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11.14: Einführung in DNA-Basenpaare und Replikation - Biologie

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Erklären Sie die Rolle der komplementären Basenpaarung im präzisen Replikationsprozess der DNA

In diesem Ergebnis erfahren wir mehr über die genaue Struktur der DNA und wie sie sich repliziert.

Was Sie lernen werden

  • Verstehen Sie die historische Grundlage unseres Verständnisses von DNA
  • Skizzieren Sie die grundlegenden Schritte der DNA-Replikation
  • Identifizieren Sie die wichtigsten Enzyme, die bei der DNA-Replikation eine Rolle spielen
  • Identifizieren Sie die wichtigsten Korrekturleseprozesse bei der DNA-Replikation
  • Verstehen Sie die grundlegende Rolle von Telomeren beim Schutz der DNA vor Replikationsfehlern

Aktivitäten lernen

Die Lernaktivitäten für diesen Abschnitt umfassen Folgendes:

  • Die Geschichte der DNA
  • Grundlagen der DNA-Replikation
  • Hauptenzyme
  • „Korrekturlesen“ der DNA
  • Telomere
  • Selbsttest: DNA-Basenpaare und Replikation

DNA-Replikation: Bedeutung, Modi und Mechanismus | Zellen-Biologie

Eine der wichtigsten Eigenschaften der DNA, die als genetisches Material fungiert, besteht darin, dass sie genaue Kopien von sich selbst erstellen kann (autokatalytische Funktion), die die Grundlage für die Übertragung erblicher Merkmale bilden, die sie kontrolliert. Dieser Vorgang wird als Replikation bezeichnet.

Die Replikation eines DNA-Moleküls führt zu zwei identischen Tochtermolekülen, die das Kriterium der autokatalytischen Funktion erfüllen. Messungen des DNA-Gehalts während des Teilungszyklus von Zellen zeigen, dass die DNA-Replikation an einem bestimmten Abschnitt der Interphase – der ‘S’-Phase – stattfindet.

Jedes Mal, wenn sich eine Zelle teilt – kurz vor der Zellteilung, muss sich die DNA der Zelle verdoppeln, damit jede der beiden neu entstehenden Zellen genau das gleiche DNA-Komplement und damit den gleichen Satz von Genen erhält – sowohl quantitativ als auch qualitativ – wie zuvor im Elternteil enthalten.

Die Replikation einer DNA führt zur Verdoppelung des gesamten Chromosoms einmal für jeden Zellteilungszyklus. Infolgedessen existiert jedes Chromosom als ein Paar von Chromatiden, die durch ein Zentromer miteinander verbunden sind, und sie werden während der Anaphase zu gleichen Teilen in neu entstehende Tochterzellen getrennt. Daher bleiben sowohl die chemische Natur als auch die Gesamtmenge an DNA in Zellen ähnlicher Art bei jeder Generation konstant.

Der Mechanismus der DNA-Replikation ist im Watson-Crick-Modell der DNA nicht enthalten. Die beiden Ketten einer DNA sind durch Wasserstoffbrücken verbunden. Wenn die Wasserstoffbrückenbindungen brechen, trennen sich die beiden Ketten und lösen sich auf. Es beginnt von einem Ende der DNA bis zum anderen Ende der DNA.

Nacheinander trennt sich jede Purinbase von ihrer Partner-Pyrimidinbase in jedem Basenpaar, aber die Zucker-Phosphat-Rückgrate brechen nicht. Es sieht aus wie ein Reißverschluss, der sich öffnet. Jede Elternkette der DNA dient dann als Matrize oder Form für die Synthese ihrer komplementären neuen Kette auf sich selbst und bildet zwei tochteridentische DNA-Doppelhelices (Abb. 20.1).

Modi der DNA-Replikation:

Es gibt drei mögliche Modi der DNA-Replikation und -Shytion:

Der Semiconser&Shyvative-Modus der DNA-Replikation wurde (1953) von Watson und Crick zusammen mit dem Doppelhelix-Modell der DNA vorgeschlagen. Hier beinhaltet die Replikation von DNA die fortschreitende Trennung der beiden Stränge von DNA-Molekülen durch Aufbrechen von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Basenpaaren.

Jeder Strang, der als Templat fungiert, synthetisiert seinen komplementären neuen Strang aus sich selbst heraus, indem er Rohstoffe aus dem Kernsaft nimmt. Auf diese Weise werden zwei Tochter-DNA-Helices gebildet. Jede Tochter-DNA-Helix hat einen alten oder Elternstrang und einen neuen Strang.

Es zeigt an, dass in jeder Tochter-DNA-Helix ein Elternstrang beibehalten und konserviert wird, während sein komplementärer Strang neu ist. Daher ist gemäß diesem DNA-Replikationsmodus die Eltern-DNA in jedem neuen Tochter-DNA-Molekül teilweise konserviert. Daher wird diese Art der DNA-Replikation als semikonservative Replikation bezeichnet [Abb. 20.2(a)].

Experimentelle Beweise für die semikonservative Replikation:

Obwohl drei mögliche Modi der DNA-Replikation vorgeschlagen wurden, wurde der semikonservative Modus der DNA-Replikation weithin akzeptiert. Für diese Annahme sind experimentelle Beweise oder Beweise erforderlich, um festzustellen, dass DNA tatsächlich auf diese Weise dupliziert wird.

Gleichzeitig ist es notwendig, mehrere andere Möglichkeiten auszuschließen. Mehrere experimentelle Beweise wurden vorgelegt, um den Modus der DNA-Replikation zu erklären, aber die Ergebnisse aller Experimente haben schlüssig bewiesen, dass die DNA-Replikation semikonservativ ist.

Die experimentellen Beweise sind:

(a) Meselson-Stahl-Experiment

(b) Cairns' Autoradiographie-Experiment, und

A. Meselson-Stahl-Experiment:

Der experimentelle Beweis für die semikonservative Replikation von DNA wurde erstmals 1958 von Mathew Meselson und Franklin Stahl nachgewiesen. Sie züchteten Zellen des Bakteriums Escherichia coli auf einem Medium, das 15 N (ein schweres Isotop von 14 N) in Form von Ammoniumchlorid enthielt ( NH4C1).

Die Zellen von E. coli wurden für eine 14-Zell-Generation gezüchtet, so dass die Zellen die 15 N nutzten, um Basen zu synthetisieren, die dann in die DNA eingebaut wurden. DNA mit 15 N hat eine nachweisbare höhere Dichte (1,724 g/cm 2 ) als die mit 14 N (1,710 g/cm 2 ).

Daher werden sie entsprechend schwere und leichte DNA genannt. Schwere und leichte DNA können leicht durch Zentrifugation mit Gleichgewichtsdichtegradienten getrennt werden, wobei sie im Zentrifugenröhrchen eine deutliche Bande bilden (Abb. 20.3).

Die Zellen von E. coli wurden dann subkultiviert und auf einem Medium wachsen gelassen, das normales 14 N enthielt. Der Übertragung der Zellen auf Medium, das normales 14 N enthielt, wurde die DNA aus Zellen nach null, eins, zwei, drei usw. Zellen extrahiert Generationen (eine Zellgeneration stellt die Zeit dar, in der alle Zellen eine Zellteilung durchlaufen).

Die extrahierten DNAs in jeder Zellgeneration wurden im Dichtegradienten von Cäsiumchlorid (CsCl) analysiert.

DNA, die 15 N in beiden Strängen enthält (schwere DNA), bildet eine Bande im CsCl-Dichtegradienten an einer Position mit höherer Dichte als die, die 14 N in beiden Strängen enthält (leichte DNA). Nach einer Wachstumsgeneration in 14 N-Medium bildet die DNA-Bande eine Zwischendichte (Hybrid-DNA).

Eine solche Hybrid-DNA enthält 15 N in einem Strang und 14 N in dem anderen Strang. Nach zwei Wachstumsgenerationen in 14 N-Medium ist die Hälfte der DNA-Banden bei Hybriddichte und die halbe Bande bei leichter Dichte zu sehen.

Es sei darauf hingewiesen, dass nach der konservativen Replikationsmethode nach einer Generation keine Zwischenbande auftritt. Nur schwere und leichte Bands würden gebildet. In ähnlicher Weise würde der dispersive Replikationsmodus nur ein Band mit identischer Dichte erzeugen. Es würden keine Licht- oder Zwischenbänder gebildet werden.

Daher erklärt das Ergebnis des Experiments von Meselson und Stahl klar den semikonservativen Modus der DNA-Replikation, während die Erwartungen anderer Replikationsmodi (konservativ, dispersiv) nicht erfüllt sind.

B. Cairns’-Autoradiographie des replizierenden bakteriellen Chromosoms:

Der semikonservative Modus der Replikation von bakterieller DNA oder Chromosomen wurde 1963 auch von J. Cairns demonstriert, indem er die als Autoradiographie bezeichnete Technik zum Nachweis und zur Lokalisierung der eingebauten radioaktiven Isotope verwendet, die bei der Herstellung von bakterieller DNA durch Belichtung mit einer fotografischen Emulsion vorhanden sind. Unter Verwendung von Autoradiographie kann die DNA-Replikation leicht verfolgt werden.

Für das Experiment züchtete Cairns E. coli in Medium, das tritiiertes Desoxy-Ribonukleosid von Thymidin ( 3 H-Thymidin) enthielt. Thymidin kommt ausschließlich in der DNA vor. Es ist in keinem anderen Hauptbestandteil der Zelle vorhanden.

Es ist also offensichtlich, dass, wenn die bakterielle DNA vor der Zellteilung repliziert, 3 H-Thymidin aus dem Medium in das Zytoplasma der Zelle absorbiert und schließlich in die neu synthetisierte DNA eingebaut wird. Nach regelmäßigen Abständen sammelte Cairns die E. coli-Zellen, lysierte sie sehr schonend, um die DNA nicht zu brechen und sammelte die intakte DNA auf Membranfiltern.

Diese Filter wurden an Glasobjektträgern befestigt und dann wurden die Objektträger mit einer fotografischen Emulsion oder einem Film bedeckt, der sehr empfindlich gegenüber β-Teilchen (den niederenergetischen Elektronen, die beim Zerfall von tritiiertem Thymidin emittiert werden) ist. Die Objektträger wurden ausreichend lange im Dunkeln gelagert.

Während dieser Lagerung belichteten die von tritiiertem Thymidin emittierten Partikel den Film. Die Filme wurden dann entwickelt, um die Autoradiogramme von E. coli-DNA oder -Chromosom zu sehen. Dieses Autoradiogramm zeigte die Bereiche der Anwesenheit von tritiiertem Thymidin und somit indirekt die Anwesenheit von markierter DNA.

Im Diagramm (Abb. 20.5) haben Schleifen A und B eine zweite Replikation in 3 H-Thymidin abgeschlossen und Schleife C muss noch ein zweites Mal repliziert werden. Cairn-Zeichnung [Abb. 20.5(a)] zeigt radioaktive DNA-Stränge als durchgezogene Linien und nicht-radioaktive Stränge als gestrichelte Linien.

Es ist auch anzumerken, dass Schleife B im Autoradiogramm mit zwei radioaktiven Strängen vorliegt und etwa die doppelte Korndichte von Schleife A mit nur einem radioaktiven Strang aufweist. X und Y bezeichnen die Replikationsgabeln, den Verzweigungspunkt, an dem die DNA-Synthese stattfindet.

Cairns’-Autoradiogramm eines kreisförmigen Chromoshysoms, das in Medium mit 3 H-Thymin gezüchtet wurde, zeigt das Vorhandensein von Replikationsaugen oder Bub­bles. Diese sogenannten Θ Strukturen weisen darauf hin, dass sich Duplex-DNA durch die fortschreitende Trennung ihrer beiden Elternstränge, begleitet von der Synthese ihrer komplementären Stränge, repliziert, um zwei halbkonservativ Duplex-Tochterstränge zu ergeben.

DNA-Replikation mit Θ Strukturen ist bekannt als Θ -Reproduzieren. Die Trennung der beiden komplementären Stränge eines DNA-Moleküls würde eine Drehung der Doppelhelix um 360° für jede Helixwindung erfordern. Dies erfordert die Existenz einer Art Wirbel im Chromosom.

Die verfügbaren Beweise legen nahe, dass eine Spaltung oder ein Bruch einer Phosphodiesterbindung in einem Strang der Doppelhelix eine Rotationsachse bereitstellt, um das Abwickeln zu ermöglichen. Cairns interpretierte, dass die semikonservative Replikation an einer Stelle auf dem Chromosom oder der DNA begann, die er den Replikationsstartpunkt nannte, und in eine Richtung fortschreitet, bis die gesamte DNA von E. coli repliziert ist.

Derzeit ist jedoch bekannt, dass die DNA-Replikation tatsächlich bidirektional und nicht in eine Richtung verläuft. Die DNA-Replikation beginnt in beide Richtungen vom Replikationsursprungspunkt und beide Y-förmigen Strukturen sind Replikationsgabeln, die beiden Replikationsgabeln bewegen sich in entgegengesetzte Richtungen – sequentiell um die zirkuläre DNA.

Der semikonservative Replikationsmodus von Chromosomen höherer Pflanzen wurde auch von J.H. Taylor et al. in den Wurzelspitzenzellen von Vicia faba unter Verwendung der Autoradiographietechnik. Sie beobachteten, dass, wenn mit tritiiertem Thymidin behandelte Wurzelspitzen von Vicia faba in tritiiertes Thymidin-freies Medium transferiert wurden, in der ersten Generation der Duplikation beide Chromatiden la­belliert wurden.

In der zweiten Generation der Duplikation wurde in jedem Chromosom eine der beiden Chromatiden als markiert gefunden, während die andere Chromoshymatide unmarkiert war. In der dritten Generation der Duplikation bestanden 50% Chromosomen aus einem markierten und einem unmarkierten Chromatiden.

Taylors Experiment ist sehr wichtig, weil es den semikonservativen Replikationsmodus in Chromosomen einer höheren Pflanze demonstrierte.

Nach diesem Mechanismus kann die Replikation der DNA konservativ sein, was bedeutet, dass die Eltern-Doppelhelix vollständig konserviert ist und intakt bleibt und irgendwie die Synthese einer Tochter-Doppelhelix aus zwei neu synthetisierten Strängen steuert [Abb. 20.2(b)],

Bei der dispersiven Replikation zerfällt das alte oder Eltern-DNA-Molekül in mehrere Teile. Jedes Stück wird dann repliziert. Die alten und neuen Segmente rekombinieren zufällig, um Tochter-DNA-Moleküle zu ergeben, die sowohl alte als auch neue Segmente entlang ihrer gesamten Länge aufweisen [Fig. 20.2(c)],

Mechanismus der DNA-Replikation:

Die DNA-Replikation ist ein mehrstufiger komplexer Prozess. Es wird durch den Multienzymkomplex katalysiert, der oft als Replikationsapparat oder Replisom bezeichnet wird und erfordert die Beteiligung mehrerer anderer Proteine. Die DNA-Replikation beginnt immer an bestimmten einzigartigen und festen Punkten der DNA, die als Ursprung bezeichnet werden.

Jedes prokaryontische Chromosom hat einen einzigen Ursprung, aber jedes eukaryontische Chromosom hat mehrere Ursprünge (z. B. enthält das Riesenspeichelchromosom von Drosophila 7.000 Ursprünge), Phagen T2 hat einen primären und einen sekundären Ursprung. Bei Vorliegen eines primären Ursprungs bleibt der sekundäre Ursprung funktionslos. Wenn jedoch der primäre Ursprung gelöscht wird, übernimmt der sekundäre Ursprung den funktionalen Ursprung.

Studien mit verschiedenen Organismen zeigen, dass die Replikation von DNA-Molekülen sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryonten bidirektional ist. Die bidirektionale Replikation ist jedoch nicht universell. Das Chromosom des Coli-Phagen P2 das, wie das Lambda-Chromosom, während der Replikation zirkulär ist, repliziert unidirektional von einem einzigartigen Ursprung.

Die doppelsträngige DNA repliziert nicht. Daher müssen vor der Replikation zwei DNA-Stränge nach und nach vom Punkt des Replikationsursprungs in Form eines Replikationsauges oder einer Y-förmigen Replikationsgabel getrennt werden.

Bei der Trennung erfolgt auch die DNA-Synthese meist bidirektional oder selten unidirektional. DNA wird durch Enzyme repliziert, die als DNA-gerichtete DNA-Polymerase oder einfach als DNA-Polymerasen bekannt sind. Dieses Enzym verwendet freie einzelsträngige DNA als Matrize, auf der die Synthese des komplementären Tochterstrangs stattfindet.

Um das Erfordernis der DNA-Polymeraseaktivität zu erfüllen, sind zwei Enzyme und DNA-Helikase erforderlich. DNA-Gyrase reduziert die Verknüpfung von DNA-Strängen und DNA-Helikase bindet zuerst an die Ursprungspunkte und induziert das Abwickeln komplementärer Stränge der DNA-Doppelhelix, um sie einzelsträngig zu machen.

Bestimmte Proteine ​​– sogenannte einzelsträngige Bindungsproteine ​​(SSBPs) – binden fest an die einzelsträngige DNA-Rehygion und tragen zur Stabilisierung der erweiterten einzelsträngigen Matrizen bei, die für die Aktivität der DNA-Polymerase benötigt werden. In einem DNA-Duplex verlaufen zwei antiparallele Elternstränge in entgegengesetzte Richtungen (einer ist 5′ → 3′ und der andere ist 3’→ 5′). Aber die beiden Elternstränge werden auf unterschiedliche Weise repliziert.

Die Synthese der Tochter-DNA verläuft immer in Richtung 5’→3′ an beiden Elternsträngen. Alle bekannten DNA-Polymerasen von sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen haben einen absoluten Bedarf an einer freien 3′-OH-Gruppe eines präexierenden Polynukleotids für die Initiation der DNA-Replikation, einem Primer (RNA oder DNA, aber nur RNA wird in vivo verwendet) und den vier Desoxynukleosiden Triphosphate (dATP, dTTP, dGTP und dCTP), die die Bausteine ​​der DNA sind.

Im Fall des 3’→5′ Matrizenstrangs der Eltern-DNA steht die freie 3′-OH-Gruppe direkt für die Aktivität der DNA-Polymerase zur Verfügung. Daher wird die Tochter-DNA kontinuierlich in Richtung 5′ →3′ synthetisiert, während die Replikationsgabel fortschreitet. Die Replikation eines anderen parentalen Matrizenstrangs (5′ → 3′) des DNA-Moleküls ist diskontinuierlich. Die Replikation dieses (5′ → 3′) Strangs beginnt etwas später als die des 3′ → 5′ Strangs.

Folglich repliziert ein Abschnitt des 5′ →3′ Strangs (in Bezug auf den Ursprung) eines DNA-Moleküls immer später als der homologe Abschnitt des 5′ →3′ Strangs. Daher wird der Strang 3’→5′ eines DNA-Moleküls als führender Strang bezeichnet, während der Strang 5′→3′ als nachlaufender Strang bezeichnet wird.

Der führende Strang wird kontinuierlich und der nachlaufende Strang diskontinuierlich synthetisiert – dies wird als semidiskontinuierliche Replikation bezeichnet.

Im nacheilenden Strang (5’→ 3′) ist die freie 3′-OH-Gruppe für die Aktivität der DNA-Polymerase nicht ohne weiteres verfügbar. Der nachlaufende Strang transkribiert also einen 10-60 Nukleotide langen RNA-Primer (in 5′ →der Ursprung (in der 3′ -> 5′ Richtung des nachlaufenden Strangs).

Das 3′-OH dieser Primer-RNA bietet der DNA-Polymerase den Ausgangspunkt, um die Replikation des nacheilenden Strangs zu katalysieren. Offensichtlich verläuft die Replikation des nacheilenden Strangs von der Replikationsgabel in Richtung des Ursprungs, d. h. seine Richtung ist entgegengesetzt zu der des führenden Strangs (vom Ursprung in Richtung der Gabelung). Der neue Tochterstrang wird jedoch bei beiden Leitsträngen aus 5′ → 3′ synthetisiert.

Die Synthese der RNA-Primer wird durch eine spezielle Enzymklasse, die Primasen, katalysiert. Primase-Aktivität erfordert die Bildung eines Komplexes aus Primase und mindestens sechs anderen Proteinen – der Komplex wird Primo Some genannt. Neben Primase enthält das Primo einige Pre-Priming-Proteine, die vorläufig als Protein i, n, n’ und n” bezeichnet werden und die Produkte der Gene dnaB und dnaC.

Das Primosom führt die anfängliche Priming-Reaktion für den Lead&Shying-Strang und das wiederholte Priming der Synthese von Okazaki-Fragmenten für den nacheilenden Strang durch. Okazaki-Fragmente (Abb. 20.7) sind nach R. Okazaki benannt, der sie zuerst identifizierte.

Die Replikation des nacheilenden Strangs ist insofern diskontinuierlich, als sie mehrmals gestartet werden muss und jedes Mal, wenn ein Okazaki-Fragment produziert wird. Okazaki-Fragmente sind in E. coli etwa 1.000-2.000 Nukleotide lange DNA-Fragmente, während sie in Eukaryoten nur 100-200 Nukleotide lange DNA-Fragmente sind.

In Prokaryoten werden die Synthese der Tochter-DNA am führenden Strang und die Synthese von Okazaki-Fragmenten am nachlaufenden Strang durch die DNA-Polymerase III katalysiert – ein komplexes Enzym, das sieben verschiedene Polypeptide enthält – α, β, ja, , ɛ, r, Q.

Im nacheilenden Strang sind Okazaki-Fragmente mit RNA-Primern assoziiert, die durch DNA-Polymerase I in Prokaryonten verdaut werden. Dieses Enzym katalysiert auch das Auffüllen der so entstandenen Lücken im neuen Strang.

Die Okazaki-Fragmente (nach der Lückenfüllung durch DNA-Polymerase I) werden durch die DNA-Ligase verbunden, die die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen den benachbarten Okazaki-Fragmenten katalysiert. So entsteht ein kompletter daugh­ter-DNA-Strang auf nacheilendem Elternstrang.

Aus der obigen Beschreibung wird bemerkt, dass die DNA-Replikation in einer Richtung vom Ursprung aus fortschreitet und die gleichen Ereignisse auch in der entgegengesetzten Richtung des Ursprungs auftreten. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die Replikation des führenden Strangs (in Bezug auf den Ursprung) eines DNA-Moleküls kontinuierlich ist, während die des nachlaufenden Strangs diskontinuierlich ist.

Dieses Konzept ist für prokaryontische und eukaryontische Organismen anwendbar und ist auch für beide Replikationsgabeln, die an jedem Ursprung erzeugt werden, haltbar.

Enzyme und Proteine, die an der DNA-Replikation beteiligt sind:

Die DNA-Replikation ist ein komplexer Prozess. Es benötigt eine große Vielfalt an Enzymen und Proteinen.

Wichtige Enzyme und Proteine, die an der DNA-Replikation beteiligt sind, sind:

ich. Als Helikasen bekannte Enzyme, die DNA-Stränge an der Replikationsgabel trennen

iii. Proteine, die sie daran hindern, sich erneut zu verbinden, bevor sie repliziert werden

NS. Enzyme, die RNA-Primer synthetisieren

vi. Ein Enzym zum Entfernen von RNA-Primern und

vii. Ein Enzym zur kovalenten Verknüpfung aufeinander folgender Okazaki-Fragmente.

DNA-Helikasen (DNA-abhängige ATPasen):

DNA-Helikasen haben die Eigenschaft, einen DNA-Duplex abzuwickeln. Für diesen Prozess benötigt das Enzym die Energie, die aus der Hydrolyse von ATP gewonnen wird. Pro abgewickeltem Nukleotid werden zwei Moleküle ATP hydrolysiert.

Dies ist ein hoher Preis für die Entwindung der DNA, da 60 kJ Energie freigesetzt werden, um Wasserstoffbrückenbindungen aufzubrechen. DNA-Helikasen werden auch benötigt, um die Transkription zu initiieren. In E. coli wurden sieben Helikasen teilweise charakterisiert – Helikase I, Helikase II, Helikase III und so weiter.

Alle synthetischen Aktivitäten (Transkription, Replikation und Synthese usw.), die doppelsträngige DNA beinhalten, erfordern eine Trennung der Stränge. Das bedeutet, dass doppelsträngige DNA am Ort der synthetischen Aktivität in zwei einzelsträngige Strukturen umgewandelt werden soll.

Zwei DNA-Stränge liegen jedoch nicht einfach nebeneinander, sie sind ineinander gewunden. Ihre Trennung erfordert daher, dass sich die Stränge im Raum umeinander drehen. Dies erfordert die Existenz einer Art Drehgelenk in der DNA.

Vorliegende Beweise deuten auch darauf hin, dass ein vorübergehender Einzelstrangschnitt (Bruch einer Phosphodiesterbindung in einem Strang der Doppelhelix) eine Achsendrehung bereitstellt, um ein Abwickeln zu ermöglichen. DNA verhält sich tatsächlich wie eine geschlossene Struktur ohne freie Enden.

Somit kann - nach einem vorübergehenden Einzelstrangschnitt und unter Verwendung des abgeschnittenen freien Endes - ein Strang um den anderen gedreht werden, wonach der Bruch nachgeholt wird. Eine solche Reaktion wandelt ein topologisches Isomer in ein anderes um.

Topologische Isomere sind DNA-Moleküle, die bis auf einen Unterschied in der Verbindungszahl identisch sind, also der Häufigkeit, mit der ein Strang den anderen im Raum kreuzt. DNA-Topoisomerasen katalysieren diese Umwandlung. Einige Topoisomerasen können nur negative Supercoils von DNA entfernen, andere können sowohl negative als auch positive Supercoils entfernen.

Es gibt zwei Arten von Topoisomerase:

Typ-I-Enzym wirkt, indem es einen vorübergehenden Bruch in einem DNA-Strang macht.

Enzyme vom Typ II wirken, indem sie einen vorübergehenden Doppelstrangbruch einführen.

Die am besten charakterisierte Topoisomerase vom Typ I ist das Produkt des top A-Gens von E. coli, das stark negativ supercoiled DNA relaxiert. Dieses Enzym wirkt nicht auf positiv supercoiled DNA.

In Prokaryonten bindet Topoisomerase I an DNA und bildet einen stabilen Komplex, in dem ein DNA-Strang eingekerbt wurde und sein 5′ -Phosphat kovalent an einen Tyrosinrest im Enzym gebunden ist. Das eukaryotische Enzym (Topoisomerase) produziert eine 5’OH-Gruppe (die zu Polynukleotidkinase phosphoryliert werden kann) und ein 3′ Phosphat, das an ein Tyrosin im Enzym gebunden ist.

Topoisomerase vom Typ I bindet zuerst an eine Region, in der die Duplex-DNA in ihre Einzelstränge zerlegt wird, dann bricht sie einen Strang und zieht den anderen Strang durch den Bruch und verschließt schließlich den Bruch.

Topoisomerase Typ II entfernt im Allgemeinen sowohl negative als auch positive Supercoils von DNA. Die Reaktion benötigt ATP. Ein ATP wird wahrscheinlich hydrolysiert, um das Enzym durch Konformationsänderungen zu treiben, die die erforderliche Kraft bereitstellen, um einen DNA-Duplex durch den Bruch im anderen Duplex zu drücken.

Die Reaktion der Topoisomerase II stellt wahrscheinlich eine unspezifische Erkennung von DNA-Duplexen dar, die in Apposition gebracht werden.

Das Enzym macht einen Doppelstrangbruch in einem Duplex und ein ungebrochener Duplex wird durch das Ende des Bruchs geleitet. Schließlich wird der Bruch versiegelt und das Enzym setzt DNA frei. Auf diese Weise relaxiert Topoisomerase II sowohl positive als auch negative Supercoils.

Es gibt mindestens zwei Arten von Topoisomerase II. Die eukaryontischen Enzyme und das Enzym des Bakteriophagen T4 sind in der Lage, supercoiled DNA zu relaxieren. Das heißt, sie katalysieren die Umwandlung von supercoiled DNA in einen entspannten, zyklischen Duplex.

Bakterielle Topoisomerasen vom Typ II sind als DNA-Gyrasen bekannt und können zusätzlich negative superhelikale Windungen in kovalent geschlossene, entspannte, zyklische Duplex-DNA-Moleküle einführen.

DNA-Gyrasen, die die Bildung negativer Supercoils in der DNA katalysieren, sind für die Replikation essentiell und spielen vermutlich eine Schlüsselrolle beim Entwindungsprozess. Ein dritter Typ von Topoisomerase II wurde bei Archaebakterien beschrieben. Diese umgekehrte Gyrase ist in der Lage, einen entspannten zyklischen DNA-Duplex in ein positiv supergeknäultes Molekül umzuwandeln.


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