frage, ob ein Knoten zur mechanischen Stabilität beiträgt oder nicht, von einer Reihe von Faktoren abhängen kann, einschließlich anderer Aspekte der Proteinstruktur und potenzieller Zuggeschwindigkeit/-kraft usw. Mehrere Computerstudien haben ergeben, dass das Verknoten die mechanische Stabilität eines verknoteten Proteins erhöhen könnte. Dadurch wird es resistenter gegenüber zellulären Translokations- und Abbauwegen [149, 178, 185, 186]. Ob das Verknoten einem verknoteten Protein gegenüber seinem ungeknoteten Gegenstück einen vorteilhaften stabilisierenden Effekt verleiht, ist noch immer nicht eindeutig und muss daher mit weiteren experimentellen und rechnerischen Studien getestet werden.

Die inzwischen identifizierte erhebliche Zahl von Protein-Slipknots hat auch die Frage aufgeworfen, ob solche Topologien eine funktionelle oder strukturelle Rolle im Protein spielen. Im Fall der homodimeren E coli alkalische Phosphatase, Yeates und Mitarbeiter konstruierten Cysteinreste an verschiedenen Positionen in der hervorstehenden Schleife des Slipknot, so dass die intermolekulare Disulfidbindung zwischen den beiden Untereinheiten zu einem verknoteten System führte [140]. Unter Verwendung der thermischen Denaturierung zeigten die Ergebnisse, dass die verknoteten Mutanten thermisch stabiler waren als entweder die Wildtyp- oder andere Kontrollmutanten. Dies deutete darauf hin, dass der Slipknot in der Struktur eine Rolle bei der Thermostabilität des Enzyms spielen könnte [140]. Es ist auch erwähnenswert, dass das Slipknotted B116-ähnliche Protein in einem Virus gefunden wird, das thermophile Sulfolobus Archaebakterien [140]. In einer anderen Studie zeigten Knotting-Fingerprint-Analysen von Transmembran-Transportkanälen aus fünf verschiedenen Proteinfamilien, dass die Slipknotted-Topologie erhalten bleibt. Dies hat zu Spekulationen geführt, dass die Slipknot-Schleife, die mehrere Transmembranen zusammenschnürt α-Helices, können ihre Position innerhalb der Membran während ihrer Transporter- und Symporterwirkung stabilisieren [142] (siehe Abbildung 10(d) für Beispiele der Strukturen von zwei Slipknotted-Transmembranproteinen).

5.3. Experimentelle und rechnerische Einblicke in die Faltung von verknoteten und Slipknotted-Proteinen

Die Untersuchung, wie Proteine ​​ihre einzigartige 3D-Konformation (nativer Zustand) erreichen, stand im Fokus vieler Forscher auf dem Gebiet der Proteinfaltung. Viele Jahrzehnte lang konzentrierten sich umfangreiche Faltungsstudien auf kleine, monomere Proteine ​​und damit sind die Mechanismen ihrer Faltung heute relativ gut etabliert [187–191]. Dazu gehören Gerüst-, Nukleations-Kondensations- und hydrophobe Kollaps-Mechanismen, die als Punkte auf einem Spektrum eines einheitlichen Mechanismus angesehen werden können [187, 188]. Aktuelle Faltungstheorien haben gezeigt, dass kleine, monomere Proteine, die sich effizient und schnell falten, ihre energiearme niederenergetische Konfiguration aus einem Ensemble von denaturierten Polypeptidketten hoch kooperativ erreichen und relativ glatte, trichterförmige Energielandschaften durchqueren können [192, 193] . Es ist jedoch noch unklar, wie diese Konzepte und Mechanismen auf größere Proteine ​​mit komplexeren Topologien einschließlich der Klassen der verknoteten und Slipknotted-Proteine ​​anwendbar sind. Solche Proteine ​​müssen nicht nur kinetische Fallen vermeiden, sondern auch erhebliche topologische Barrieren während der Faltung überwinden. Dieser Abschnitt fasst die jüngsten Entwicklungen zum Verständnis der Mechanismen zusammen, die an der Bildung dieser Arten komplexer Strukturen beteiligt sind.

5.3.1. Experimentelle Studien an verknoteten Proteinen.

Obwohl die Aufklärung der Faltung von verknoteten Proteinen mit experimentellen Ansätzen eine Herausforderung bleibt, wurden in den letzten Jahren einige bedeutende Fortschritte erzielt. Die meisten experimentellen Faltungsstudien an verknoteten Proteinen konzentrierten sich auf die kleeblattverknoteten α/β MTasen, YibK aus H. Influenzae und YbeA von E coli [194–201]. Beide Proteine ​​sind Homodimere, die an die Co-Faktoren AdoMet und S-Adenosyl-Homocystein (AdoHcy) binden und am C-Terminus einen Kleeblattknoten enthalten, in dem mindestens 40 Reste eine ähnlich große Schleife passieren (Abbildung 10(a)) [160, 202]. Umfangreiche biophysikalische Techniken wurden eingesetzt, um die Knoten- und Faltungsmechanismen von gereinigtem, rekombinant exprimiertem YibK und YbeA zu untersuchen. Beide entfalten sich reversibel in vitro bei Zugabe von chemischem Denaturierungsmittel mit gleichzeitigem Verlust der Sekundär- und Tertiärstruktur [195, 198]. Kinetische Studien zeigten, dass sich YibK und YbeA über sequentielle Mechanismen ähnlich falten, die einen oder mehrere monomere Zwischenzustände und einen langsamen geschwindigkeitsbestimmenden Dimerisierungsschritt beinhalten [196, 198].

Um Kettenverknüpfungsereignisse während der Faltung von YibK und YbeA zu untersuchen, konstruierten Mallam und Mitarbeiter einen Satz verknoteter Fusionsproteine, in denen A. fulgidus Dieses, ein stabiles 91-Reste-Protein, wurde an die N-, C- oder beide Termini beider MTasen fusioniert [201]. Dies wurde als "molekularer Stopfen" verwendet, um das Einfädeln zu unterbrechen oder das Verknoten der Kette insgesamt zu verhindern. Bemerkenswerterweise zeigten diese Experimente, dass beide Proteine ​​der Fusion zusätzlicher Domänen an ihren N- und C-Termini standhalten und in der Lage sind, sich in native oder native-ähnliche Zustände zu falten, die in der Lage sind, Cofaktor zu binden. Die in dieser Studie erzeugten Fusionsproteine ​​stellen einige der am tiefsten verknoteten bekannten Proteine ​​dar, wobei die C-terminalen Fusionen etwa 140 oder mehr Reste erfordern, um eine Schleife zu passieren, um den verknoteten nativen Zustand zu bilden. Überraschenderweise zeigten alle Fusionsproteine ​​Entfaltungs- und Rückfaltungskinetiken, die der Mutter-MTase sehr ähnlich waren, was den ersten Hinweis darauf gibt, dass die Polypeptidkette auch in einem stark unstrukturierten chemisch denaturierten Zustand verknotet bleiben könnte. Dies wurde später durch in vitro Faltungsexperimente an zirkularisierten Varianten von YibK und YbeA, Mallam und Mitarbeiter entdeckten, dass die denaturierten Ensembles selbst in hohen Konzentrationen des chemischen Denaturierungsmittels, unter denen keine oder nur eine geringe Sekundär- oder Tertiärstruktur vorhanden war, kinetisch eingefangene verknotete Polypeptidketten enthielten [194] . Es wurde dann festgestellt, dass alle vorherigen in vitro Faltungsexperimente an diesen rekombinant exprimierten und chemisch denaturierten Proteinen untersuchten tatsächlich die Rückfaltung von einem ungefalteten, aber verknoteten denaturierten Zustand zu einer verknoteten und gefalteten nativen Struktur. Dieses unerwartete Ergebnis legt nahe, dass es im denaturierten Zustand Wechselwirkungen gibt, die den Knoten kinetisch stabilisieren. Obwohl CD-Messungen im fernen UV darauf hindeuten, dass im denaturierten Zustand keine signifikante Sekundärstruktur vorhanden ist, zeigen neuere NMR-Zuordnungen des Rückgrats und chemische Verschiebungen von Harnstoff-denaturiertem YbeA, dass unter diesen Bedingungen tatsächlich noch eine gewisse Restsekundärstruktur verbleibt [203 ]. Die Tatsache, dass der Knoten über einen langen Zeitraum im denaturierten Zustand bestehen kann, wurde auch von einer anderen Gruppe bestätigt, die teilte, dass Gleichgewichtsentfaltungs- und -rückfaltungsübergänge einer strukturhomologen MTase eine scheinbare Hysterese zeigten [204]. Es wurde spekuliert, dass dieses Verhalten mit der Entkopplung der Entfaltungs- und Entbindungsereignisse des verknoteten Proteins übereinstimmt [204]. Kürzlich wurden Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)-Experimente durchgeführt, um den denaturierten Zustand von TrmD, einer weiteren kleeblattverknoteten MTase, zu charakterisieren [205]. Die Ergebnisse legten nahe, dass der Knoten nicht nur unter denaturierenden Bedingungen (ähnlich denen von YibK und YbeA) erhalten blieb, sondern während des Entfaltungsprozesses auch zum C-Terminus der Polypeptidkette glitt [205].

Bis vor kurzem gab es keine experimentellen Studien darüber, wie der Knoten zuerst aus einer ungeknoteten linearen Polypeptidkette gebildet wird. Bei Verwendung eines gekoppelten in vitro Transkriptions-Translations-System und kinetische Puls-Proteolyse-Experimente konnten Mallam und Jackson die Faltung entstehender Ketten von YibK und YbeA nach ihrer ersten Synthese durch das Ribosom spezifisch untersuchen (Abbildung 11(a)) [199]. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die entstehenden Ketten korrekt zu ihrer kleeblattgeknüpften Struktur falten konnten, wenn auch sehr langsam. Darüber hinaus wurde eine signifikante Verzögerungszeit zwischen der Kettensynthese und dem Auftreten eines proteolytisch stabilen nativen Zustands beobachtet. Die Ergebnisse stimmten mit der Proteinverknotung und -faltung einer anfänglich ungeknoteten entstehenden Kette überein und zeigten somit, dass ein mit dem Verknotungsschritt verbundener Prozess geschwindigkeitsbestimmend ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das GroEL-GroES-Chaperonin einen dramatischen Einfluss auf die Faltungsgeschwindigkeit der neu translatierten Polypeptidketten hat, was belegt, dass Chaperonine wahrscheinlich bei der posttranslationalen Faltung dieser bakteriellen Knotenproteine ​​wichtig sind in vivo.

Abbildung 11. Experimentelle Charakterisierung der Faltung der kleeblattverknoteten Methyltransferasen YibK und YbeA. (a) Eine schematische Darstellung der experimentell beobachteten Faltungs- und Knotenwege. (b) Ein schematisches Diagramm, das einen möglichen aktiven Mechanismus für die bakterielle GroEL-GroES-Chaperonin-Wirkung auf die Faltung der bakteriellen kleeblattverknoteten Methyltransferase veranschaulicht. D, denaturiert I, Zwischenstufe N, nativ.

Vor kurzem haben wir das Knüpf- und Faltungsverhalten der entstehenden Ketten der verschiedenen N- und C-terminalen Diese Fusionen von YibK und YbeA unter Verwendung der gekoppelten in vitro Transkriptions-Translationssystem und kinetische Puls-Proteolyse-Experimente [206]. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Multidomänenproteine ​​mit extrem tiefen Knoten synthetisiert werden können in vitro und ohne molekulare Begleitpersonen spontan verknoten, wenn auch sehr langsam. Darüber hinaus wurde geschlussfolgert, dass der C-Terminus dieser Proteine ​​entscheidend für das Einfädeln der Polypeptidkette zur Bildung des Knotens ist, was die ersten experimentellen Einblicke in den Knotenmechanismus dieser Klasse von bakterieller verknoteter MTase liefert. Weitere Experimente mit dem GroEL-GroES-Chaperonin zeigten, dass es die Faltung von verknoteten Proteinen durch einen Mechanismus aktiv unterstützt, der die Entfaltung kinetisch gefangener unverknoteter und fehlgefalteter Zwischenstufen beinhalten kann (Abbildung 11(b)). Diese Schlüsselbeobachtungen liefern nicht nur wichtige Informationen über den komplexen Faltungsweg von kleeblattverknoteten Proteinen, sondern auch weitere Einblicke, wie topologisch verknotete Proteine ​​dem evolutionären Druck standgehalten haben und eine effiziente Faltung erreichen in vivo.

Im Jahr 2010 konstruierte die Yeates-Gruppe ein künstlich mit Kleeblatt verknotetes Protein, indem sie zwei Monomere kovalent miteinander verknüpfte, die in der dimeren Struktur von HP0242 aus H. pylori [207]. Ein in vitro Die experimentelle Charakterisierung dieses entworfenen verknoteten Proteins und einer ungeknoteten monomeren Variante des HP0242-Dimers wurde durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass, obwohl die geknotete Variante stabiler war als die ungeknotete, sie sich mit einer erheblich langsameren Geschwindigkeit (ca.

AFM wurde auch verwendet, um die mechanische Entfaltung der mit flachem Kleeblatt verknoteten Carboanhydrase B zu untersuchen. In diesem Fall verlängerte sich die Polypeptidkette auf eine viel kürzere Strecke als ihre theoretische Strecklänge, was darauf hindeutet, dass die verknotete Struktur gestrafft ist, aber beibehalten [182, 208]. In ähnlicher Weise ergaben AFM-Experimente zur mechanischen Entfaltung des Achterknotens in der Chromophor-bindenden Domäne des Phytochroms ebenfalls einen straffen Knoten von ungefähr 17 Resten [175]. Obwohl diese Experimente nicht unbedingt umfassende Informationen über die Faltungswege dieser Proteine ​​liefern, waren sie entscheidend für den Nachweis, dass die Knoten in der Struktur vorhanden waren, und für die Bestimmung der minimalen Länge der Polypeptidkette, die zum Knüpfen erforderlich ist.

Neben den oben ausführlich beschriebenen kleeblattverknoteten Proteinen ist die andere Familie verknoteter Proteine, deren Faltungswege im Wesentlichen experimentell charakterisiert wurden,2-verknotete UCHs [177, 209]. Die Entfaltung zweier humaner UCHs-UCH-L1, einer neuronalen Form des Enzyms, und UCH-L3, das in vielen Zelltypen ubiquitär exprimiert wird, wurde bestimmt und in beiden Fällen in vitro die Entfaltung/Rückfaltung mit chemischen Denaturierungsmitteln erwies sich als vollständig reversibel [177, 209]. Im Fall von UCH-L3 wurden die Gleichgewichtsentfaltungsdaten an ein einfaches Zweizustandsmodell angepasst [209], während die für UCH-L1 mit einem Dreizustandsmodell konsistent waren, in dem ein Zwischenzustand besetzt ist [177]. Mittels NMR-Experimenten mit Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) wurde der Zwischenzustand indirekt charakterisiert und es wurde festgestellt, dass das zentrale β-Blattkern des Proteins bleibt strukturiert, während viele der umgebenden α-Helices haben sich entfaltet [177]. Obwohl eine vollständigere Analyse des Faltungsweges von UCH-L1 noch nicht veröffentlicht werden muss, ähnelt die Faltung der von UCH-L3, sodass beide mehrere Entfaltungs- und Rückfaltungsphasen aufweisen, die auf parallele Wege und die Population von mindestens zwei hinweisen. metastabile Zwischenzustände (Luo et al unveröffentlichte Ergebnisse).

5.3.2. Computerstudien an verknoteten Proteinen.

Viele Computerstudien haben viel Licht auf die Faltung von verknoteten Proteinen geworfen. Grobkörnige Simulationen waren hervorragend geeignet, die möglichen Mechanismen und allgemeinen Merkmale der Faltung von verknoteten Proteinen aufzudecken [210, 211]. Wallin et al führte die erste solche Simulation mit a Cα Modelldarstellung von YibK und beobachteten ähnlich wie experimentelle Studien zwei parallele Faltungswege [210]. Sie kamen auch zu dem Schluss, dass spezifische, nicht-native Wechselwirkungen mit Resten in der C-terminalen Region der Kette erforderlich sind, damit das Protein erfolgreich verknoten und falten kann. Im Gegensatz dazu zeigten Sulkowska und Mitarbeiter, dass allein native Wechselwirkungen ausreichen, um die Faltung von YibK und YbeA mit einem grobkörnigen strukturbasierten Modell zu simulieren, obwohl die Anzahl der erfolgreichen Trajektorien nur 1 – 2 % betrug [211]. Diese Simulationen zeigten auch, dass partielle Entfaltungsereignisse (Backtracking) erforderlich waren, da die Reihenfolge, in der native Kontakte gebildet werden, entscheidend für die korrekte Faltung der verknoteten Struktur ist und dass die Faltung häufig durch ein Slipknotted-Intermediat auftrat (Abbildung 12(a)). Wichtig ist, dass in derselben Studie Simulationen einer umverdrahteten, nicht verknoteten Variante festgestellt haben, dass es signifikante topologische Barrieren bei der Faltung der verknoteten Struktur gibt [211]. Unter Verwendung eines ähnlichen Modells zeigten erste Ergebnisse neuerer kinetischer Entfaltungssimulationen einer strukturell homologen MTase, dass die Entfaltung des Proteins in einen vollständig entfalteten, ungeknoteten Zustand in einem schrittweisen Prozess erfolgt [204]. Darüber hinaus zeigten die Simulationen, dass das Entknoten der Kette im Vergleich zum anfänglichen Entfalten langsam ist [199].

Abbildung 12. Computersimulationen der Faltungswege von verknoteten Proteinen. (a) Strukturbasiertes Modell, das verwendet wird, um die Faltung von kleeblattverknoteter MTase zu simulieren, wobei der Faltungsweg, der zur nativen verknoteten Konformation führt, über eine dazwischenliegende 'Slipknot'-Konfiguration erfolgt. Falsche Konfigurationen müssen einen "Backtracking"-Mechanismus verwenden, um kinetischen Fallen zu entkommen, die als topologische Barrieren wirken. Angepasst nach [211]. (b) Schnappschüsse aus der Faltungssimulation des 61-verknotetes Protein, DehI. Copyright 2010 Bölinger et al [154]. (c) Eine auf allen Atomen basierende molekulardynamische Simulation des Faltungsweges von MJ0366. Das Protein bildet eine Schleife mit der korrekten Chiralität (I), von der es zwei Routen in den nativen Zustand (N) folgt: eine „Plugging“- oder „Slipknotting“-Route. T ist ein Beispiel dafür, wie das Protein kinetisch eingefangen werden kann und daher nicht in der Lage ist, zu N zu gelangen. Nach [141]. (d) Schematische Darstellungen des Ziehens eines kleeblattgeknüpften Proteins an verschiedenen Punkten (durch die Kreise angezeigt) und der daraus resultierenden endgültigen Konformationen.

Ähnliche Rechenansätze wurden auch in den Faltungssimulationen des 61-Knoten in DehI [154]. Obwohl die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Faltungen gering war, zeigte die Studie, dass die komplexe Knotenstruktur durch einen einfachen Bindeprozess gebildet werden kann. In diesem Fall werden zwei ungeknotete Schleifen, eine kleine Schleife und eine größere Schleife (die eine prolinreiche unstrukturierte Region enthält) ausgerichtet und ein Knoten kann auf zwei alternativen Wegen gebildet werden (Abbildung 12(b)) [154]. In der ersten Route wird der C-Terminus über eine Slipknot-Konformation durch die kleinere Schleife (S-Schleife) gefädelt, bevor die größere Schleife (B-Schleife) über die kleinere Schleife gedreht wird. Bei der anderen Route ist die Reihenfolge der beiden Schritte umgekehrt.

Im Gegensatz zu sehr kleinen Proteinen mit einfachen Architekturen (die im Allgemeinen schnelle Entfaltungs- und Faltungsraten aufweisen) wurden Simulationen der Moleküldynamik (MD) nur aus Atomen auf verknotete Systeme angewendet, da sie häufig zu groß für solche atomistischen Ansätze sind. Gebraucht. Allerdings konnte diese Methode in wenigen Fällen auch an kleinen, flach geknoteten Proteinen angewendet werden, wie z. B. für MJ0366 aus M. Jannaschii, eines der kleinsten bisher entdeckten kleeblattverknoteten Proteine ​​[141]. Daten aus einer thermodynamischen Analyse der Entfaltung/Faltung zeigten, dass das System dreistufig ist und zuerst durch Verdrehen einer Schleife ein Zwischenprodukt gebildet wird, gefolgt von einem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt, der mit dem Einfädeln des C-Terminus durch die Schleife verbunden ist . Bei Temperaturen nahe der Faltungstemperatur wurden zwei Faltungsmechanismen für die Bildung der verknoteten nativen Struktur beobachtet, wobei das Einfädeln über (i) eine Verstopfungsroute (der C-Terminus geht zuerst durch die Knotenschlaufe) oder (ii) die Bildung erfolgen kann eines Slipknot (Abbildung 12(c)) [141]. Interessanterweise führte das Absenken der Temperatur der Simulation zu mechanistischen Veränderungen. Dazu gehören eine Verknotung durch Einfädeln des N-Terminus und das „Backtracking“ von fehlgefalteten Proteinen in topologischen Fallen. In jüngerer Zeit zeigten Simulationen an VirC2, einem Protein mit der gleichen Faltung wie MJ0366, das jedoch einen tieferen Knoten besitzt, ein ähnliches Profil der freien Energie, was darauf hindeutet, dass die Topologie eine wichtige Rolle beim Faltungsmechanismus spielt [212]. Ein Gō-ähnliches Potential mit minimaler Energiefrustration wurde auch verwendet, um die Faltung einer verkürzten Mutante einer anderen kleeblattverknoteten MTase zu simulieren [213]. Die Ergebnisse dieser Studie legten einen Weg nahe, bei dem sich die N-terminale Region des Proteins zuerst faltet und dass das Einfädeln des C-Terminus durch die Struktur zur Bildung des Knotens ein später und geschwindigkeitsbestimmender Schritt ist [213].

Molekulardynamiksimulationen wurden auch verwendet, um die Hochtemperatur-Entfaltung von YibK zu simulieren [214]. Die Simulationen ergaben bis zu vier Zwischenzustände in der Landschaft der freien Energie, die mit den in experimentellen Studien beobachteten parallelen Pfaden und mehreren Zwischenstufen übereinstimmen.Außerdem wurde festgestellt, dass sich der denaturierte Zustand von YibK erst bei sehr hohen Simulationstemperaturen auflöst, wenn der C-Terminus über eine Slipknot-Konformation aus der Knotenschlinge herausfädelt. Andere Entfaltungssimulationen wurden auch verwendet, um die mechanische Stabilität von verknoteten Proteinen und den Einfluss von Zugposition, Zuggeschwindigkeit und Temperatur auf die Entfaltung/Entfesselung zweier anderer MTasen zu untersuchen [215]. Es hat sich gezeigt, dass das Ziehen der Kette an beiden Enden zum Festziehen des Knotens führt, während das Ziehen an anderen Stellen zum Entknoten der Kette führen kann (Abbildung 12(d)).

Verschiedene Computerstudien haben auch Monte-Carlo-Simulationen an Gittermodellen mit Gō-ähnlichen Potentialen verwendet, um den Faltungsmechanismus von verknoteten Proteinen zu verstehen. In diesen Fällen wird ein auf einem generischen Polymermodell basierendes Potenzial verwendet und zusätzliche attraktive Wechselwirkungen für Reste aufgenommen, die im nativen Zustand miteinander in Kontakt stehen. Faisca und Mitarbeiter zeigten, dass die Faltung eines stark verknoteten Kleeblatt-Modellproteins viel langsamer war als eine strukturell ähnliche, aber nicht geknotete Variante, und dass die Verknotung ein spätes Ereignis war und mit der Faltung einherging [216]. Mit dem gleichen Modell untersuchten Soler und Faisca den Effekt des Oberflächen-Tetherings auf die Faltung des Systems [217]. In diesem Fall wurde gezeigt, dass die Beweglichkeit des dem Knoten am nächsten liegenden Endes für eine erfolgreiche Faltung entscheidend ist und eine Behinderung zu einer Abnahme der Faltungsrate und einer Änderung des Knotenweges führt, so dass es zum Einfädeln des anderen Endes kommt. Kürzlich hat dieselbe Gruppe diese Studien erweitert und das gleiche Modell verwendet, um den Einfluss von Knoten, Knotentiefe und Motiv auf die Faltungseigenschaften von 3 . genauer zu untersuchen1-verknotete Proteine ​​[180]. Die Ergebnisse zeigten, dass tief verknotete Proteine ​​eine höhere Wahrscheinlichkeit haben, ihre Knoten im denaturierten Ensemble zu behalten, was mit experimentellen Studien übereinstimmt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass spezifische native Kontakte innerhalb des kleeblattverknoteten Kerns entscheidend sind, um den Knoten im denaturierten Zustand zu erhalten, und dass das Einfädeln in den späten Stadien der Faltung auftritt [180]. Kürzlich erweiterten Soler und Mitarbeiter ihre Studien, um den Faltungsmechanismus des komplexeren 52-Knoten [176]. Ähnlich wie bei den Kleeblattknoten wurde gezeigt, dass der dem Knotenkern am nächsten liegende Kettenende für die Einfädelbewegung zur Bildung des Knotens wichtig ist und in keinem Fall ein Mechanismus war, der die anfängliche Bildung eines 31-Knoten beobachtet. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Wahrscheinlichkeit einer gleichzeitigen Verknotung und Faltung von 52-verknotete Proteine ​​sind deutlich kleiner als bei Kleeblattknoten als Einfädeln zur Bildung des 52 Knoten ist ein besonders spätes Konformationsereignis [176].

Monte-Carlo-Simulationen eines Cα Modell der kleeblattverknoteten AOTCase zeigte, dass nicht-native Kontakte zwischen dem C-Terminus und anderen Regionen im Protein entscheidend sind, um die Knotenschleife zu bilden, durch die die Kette gefädelt wird [218], im Einklang mit der Studie von Wallin und Mitarbeitern [210]. Die Bedeutung nicht-nativer Wechselwirkungen bei der Förderung der Faltung der nativen Knotentopologie von AOTCase und MJ036 wurde kürzlich auch in Simulationen unter Verwendung von Proteinmodellen mit unterschiedlicher struktureller Auflösung (grobkörnig oder atomistisch) und verschiedenen Kraftfeldern (von rein nativ-zentrisch) hervorgehoben zu realistischen atomistischen) [219]. Wiederum scheint es, dass diese Kontakte zwischen dem C-Terminus und einer Schleife gefunden wurden, durch die die Kette gefädelt wird.

5.3.3. Experimentelle und rechnerische Studien zu Slipknots.

Zahlreiche Simulationsstudien haben gezeigt, dass ein Slipknot eine wichtige Zwischenkonfiguration bei der Faltung von verknoteten Proteinen sein kann [141, 142, 211, 212] und somit könnte das Verständnis der an ihrer Bildung beteiligten Mechanismen Aufschluss darüber geben, wie tief verknotete Proteine ​​falten. Mit strukturbasierten grobkörnigen Simulationen untersuchten Sulkowska und Mitarbeiter die Faltung der Thymidinkinase und fanden heraus, dass ihre Slipknot-Struktur durch einen einfachen „Flipknot“-Mechanismus erreicht werden kann, bei dem eine Slipknot-Schleife über den ungeknoteten nativen Kern des Proteins rotiert [211]. Die Rotation der Schleife wird höchstwahrscheinlich durch das Vorhandensein von Glycin- und Prolinresten in den Hinge-Regionen unterstützt [211]. Die beobachtete geringe Erfolgsrate von Faltungsereignissen deutet jedoch darauf hin, dass möglicherweise andere Faktoren erforderlich sind, um die topologische Barriere zu überwinden, oder dass die Barriere groß ist. Dieselbe Gruppe erweiterte diese Studien und verwendete dasselbe Modell, um die mechanische Entfaltung des Slipknots im selben Protein zu analysieren [220]. Schwache Dehnungskräfte führten zu einem sanften Auflösen des Rutschknotens, während bei ausreichend großen Zugkräften ein metastabiles Zwischenprodukt mit festgezogenem Knoten beobachtet wurde. Bemerkenswert ist, dass sich dieses Verhalten von Slipknotted-Strukturen von dem bei einheitlich elastischen Polymeren beobachteten unterscheidet [220]. Kürzlich verwendeten He und Mitarbeiter AFM, um experimentell die mechanische Entfaltung von AFV3-109 zu untersuchen, einem Protein mit einer relativ einfachen Slipknotted-Struktur [221, 222]. Die Ergebnisse zeigten, dass sich der Slipknot löste und die Polypeptidkette vollständig verlängert war, wenn wie erwartet an beiden Enden mechanische Kräfte aufgebracht wurden [221]. Im Gegensatz dazu führte das Aufbringen von Kräften am N-Terminus und der eingefädelten Schlaufe dazu, dass sich der Gleitknoten zu einem Kleeblattknoten zusammenzog, wobei

13 Aminosäurereste [222]. In beiden Fällen wurde festgestellt, dass der Entfaltungsprozess über mehrere parallele Pfade entweder in zwei oder drei Zuständen verläuft und mit einem kinetischen Aufteilungsmechanismus für die mechanische Entfaltung übereinstimmt [221, 222].

5.4. Evolution und Erhaltung

Trotz der Tatsache, dass es mittlerweile eine beträchtliche Anzahl topologisch verknoteter Proteine ​​in der PDB gibt, ist es erwähnenswert, dass die meisten Proteine ​​nicht verknotet sind. Dies legt nahe, dass die Evolution solche Strukturen im Allgemeinen vermieden hat. Eine neuere Studie von Sulkowska und Mitarbeitern hat jedoch festgestellt, dass, wenn sie auftreten, trotz sehr geringer Sequenzähnlichkeit sowohl verknotete als auch verknotete Topologien über verschiedene Familien hinweg erhalten bleiben [142]. Es überrascht nicht, dass die stark konservierten Teile von Proteinen innerhalb des verknoteten Kerns zu finden sind und potenzielle Scharnierregionen, von denen vermutet wurde, dass sie beim Einfädeln der Kette zu einem Knoten oder Slipknot wichtig sind [142].

Für einige Proteinfamilien, bei denen es eine beträchtliche Anzahl von verknoteten und ungeknoteten Varianten gibt, war es möglich, eine phylogenetische Analyse der Sequenzen durchzuführen und dadurch zu identifizieren, wie sich verknotete Strukturen aus ungeknoteten Vorfahren entwickelt haben könnten. Potestio und Mitarbeiter erstellten einen phylogenetischen Baum von Transcarbamylase-ähnlichen Faltungen [223]. In diesem Fall war bekannt, dass einige verknotete und ungeknotete Varianten unterschiedliche Grade an Sequenzidentität aufwiesen, was auf Wege hindeutet, bei denen Strukturen und daher Sequenzen zu unterschiedlichen Zeiten divergiert hatten. Zum Beispiel teilen die beiden verknoteten Enzyme AOTCase und SOTCase nur 35% Sequenzidentität [224] während die verknotete AOTCase 41% Sequenzidentität mit der ungeknoteten OTCase hat [225]. Die Rekonstruktion des phylogenetischen Baumes zeigte, dass alle verknoteten Homologen einen Unterzweig des Baumes bevölkern und sich von ungeknoteten Homologen durch das Vorhandensein zusätzlicher Schleifensegmente unterscheiden [223]. Daher wurde vorgeschlagen, dass sich einige verknotete Strukturen aus unverknoteten durch das Einfügen einer „knotenfördernden“ Schleife entwickelt haben, die effektiv einen anderen Teil der Kette umfasst und so den Knoten bildet.

Schlingen wurden auch aus anderen Studien mit der Bildung von verknoteten Strukturen in Verbindung gebracht. Virnau und Mitarbeiter zeigten mit rechnerischen Ansätzen, dass die verknotete Transcarbamylase-AOTCase eine ziemlich starre, prolinreiche Schleife besitzt, die der ungeknoteten OTCase fehlt (Abbildung 10(b)) [149]. Interessanterweise ist der Stauerknoten in α-Halogensäure-Dehalogenase DehI wird auch teilweise durch eine große prolinreiche Schleife gebildet, die zwei nicht verknotete Regionen innerhalb der Struktur verbindet [154].

Mit einem völlig anderen Ansatz hat die Gruppe um Yeates auch einen anderen Weg zu verknoteten Strukturen durch das rationale Design einer neuartigen verknoteten Struktur aufgezeigt. In diesem Fall wurde ein monomeres verknotetes Protein durch Fusion von C- und N-terminalen Ketten eines Homodimers erzeugt, das eine stark verschränkte, aber nicht verknotete Struktur bildet. Diese Studie zeigte, dass die genetische Fusion und Tandem-Wiederholung eines Gens eines ungeknoteten dimeren Proteins zu kleeblattverknoteten Strukturen führen könnte [207].

Es ist klar, dass verknotete und verknotete Proteinstrukturen, sobald sie durch einen evolutionären Weg gebildet wurden, hoch konserviert sind. Durch experimentelle und computergestützte Studien wissen wir jedoch auch, dass diese Arten von Strukturen komplexere Faltungswege aufweisen als ihre ungeknoteten Gegenstücke. Dies lässt vermuten, dass die geknoteten und Slipknotted-Motive innerhalb der Proteinfamilien in gewisser Weise vorteilhaft und wichtig für die Funktion oder Regulation des Proteins sein können.

5.5. Zusammenfassung

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl experimentelle als auch computergestützte Studien bedeutende Fortschritte bei der Ermittlung einiger der wichtigsten allgemeinen Merkmale der Faltungswege topologisch komplexer Proteine ​​gemacht haben. Im Gegensatz zu kleinen monomeren Proteinen mit einfachen Faltungen ist klar, dass Proteine ​​mit topologisch verknoteten oder rutschverknoteten Strukturen viel komplexere Energielandschaften mit vielen Zwischenzuständen und parallelen Pfaden aufweisen. Computerstudien haben Einblicke in den Faltungsprozess geliefert, der die Bildung einer verdrillten Schlinge mit anschließendem Einfädeln über eine Zwischengleitknotenkonfiguration, eine Verschlussroute oder einen „Flip“-Mechanismus beinhalten kann, bei dem der Knotenschritt geschwindigkeitsbestimmend sein kann [141, 211, 226]. Darüber hinaus scheinen nicht-native Wechselwirkungen bei solchen Strukturen mit komplexer Architektur eine wichtigere Rolle zu spielen als bei der Faltung kleinerer Proteine ​​mit relativ einfachen Faltungen [227–229]. Darüber hinaus erfordert die Bildung vorübergehend fehlgefalteter Spezies, die zu kinetischen Fallen in der Landschaft der freien Energie topologisch verknoteter Proteine ​​führt, höchstwahrscheinlich Backtracking-Ereignisse und möglicherweise die Wirkung molekularer Chaperone, damit die native Struktur sowohl schnell als auch effizient erreicht werden kann [199, 206 , 211]. Eine solche „frustrierte“ Faltungsenergielandschaft steht im Gegensatz zu den relativ glatten Faltungstrichtern, die für kleinere, einfachere Proteine ​​vorgeschlagen werden [192, 230].

Eine Reihe neuerer Studien hat gezeigt, dass verknotete und Slipknotted-Proteine ​​konserviert sind, was darauf hindeutet, dass der Knoten oder Slipknot möglicherweise eine Rolle bei der Struktur, Stabilität, Funktion oder Regulation des Proteins spielt. Trotz dieser Erkenntnis muss noch eindeutig geklärt werden, ob es irgendwelche vorteilhaften Eigenschaften einer geknoteten Struktur gegenüber einer ungeknoteten gibt. In der Tat, ob es irgendwelche chemischen oder physikalischen Eigenschaften solcher Strukturen gibt, die sich grundlegend von denen ohne Knoten unterscheiden. Das Verstehen und Identifizieren solcher Eigenschaften wird möglicherweise wichtige Erkenntnisse für zukünftige Anwendungen im Protein-Engineering und therapeutische Entwicklungen liefern.


CRISPR hatte ein Leben, bevor es ein Werkzeug zur Genbearbeitung wurde

WAFFEN DER MASSENENTWICKLUNG Bakterien und Archaeen, die mit CRISPR-Systemen bewaffnet sind, führen seit Äonen Krieg mit Viren. Hier greifen Horden von Viren, sogenannte Phagen, ein Bakterium an, um es in eine Fabrik zur Herstellung von Viren zu verwandeln.

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Es ist der schillernde Star der Biotech-Welt: ein leistungsstarkes neues Werkzeug, das die Struktur der DNA geschickt und präzise verändern kann. Es verspricht Heilmittel gegen Krankheiten, robustere Pflanzen, malariaresistente Mücken und mehr. Die Raserei über die Technik – bekannt als CRISPR/Cas9 – ist in vollem Gange. Jede Woche werden neue CRISPR-Ergebnisse in wissenschaftlichen Zeitschriften veröffentlicht. Vor Gericht streiten Universitäten um Patente. Die Medien berichten fast täglich über die Durchbrüche sowie die Ethik dieses Game Changers.

Aber CRISPR hat eine weniger pailletten- und glitzernde Seite, die für jeden, der die Natur verstehen möchte, genauso verlockend ist. Die Biologie hinter der CRISPR-Technologie stammt aus einem Kampf, der seit Äonen tobt, außer Sicht und doch um uns herum (und auf uns und in uns).

Das CRISPR-Bearbeitungstool hat seinen Ursprung in Mikroben – Bakterien und Archaeen, die überall in obszöner Zahl leben, von den Unterwasserschlössern bis zum Rotz in der menschlichen Nase. Seit Milliarden von Jahren stehen diese einzelligen Organismen im Konflikt mit den Viren – den sogenannten Phagen –, die sie angreifen, Eindringlingen, die so zahlreich sind, dass ein einziger Tropfen Meerwasser 10 Millionen fassen kann. Und natürliche CRISPR-Systeme (es gibt viele) spielen in diesem Gerangel eine große Rolle. Sie fungieren als Gatekeeper und katalogisieren im Wesentlichen Viren, die in Zellen gelangen. Wenn ein Virus erneut auftaucht, kann die Zelle – und ihre Nachkommen – es erkennen und zerstören. Das Studium dieses Systems wird Biologen viel über Ökologie, Krankheiten und die allgemeine Funktionsweise des Lebens auf der Erde lehren.

Aber der Übergang von der einfachen Lehrbuchgeschichte in das wirkliche Leben ist chaotisch. In den wenigen Jahren, seit die Abwehrfunktion von CRISPR-Systemen erkannt wurde, haben sich Mikrobiologen damit beschäftigt, Proben zu sammeln, Experimente durchzuführen und Unmengen von DNA-Daten zu verarbeiten, um zu versuchen, zu verstehen, was die Systeme tun. Daraus ist viel elegante Physiologie entstanden, eine Menge Komplexität, jede Menge Überraschungen – und mehr als ein kleines Mysterium.

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Verdorbener Joghurt

Die Biologie ist kompliziert, und ihre grundlegenden Nüsse und Schrauben erforderten einiges herauszufinden. CRISPR/Cas-Systeme bestehen aus zwei Teilen: dem CRISPR-Bit und dem Cas-Bit. Das CRISPR-Bit – oder „geclusterte regelmäßig interspaced kurze palindromische Wiederholungen“ – wurde in den späten 1980er und 1990er Jahren entdeckt. Die Wissenschaftler setzten die Geschichte dann langsam zusammen, indem sie Mikroben untersuchten, die in den Eingeweiden von Tieren und in Salzwiesen gedeihen, die Pest verursachen und aus denen köstlichen Joghurt und Käse hergestellt werden.

Keiner der Wissenschaftler wusste zunächst, womit er es zu tun hatte. Sie sahen DNA-Abschnitte mit einem charakteristischen Muster: kurze Längen wiederholter Sequenzen, getrennt durch andere DNA-Sequenzen, die heute als Spacer bekannt sind. Jeder Spacer war ein Unikat. Da sich die Liste der Abstandshalter in einer bestimmten Mikrobenart von Zelle zu Zelle unterscheiden konnte, war eine frühe Erkenntnis, dass diese Unterschiede für die forensische „Typisierung“ nützlich sein könnten – Ermittler konnten feststellen, ob Lebensmittelvergiftungsfälle miteinander verbunden waren oder ob jemand gestohlen hatte die Joghurt-Starterkultur eines Unternehmens.

Nahe Begegnungen

Bakterien verwenden CRISPR/Cas als eine Form der Immunität oder Selbstverteidigung gegen Eindringlinge. Ein Bakterium baut eine Bibliothek mit genetischem Material von früheren Eindringlingen auf, damit das Bakterium und seine Nachkommen es deaktivieren können, wenn derselbe Eindringling erneut angreift.

L. Marraffini/Natur 2015, bearbeitet von J. Hirshfeld

Doch kuriose Erkenntnisse häuften sich. Es stellte sich heraus, dass einige dieser Spacer mit der DNA von Phagen übereinstimmten. In einer Flut von Berichten im Jahr 2005 zeigten Wissenschaftler beispielsweise, dass Stämme des Milchsäurebakteriums Streptococcus thermophilus enthaltene Spacer, die dem genetischen Material von Phagen entsprachen, von denen bekannt ist, dass sie infizieren Streptokokken. Und je mehr Spacer ein Stamm hatte, desto widerstandsfähiger war er gegen den Angriff von Phagen.

Dies sah sehr nach einer erlernten oder adaptiven Immunität aus, ähnlich wie unser eigenes Antikörpersystem: Nachdem Sie einer bestimmten Bedrohung ausgesetzt waren, erinnert sich Ihr Immunsystem und Sie sind danach resistent gegen diese Bedrohung. In einem klassischen Experiment veröffentlicht in Wissenschaft 2007 zeigten Forscher des Lebensmittelunternehmens Danisco, dass dies so ist. Sie konnten sehen, wie neue Spacer hinzugefügt wurden, wenn ein Phagen eine Kultur von . infizierte S. thermophilus. Danach war das Bakterium gegen den Phagen immun. Sie konnten künstlich einen Phagen-Spacer in die CRISPR-DNA einbauen und sehen, wie Resistenz entsteht, als sie den Spacer wegnahmen, die Immunität ging verloren.

Dies waren nützliche Informationen für eine Industrie, die ganze Bottiche mit joghurtbildenden Bakterien finden konnte, die durch Phagenbefall ausgelöscht wurden. Es war eine aufregende Zeit in wissenschaftlicher und kommerzieller Hinsicht, sagt Rodolphe Barrangou von der North Carolina State University in Raleigh, der einen Großteil der Danisco-Arbeit gemacht hat. „Es war nicht nur die Entdeckung eines coolen Systems, sondern auch die Entdeckung einer leistungsstarken Technologie zur Phagenresistenz für die Milchindustrie“, sagt er.

Der zweite Teil des CRISPR/Cas-Systems ist das Cas-Bit: ein Satz von Genen, der sich in der Nähe des Clusters von CRISPR-Spacern befindet. Die DNA-Sequenzen dieser Gene deuten stark darauf hin, dass sie Anweisungen für Proteine ​​enthalten, die in irgendeiner Weise mit DNA oder RNA interagieren – daran festhalten, sie schneiden, kopieren, entwirren. Als Forscher das eine oder andere Cas-Gen inaktivierten, sahen sie, wie die Immunität ins Wanken geriet. Offensichtlich waren die beiden Teile des Systems – CRISPR und Cas – ein Team.

Es bedurfte vieler weiterer Experimente, um zu dem heutigen Grundmodell zu gelangen, wie CRISPR/Cas-Systeme Phagen bekämpfen – und nicht nur Phagen. Andere Arten von fremder DNA können in Mikroben eindringen, darunter kreisförmige Ringe, die als Plasmide bezeichnet werden und von Zelle zu Zelle wandern, und DNA-Stücke, die als transponierbare Elemente bezeichnet werden und innerhalb des Genoms herumspringen. CRISPRs können diese Eindringlinge abwehren und das Genom einer Mikrobe in Ordnung halten.

Der Vorgang funktioniert so: Ein Virus injiziert sein Erbgut in die Zelle. Die Zelle erkennt diese Gefahr und wählt einen kleinen Streifen dieses genetischen Materials aus und fügt ihn den Spacern im CRISPR-Cluster hinzu. Dieser Schritt, der als Immunisierung oder Anpassung bekannt ist, erstellt eine Liste von Begegnungen, die eine Zelle im Laufe der Zeit mit Viren, Plasmiden oder anderen fremden DNA-Stücken hatte – sauber geordnet in umgekehrter chronologischer Reihenfolge, vom neuesten zum ältesten.

Ältere Spacer werden irgendwann abgeworfen, aber ein CRISPR-Cluster kann lang werden – der bisherige Rekordhalter sind 587 Spacer in Haliangium ochraceum, eine salzliebende Mikrobe, die aus einem Stück Algen isoliert wird. „Es ist, als würde man sich die letzten 600 Aufnahmen ansehen, die man im Arm hatte“, sagt Barrangou. "Denk darüber nach."

Neuer Abstandshalter angebracht, die Mikrobe ist jetzt immunisiert. Später kommt das Targeting. Wenn derselbe Phagen erneut in die Zelle eindringt, wird er erkannt. Die Zelle hat RNA-Kopien des entsprechenden Spacers angefertigt, die an die passende Stelle im Genom des eindringenden Phagen binden. Diese „Führungs-RNA“ führt Cas-Proteine ​​dazu, die Phagen-DNA anzugreifen und zu zerschneiden, um den Eindringling zu entgiften.

Alle Streifen von CRISPR

Wissenschaftler haben die Reihe bekannter CRISPR-Systeme basierend auf DNA-Sequenzdaten in fünf Typen und 16 Untertypen unterteilt. Die Artenverteilung unterscheidet sich in Archaeen und Bakterien.

K. S. Makarova et al./Nat. Rev. Mikrobio. 2015, bearbeitet von J. Hirshfeld

Forscher wissen jetzt, dass es einen Konfetti-Sturm verschiedener CRISPR-Systeme gibt, und die Liste wächst weiter. Einige sind einfach – wie das CRISPR/Cas9-System, das für die Gen-Editierung in komplexeren Lebewesen angepasst wurde (SN: 15.04.17, p. 16) – und einige sind aufwendig, mit vielen Protein-Arbeitspferden, die eingesetzt werden, um die Arbeit zu erledigen.

Diejenigen, die die Entwicklung von CRISPR-Systemen erforschen, entschlüsseln eine komplexe Geschichte. Der Teil der CRISPR-Toolbox, der an der Immunität beteiligt ist (das Hinzufügen von Spacern, nachdem Phagen ihr genetisches Material injiziert haben), scheint von einem bestimmten Typ eines transponierbaren Elements namens Casposon zu stammen. Der für das Targeting verantwortliche Teil hat jedoch mehrere Ursprünge – in einigen Fällen handelt es sich um eine andere Art von transponierbarem Element. In anderen ist es ein Mysterium.

Die Nachteile

Angesichts der Kraft von CRISPR-Systemen, Feinde abzuwehren, könnte man meinen, jede respektable Mikrobe da draußen in den Böden, Schloten, Seen, Eingeweiden und Nasenlöchern dieses Planeten hätte eine. Nicht so.

Die Zahlen sind alles andere als sicher, zum Teil, weil die Wissenschaft nicht annähernd alle Mikroben der Welt identifiziert, geschweige denn alle nach CRISPRs untersucht hat. Aber die bisher gesammelten Unmengen an mikrobiellen genetischen Daten werfen interessante Trends auf.

Tallies deuten darauf hin, dass CRISPR-Systeme bei bekannten Archaeen weitaus häufiger vorkommen als bei bekannten Bakterien – solche Systeme existieren in etwa 90 Prozent der Archaeen und etwa 35 Prozent der Bakterien, sagt Eugene Koonin, ein computergestützter Evolutionsbiologe an den National Institutes of Health in Bethesda. Md. Archaea und Bakterien, obwohl sie sowohl klein als auch einzellig sind, befinden sich auf gegenüberliegenden Seiten des Lebensbaums.

Vielleicht noch wichtiger, sagt Koonin, haben fast alle bekannten Mikroben, die in superheißen Umgebungen leben, CRISPRs. Die mathematischen Modelle seiner Gruppe legen nahe, dass CRISPR-Systeme am nützlichsten sind, wenn Mikroben auf eine ausreichend große Anzahl von Viren treffen, um das adaptive Gedächtnis zu nutzen. Aber wenn die Vielfalt zu groß ist und sich Viren sehr schnell ändern, helfen CRISPRs nicht wirklich – weil Sie den gleichen Virus nie wieder sehen würden. Die superheißen Ökosysteme, sagt er, scheinen eine stabile Menge an Phagendiversität zu haben, die weder zu hoch noch zu niedrig ist.

Und CRISPR-Systeme haben Nachteile. So wie Menschen Autoimmunreaktionen gegen ihren eigenen Körper entwickeln können, können Bakterien und Archaeen versehentlich CRISPR-Abstandshalter aus Teilen ihrer eigenen DNA herstellen – und riskieren, ihr eigenes genetisches Material zu zerkauen. Forscher haben dies beobachtet. „Keine Immunität hat ihren Preis“, sagt Rotem Sorek, ein mikrobieller Genomiker am Weizmann Institute of Science in Rehovot, Israel.

Aber Fehler sind selten, und Sorek und seine Kollegen haben kürzlich herausgefunden, warum sie in der Mikrobe studieren. Die Forscher berichteten in Natur im Jahr 2015, dass CRISPR-Spacer aus linearen DNA-Stücken hergestellt werden – und Phagen-DNA ist linear, wenn sie in Zellen eindringt. Das Bakterienchromosom ist aufgrund seiner kreisförmigen Form geschützt. Sollte es brechen und für einen Zauber linear werden, zum Beispiel wenn es repliziert wird, enthält es Signale, die die Cas-Proteine ​​abwehren.

CRISPR-Systeme haben noch andere Nachteile. Es ist nicht immer ein Bonus, Phagen und andere Eindringlinge fernzuhalten, die manchmal nützliche Dinge bringen können. Escherichia coli O157:H7, berühmt für seine Lebensmittelvergiftung, kann Menschen aufgrund von Toxin-Genen, die es beherbergt, die von einem Phagen eingebracht wurden, krank machen, um nur eines von unzähligen Beispielen zu nennen. Sogar CRISPR-Systeme selbst werden über Phagen, Plasmide oder transponierbare Elemente im mikrobiellen Reich verbreitet.

Für Mikroben, denen CRISPR-Systeme fehlen, gibt es viele andere Möglichkeiten, fremde DNA abzuwehren – bis zu 10 Prozent eines mikrobiellen Genoms könnten für hawkishe Kriegsführung verwendet werden, und neue Abwehrsysteme werden immer noch entdeckt.

Gegenmaßnahmen

Der Krieg zwischen Bakterien und Phagen ist natürlich zweiseitig. So wie eine Mikrobe Türen geschlossen halten will, um ihre genetische Integrität zu schützen und der Zerstörung zu entgehen, will der Phagen hinein.

Und so wehrt sich der Phage gegen CRISPRs. Es verwandelt sich genetisch in Formen, die CRISPRs nicht mehr erkennen. Oder es entwirft maßgeschneiderte Artillerie. Der Mikrobiologe Joe Bondy-Denomy, jetzt an der University of California, San Francisco, stieß als Doktorand im Labor des Molekularmikrobiologen Alan Davidson an der University of Toronto auf solche maßgeschneiderten Waffen. Das Team wusste, dass das Bakterium Pseudomonas aeruginosa, das im Boden und im Wasser lebt und gefährliche Infektionen verursachen kann, verfügt über ein starkes CRISPR-System. Einige Phagen schienen davon jedoch nicht betroffen zu sein.

Das liegt daran, dass diese Phagen kleine Proteine ​​​​haben, die an diesen oder jenen Teil der CRISPR-Maschinerie binden und diesen stören, wie zum Beispiel das Cas-Enzym, das die Phagen-DNA schneidet. Die Bindung deaktiviert das CRISPR-System, berichteten die Forscher 2015 in Natur. Bondy-Denomy und andere haben seitdem Anti-CRISPR-Gene in anderen Phagen und anderen Arten interlopierender DNA gefunden. Die Gene seien so verbreitet, sagt Davidson, dass er sich fragt, wie viele CRISPR-Systeme wirklich aktiv sind.

In einer besonders bizarren Wendung fand die Mikrobiologin Kimberley Seed von der University of California, Berkeley, einen Phagen, der ein eigenes CRISPR-System trägt und es verwendet, um sich gegen das Cholera-Bakterium zu wehren, das in ihn eingedrungen ist, berichteten sie und Kollegen 2013 in Natur. Es zerhackt ein Segment der bakteriellen DNA, das normalerweise eine Phageninfektion hemmt.

Natürlich würde man bei diesem nie endenden Gerangel erwarten, dass die Mikroben wieder gegen die Phagen kämpfen. „Ich werde oft gefragt: ‚Großartig, die Anti-CRISPRs sind da, also wo sind die Anti-Anti-CRISPRs?‘“, sagt Bondy-Denomy. So etwas hat noch niemand gefunden.

Evolutionstreiber

Es ist eine Sache, CRISPR-Systeme in gut kontrollierten Laborumgebungen oder in nur einer Mikrobenart zu untersuchen. Es ist eine andere, zu verstehen, was all die verschiedenen CRISPRs tun, um das Ökosystem einer sprudelnden heißen Quelle, eines menschlichen Darms, einer erkrankten Lunge oder eines von Cholera verseuchten Flusses zu gestalten. Die Schätzungen der CRISPR-Häufigkeit könnten sinken, wenn mehr Proben genommen werden, insbesondere von Dark Horse-Mikroben, über die Forscher wenig wissen.

In einem Bericht von 2016 in Naturkommunikation, zum Beispiel entdeckten die Geomikrobiologin Jill Banfield von der UC Berkeley und Kollegen 1.724 Mikroben im Grundwasser von Colorado, die behandelt wurden, um die Fülle an Arten zu erhöhen, die schwer zu isolieren sind. CRISPR-Systeme waren in dieser Stichprobe viel seltener als in Datenbanken mit bekannteren Mikroben.

Das Auszählen von CRISPRs ist natürlich nur der Anfang. Mikrobielle Gemeinschaften – einschließlich derjenigen in unserem eigenen Darm, wo es viele CRISPR-Systeme und Phagen gibt – sind dynamisch und nicht eingefroren. Wie beeinflussen CRISPRs die Evolution von Phagen und Mikroben in freier Wildbahn? Die Labore von Banfield und Barrangou haben sich zusammengetan, um zuzusehen, wie S. thermophilus und Phagen zusammen in einem Milchmedium für Hunderte von Tagen inkubiert. Das Team sah, wie die Bakterienzahl sank, als die Phagen eindrangen, dann die Bakterien Spacer gegen die Phagen annahmen und sich sammelten – und die Phagenzahlen sanken wiederum nach unten. Dann entstanden neue Phagenpopulationen, immun gegen S. thermophilus Abwehrkräfte aufgrund genetischer Veränderungen. Auf diese Weise berichteten die Forscher 2016 in mBio, CRISPRs sind „einer der grundlegenden Triebkräfte der Phagen-Evolution“.

CRISPR-Systeme können aufgenommen, fallengelassen und dann im Laufe der Zeit von Bakterien und Archaeen wieder aufgenommen werden, möglicherweise wenn sich Bedingungen und Bedürfnisse ändern. Das Bakterium Vibrio cholerae ist ein Beispiel für diese Dynamik, wie Seed und Kollegen 2015 im . berichteten Zeitschrift für Bakteriologie. Die älteren, klassischen Stämme dieser medizinischen Fäule enthielten CRISPRs, aber diese Stämme starben in den 1960er Jahren in der Wildnis weitgehend aus. Stämme, die heute Cholera verursachen, haben keine CRISPRs.

Niemand weiß warum, sagt Seed. Wissenschaftler betonen jedoch, dass es eine Fehlcharakterisierung ist, die Beziehung zwischen Mikroben und Phagen, Plasmiden und transponierbaren Elementen als einen simplen Krieg darzustellen. Phagen richten nicht immer Chaos an, sie können ihre Genome leise in das Bakterienchromosom einschleusen und gutartig koexistieren, wobei sie zusammen mit der Wirts-DNA kopiert werden. Phagen, Plasmide und transponierbare Elemente können neue, nützliche Eigenschaften verleihen – manchmal sogar essentielle. Tatsächlich ist eine solche Bewegung der DNA zwischen Arten und Stämmen das Herzstück der Entwicklung von Bakterien und Archaeen.

Es geht also darum, ein Gleichgewicht zu finden. „Wenn Sie zu viel fremde DNA einbauen, können Sie eine Art nicht erhalten“, sagt Luciano Marraffini, ein Molekularmikrobiologe an der Rockefeller University in New York City, dessen Arbeit erstmals zeigte, dass das Schneiden von DNA der Schlüssel zu CRISPR-Systemen ist. Aber Sie müssen etwas DNA hineinlassen, und wahrscheinlich erlauben einige CRISPR-Systeme dies: Das System, in dem er studiert Staphylococcus epidermidis, zum Beispiel, geht nur nach Phagen, die sich in ihrem zelltötenden oder lytischen Zustand befinden, berichteten er und Kollegen 2014 in Natur.

Die Geschichte geht nach der Grafik weiter

Zwei Wege zu reisen

Phagen zerstören nicht immer die Mikroben, in die sie eindringen. Viele haben zwei Zustände: Sie können die Protein-, RNA- und DNA-bildenden Systeme einer Zelle dazu nutzen, mehr von sich selbst in Massen zu produzieren, im sogenannten „lytischen“ Zyklus, wodurch die Zelle letztendlich getötet wird. Oder sie schleusen ihr Erbgut in das Wirtschromosom ein, das bei jeder Zellteilung passiv kopiert wird, im „lysogenen“ Zyklus. Dieses eingebaute genetische Material kann dem Bakterium manchmal nützlich sein.

E. Ottwell

Quellen: Ron Feiner et al./Nat. Rev. Mikrobiol. 2015 „Die lytischen und lysogenen Zyklen von Bakteriophagen.“ Grenzenlose Biologie, August 2016. bit.ly/boundless-phage

Jenseits der Verteidigung

Bei CRISPR-Systemen ist eines ganz klar: Sie sind in vielerlei Hinsicht verwirrend. Zunächst sollten die Spacer in einer Mikrobe ihre eigene, individuelle Geschichte der Phagen widerspiegeln, auf die sie gestoßen ist. Man könnte also meinen, es gäbe lokale Stammbäume, dass ein in Frankreich beprobtes Bakterium einen anderen Spacer-Cluster hat als ein in Argentinien beprobtes Bakterium. Das sehen Forscher nicht immer.

Nimm das Böse P. aeruginosa. Rachel Whitaker, eine mikrobielle Populationsbiologin an der University of Illinois in Urbana-Champaign, studiert Pseudomonas Proben von Menschen mit Mukoviszidose, deren Lungen chronische Infektionen entwickeln. Sie hat keine Anzeichen dafür gefunden, dass zwei Patienten, die nahe beieinander leben, mehr Ähnliches in sich tragen P. aeruginosa CRISPRs als zwei Patienten, die Tausende von Kilometern voneinander entfernt sind. Dennoch würde man sicherlich erwarten, dass nahegelegene CRISPRs engere Matches sind, denn die Pseudomonas wäre auf ähnliche Phagen gestoßen. "Es ist sehr seltsam", sagt Whitaker.

Andere haben dasselbe bei wärmeliebenden Bakterien beobachtet, die aus weit entfernten sprudelnden heißen Quellen entnommen wurden. Es ist, als ob Wissenschaftler nicht wirklich verstehen würden, wie sich Bakterien auf der ganzen Welt ausbreiten – es könnte einen starken Effekt einer weit entfernten Passage durch Luft oder Wind geben, sagt Konstantin Severinov, der CRISPR-Systeme an der Rutgers University in New Brunswick, N.J., studiert.

Eindringlinge mit Vorteilen

NIAID/FLICKR (CC BY 2.0) Y_TAMBE/WIKIMEDIA COMMONS (CC BY-SA 3.0)

Manchmal gibt es Belohnungen, wenn fremde DNA in eine Zelle gelangt. Die Fähigkeit, Antibiotika zu umgehen und Schwermetallen zu widerstehen, wurde auf Gene aus Phagen, Plasmiden und transponierbaren Elementen zurückgeführt.

  • Staphylococcus aureus (oben links), Salmonella typhimurium und andere krankheitserregende Bakterien sind mit Hilfe von Resistenzgenen auf Plasmiden, transponierbaren Elementen und Phagen-DNA resistent gegen Antibiotika geworden. Oft werden mehrere Gene gemeinsam übertragen.
  • Escherichia coli O157:H7 enthält neben anderen importierten Eigenschaften, die das Bakterium gefährlich machen, Shigatoxine, ein Geschenk der Phagen-DNA.
  • Stämme von E coli, Pseudomonas aeruginosa (oben rechts), Bacillus subtilis und andere sind resistent gegen Schwermetalle wie Quecksilber, Arsen und Chrom. Diese Bakterien kommen in verschmutzten Gewässern und in Krankenhäusern vor, wo Schwermetalle als Desinfektionsmittel eingesetzt werden. Plasmide und transponierbare Elemente übertragen oft die Resistenz.
  • Rhizobium leguminosarum und andere Rhizobien können aufgrund von Genen auf Plasmiden, die die Bakterien beherbergen, Stickstoff aus der Luft ziehen und für Pflanzen verfügbar machen.

Eine weitere Seltsamkeit ist die unterschiedliche Kraft der CRISPR-Systeme. Einige sind sehr aktiv. Der Molekularbiologe Devaki Bhaya von der Abteilung Pflanzenbiologie der Carnegie Institution for Science an der Stanford University sieht deutliche Anzeichen dafür, dass beispielsweise in den Cyanobakterien der heißen Quellen von Yellowstone häufig Abstandshalter hinzugefügt und entfernt werden. Aber andere Systeme sind träge, und E coli, das klassische Arbeitspferd der Genetikforschung, hat ein respektables CRISPR-System – also ausgeschaltet.

Vielleicht war es schon länger weg. Vor etwa 42.000 Jahren starb im heutigen Nordwesten Sibiriens ein Mammutbaby. Die im Jahr 2007 gefundenen Überreste waren so gut erhalten, dass die Eingeweide intakt waren und E coli DNA konnte extrahiert werden.

In der Forschung veröffentlicht in Molekulare Ökologie Im Januar fand Severinovs Team überraschende Ähnlichkeiten zwischen den Abstandshaltern in dem von Mammut abgeleiteten E coli CRISPR-Cluster und die in der heutigen Zeit E coli. „In der ganzen Zeit gab es keinen Umsatz“, staunt Severinov. Warum ist das CRISPR-System nicht aktiv? E coli sich die Mühe machen, es zu behalten?

Dieses Dilemma führt direkt zu dem, was einige Forscher als intellektuell „skandalöse Situation“ bezeichnen.

In einigen Fällen stimmt die genetische Sequenz von Spacern gut mit der Phagen-DNA überein. Aber insgesamt ist nur ein Bruchteil (rund 1 bis 2 Prozent) der den Wissenschaftlern bekannten Spacer einem Virus oder einem Plasmid zugeordnet. In E coli, passen die Abstandshalter nicht zu üblichen, klassischen Phagen, von denen bekannt ist, dass sie das Bakterium infizieren. „Ist es so, dass es auf der Welt eine riesige, unbekannte Menge an viraler Dunkler Materie gibt?“ sagt Koonin – oder entwickeln sich Phagen superschnell? "Oder ist es etwas ganz anderes?"

Angesichts dieses Rätsels vermuten einige Forscher stark – und haben Beweise dafür –, dass CRISPR-Systeme möglicherweise mehr tun, als nur zu verteidigen, dass sie möglicherweise andere Aufgaben haben. Kommunikation vielleicht. Oder Gene ein- und ausschalten.

Aber die CRISPR-Sequenzen einiger Mikroben tun Sinn machen, insbesondere wenn man sich die zuletzt hinzugefügten Spacer ansieht, und andere können Hinweise auf noch unentdeckte Phagen sein. Auch wenn sie sich über viele Dinge über CRISPR den Kopf kratzen, sind Wissenschaftler auch von den Geschichten begeistert, die CRISPR-Cluster über die Viren und andere DNA-Stücke erzählen können, auf die Bakterien und Archaeen stoßen und die sie, aus welchen Gründen auch immer, für das Protokoll notieren . Worauf achten Mikroben? Was ignorieren sie?

CRISPRs bieten ein helles neues Fenster zu solchen Fragen und bergen tatsächlich bereits neue Phagen und Fakten darüber, wer in der mikroskopischen Welt wen infiziert.

„Wir können alles katalogisieren, was da draußen ist. Aber wir wissen nicht wirklich, worauf es ankommt“, sagt Bondy-Denomy. „CRISPRs können uns helfen, zu verstehen.“

Rosie Mestel ist eine freiberufliche Autorin mit Sitz in Los Angeles.

Dieser Artikel erscheint in der Ausgabe vom 15. April 2017 von Wissenschaftsnachrichten mit der Schlagzeile “The Original CRISPR: Bevor der Geneditor zu einem berühmten Werkzeug wurde, war er eine Waffe in einem endlosen mikroskopischen Krieg.”

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Eine Version dieses Artikels erscheint in der Ausgabe vom 15. April 2017 von Wissenschaftsnachrichten.

Zitate

R. Barrangouet al. CRISPR bietet erworbene Resistenz gegen Viren bei Prokaryoten. Wissenschaft. vol. 315, 23. März 2007, p. 1709. doi: 10.1126/science.1138140.

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4 Anwendungen

4.1 DNA-basierte plasmonische Nanostrukturen

Chirale Moleküle weisen typischerweise eine unterschiedliche Absorption von links- und rechtshändig zirkular polarisiertem Licht auf – eine Eigenschaft, die als Zirkulardichoismus (CD) bekannt ist und ausgiebig genutzt wurde, um chirale Molekülstrukturen zu charakterisieren. [ 133 ] Wird der Unterschied zwischen den Absorptionen von links- und rechtshändig polarisiertem Licht als Funktion der Wellenlänge aufgetragen, entsteht aufgrund der Chiralität der darunter liegenden Moleküle ein Muster von Spitzen und Tälern, das als eine Art Fingerabdruck für das Molekül fungiert . Die meisten Medien, die ein CD-Signal aufweisen, haben eine sehr schwache optische Reaktion. [ 134 ] Eine schwache optische Reaktion kann jedoch durch plasmonische Nanostrukturen verstärkt werden. [ 135, 136 ] Kneer et al. zeigten eine verstärkte CD-Reaktion eines DNA-Origami-Blatts, wenn es zwischen zwei Goldnanopartikeln platziert wurde. [ 137 ]

Ein Plasmon ist ein Quantum kollektiver freier Elektronengasschwingungen in Metall, [ 138 ] das durch Licht einer bestimmten geometrieabhängigen (Resonanz-)Frequenz angeregt werden kann. Wenn die Wellenlänge der Anregung ähnlich oder länger als die Größe des Metallpartikels ist (die Partikelgröße beträgt typischerweise einige zehn bis hunderte von Nanometern), wird das Plasmon auf der Oberfläche des Partikels lokalisiert. Wenn ein Plasmon angeregt wird, verhält sich das Elektronengas im Teilchen wie ein einfacher Dipol, der parallel zur Richtung des oszillierenden elektrischen Felds schwingt, das elektrische Feld innerhalb einer Wellenlänge der Teilchenoberfläche (der Nahfeldzone) verstärkt und die . des Teilchens erhöht Wirkungsquerschnitte für Streuung und Absorption. Befindet sich ein weiteres Teilchen mit ähnlicher Resonanzfrequenz im Nahfeldbereich, kann sich eine kollektive Hybridmode ausbilden. Chirale plasmonische Moden können sich entweder in gehandhabten Nanopartikelgruppen oder in chiral zusammengesetzten Gruppen einzelner resonanter Nanopartikel bilden. [ 139 ] Diese Art der optischen Reaktion ist viel stärker als die chiraler Moleküle und im sichtbaren Lichtbereich nachweisbar, was für Sensoranwendungen sehr wünschenswert ist.

Die Herstellung chiraler plasmonischer Bauelemente unter Verwendung herkömmlicher Lithographieverfahren kann teuer und fehleranfällig sein, insbesondere wenn die Bauelemente komplexe 3D-Geometrien aufweisen. Da sie robust, präzise und programmierbar ist, hat die Selbstorganisation von DNA die Herstellung komplexer plasmonischer Nanostrukturen in Lösung ermöglicht. [ 108, 129, 132 ] DNA-Moleküle können entweder Metallnanopartikel in eine vorgeschriebene geometrische Form binden [ 108, 128 ] oder als Templat für den Aufbau von Metallnanopartikeln dienen. [ 129, 131, 140 ] Selbstorganisierte DNA-Nanostrukturen wurden auch verwendet, um vollständig metallische Nanostrukturen mit gezielten plasmonischen Eigenschaften aufzubauen. [ 141 ] Beachten Sie, dass in den hier diskutierten plasmonischen Strukturen die DNA als Matrize dient, auf der plasmonische Partikel chiral angeordnet sind.

Eines der frühesten Beispiele für eine plasmonische DNA-Nanostruktur war eine DNA-Pyramide, die vier unterschiedlich große Gold-Nanopartikel enthielt, die mittels kovalent verknüpfter DNA-Stränge an den Scheitelpunkten der Pyramide platziert wurden (Abbildung 5a). [ 108 ] Govorov und Mitarbeiter zeigten theoretisch, dass Goldnanopartikel, die auf solchen pyramidenförmigen Objekten sowie auf Helices angeordnet sind, im sichtbaren Lichtbereich eine starke CD-Reaktion zeigen sollten, die die Reaktion natürlicher chiraler Moleküle übertrifft. Yanet al.maßen experimentell die CD-Reaktion einer Pyramiden-DNA-Nanostruktur, [ 128 ] und zeigten, dass die Intensität der CD-Spektren durch die räumliche Anordnung verschiedener Arten von Nanopartikeln an den Scheitelpunkten der Pyramide präzise gesteuert werden kann (Abbildung 5b). Eine pyramidenartige Anordnung von vier Nanopartikeln wurde auch unter Verwendung eines blattartigen DNA-Origami-Bündels realisiert, indem drei Gold-Nanopartikel auf einer Seite des DNA-Origami-Blatts und der vierten auf der anderen Seite angebracht wurden, wodurch eine chirale Anordnung entstand. [ 140 ] Helixförmige Metall-DNA-Metamoleküle wurden von Kuzyk und Mitarbeitern aufgebaut, indem ein 24-Helix-DNA-Origami-Stäbchen mit 10 in einem helikalen Muster angeordneten Goldnanopartikeln dekoriert wurde. [ 142 ] Es wurde festgestellt, dass die Händigkeit der Nanopartikel-Anordnung in solchen Strukturen das Vorzeichen der CD-Winkelverschiebung im sichtbaren Lichtbereich umkehrt.

Der Einbau optisch aktiver Elemente in konformativ dynamische DNA-Nanostrukturen ermöglicht es, die optische Aktivität solcher Nanostrukturen durch externe Stimuli zu modulieren. Ein Konformationsübergang in einer DNA-Nanostruktur kann entweder durch eine Änderung der Umgebung der Nanostruktur oder durch die Verwendung dynamischer DNA-Nanotechnologie-Designmotive ausgelöst werden, einschließlich Schloss-und-Schlüssel-DNA-Stränge und toehold-vermittelter Strangverdrängung. [ 131 ] Schreiber et al. [ 129 ] verwendeten helikale Metall-DNA-Nanostrukturen, um Systeme zu konstruieren, die die optische Reaktion beim Trocknen oder Rehydratisieren modulierten (Abbildung 5c). In diesen Systemen veränderte das Trocknen oder Rehydratisieren die Konformation der Nanostrukturen in Bezug auf die Oberfläche, an der sie befestigt waren, und änderte die Richtung der CD-Reaktion von normal zur Oberfläche unter nassen Bedingungen zu parallel zur Oberfläche beim Trocknen. Kuzyk et al. stellten zwei 14-Helix-DNA-Origami-Bündel, die jeweils mit einem Gold-Nanostäbchen verziert waren, in Form eines Kreuzes zusammen und nutzten DNA-Hilfsstränge, um die Orientierung der Bündel von parallel auf normal und umgekehrt umzuschalten. [ 143 ] Ein ähnliches Prinzip wurde verwendet, um pH-schaltbare Nanostrukturen zu realisieren, [ 130, 144 ] mit pH-modulierter Affinität der TAT/CGC-Tripletts in den DNA-Verriegelungssträngen (Abbildung 5d). Es wurde gezeigt, dass die Beschichtung von Goldstäben mit einer Silberschicht die optische Reaktion der Nanostabsysteme stark erhöht. [ 145 ] Lanet al. [ 131 ] demonstrierten den Wechsel zwischen mehr als zwei chiralen Zuständen unter Verwendung einer Struktur, bei der mehrere Goldnanostäbchen an ein V-förmiges DNA-Origami-Templat gebunden waren (Abbildung 5d). Eine gefaltete Struktur konnte durch Hinzufügen von Schloss-und-Schlüssel-DNA-Strängen (Schalter 1 in Abbildung 5e) in eine verlängerte Struktur umgewandelt werden (Schalter 1 in Abbildung 5e) und auch von linkshändigen zu rechtshändigen Konformationen über eine Toehold-vermittelte Strangverdrängungsreaktion (Schalter 2 in Abbildung 5e). In einem anderen Ansatz [ 146 ] wurde die gegenseitige Orientierung mehrerer Metallnanostäbchen an mehreren Schichten von DNA-Origami-Stäbchen und -Faltblättern mithilfe von Blocker- und Aktivatorsträngen kontrolliert, wodurch acht verschiedene plasmonische Stereoisomere realisiert wurden.

Die Konjugation von Metallnanopartikeln an ein DNA-Gerüst hat es ermöglicht, durch molekulare Wechselwirkungen verursachte Veränderungen der CD-Antwort für biosensorische Anwendungen zu verstärken. Ein solcher Sensor wurde von Ma et al. beschrieben, [ 132 ] bei dem die Selbstorganisation von Goldnanostäbchen durch Hybridisierung des Analytstrangs an mit den Nanostäbchen konjugierte Stränge vermittelt wurde (Abbildung 5f). In der Anordnung wurde festgestellt, dass die Verbindung eines Nanostäbchens mit dem anderen über DNA-Duplexe ein Nanostäbchen in Bezug auf das andere drehte, was dem System eine CD-Antwort verleiht. Es wurde festgestellt, dass die Amplitude der CD-Antwort mit der Konzentration des DNA-Analyten zunimmt und den Nachweis des in attomolaren Konzentrationen vorliegenden DNA-Analyten ermöglicht.

4.2 DNA-Spintronik

Die intrinsische Krümmung eines chiralen Moleküls sorgt dafür, dass bei der Bewegung eines Elektrons ein wirksames Magnetfeld erzeugt wird. Dieses Magnetfeld wirkt auf das magnetische Moment des Elektrons, wodurch die Tunnelwahrscheinlichkeit durch das chirale Molekül für Elektronen mit entgegengesetztem Spin unterschiedlich ist. Dieses Phänomen wird als chiral-induzierte Spinselektivität (CISS) bezeichnet, [ 148, 151, 152 ] schematisch dargestellt in Abbildung 6a. Die physikalischen Ursprünge von CISS lassen sich auf die Spin-Bahn-Kopplung zurückführen, einen relativistischen Effekt, der aus dem magnetischen Drehmoment entsteht, das auf das Elektron ausgeübt wird, wenn es um den Kern kreist. [ 153, 154 ] Betrachtet man ein 2D-Material mit gebrochener Symmetrie, wie z. B. eine Grenzfläche, werden die Ströme von Elektron und Spin durch den Rashba-Effekt gekoppelt, [ 153, 154 ] was die Manipulation der Spin-Freiheitsgrade über das elektrische Feld ermöglicht .

Experimente haben gezeigt, dass dsDNA-Moleküle einen messbaren CISS-Effekt erzeugen können [ 148, 149 ] (Abbildung 6b). In diesen Experimenten wurden thiolierte ssDNA-Moleküle auf einem Ni-Substrat absorbiert, während komplementäre ssDNA-Stränge an Goldnanopartikel gebunden wurden. Bei der Hybridisierung der Ständer wurden Ni-dsDNA-Au-Übergänge gebildet und ihre elektrische Leitfähigkeit wurde mit AFM mit einer leitfähigen Spitze im Kontaktmodus untersucht. [ 148, 149 ] Ein Permanentmagnet wurde verwendet, um das Ni-Substrat zu magnetisieren, wodurch zwei Leitungsbänder im Ni-Substrat erzeugt wurden: ein Band entsprach den Elektronen, deren Spin zum Magnetfeld ausgerichtet war, und das andere war entgegengesetzt zum Magnetfeld ausgerichtet. Das resultierende ichV Kurven sind in Abbildung 6b unten gezeigt. Wenn die Spinorientierung des Ni-Substrats mit der bevorzugten Transmissionsrichtung durch das chirale Molekül ausgerichtet ist, ist der Strom höher als wenn das Ni-Substrat in die andere Richtung magnetisiert wird. Notiere dass der NS Kurven sind symmetrisch, was bedeutet, dass die Elektronen mit entgegengesetztem Spin von Gold zu Ni fließen, wenn eine entgegengesetzte Vorspannung angelegt wird. Wir stellen weiterhin fest, dass in der DNA-Spintronik Tunnel zwischen den aromatischen Orbitalen von Nukleobasen auftritt, jedoch zeigen auch chirale Moleküle ohne aromatische Gruppen diesen Effekt. Diese Art von Spinselektivität kann überall dort auftreten, wo ein chirales Potential existiert.

Eine mögliche Anwendung des Spinselektivitätseffekts der DNA ist die elektrochemische Wasserspaltung (Abbildung 6c). Die Trennung von Wasser, das ein Spin-Singulett ist (das keine ungepaarten Elektronen enthält), in H2 (Unterlinge) und O2 (natürlich in einem Spintriplett-Zustand mit einem Gesamtspin von eins) ist Spin verboten, und daher ist dieser Prozess langsam. [ 147 ] Spinselektion kann diesen Prozess beschleunigen. In den Experimenten von Mtangi et al. wurden [ 150 ] CdSe-Nanopartikel (rot) mit TiO2 Nanopartikel und dann das TiO2 Nanopartikel wurden an der leitenden Elektrode aus fluordotiertem Zinnoxid (FTO) angebracht, die als Anode diente. Als Kathode diente die Pt-Elektrode, von der aus Wasserstoff erzeugt wurde. Aufgrund der Anwesenheit chiraler Moleküle konnten Elektronen nur eines Spinzustands von CdSe auf Titandioxid übertragen werden. Somit war die Spinorientierung der Löcher in den CdSe-Nanopartikeln gut definiert. Da die Sauerstoffatome den gleichen ungepaarten Spin hatten, ist die Wahrscheinlichkeit der Bildung von O2 war viel höher als in einem System ohne chirale Moleküle. [ 150 ]

Spinsysteme sind aufgrund ihrer Schaltbarkeit und langen Kohärenzzeit vielversprechende Kandidaten für die Speicherung von Quanteninformationen. Die Verwendung von CISS zum Bau einer Spin-Speichervorrichtung ist ebenfalls möglich und wurde experimentell für mehrere (aber nicht Nukleinsäure-) chirale Moleküle realisiert. [ 155-157 ] Abbildung 6d veranschaulicht das Design eines CISS-basierten Speichers, der möglicherweise dsDNA als CISS-Filtermolekül verwenden könnte. Das linke Feld von Fig. 6d zeigt einen elektrischen Speicher, der durch den elektrischen Strom geschrieben und ausgelesen wird, wie er von Koplowitz et al. konzipiert wurde. [ 157 ] Das ferromagnetische Nanopartikel (rot) wird zuerst in der Richtung anti-ausgerichtet zur Spinrichtung magnetisiert, was den Transfer vom Substrat zum Nanopartikel begünstigt. Um in den Speicher zu schreiben, wird eine hohe Kreuzmolekülspannung angelegt. Nur ein Spin darf durch das chirale Molekül zum Substrat gelangen, und somit wird der Spin des Nanopartikels umgedreht. Zum Auslesen der Informationen wird eine niedrigere Spannung angelegt. Da die Spin-Zustände der geschriebenen Bits bereits besetzt sind, haben die ungeschriebenen Bits einen geringeren Widerstand als die geschriebenen Bits. Das rechte Feld von Fig. 6d zeigt einen Entwurf eines einzelnen Bits eines optischen Speichers, der durch zirkular polarisiertes Licht angesteuert wird. Wenn das Nanopartikel durch Licht angeregt wird, schwingt die Ladung mit dem elektrischen Feld und erzeugt ein Netto-Spin-Transfer-Drehmoment zwischen dem angeregten Quantenpunkt und dem ferromagnetischen Substrat, wodurch eine lokale Magnetisierung im Substrat zurückbleibt. [ 147, 155 ] Ben et al. konnten diese Art von Speicher auslesen, indem sie die Hall-Spannung über dem Substrat messen. [ 155 ] Während diese beiden Arten von spinselektiven Speichern mit Silizium kompatibel sind, erfordert das Löschen von Informationen den chemischen Austausch der Moleküle durch ihre Enantiomere, was ein höchst ineffizienter Prozess sein kann. Da bereits Verfahren zum Umschalten der Chiralität eines DNA-Origami entwickelt wurden, könnten DNA-Origami-Konstrukte möglicherweise eine Rolle bei der zukünftigen Entwicklung dieser Art von Speichergeräten spielen.

4.3 Weitere sich abzeichnende Anwendungsbereiche

Die Kontrolle und Anpassbarkeit von DNA-Nanostrukturen macht sie zu einer attraktiven Perspektive für den gezielten Wirkstofftransport. Insbesondere dienten DNA-Origami-basierte Anordnungen als Vehikel für die Abgabe des Krebsmedikaments Doxorubicin (Dox), das zwischen DNA-Basen interkaliert, an infizierte Zellen. [ 158, 160, 161 ] In einer solchen Studie [ 158 ] wurden zwei stäbchenförmige DNA-Origami-Nanostrukturen mit unterschiedlichen globalen Designs (Abbildung 7a) wurden verwendet, um Dox an menschliche Brustkrebszellen zu verabreichen. Es wurde festgestellt, dass die global verdrehte Struktur den Wirkstoff langsamer freisetzt als die geradlinige Origami-basierte Struktur oder das frei diffundierende Dox (Abbildung 7b). Somit scheint die Kinetik der Wirkstofffreisetzung durch die globale Drehung der Nanostruktur gesteuert zu werden, was interessante Möglichkeiten zur dynamischen Regulierung der Wirkstofffreisetzung oder zur Konditionierung der Freisetzungsgeschwindigkeit an das Vorhandensein spezifischer Biomarker eröffnet.

Mit DNA-Origami als Baumaterial könnten Informationen mit nanoskaliger Präzision gespeichert oder angezeigt werden. Die Spinselektivität von DNA-Origami könnte genutzt werden, um ein Array von Bits aufzubauen, die möglicherweise als Speichergerät dienen könnten. Frühere Studien [ 155, 157 ] verwendeten eine Reihe von kurzen α-helikale Peptide, um eine solche Vorrichtung herzustellen (Abbildung 6d). Eine weitere potenzielle Anwendung ist ein aktiv schaltbares Display (Abbildung 7c), das unter Verwendung von Nanopartikeln konstruiert werden könnte, die mit DNA-Origami in einem chiralen Muster angeordnet sind, um eine starke CD-Antwort zu liefern. Wenn rechtshändiges Licht entlang der Helixachse einer linkshändigen Helix scheint, wird ein Großteil des Lichts absorbiert. [ 129 ] Wird dieselbe Helix so gedreht, dass ihre Helixachse senkrecht zum Licht steht, nimmt die Absorption ab. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein DNA-Origami-Bündel mit einer Elektrode reversibel zwischen aufrechter und flacher Konfiguration umgeschaltet werden kann. [ 162 ] Dieser Mechanismus könnte verwendet werden, um Absorptionszustände elektrisch zu schalten, um eine Anzeige zu erstellen.

Nicht zuletzt können chirale Nanostrukturen für den Transport einzelner Biomoleküle wie DNA-Stränge oder ungefaltete Proteine ​​von entscheidender Bedeutung sein. 7d veranschaulicht eine solche Möglichkeit, bei der ein spiralförmiger Stufendefekt in einer mehrschichtigen Graphenmembran die Lieferung eines einzelnen DNA-Strangs zum Zentrum der Spirale führt. [ 159 ] Molekulardynamik-Simulationen und AFM-Experimente haben gezeigt, dass die Verschiebung eines adsorbierten Moleküls über einen Stufendefekt eine gerichtete Anisotropie aufweist und dass sich ein solches Molekül viel wahrscheinlicher entlang der Stufendefektkante bewegt als quer dazu. Eine externe Kraft, die die Richtung in einem Muster ändert, das der Chiralität der Kantendefektstruktur entspricht, bringt das Molekül unabhängig davon, wo das Molekül adsorbiert ist, in die Mitte der Struktur, während die Anwendung der externen Kraft im entgegengesetzten Chiralitätsmuster sich bewegt das adsorbierte Molekül vom Zentrum der Struktur entfernt.


DISKUSSION

In diesem Artikel haben wir synthetische Genschaltkreise für räumliche Muster vorgestellt, die einfach in Design und Konstruktion, aber robust und in ihrer Funktion einstellbar sind. Die Schaltungen erforderten nur minimale DNA-Teile für den Zusammenbau, erzeugten jedoch gewünschte Muster ohne die Notwendigkeit einer Feinabstimmung der Architektur. Darüber hinaus waren sie robust gegenüber den Störungen verschiedener Umweltfaktoren (z. B. Medienzusammensetzung, pH-Wert und Temperatur) und den Variationen zellulärer Kontexte (z. B. Wirtsorganismus und Plasmidkopienzahl). Darüber hinaus waren die Schaltungen, obwohl sie robust waren, in hohem Maße auf die entworfenen Regulierungssignale abstimmbar. Aufgrund ihrer Robustheit und Abstimmbarkeit ermöglichten uns die Schaltkreise außerdem, vorhersagbare räumliche Strukturen synthetischer Bakteriengemeinschaften zu etablieren und kontrollierbare Anordnungen von zellulären Gittern und Flecken im Weltraum zu erstellen. Im Vergleich zu anderen Beispielen, die zur Kontrolle des räumlichen Bandverhaltens konstruiert wurden (12, 17–19), bietet diese Studie eine einfache und dennoch zuverlässige Lösung zur Programmierung robuster und abstimmbarer räumlicher Muster, die genutzt werden können, um komplexe Populationsstrukturen zu erzeugen. Die Zerbrechlichkeit von Schaltkreisen ist eine der größten Hürden in der synthetischen Biologie, die den Aufbau komplexer Netzwerke für fortgeschrittene Funktionalitäten und die Anwendung der synthetischen Biologie in realen Umgebungen behindert (10, 31–34). Um dieser Herausforderung zu begegnen, waren die Hauptanstrengungen die Entwicklung neuer Konstruktionsprinzipien und -methoden. Diese Studie zeigt, dass ein tiefer Abbau der unerschlossenen Kapazitäten natürlicher Systeme, wie der dualen Funktionalität von Nisin, eine alternative Strategie zum Aufbau von Robustheit sein kann. Wichtig ist, dass die Implementierung der gewünschten Funktionalität bei entsprechendem Mining keine komplexe Schaltungskonstruktion und -optimierung erfordert.

Diese Arbeit verbessert unsere Fähigkeit, mikrobielle Gemeinschaften zu kontrollieren und Umweltsignale zu erfassen. Es kann auch der Entwicklung von Tissue Engineering und Biomaterial-Fabrikationen zugute kommen, die eine räumlich-zeitliche Kontrolle von Signalmolekülen erfordern. Da das Bandpassverhalten der konstruierten Schaltkreise häufig in der Natur auftritt, bietet die Studie außerdem Einblicke in die grundlegenden zellulären Koordinationsprozesse natürlicher Systeme, wie z. B. den Zusammenbau mikrobieller Gemeinschaften und die Embryoentwicklung.