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Welches ist die Richtlinie für die Auswahl eines molekularen Ziels, um Wirbeltierwirte aus Arthropoden-Blutmehl zu identifizieren?

Welches ist die Richtlinie für die Auswahl eines molekularen Ziels, um Wirbeltierwirte aus Arthropoden-Blutmehl zu identifizieren?


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Es gibt einige molekulare Ziele, um Wirbeltierwirte aus Arthropoden-Blutmehl zu identifizieren, einschließlich des Cyt b-Gens und des COI-Gens. Welche Standards oder Eigenschaften muss ich beachten, um ein molekulares Ziel für die Identifizierung von Wirtsblut von Mücken auszuwählen? Ich würde Ihre Hilfe schätzen.


Ich habe mich mit dem Thema befasst und Experten gefragt, und die beste Annäherung, um den Wirbeltierwirt aus Arthropoden-Blutmahlzeiten zu kennen, ist das Zielen auf mitochondriale Gene, da Sie saubere Sequenzdaten erhalten können, da nur ein Allel vorhanden ist und nicht zwei.

Innerhalb des mitochondrialen Genoms sollten Sie ein Gen auswählen, das für die meisten Wirbeltierarten, die Sie wahrscheinlich in Ihrer Region entdecken werden, weit sequenziert wurde, sonst werden Sie viele unbekannte Identitäten unter Ihren Blutmahlzeiten haben. Tatsächlich gibt es nur zwei Möglichkeiten, die diesen Kriterien entsprechen: das Cytochromoxidase I (COI)-Gen, das vom Database of Life-Projekt verwendet wurde; und Cytochrom b, für das Sequenzen in der GenBank weithin verfügbar sind (d. h. für viele Wirbeltierarten). Wenn Sie bei einem ein negatives Ergebnis erhalten, können Sie das andere ausprobieren. Primersequenzen sind in der Literatur weit verbreitet.

Zusammenfassend müssen Sie COI- und Cytb-Zielgene sein, um die Wirtsidentifikation sicherzustellen und eine nicht identifizierte Übereinstimmung im Database of Life-Projekt oder in der GenBank zu verhindern.

Ich gebe Ihnen ein Papierbeispiel, um die Methodik zu überprüfen: Host Preference of the Arbovirus Vector Culex erraticus (Diptera: Culicidae) am Sonso Lake, Cauca Valley Department, Kolumbien


Barcoding von Blutmahlzeiten: Neue wirbeltierspezifische Primer-Sets zur Zuweisung taxonomischer Identitäten zur Wirts-DNA aus Mückenblutmahlzeiten

Die Übertragungsdynamik von Krankheitserregern, die durch Moskitos vektorisiert werden, wird zum Teil durch das Nahrungsmuster des Wirts von Moskitos vermittelt. Diese Muster werden mittels Blutmehlanalyse aufgeklärt, einer Sammlung serologischer und molekularer Techniken, die die taxonomischen Identitäten der Wirtstiere bestimmen, aus denen Blutmehl gewonnen wird. Moderne Blutmehlanalysen beruhen auf Polymerase-Kettenreaktion (PCR), DNA-Sequenzierung und bioinformatischen Vergleichen von Blutmehl-DNA-Sequenzen mit Referenzdatenbanken. Im Idealfall amplifizieren Primer, die in PCRs zur Blutmehlanalyse verwendet werden, Templates aus einem taxonomisch unterschiedlichen Bereich von Vertebraten, erzeugen ein kurzes Amplikon und vermeiden die Co-Amplifikation von Nicht-Ziel-Templates. Es gibt nur wenige Primer-Sets, die diesen Anforderungen entsprechen Cytochrom C Oxidase-Untereinheit I (COI) Gen, dem Artidentifikationsmarker mit der höchsten taxonomischen Abdeckung in Referenzdatenbanken. Hier präsentieren wir neue Primer-Sets, die entwickelt wurden, um Fragmente der DNA-Barcoding-Region des Wirbeltiers zu amplifizieren COI Gen, während die Co-Amplifikation von Moskito-Matrizen ohne Multiplex- oder Nested-PCR vermieden wird. Die Primer wurden validiert unter Verwendung von Wirts-Vertebraten-DNA-Matrizen aus Mückenblutmahlzeiten bekannter Herkunft, die alle terrestrischen Wirbeltierklassen repräsentieren, und im Feld gesammelten Mückenblutmahlzeiten unbekannter Herkunft. Wir fanden, dass die Primer im Allgemeinen bei der Amplifikation von Wirbeltierwirten wirksam waren, jedoch nicht bei Moskito-DNA-Matrizen. Auf die Probe unbekannter Mückenblutmahlzeiten angewendet, wurden > 98% (60/61) der Blutmahlzeiten zuverlässig identifiziert, was die Machbarkeit der Identifizierung von Mückenwirten mit den neuen Primern demonstriert. Diese Primer sind insofern von Vorteil, als sie zur Amplifikation verwendet werden können COI Matrizen aus einer Vielzahl von Wirbeltierwirten mithilfe von Standard-PCR, wodurch der Prozess der Identifizierung von Mückenwirten rationalisiert und auf DNA-Sequenzierungs- und Metabarcoding-Ansätze der nächsten Generation angewendet werden könnte.


Originaler Forschungsartikel

Luis M. Hernández-Triana 1 *, Javier A. Garza-Hernández 2 , Aldo I. Ortega Morales 3 , Sean W. J. Prosser 4 , Paul D. N. Hebert 4 , Nadja I. Nikolova 4 , Elsa Barrero 1 , Erick de J. de Luna-Santillana 5 , Vicente H. González-Alvarez 6 , Ramón Mendez-López 3 , Rahuel J. Chan-Chable 3 , Anthony R. Fooks 1 und Mario A. Rodríguez-Pérez 5 †
  • 1 Behörde für Tier- und Pflanzengesundheit, Abteilung für Virologie, Forschungsgruppe Tollwut und wild lebende Zoonosen, Addlestone, Vereinigtes Königreich
  • 2 Instituto de Ciencias Biomຝicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Chihuahua, Mexiko
  • 3 Departamento de Parasitolog໚, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Unidad Laguna, Periférico Raúl López Sánchez y Carretera a Santa Fe, Torreón, Mexiko
  • 4 Zentrum für Biodiversitätsgenomik, University of Guelph, Guelph, ON, Kanada
  • 5 Instituto Politຜnico Nacional, Centro de Biotecnolog໚ Genómica, Reynosa, Mexiko
  • 6 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Guerrero, Chilpancingo, Mexiko

Es gibt 񾉀 Arten von Culicidae in Mexiko, von denen einige Vektoren von durch Arthropoden übertragenen Viren wie dem Zika-Virus, Dengue-Virus, Chikungunya-Virus und dem West-Nil-Virus sind. Daher ist die Identifizierung der Nahrungspräferenzen von Mücken von größter Bedeutung für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Vektoren und Wirten, die wiederum die Kontrolle von Krankheitsausbrüchen unterstützen können. Typischerweise werden DNA und RNA zur Identifizierung von Tieren (Insekten und Blutmehlwirte) und Virus getrennt extrahiert, aber diese Studie zeigt, dass mehrere Organismen aus einem einzigen RNA-Extrakt analysiert werden können. Zum ersten Mal wurde Rest-DNA, die in Standard-RNA-Extrakten vorhanden ist, durch DNA-Barcoding in Zusammenarbeit mit Sanger und Next-Generation-Sequencing (NGS) analysiert, um sowohl die Mückenart als auch die Quelle ihrer Mahlzeiten bei blutgefütterten Weibchen zu identifizieren, die in sieben Waldgebieten gefangen wurden Gemeinden im Bundesstaat Chiapas, Mexiko. Während die molekulare Identifizierung von Moskitos Standard-Barcoding-Methoden umfasste, wurde die Sensitivität der Identifizierung von Blutmehl durch die Verwendung kurzer Primer mit NGS maximiert. Insgesamt sammelten wir 1.634 Exemplare aus 14 Gattungen, 25 Untergattungen und 61 Morphospezies von Mücken. Davon waren vier Arten neue Rekorde für Mexiko (Aedes guatemala, Ae. insolitus, Limatus asulleptus, Trichoprosopon pallidiventer) und neun waren neue Rekorde für den Bundesstaat Chiapas. DNA-Barcode-Sequenzen für 𾌀 bp des COI-Gens wurden von 291 Proben erhalten, während 130 bp-Sequenzen von weiteren 179 Proben gewonnen wurden. In neun Taxa wurden hohe intraspezifische Divergenzwerte (Ϣ%) beobachtet, die auf kryptische Spezieskomplexe hindeuten: Anopheles Eiseni (5.39%), Ein. pseudopunctipennis (2.79%), Ä. podographicus (4.05%), Culex Ostern (4.88%), Cx. erraticus (2.28%), Toxorhynchites haemorrhoidalis (4.30%), Tr. pallidiventer (4.95%), Wyeomyia adelpha/Wy. Guatemala (7.30%), und Wy. Pseudopekten (4,04 %). Die Studie erhöhte die Zahl der bekannten Mückenarten von 128 Arten auf 138 Arten für den Bundesstaat Chiapas und 239 für Mexiko insgesamt. Die Blutmahlanalyse hat das gezeigt Aedes angustivittatus von Enten und Hühnern gefüttert, während Psophora albipes vom Menschen ernährt. Culex quinquefasciatus ernährte sich von verschiedenen Wirten, darunter Huhn, Mensch, Truthahn und mexikanische Grackle. In den untersuchten Proben wurde keine Arbovirus-RNA durch die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion nachgewiesen. Diese Studie zeigte zum ersten Mal, dass restliche DNA, die in RNA-Blutmehlextrakten vorhanden ist, zur Identifizierung von Wirtsvektoren verwendet werden kann, was die wichtige Rolle molekularer Ansätze sowohl bei der Vektoridentifizierung als auch bei der Aufdeckung von Wirt-–vector–-Pathogen-Interaktionen unterstreicht.


Ältere Techniken

Proteinelektrophorese

Die Proteinelektrophorese, insbesondere in Kombination mit der Färbung auf Enzymaktivität, wurde früher häufig in Studien zur Systematik von Wirbellosen und zur Populationsgenetik eingesetzt, wurde jedoch heute weitgehend durch DNA-Techniken ersetzt, die möglicherweise eine weitaus reichhaltigere Informationsquelle bieten. Die Verwendung von Elektrophorese zur Analyse des Darminhalts von Gliederfüßern wurde in Murray . untersucht et al. (1989) und Salomon et al. (1996). Der am häufigsten verwendete Ansatz bestand darin, Extrakte von homogenisierten Raubtieren (oder nur deren Eingeweide) auf Polyacrylamidgelen zu analysieren und auf Enzymaktivität, insbesondere Esterasen, zu färben (z. B. Schelvis & Siepel 1988 Walrant & Loreau 1995). Die Streifenbildungsmuster werden dann mit denen für die Zielbeute verglichen. Die Hauptnachteile dieses Ansatzes sind entweder ein Mangel an artspezifischen diagnostischen Bändern oder einfach die Unmöglichkeit, die komplexen Bandmuster zu trennen, die entstehen, wenn ein einzelner Raubtierdarm die Überreste mehrerer verschiedener Beutetiere enthält (Walrant & Loreau 1995). Die Elektrophorese ist am effektivsten, wenn sich die Raubtiere von einem begrenzten Beutebereich ernähren (z. B. Giller 1986 Lister et al. 1987 Dicke & de Jong 1988 Solomon et al. 1996 ) und wird heute noch gelegentlich verwendet ( Corey et al. 1998 Paill 2000 Traugott 2001). Elektrophorese in verschiedenen Formen wurde hauptsächlich verwendet, um die Ernährung von Arthropoden wie räuberischen Coleoptera, Hemiptera und Acarina zu analysieren. Es wurde auch in der Wirbeltierforschung angewendet, um beispielsweise die Ernährung von Seevögeln zu untersuchen (Walter & O’Neill 1986 Freeman & Smith 1998).

Immunoassays mit polyklonalen Antiseren

Polyklonale Antiseren werden seit über 50 Jahren umfassend zur Analyse des Darminhalts von wirbellosen Raubtieren verwendet, und das Thema (Techniken und Anwendungen, Vor- und Nachteile) wurde in mehreren früheren Übersichten umfassend behandelt, hauptsächlich in Bezug auf die Prädation durch terrestrische Arthropoden ( Boreham & Ohiagu 1978 Sunderland 1988 Greenstone 1996 Symondson & Hemingway 1997 Symondson 2002 Sunderland et al. im Druck). Hoyt et al. (2000) überprüfen die Verwendung polyklonaler Antiseren zur Untersuchung von Nahrungsnetzen in marinen Ökosystemen und beschreiben die Verwendung von Pricipitin-Tests und Western-Blotting, um die Prädation von Garnelen auf harpacticoide Copepoden zu untersuchen.

Kurz gesagt beinhalten die Techniken die Erzeugung von Antikörpern durch Injektion von Ziel-Beuteproteinen in ein Säugetier (normalerweise ein Kaninchen). Nach zwei oder drei solcher Injektionen werden Antikörper aus Blutseren gewonnen. Die Antikörper umfassen eine große Anzahl unterschiedlicher Spezifitäten, die an Epitope (Bindungsstellen) auf den injizierten Antigenen binden. Diese Mischung von Antikörpern wird dann in einer Reihe verschiedener Assayformate verwendet, um zu testen, ob Antigene im Darm von im Feld gesammelten Raubtieren vorhanden sind und somit ob die Zielbeute verbraucht wurde.

Antikörper und Testproben wurden auf eine Vielzahl von ausgeklügelten Wegen zusammengebracht (überprüft in Boreham & Ohiagu 1978). In den meisten früheren Assays durften Antikörper und Antigen entweder durch eine Flüssigkeit oder ein Gel passiv zueinander diffundieren (Präzipitintests) oder schneller in einem elektrischen Feld zusammengebracht werden (Immunelektroosmophorese). Ein weißer Niederschlag zeigte eine positive Reaktion an, bei der die bivalenten Antikörper mit ihren spezifischen Antigenen Matrizen bilden. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um die Ernährung einer breiten Palette von Arthropoden-Raubtieren zu analysieren (überprüft von Greenstone 1996). Obwohl die meisten Studien das Spektrum der Raubtiere untersuchten, die sich von einer Zielbeute ernähren, wurden in einigen eine Reihe von Antiseren entwickelt, um die Beutewahl in beispielsweise Wäldern ( Dennison & Hodkinson 1983 ) und Meeren ( Feller et al. 1985 Mayfield et al. 2000) Ökosysteme. Eine Weiterentwicklung des Präzipitintests, die Raketenimmunelektrophorese, ermöglicht die getrennte Analyse verschiedener Antigene innerhalb einer Probe durch Kombination von Elektrophorese und Präzipitintests. Dieser Test wurde beispielsweise effektiv eingesetzt, um den Darminhalt von Kopffüßern auf die Überreste verschiedener Krebstiere ( Boyle et al. 1986 ) und Robben und Delfine für die Überreste von Salmoniden ( Pierce et al. 1990b). Interessanterweise erwies sich der gleiche Ansatz als effektiv, wenn er nichtinvasiv verwendet wurde, um Kot von Robben auf die Überreste bestimmter Fische zu untersuchen ( Pierce et al. 1990a 1990b). Offensichtlich denaturieren Robben Proteinantigene zumindest nicht vollständig während der Verdauung, und es ist vielleicht überraschend, dass dieser Ansatz für Studien der Ernährung anderer Wirbeltiere nicht weiter verbreitet wurde (siehe jedoch unten DNA-Techniken).

Präzipitin-Techniken werden immer noch gelegentlich in Prädationsstudien verwendet (z. B. Hoyt et al. 2000 ), trotz der Verfügbarkeit weitaus empfindlicherer Ansätze, insbesondere Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA). ELISA erhält seine hohe Sensitivität, indem er ein Enzym direkt oder indirekt an die Antikörper in einem Antiserum anlagert. Assays finden normalerweise auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen statt, in denen eine positive Reaktion durch die Anwesenheit des Enzyms angezeigt wird, indem ein Substrat in Gegenwart des spezifischen Antigens von einem farblosen in ein farbiges Produkt umgewandelt wird. Assayformate und -protokolle sowie Beispiele für die Verwendung von ELISA in Prädationsstudien werden umfassend in Sunderland (1988), Greenstone (1996), Symondson & Hemingway (1997), Symondson (2002) und Sunderland . besprochen et al. (im Druck). Seit seiner ersten Verwendung in Prädationsstudien von Miller (1981) und Ragsdale et al. (1981) wurden polyklonale Antiseren plus ELISA verwendet, um die Ernährung eines breiten Spektrums von wirbellosen Raubtieren zu untersuchen. In den meisten Fällen untersuchten die Studien wiederum das Spektrum der Raubtiere, die sich von einer Zielbeuteart wie Blattläusen ernähren ( Crook & Sunderland 1984 Chiverton 1987 Sunderland et al. 1987 ), Mirid Bugs ( McIver & Tempelis 1993 ) und Lepidoptera Larven ( Kapuge et al. 1987 DuDevoir & Reeves 1990). In wenigen Fällen wurden die Prädation durch Schlüsselprädatoren unter unterschiedlichen Bedingungen oder zu unterschiedlichen Jahreszeiten in Bezug auf den Beutekonsum (quantitativer ELISA) und die Beutepopulationsdichte (z. B. Symondson .) quantitativ bewertet et al. 1996). Methoden zur Schätzung der Prädation im Feld aus ELISA-Daten (und anderen Immunoassay-Systemen) wurden von Sopp . überprüft et al. (1992) und Mills (1997).

Gelegentlich wurde auch die Ernährung von Wirbeltieren mit ELISA untersucht, einschließlich der Analyse des Pflanzeninhalts von Pinguinen ( Walter et al. 1986). ELISA wurde auch verwendet, um Räuber-Beute-Interaktionen zwischen Wirbellosen in marinen Ökosystemen zu untersuchen: Theilacher et al. (1993) untersuchten die Prädation durch Krebstiere in den frühen Stadien von Sardellen (mittels Dot-ELISA – siehe unten) Venter et al. (1999 ) untersuchten die Ausbeutung von Zooplankton durch Tintenfischparalarven und Mayfield et al. (2000) entwickelten Antiseren, um die Ernährung von Hummern zu untersuchen.

Die Neigung polyklonaler Antikörper zu Kreuzreaktionen (z. B. Mayfield et al. 2000 ) kann manchmal durch Absorption und Präzipitation ( Symondson & Liddell 1993a ) oder Affinitätsreinigung auf einer Säule ( Schoof et al. 1986), entfernt effektiv alle Antikörper, die an Proteine ​​einer Nicht-Zielspezies binden. Die Züchtung von Antiseren gegen einzelne, gereinigte, beutespezifische Proteine ​​kann die Spezifität eines Antiserums verbessern, kann aber in der Praxis dennoch zu Kreuzreaktivitätsproblemen führen (z. B. Blackwell® et al. 1994). Ein Hauptproblem bei polyklonalen Antiseren ist die fehlende Reproduzierbarkeit: Keine zwei Antiseren haben die gleichen Eigenschaften, selbst wenn sie in demselben einzelnen Säuger gezüchtet werden.


Einführung

Die Familie Culicidae ist aufgrund der großen Zahl von Krankheitserregern, die einige Arten auf Tiere und Menschen übertragen, medizinisch bedeutsam und auch Treiber zahlreicher neu auftretender Infektionskrankheiten weltweit (1, 2). Die Kenntnis der Blutfütterungspräferenzen einer Mückenart bietet wichtige Einblicke in die Dynamik der Virusübertragung und ermöglicht es den Gesundheitsbehörden, effiziente Strategien zur Vektorkontrolle zu entwickeln und umzusetzen (3). Mücken-vektorisierte Krankheitserreger tragen zur größten Vielfalt vernachlässigter Tropenkrankheiten bei, die erhebliche Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier haben (4). Weltweit gibt es 3.574 anerkannte Culicidae-Arten (5), daher ist die korrekte Identifizierung der Arten, die als Vektoren fungieren, entscheidend für die Charakterisierung der Übertragungswege von Krankheitserregern.

Wirtsauswahl- und Fütterungspräferenzstudien von Mücken und anderen hämatophagen Arthropoden in Kombination mit Pathogen-Screening spielen eine wichtige Rolle beim Verständnis der Dynamik von Vektor-–host–pathogen-Interaktionen (6�). Sobald die Nahrungspräferenzen bekannt sind und Wirtsarten identifiziert sind, bei denen ein Risiko für die Übertragung von Krankheitserregern durch Arthropoden besteht, können die Mechanismen der Krankheitsübertragung aufgeklärt werden (17�). Die systematische Charakterisierung der Wirtsgenetik von Vögeln und Säugetieren hat die Spezifität von Studien erhöht. Angetrieben durch den Einsatz molekularer Techniken hat die genetische Analyse serologische Methoden zur Identifizierung von Blutmahlzeiten weitgehend ersetzt (9). Zu diesem Zweck wurden mehrere genetische Marker verwendet, darunter mitochondriale (z. B. cytB, COI) und nukleäre (z. B. ITS2) (20, 21) Marker.

Während die genetische Analyse serologische Methoden weitgehend ersetzt hat, stehen Studien zur Wirtspräferenz vor Herausforderungen. Erstens wird die genaue Identifizierung von Arthropodenvektoren durch die morphologische Ähnlichkeit der Arten, durch abnehmende taxonomische Expertise und durch das Vorhandensein von Artenkomplexen erschwert (22�). Zweitens wird die Fähigkeit, eine Sequenz für den Wirt wiederzugewinnen, durch den Grad der Verdauung der Blutmahlzeit innerhalb der Mücke sowie durch die Konservierungsmethode nach dem Fang beeinflusst (15, 16, 26). Drittens erhöht das potenzielle Vorhandensein von Krankheitserregern in der Blutmahlzeit die Biosicherheitsprobleme. Um die erste Barriere zu überwinden, wird die Analyse der COI-mtDNA-Barcode-Region (27, 28) heute weltweit häufig zur Identifizierung von Mücken verwendet (29�). Um die zweite Herausforderung zu mildern, setzen Forscher nun Hochdurchsatz-Sequenzierung in Kombination mit wirbeltierspezifischen Primer-Cocktails ein (35, 36). Drittens haben die Verwendung von FTA-Karten und deren Analyse in Einrichtungen mit hoher Eindämmung, die unter strengen Biosicherheitsvorschriften betrieben werden, die Bedenken hinsichtlich der Biosicherheit verringert. Zusammengenommen ermöglichen diese Fortschritte den Forschern nun, ihr Verständnis der Wirt-&-Vektor-&-Pathogen-Interaktionen zu erweitern.

In Mexiko wurden 234 Mückenarten registriert (37). Wie einige (Aedes aegypti. Ä. albopictus, Culex quinquefasciatus) wichtige Vektorarten sind, verzeichnet Mexiko eine anhaltende Zirkulation von Arboviren wie Chikungunya (CHIKV), Dengue (DENV), Zika (ZIKV) und West Nile (WNV) (38). Waldlandschaften in Chiapas wie der Lancadon-Dschungel repräsentieren einen Großteil der tropischen Wälder in Mexiko (39). Obwohl es eine der artenreichsten Regionen Mittelamerikas ist, droht die Zerstörung durch menschliche Aktivitäten (40). Über die Vielfalt der Mücken oder Arboviren, die im Lancadon-Dschungel oder in anderen Reservaten Mexikos zirkulieren, liegen mit Ausnahme einer früheren Studie nur wenige Informationen vor (41). Darüber hinaus haben nur wenige epidemiologische Studien die Identifizierung von Blutmehl bei mexikanischen Mücken untersucht. Zum Beispiel untersuchte (42) die Ernährungspräferenz des Wirts von Cx. Quinquefasciatus in Monterrey, während (3), (43) und (44) Städte auf der Halbinsel Yucatán oder (45) innerhalb eines Bergwaldes untersuchten. In dieser Studie wurde ein integrierter Ansatz verwendet, der die Identifizierung von Mücken mithilfe von Morphologie und DNA-Barcoding, die Identifizierung von Blutmahlzeiten mithilfe von Hochdurchsatz-Sequenzierung und das Arbovirus-Screening mithilfe der reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) umfasste, um die Mückenfauna zu charakterisieren und die Host–vector–Pathogen-Interaktionen in Waldgemeinschaften im Bundesstaat Chiapas. Darüber hinaus verwendet diese Studie eine neue Methode zur Identifizierung von Vertebraten-Wirts-DNA aus Restspuren in Arthropoden-RNA-Extrakten.


Welches ist die Richtlinie für die Auswahl eines molekularen Ziels, um Wirbeltierwirte aus Arthropoden-Blutmehl zu identifizieren? - Biologie

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Verwandtschaftserkennungsfähigkeiten, die erstmals vor 25 Jahren bei Krötenkaulquappen demonstriert wurden, scheinen jetzt schwach zu sein. mehr Verwandtschaftserkennungsfähigkeiten, die erstmals vor 25 Jahren bei Krötenkaulquappen nachgewiesen wurden, scheinen heute bei Amphibien weit verbreitet zu sein. Bei einigen Wirbeltieren basiert die Verwandtschaftserkennung zumindest teilweise auf hochpolymorphen Genen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC). Neben dem Schutz der Tiere vor Krankheitsresistenz regulieren MHC-Gene das Sozialverhalten. Sie ermöglichen es Verwandten, sich gegenseitig zu erkennen, damit sie zum gegenseitigen Nutzen zusammenarbeiten können. Diese beiden scheinbar unterschiedlichen Funktionen der MHC-Gene könnten zusammenhängen, denn Tiere müssen sich auszüchten, um das Immunsystem ihrer Nachkommen zu optimieren. Die Fähigkeit, den MHC-Typ zu unterscheiden, erleichtert daher wahrscheinlich die Verwandtschaftsunterscheidung bei Kaulquappen.

Ich testete die Assoziationspräferenzen von Kaulquappen des Afrikanischen Krallenfrosches (Xenopus laevis) in einem Laborauswahlgerät. Wie bei anderen Anuran-Arten fand ich heraus, dass Kaulquappen in früheren Entwicklungsstadien sich bevorzugt mit unbekannten Geschwistern gegenüber unbekannten Nicht-Geschwistern verbünden, sich diese Präferenz jedoch während der Entwicklung umkehrt. Kaulquappen, die sich der Metamorphose nähern, zeigten eine Umkehr ihrer Präferenz, sie schulen bevorzugt mit Nicht-Verwandten und nicht mit Verwandten. Der ontogenetische Wechsel der Larvenschulungspräferenzen fällt mit dem Einsetzen einer durch Schilddrüsenhormone (TH) kontrollierten Entwicklung zusammen und kann ein Hinweis auf eine verminderte Fitness im Zusammenhang mit einer Schulung mit Verwandten in späteren Entwicklungsstadien sein. Diese können aus einer Zunahme der intraspezifischen Konkurrenz, der Prädation oder der Krankheitsanfälligkeit prometamorpher Individuen resultieren. Alternativ könnte das in späteren Larvenstadien beobachtete Verwandtschaftsvermeidungsverhalten ein dissoziatives Verhalten widerspiegeln, das die Vermeidung von Inzucht bei der Reproduktionsreife erleichtert. Dies ist die erste Studie, die während der Entwicklung der Amphibienlarven eine Verschiebung von einer Assoziationspräferenz für Verwandtschaft zu Nicht-Verwandtschaft feststellt.

Mit allelspezifischen PCR-Techniken an Kaulquappen vom MHC-Typ testete ich Assoziationspräferenzen zwischen Geschwistern basierend auf gemeinsamen MHC-Haplotypen. Indem ich nur Vollgeschwister in experimentellen Tests verwendete, kontrollierte ich genetische Variationen an anderen Stellen im Genom, die die Schulpräferenzen beeinflussen könnten. Ich fand heraus, dass Kaulquappen von X. laevis zwischen bekannten Vollgeschwistern aufgrund von Unterschieden bei den MHC-Genen unterscheiden. Probanden aus vier Familien, die bevorzugt mit MHC-identischen Geschwistern unterrichtet wurden, gegenüber denen, mit denen sie keinen oder einen Haplotyp teilten. Darüber hinaus korrelierte die Stärke der MHC-assortativen Schulungspräferenzen der Kaulquappen signifikant mit den Aminosäureunterschieden in der Peptidbindungsregion (PBR) der MHC-Klasse-I- und -II-Loci. Da MHC-PBR-Polymorphismen den Pool von Peptiden bestimmen, die als Liganden für MHC-Moleküle dienen können, unterstützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass MHC-Peptidliganden die Unterscheidung des MHC-Typs vermitteln. Da die Probanden mit allen Reizgruppen gleichermaßen vertraut waren, scheint es sich bei der Kaulquappendiskriminierung um einen selbstreferentiellen genetischen Erkennungsmechanismus zu handeln, bei dem Individuen ihren eigenen MHC-Typ mit denen von Artgenossen vergleichen.

Ich fand auch heraus, dass nicht mit MHC verbundene genetische Unterschiede zu den Präferenzen der Kaulquappen-Assoziation in Tests beitragen, die MHC und Verwandtschaft kontrastieren. Kaulquappen unterschieden nicht zwischen MHC-ähnlichen Nicht-Geschwistern und MHC-unähnlichen Geschwistern und wurden bevorzugt mit MHC-ähnlichen Nicht-Geschwistern und nicht mit MHC-ähnlichen Nicht-Geschwistern assoziiert. Obwohl der MHC möglicherweise nicht allein für die genetisch bedingten Hinweise verantwortlich ist, die die Präferenzen der Kaulquappen-Assoziation lenken, ist er sicherlich wichtig, um die Unterscheidung zwischen Artgenossen bei X. laevis-Kaulquappen zu erleichtern. MHC-basierte Diskriminierung kann durch Ontogenese beibehalten werden und dazu dienen, MHC-Polymorphismen aufrechtzuerhalten, indem sie disassortative Paarung erleichtert.


Ergebnisse

Feldproben.

Unter Verwendung von CDC-Lichtfallen wurden mit Blut gefütterte weibliche Sandfliegen von drei verschiedenen bekannten CL-Foci gesammelt: Ma'ale Adumim (159), Kfar Adumim (70) und Tiberias (32). Die mit Blut gefütterten Moskitos wurden aus Arava (19), Tel-Aviv (18) und Jerusalem (13 Tabelle 1) gesammelt. Insgesamt 261 Sandfliegenweibchen von drei Phlebotom Spezies (P. sergenti, Phlebotomus papatasi (Scopoli) und Phlebotomus syriacus Adler & Theodore) und 50 Mückenweibchen von zwei Culex Spezies (Cx. pipiens und Cx. perexigus) wurden in den Jahren 2006 und 2007 analysiert ( Tabelle 1).

Anzahl der getesteten Sandfliegen und Mücken, aufgelistet nach Art und Standort

Anzahl der getesteten Sandfliegen und Mücken, aufgelistet nach Art und Standort

Blutmehlzustand.

Sandfliegen wurden auf Blutmehlfrische und Größe untersucht (Tabelle 2). Das Screening ergab einen höheren Anteil an großen und mittleren Blutmahlzeiten (67%) als an kleinen (27%) und sehr kleinen Blutmahlzeiten (6%). Die Mehrheit der großen und mittleren Blutmehle hatte eine rote Farbe, während die Mehrheit der kleineren Blutmehle braun war (Tabelle 2). Größe und Farbe des Blutmehls hatten einen kombinierten signifikanten Effekt (F = 3,35 df = 3 P = 0,016) auf die PCR-Erkennbarkeit. Die Nachweisbarkeit wurde durch die Farbe der mittleren und großen Blutmahlzeiten nicht beeinflusst. Die Nachweisbarkeit von kleinen roten Blutmehlen war ähnlich der von größeren Blutmehlen, war jedoch bei kleinen braunen Blutmehlen reduziert. Weitere Abnahmen wurden bei sehr kleinen braunen Blutmehlen festgestellt. Die Bedeutung der einzelnen Effekte war F = 4,8 df = 1 und P = 0,029 für Frische und F = 6,08 df = 3 und P = 0,001 für die Größe. Die Identifizierung von Blutmehlen konnte in 26 Proben wegen fehlgeschlagener PCR-Amplifikation und/oder geringer Sequenzqualität auch nach mehreren Amplifikationsversuchen nicht durchgeführt werden (Abb. 1).

Korrelation zwischen Sandfliegenblutmehlgröße und Frische und erfolgreicher PCR-Analyse

Korrelation zwischen Sandfliegenblutmehlgröße und Frische und erfolgreicher PCR-Analyse

PCR-Amplifikation ausgewählter Proben mit den Primern 12S (A) und 12–16S (B).

PCR-Amplifikation ausgewählter Proben mit den Primern 12S (A) und 12–16S (B).

Host-Identifikation.

Die Validierung der Methode wurde an DNA durchgeführt, die aus Blutproben bekannter Wirbeltierarten (Schnaps, Hund, Katze, Schaf, Rebhuhn und Mensch) extrahiert wurde, sowie an Labormücken, die von Menschen, Wachteln, Mäusen und Hamstern gefüttert wurden. Die Proben wurden unter Verwendung beider Primersets amplifiziert und sequenziert. DNA-Polymorphismus wurde in allen untersuchten Proben für beide Genregionen nachgewiesen (Supp Table 1 [nur online]: A, 12S B, 12–16S). Die Validität wurde an 50 Blutmahlzeiten mit den beiden Primer-Sets weiter getestet. In der Mehrzahl der Proben (37, 74 %) wurde eine Speziesidentifikation basierend auf beiden Primersätzen erhalten. Zehn Blutmahlzeiten (20 %) wurden nur durch das Primerpaar 12S und zwei (4%) nur durch das Primerpaar 12–16S identifiziert. Eine inkonsistente Speziesidentifizierung unter Verwendung von zwei Primersätzen wurde nur für eine Probe beobachtet.

In 285 (92%) aller Proben wurde der Wirt aus Blutmehl erfolgreich identifiziert ( Tabelle 3): bestehend aus Sandfliegen (P. sergenti [221, 94%], P. papatasi [15, 75%] und P. syriacus [5, 71 %]) und Mücken (Cx. perexigus [15, 94 %] und Cx. pipiens [29, 85 %]). Die identifizierten Blutmahlzeiten stammten von 22 heimischen und wilden Wirbeltierarten, darunter 13 Säugetiere und 9 Vögel. Eine Ähnlichkeit mit <2% Sequenzdivergenz wurde für 12 Säugetier- (93 %) und 4 (44 %) Vogelwirte erreicht. Geringere Ähnlichkeiten (90–96 %) qualitativ hochwertiger Sequenzen ermöglichten eine Identifizierung auf Gattungsebene bei Gazelle (Mammalia: Cervidae) und auf Familienebene bei den Phasmidae (Aves: Galliformes). Unter den Phasmidae waren 18 Proben einer Gruppe identisch mit dem lokalen Rebhuhn (Alectoris chukar), üblich in den Studiengebieten. Die anderen 11 Phasmidae-Sequenzen wurden noch nicht auf Artebene identifiziert. Eine weitere Gruppe von 10 ähnlichen Vogelproben mit einer Sequenzabweichung von 6–8% von GenBank-Sequenzen wurde als Tauben identifiziert (Aves: Columbiformes: Columbidae). Eine Vogelsequenz mit einer Ähnlichkeit von <0% zu den nächsten GenBank-Sequenzen wurde der Klasse Aves zugeordnet. Die Speziesidentifikation mittels DNA-Sequenzierung ergab, dass es fast immer einen Wirt pro Blutmahlzeit gab. Nur wenige Chromatogramme wiesen Doppelpeaks auf, die als multipler Wirtsursprung interpretiert wurden. Sequenzen von DNA-Mischungen, die aus zwei bekannten Vertebraten-Spezies hergestellt wurden, ergaben inkonsistente Chromatogramm-Ergebnisse. Daher konnten wir Chromatogrammen mit Doppelpeaks keinen multiplen Blutursprung zuordnen.

Wirts-DNA-Identifizierung in feldgesammelten Sandfliegen und Stechmücken, bestimmt durch 12S–16S-rRNA-Genanalyse

Wirts-DNA-Identifizierung in feldgesammelten Sandfliegen und Stechmücken, bestimmt durch 12S–16S-rRNA-Genanalyse

Einundzwanzig verschiedene Wirtstaxa wurden in den Blutmehlen identifiziert, die aus gewonnen wurden P. sergenti Sandfliegenweibchen, gesammelt in den drei CL-Foci (Tabelle 3). Die Mehrheit (85%) stammte von 13 verschiedenen Säugetierwirten. Drei Arten von bodenbrütenden und bodenbewohnenden Fasanen machten 80 % (27/34) der Blutmahlzeiten von Vögeln aus. Von den 221 identifizierten Blutmahlzeiten wurde bei 42% der Weibchen Klippschliefer-DNA und bei 23% Hauskatzen-DNA gefunden. Der Anteil dieser beiden häufigsten Wirte war in den drei Studienzentren unterschiedlich (Tabelle 4), was die Verfügbarkeit der Wirte widerspiegelt. Hyrax-DNA wurde bei 84% der in Tiberias gesammelten Weibchen, bei 47% der Weibchen aus Kfar Adumim und nur bei 24% der Weibchen aus Ma'ale Adumim gefunden. Etwa ein Drittel (36%) der Weibchen von Ma'ale Adumim enthielt DNA von Hauskatzen, während nur wenige Blutmahlzeiten von Hauskatzen in Sandfliegen gefunden wurden, die in Tiberias und in Kfar Adumim gesammelt wurden. In 15 Blutmahlzeiten aus wurden sechs Wirtsarten identifiziert P. papatasi und fünf Wirtsarten in 5 Blutmahlzeiten aus P. syriacus. Bei beiden Arten wurde das Blut von Klippschliefer, Hauskatze und Haushund gefunden. Gazellen-DNA wurde in sechs identifiziert P. papatasi Frauen (Tabelle 3). Die Mehrheit der identifizierten Cx. pipiens Blutmahlzeiten stammten von Säugetieren (26 von 29, 90 %), während ein hoher Anteil der identifizierten Cx. perexigus Blutmehle stammten von Vögeln (10 von 15, 67% Tabelle 3).

Die Häufigkeit und Häufigkeit (%) der Identifizierung von Wirtsarten in Blutmahlzeiten von P. sergenti an drei verschiedenen Standorten gesammelt

Die Häufigkeit und Häufigkeit (%) der Identifizierung von Wirtsarten in Blutmahlzeiten von P. sergenti an drei verschiedenen Standorten gesammelt

Humane DNA wurde in 13 Blutmahlzeiten identifiziert, die von Cx. pipiens (4 von 29, 11%), P. papatasi (2 von 15, 13 %) und P. sergenti (7 von 221, 3%).

Leishmanien Erkennung.

Alle 261 Sandfliegenproben wurden auf Leishmanien DNA durch PCR unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten Primer-Sets (El Tai et al. 2000). Leishmanien DNA wurde in drei gefunden P. sergenti Sandfliegenweibchen (3 von 27 [11%]) aus Tiberias, die Hyraxblut enthielten, und es wurde bei keinem der Weibchen, die von anderen Wirten gefüttert wurden, oder bei den anderen Sandfliegenarten nachgewiesen ( Abb. 2).

PCR-Amplifikation von Leishmanien DNA von angeschwollen P. sergenti in Tiberias gesammelte Weibchen.

PCR-Amplifikation von Leishmanien DNA von angeschwollen P. sergenti in Tiberias gesammelte Weibchen.


Diskussion

Kriebelmücken standen im Fokus vieler Studien, da sie starke Blutsauger und kompetente Überträger von Krankheitserregern bei Mensch und Tier sind. Bis heute sind sie jedoch nicht an der Infektion und möglichen Übertragung von . beteiligt D. immitis oder D. repens. Wir fanden eine hohe Prävalenz von S. turgaicum (s.l.) in the region, with blood meals primarily from humans and dogs, and with DNA of the microfilariae of both species in the specimens with empty abdomens which are unfed or fully gravid. Detection of filarial DNA in blackflies with empty abdomens indicates considerable age or survival which is epidemiologically thought-provoking indicating that the parasite is still present following the blood-digestion process and may evolve to its infective stage. The second point should be confirmed in future studies by confirming the vitality of the nematodes or the developmental stages of the microfilariae in the epidemiologically important parts of the fly’s body.

Dirofilariasis is largely caused by two parasites, D. (Dirofilaria) immitis (Leidy, 1856) and D. (Nochtiella) repens (Railliet & Henry, 1911) (Spirurida: Onchocercidae), in humans and carnivores, with distinct clinical and epidemiological features. Dirofilaria immitis is responsible for severe cardiopulmonary dirofilariasis, whereas D. repens causes non-pathogenic subcutaneous dirofilariasis in canids and felids. Entsprechend, D. immitis und D. repens are globally regarded as human pulmonary and hypodermic/ophthalmic dirofilariasis, respectively [28, 29]. Herein we detected both nematodes in the study areas however, their clinical manifestations need to be determined in detail in the future.

Successful development of the Dirofilaria species depends on an intermediate mosquito species and a vertebrate as a definitive host [30]. Many species of culicid mosquitoes in the genera Aedes, Anopheles, Armigeres, Coquillettidia, Culex, Culiseta, Mansonia und Psorophora allow the development of both D. immitis und D. repens [31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55] which may transmit carrying worms to available vertebrates. Dirofilaria immitis, can parasitize many canines and felines in tropical, subtropical, and temperate regions worldwide [56]. However, filarial infections of dog, cat, fox, wolf, coyote, and least weasel by D. repens have been documented only in Old World countries [56]. Humans are not appropriate hosts for Dirofilaria spp. however, among mammalian hosts, dogs are the most important reservoir host for human infection of both species of Dirofilaria [57].

Human and animal dirofilariasis has been documented in 11 of the 31 provinces of Iran. In two main foci of the country (southern regions of the Aras River: East Azerbaijan and Ardebil Provinces), the highest frequencies of dirofilariasis caused by D. immitis were 36.8% in dogs, 57.1% in jackals, 50% in foxes, 50% in wolves, and 0.8% in cats, and by D. repens, 60.8% in dogs and 10% in jackals [48, 58]. Fourteen cases of human subcutaneous, ocular, testicular, and pulmonary dirofilariasis have been reported in the country [58]. The infective third-stage larvae of D. immitis und Setaria labiatopapillosa (Alessandrini) (Spirurida: Onchocercidae) were, respectively, reported in Cx. theileri und An. maculipennis [48].

Even if the presence of DNA of these parasites in the blackflies is suggestive, further studies are needed to demonstrate that blackflies are true vectors of D. immitis/D. repens. Simulium turgaicum (s.l.) was the most widespread blackfly in all ecotypes studied of the ten villages of Khoda-Afarin County. Die Dirofilaria spp. infection rate in S. turgaicum (s.l.) (0.625%) was significantly lower compared to those observed in culicid mosquitoes (0.85–10%) [29]. These flies frequently feed on humans and dogs and potentially could pick up Dirofilaria spp. The possibility of blackflies as vectors of the Dirofilaria in this study is reinforced by studies showing that D. ursi Yamaguti, 1941 is transmitted by blackflies to black bears in North America and Japan [59, 60]. Likewise, in support of the vectorial activities of simuliids in Iran, a nodular eye lesion of human onchocerciasis caused by O. lupi and the involvement of blackflies in its transmission has been reported from center of the country [61].

Complex interactions between intrinsic and extrinsic factors influence vector competence. Intrinsic factors, such as genetics and physiology, as well as behavioral traits, may govern an insect’s ability to acquire, support development, and transmit pathogenic agents. Extrinsic factors include the populations of the host reservoir and their activity patterns, climatic conditions, genetic variability in infectivity of pathogens, and even gut microorganisms [62,63,64,65,66,67]. Although blackflies are recognized as one of the most important medical and veterinary groups of arthropods due to their vector competence, there is a little information on their biology and ecology in Iran. This study is the first step for issuing public health policies and blackfly control campaigns in Iran, as well as those interested in studying the factors affecting vector eligibility.

Development of filarial nematodes to the third larval stage in the intermediate insect vector is essential for successful transmission to the definitive host. Microfilaria such as D. ursi develops to the third larval stage in the Malpighian tubules of the corresponding vector [68]. However, vector incrimination of blackflies relies on the presence of L3 worms in the head capsules of the female insects [68]. Future studies should be conducted to locate microfilariae in the Malpighian tubules and head capsules of the females of S. turgaicum (s.l.)

The literature shows that D. immitis und D. repens can infect many species of mammals varying in both quantity and quality [29]. Dissimilarity in susceptibility to parasites is common in multi‐host, multi‐parasite collections, and can have profound significance for ecology and evolution in these systems [69, 70]. This may lead to heterogeneous and asymmetric transmission among and between host species [71,72,73,74]. The results of the present study show that insects other than Culicidae mosquitoes may be involved in establishing a cycle of dirofilariasis in the region. Since both D. immitis und D. repens can infect many species of mammals and can be transmitted by various vector species of mosquitoes and blackflies, they exhibit poor host specificity in terms of definitive and intermediate hosts [75]. These findings challenge our ability to recognize, forecast, and handle dirofilariasis dynamics in the region.

The results of this study revealed that S. turgaicum (s.l.) has diverse host preferences and feeds on humans, dogs, bovids and birds. A majority (69%) of the specimens fed on humans and/or dogs. This may be related to host availability in the region and could have important epidemiological consequences. Dogs are the main reservoir of Dirofilaria spp., and if a blackfly prefers to feed on humans and dogs, then the probability of becoming infected and then transmitting the parasite to a human will be increased. However, to incriminate S. turgaicum (s.l.) as an actual vector of D. immitis und D. repens, more information on the biological and ecological factors that influence the transmission of these parasites in the studied region should be provided. These are included, but not limited to, parous rates, daily and seasonal fluctuations of biting activities (especially of parous females), preference for human body parts, longevity, flight range, and gonotrophic cycle [76].


We appreciate permission from Texas Parks and Wildlife Division and Government Canyon State Natural Area for providing access to the campgrounds and caves to facilitate this study. We would also like to acknowledge the students of VIBS/ENTO 426/626 that participated in field work.

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Keywords: soft ticks, Argasidae, Ornithodoros turicata, blood meal, host identification

Citation: Busselman RE, Olson MF, Martinez V, Davila E, Briggs C, Eldridge DS, Higgins B, Bass B, Cropper TL, Casey TM, Edwards T, Teel PD, Hamer SA and Hamer GL (2021) Host Bloodmeal Identification in Cave-Dwelling Ornithodoros turicata Dugès (Ixodida: Argasidae), Texas, USA. Vorderseite. Vet. Wissenschaft 8:639400. doi: 10.3389/fvets.2021.639400

Received: 08 December 2020 Accepted: 20 January 2021
Published: 15 February 2021.

Markéta Nováková, Masaryk University, Czechia
Deon Bakkes, Agricultural Research Council of South Africa, South Africa

Copyright © 2021 Busselman, Olson, Martinez, Davila, Briggs, Eldridge, Higgins, Bass, Cropper, Casey, Edwards, Teel, Hamer and Hamer. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License (CC BY) verbreitet wird. Die Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung in anderen Foren ist unter Nennung der Urheber und Urheber sowie unter Angabe der Originalpublikation in dieser Zeitschrift im Einklang mit der anerkannten wissenschaftlichen Praxis gestattet. Es ist keine Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung gestattet, die nicht diesen Bedingungen entspricht.


JCP: participated in the conception and design of the study, carried out the sample collection, DNA extraction PCR analysis and drafted the manuscript. LS: participated in the conception and design, helped optimize the extraction and PCR analysis and helped to draft the manuscript. DL: carried out the PCR-based detection assay. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

The authors gratefully acknowledge the financial support from Fulbright Fellowship (JCP), NSF DUE-0436330 (LS), and UVM Honor's College (DL) program. We also thank Lila Specker, Erin Michaud, Bior K. Bior and James Wood for technical assistance.