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1.5: Mikroskopie - Biologie

1.5: Mikroskopie - Biologie


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Lernziele

Ziele:

  • Verwenden und pflegen Sie ein empfindliches wissenschaftliches Instrument sachgemäß.
  • Lernen Sie die Techniken kennen, die erforderlich sind, um Zellen für die Betrachtung mit einem Mikroskop vorzubereiten.
  • Machen Sie sich ein Bild von der Größe der Zellen.

Lernergebnisse der Schüler:

Nach Abschluss dieses Labs sind die Studierenden in der Lage:

  • Identifizieren Sie die Teile eines Mikroskops und ihre Funktionen.
  • Tragen, verwenden und lagern Sie ein Mikroskop ordnungsgemäß.
  • Bereiten Sie einen nassen Passepartout-Objektträger vor.
  • Betrachten und fokussieren Sie Proben unter einem Mikroskop.
  • Bestimmen Sie die Gesamtvergrößerung einer Probe.
  • Suchen Sie eine Probe, wenn Sie einen Objektträger erhalten.

Einführung

In der Biologie ist das zusammengesetzte Lichtmikroskop ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung kleiner Proben, die mit bloßem Auge nicht sichtbar sind. Das Mikroskop beleuchtet die Probe mit hellem Licht und liefert ein invertiertes Bild mit hoher Vergrößerung und Auflösung. Es gibt zwei Linsen, die das Bild der Probe vergrößern – die Objektivlinse am Objektivrevolver und die Augenlinse (oder Okular). Um das festzustellen Gesamtvergrößerung der Probe müssen Sie die Objektivlinsenvergrößerung mit der Okularlinsenvergrößerung multiplizieren.

Wissenschaftler und Techniker verwenden häufig Lichtmikroskope, um Zellen zu untersuchen. Prokaryotische Zellen sind sehr einfach und fehlen a Kern oder membrangebunden Organellen und sind klein. Auf der anderen Seite, eukaryotische Zellen sind insofern komplizierter, als sie einen Kern und viele spezialisierte Organellen enthalten. Die Struktur einer Zelle bestimmt ihre Funktion; daher sieht jede eukaryontische Zelle ganz anders aus als die andere. Deshalb sieht eine Herzzelle ganz anders aus als eine Neuron (Gehirnzelle).

Es ist sehr wichtig zu lernen, wie man ein Mikroskop richtig handhabt und benutzt. Lesen Sie die folgenden Regeln und Tipps für die Verwendung und Handhabung Ihres Mikroskops.

Allgemeine Regeln

  • START und ENDE immer mit dem Low-Power-Objektiv, wenn du ein Dia aufsetzt ODER entfernst.
  • Drehen Sie das Nasenstück niemals am Objektiv.
  • Machen Sie keine Teile des Mikroskops nass – insbesondere nicht den Objekttisch und die Objektivlinsen.
  • Nur benutzen Linsenpapier Mikroskopobjektive zu reinigen.

Reinigung des Mikroskops

Besorgen Sie sich bei Bedarf ein kleines Quadrat Linsenpapier (und NUR Linsenpapier) und wischen Sie die Mikroskoplinsen in dieser Reihenfolge vorsichtig direkt darüber:

  1. die untere Fläche aller Objektivlinsen
  2. die Okularlinse
  3. die Kondensorlinse und das Leuchtengehäuse

Teil I: Den Brief finden

Materialien

  • Mikroskop
  • Linsenpapier
  • Buchstabe „E“ Folie
  • Objektträger-Mikrometerschlitten

Verfahren

  1. Verwenden Sie immer eine Hand um den Mikroskoparm und eine Hand unter dem Mikroskopsockel.
  2. Tragen Sie es in vertikaler Position, ohne das Mikroskop zu schwingen, zu kippen, fallen zu lassen oder zu stoßen.
  3. Legen Sie das Mikroskop vorsichtig mit dem Arm zu sich auf den Labortisch. Stellen Sie das Mikroskop niemals in Randnähe auf und schieben Sie es niemals über den Tisch.

Identifizieren Sie mit einem Partner die folgenden Mikroskopteile. Kreuzen Sie jeden Teil an, während Sie gehen. Wenn Sie sich bei einer Komponente nicht sicher sind, wenden Sie sich an Ihren Lehrer.

  • Okular (Okularlinse)
  • Nasenstückring (Turm)
  • Objektive (niedrige, mittlere, hohe Leistung)
  • Bühne
  • Bühnensteuerung
  • Iris-Membran-Kondensatorlinse
  • Lichtquelle
  • Lichtintensitätsknopf (Rheostat)
  • Grobfokus-Einstellknopf
  • Feinfokus-Einstellknopf
  1. Stecken Sie das Netzkabel vorsichtig ein und positionieren Sie es so, dass es nicht stolpert oder das Mikroskop vom Tisch gezogen wird.
  2. Schalten Sie das Mikroskop ein und drehen Sie das Nasenstückring (Turm) die schnappen 10x Objektiv Linse an Ort und Stelle. Verwenden Sie das Objektiv nicht zum Drehen!
  3. Drehe die Lichtsteuerung (Rheostat) halb, um die Lichtmenge anzupassen.
  4. Die Gesamtvergrößerung, die Sie beim Blick durch ein Mikroskop beobachten, ist die Vergrößerung der Okularlinse multipliziert mit der Vergrößerung der Objektivlinse. Füllen Sie Tabelle 5.1 aus, um die von jedem Objektiv erreichte Gesamtvergrößerung anzugeben.
Tabelle 1. Erzielte Gesamtvergrößerung mit verschiedenen Objektiven eines zusammengesetzten Lichtmikroskops

Objektivname

Objektivlinse

Augenlinse

Gesamtvergrößerung

  1. An der Seite des Mikroskops befinden sich zwei übereinander liegende Knöpfe. Der größere der beiden Knöpfe ist der Grobfokus-Einstellknopf. Drehen Sie den Knopf so, dass die Bühne so weit wie möglich nach unten geht.
  2. Reinigen Sie alle Linsen mit Linsenpapier. Verwenden Sie niemals Papierhandtücher oder Kimwipes oder Hemden!
  3. Besorgen Sie sich eine Folie mit dem Buchstaben „e“ von Ihrem Lehrer. Zeichnen Sie das „e“ in Tabelle 5.2, während Sie es mit Ihren Augen betrachten (nicht durch das Mikroskop).
Tabelle 2. Der Buchstabe „e“ bei verschiedenen Vergrößerungen unter einem Lichtmikroskop

Buchstabe „e“ wie gesehen…

Zeichnung

mit bloßem Auge

100-fache Gesamtvergrößerung

400X Gesamtvergrößerung

1000X Gesamtvergrößerung
1000X Gesamtvergrößerung
In welche Richtung bewegt sich das „e“ (wenn Sie ins Mikroskop schauen), wenn Sie den Tisch nach rechts bewegen?
  1. Legen Sie den Objektträger auf die Bühne und sichern Sie ihn mit dem Bühnenclip.
  2. Verwenden Sie den Grobfokus-Knopf, um den Objekttisch so hoch wie möglich zu bewegen.
  3. Verwenden Stufeneinstellknöpfe das „e“ zu zentrieren, so dass das Licht vom Lichtquelle kann hindurchgehen.
  4. Schauen Sie durch die Okularlinsen und senken Sie den Objekttisch mit dem Grobfokus-Einstellknopf ab, bis das „e“ sichtbar wird.
  5. Verwenden Sie die Feinfokus-Einstellknopf um das Bild so klar wie möglich zu machen.
  6. An dieser Stelle können Sie verschiedene Anpassungen vornehmen, um die Bildqualität zu verbessern:
  7. Die Rheostat an der Seite des Mikroskops steuert die Intensität des Lichts. Wenn es zu hell oder zu dunkel ist, verwenden Sie diesen Knopf, um das Licht einzustellen.
  8. Die Kondensator wird auch die Lichtintensität anpassen. Der Kondensor sammelt und fokussiert das Licht, um die Probe zu beleuchten. Verwenden Sie dies nur, wenn der Rheostat Ihr Image nicht verbessern konnte. Bewegen Sie den Kondensor mit dem Kondensor-Einstellknopf so, dass er den Tisch berührt. Senken Sie ihn langsam ab, um die Beleuchtung Ihrer Probe zu verbessern. Normalerweise sollte es etwa ½ Zoll unter der Bühne sein.
  9. Die Irisblende stellt die Öffnung der Öffnung ein und steuert die Lichtmenge, die aus dem Kondensor austritt (oder die Probe beleuchtet). Sie können diese Blende öffnen und schließen, für die meisten Zwecke sollte sie vollständig geöffnet sein, aber manchmal erhöht das teilweise Schließen den Kontrast im Bild.
  10. Zeichnen Sie den Buchstaben „e“, wie er durch das Mikroskop in Tabelle 4-2 erscheint. Beachten Sie die Orientierungsänderung. Beachten Sie, dass das LINKE Okular gedreht werden kann, die Okularskala (bekannt als Absehen) jedoch in der Mitte der Okularlinse bleibt. Beachten Sie, dass das RECHTE Okular gedreht werden kann, um die Position des Zeigers zu verschieben.
  11. Bewegen Sie die Bühne langsam nach rechts. Beachten Sie, in welche Richtung sich das „e“ bewegt, wenn Sie durch das Mikroskop schauen, und notieren Sie es in Tabelle 4-2.
  12. Bewegen Sie den Schieber wieder nach links, um das „e“ neu zu zentrieren.
  13. Sobald das „e“ wieder zentriert und fokussiert ist, drehen Sie den Objektivrevolver auf das 40x-Objektiv und lassen Sie ihn einrasten. Verwenden Sie den Feinfokus, um das Bild klar zu machen. Nehmen Sie nur bei Bedarf Lichteinstellungen mit dem Rheostat, Kondensor oder der Blende vor. Zeichnen Sie alles, was Sie durch das Mikroskop sehen, in Tabelle 4-2 ein.
  14. Sobald das „e“ wieder zentriert und fokussiert ist, drehen Sie den Objektivrevolver auf das 40x-Objektiv und lassen Sie es einrasten. Verwenden Sie den Feinfokus, um das Bild klar zu machen (NOCH NIE Verwenden Sie bei dieser oder einer höheren Vergrößerung den Grobfokus, sonst riskieren Sie ein Einschnappen des Dias oder schlimmer noch das Einschnappen des Objektivs!!!) Nehmen Sie nur bei Bedarf Lichteinstellungen mit dem Rheostat, Kondensor oder der Blende vor. Zeichnen Sie alles, was Sie im Mikroskop sehen, in Tabelle 4-2 ein. Beantworten sie die folgenden Fragen.
  15. Um das Ölimmersionsobjektiv zu verwenden, drehen Sie den Objektivrevolver ZWISCHEN dem 40-fachen und dem 100-fachen Objektiv, damit der mit dem Öl gefüllte Stab den Objektträger erreichen kann. Geben Sie einen großzügigen Tropfen Öl auf den Objektträger und lassen Sie das 100x-Objektiv einrasten. Die Linse gleitet in den Öltropfen.
  16. Verwenden Sie den Feinfokus, um das Bild klar zu machen. Zeichnen Sie, was Sie in Tabelle 4-2 sehen.
  17. Kehren Sie NIEMALS zum 40X-Objektiv zurück, nachdem sich Öl auf dem Objektträger befindet. Wenn Sie Probleme beim Fokussieren mit dem Ölimmersionsobjektiv haben, müssen Sie zurückgehen und das 10x-Objektiv zum erneuten Zentrieren verwenden (den Objektivrevolver so drehen, dass das 40x-Objektiv NICHT durch das Öl auf dem Objektträger gezogen wird). Gehen Sie dann direkt zurück zum 100x-Objektiv. Wenn dies nicht funktioniert, muss die Folie sauber gewischt werden und Sie sollten von vorne beginnen.

Wenn Sie mit der Rutsche fertig sind, senken Sie die Bühne ab und entfernen Sie die Rutsche. (Senken Sie die Bühne nicht ab, wenn Sie eine andere Folie anzeigen möchten). Reinigen Sie das Öl von der Rutsche und geben Sie es Ihrem Lehrer zurück.

Teil II: Felddurchmesser

Mikroskope sind für die Vergrößerung von Bildern zu klein, um mit bloßem Auge gesehen zu werden. Sie können jedoch als Werkzeug verwendet werden, um die Größe des betrachteten Objekts abzuschätzen. Dazu müssen Sie den Durchmesser jedes Sehfeldes mit jedem Objektiv kennen. Sie können dann abschätzen, wie viel des Feldes Ihr Objekt im Feld einnimmt und dies mit dem gemessenen Durchmesser vergleichen. Nehmen wir zum Beispiel an, der Felddurchmesser mit dem 40-fach-Objektiv beträgt 0,10 mm. Sie betrachten dann ein Objekt mit dieser Linse, die ¼ des Sichtfelds einnimmt. Sie können dann schätzen, dass das Objekt ¼ (0,10 mm) lang oder 0,025 mm ist. Um den Felddurchmesser zu bestimmen, verwenden Sie einen Objektträger-Mikrometer-Objektträger, bei dem es sich im Grunde um ein sehr feines Lineal (normalerweise 2 mm) handelt, das auf einen Objektträger geätzt wird.

Verfahren

  1. Besorgen Sie sich einen Objektträger mit Mikrometer. SEI SEHR VORSICHTIG. Ein Objektträger-Mikrometer-Schlitten ist kostspielig, also behandeln Sie ihn bitte mit Respekt! Legen Sie den Objekttisch-Mikrometer-Objektträger auf den Objekttisch und fokussieren Sie mit dem 10-fach-Objektiv auf die Millimetermarkierungen. Tragen Sie den Felddurchmesser in mm ein, wenn Sie dieses Objektiv in Tabelle 3 verwenden.
  2. Wechseln Sie zum 40x-Objektiv und fokussieren Sie. Felddurchmesser in mm mit dem Mikrometer bestimmen und in Tabelle 3 eintragen. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für die anderen Objektive.
  3. Konvertieren Sie die Durchmesser in Mikrometer (μM). Alle Zell- und Organellenmessungen werden in µM durchgeführt. Reinigen Sie den Objektträger sorgfältig und legen Sie ihn zurück in seine Ablage auf dem Demotisch.
Tabelle 3. Bestimmung des Sichtfelds mit einem Tischmikrometer

Verwendetes Objektiv

Gesamtvergrößerung

Felddurchmesser (mm)

Felddurchmesser in (µm)

Teil III: Nasse Reittiere herstellen

Materialien

  • Objektträger (im Alkoholglas)
  • Deckglas (im Alkoholglas)
  • Papiertücher
  • Tablett oder Becher zum Waschen von Objektträgern
  • Zange
  • Transferpipetten
  • Messer und SchneidebrettZahnstocher
  • Zwiebel
  • Jod (Tropfflasche)
  • Methylenblau (Tropfflasche)
  • Elodea-Blatt (im Becher mit Wasser)
  • Teichwasser (im Becher)
  • 20% Salzwasser (Tropfflasche)
  • Entionisiertes Wasser (Tropfflasche)

Vorbereitete Folien:

  • Paramezium
  • Spirogyra
  • Menschlicher Blutausstrich
  • Menschliches Sichelzellenblut
  • Amphibienblutausstrich

Verfahren

Menschliche Wangenzellen

Die menschliche Wange ist gefüttert mit Epithelzellen. Sie werden heute verwendet, um eine eukaryontische Tierzelle und ihren Zellkern zu beobachten. Sie werden eine Probe Ihrer Wangenzellen abkratzen und mit dem Farbstoff Methylenblau färben. Der Farbstoff ermöglicht es Ihnen, die Kerne der Zellen deutlich zu färben. Seien Sie vorsichtig mit den Farbstoffen, die für die nassen Halterungen verwendet werden, da sie Ihre Haut und Kleidung verfärben. Außerdem werden die Objektträger und Deckgläser, die Sie verwenden, in Alkohol aufbewahrt. Stellen Sie sicher, dass Sie die Objektträger und Deckgläser mit Papiertüchern (nicht mit dem teuren Linsenpapier) abtrocknen, bevor Sie Ihre Nassfassungsdias vorbereiten.

  1. Besorgen Sie sich einen trockenen Objektträger und ein Deckglas.
  2. Geben Sie einen Tropfen Methylenblau auf den Objektträger.
  3. Kratzen Sie die Innenseite Ihrer Wange vorsichtig mit einem Zahnstocher ab und schwenken Sie sie in der Farbe auf dem Objektträger.
  4. Legen Sie ein Deckglas auf die Aufhängung und betrachten Sie es mit 1000-facher Gesamtvergrößerung
  5. Zeichnen Sie 1-3 Zellen, die groß genug sind, um die Details anzuzeigen, die Sie in Ihrem Laborhandbuch sehen. Beschriften Zellmembran, Zytoplasma und Kern. Geben Sie unbedingt die verwendete Vergrößerung und den Probennamen an. Geben Sie unter Ihrer Zeichnung auch die geschätzte Zellgröße in Mikrometern an. Siehe das Beispiel (dem die Beschriftungen fehlen).

Elodea Leaf Nasshalterung

Die Zellmembran ist auf dem . nicht sichtbar Elodea Blatt wegen seiner Nähe zur viel dickeren Zellwand. Um die Membran zu sehen, fügen Sie Salz hinzu Elodea. Durch Osmose fließt Wasser aus den Elodea-Zellen und schrumpft die Zellmembran von der steifen Zellwand (Plasmolyse).

  1. Holen Sie sich einen Objektträger. Geben Sie links 2 Tropfen dI-Wasser und rechts 2 Tropfen 20% Salz.
  2. Nimm ein Blatt von einem Stiel von Elodea und schneide das Blatt in zwei Hälften. In jede Lösung ein halbes Blatt legen.
  3. Warten Sie 3-5 Minuten und legen Sie dann ein Deckglas über jedes Blatt (überschüssiges Wasser abtupfen).
  4. Ansicht mit einer Gesamtvergrößerung von 400X.
  5. Suchen Sie nach Zellen, die einer Plasmolyse unterzogen wurden. Wenn keine gefunden werden, bereiten Sie die Folie erneut vor.
  6. Zeichnen Sie 2-3 verbundene Zellen, die groß genug sind, um die Details anzuzeigen, die Sie sehen. Beschriften Sie die Zellwand, Zellmembran, Zytoplasma und Chloroplasten in Ihrem Laborhandbuch. Geben Sie unbedingt die verwendete Vergrößerung und den Probennamen an. Geben Sie unter Ihrer Zeichnung auch die geschätzte Zellgröße in Mikrometern an.

Zwiebelmembran-Nassmontage

Zwiebelknollen sind eigentlich geschwollene Blätter, die eine unterirdische Struktur bilden. Obwohl sie keine gute Quelle zum Betrachten von Chloroplasten sind, sind sie eine ausgezeichnete Quelle zum Betrachten von eukaryotischen Pflanzenkernen.

  1. Besorgen Sie sich einen trockenen Objektträger und ein Deckglas.
  2. Schneiden Sie ein kleines Quadrat von einer Schicht der Zwiebel. Ziehen Sie mit einer Pinzette die dünne, weiße, transparente Membran von der inneren konkaven Seite eines Zwiebelstücks ab (Sie benötigen nur ein kleines Stück, etwa so groß wie ein Radiergummi) und legen Sie es auf den Objektträger. Versuchen Sie, die transparente Zwiebelmembran so flach wie möglich zu glätten.
  3. Geben Sie einen Tropfen Jod auf die Membran und warten Sie 30 Sekunden. Bedecken Sie die Membran mit einem Deckglas. Legen Sie den Objektträger in ein gefaltetes Papiertuch und klopfen Sie ihn 1 Sekunde lang sanft ab, um überschüssige Farbe zu entfernen.
  4. Betrachten Sie entweder eine 100-fache oder 400-fache Gesamtvergrößerung, sodass Sie 2-3 Zellen sehen können.
  5. Zeichnen Sie 2-3 verbundene Zellen, die groß genug sind, um die Details anzuzeigen, die Sie sehen. Beschriften Sie die Zellwand, Zellkern und Zytoplasma. Geben Sie unter Ihrer Zeichnung auch die geschätzte Zellgröße in Mikrometern an.

Teichwasser Wet Mount

Sie bereiten eine nasse Halterung von einem der folgenden Protisten vor, die im Teichwasser zu finden sind: Euglena, Spirogyra, Paramecium, und/oder Amöbe.

  1. Holen Sie sich eine Depressionsfolie und trocknen Sie sie ab. Die Muldenrutsche hat eine geschwungene Vertiefung in der Mitte der Rutsche, die es den Lebewesen ermöglicht, sich zu bewegen und nicht gequetscht zu werden.
  2. Geben Sie einen Tropfen Methylcellulose und einen Tropfen aus dem Teichwasser oder den Kulturen.
  3. Vorsichtig ein Deckglas auflegen. Wenn Sie zu viel Flüssigkeit auf dem Objektträger haben, nehmen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einer Ecke eines Papiertuchs auf.
  4. Ansicht mit 100- oder 400-facher Gesamtvergrößerung.
  1. Zeichne die Organismen, die du siehst. Geben Sie unter Ihrer Zeichnung auch die geschätzte Zellgröße in Mikrometern an.

Vorbereitete Folien

Sie sehen sich verschiedene vorbereitete Folien an, einschließlich Paramecium, Spirogyra, menschliche Blutausstriche, menschliche Sichelzellenrotblutausstriche, Froschblutausstriche und möglicherweise andere. Betrachten Sie unter dem Mikroskop mit der höchsten Vergrößerung für die besten zellulären Details und zeichnen Sie, was Sie sehen. Geben Sie auch die geschätzte Zellgröße in Mikrometern unter Ihrer Zeichnung an.

Teil IV: Labor-Check-out

Haken Sie jede Aufgabe ab, wenn Sie sie abgeschlossen haben. Der Ausbilder muss vor der Aufbewahrung Ihres Mikroskops unterschreiben.

Zurückkehrendes Verbundmikroskop

  • Objektiv mit geringer Leistung in Position drehen
  • Verwenden Sie den Grobfokus, um den Objektivrevolver nach oben zu heben
  • Folie aus Bühne entfernen
  • Achten Sie darauf, dass die Leiste von Bühnenclips nicht herausragt
  • Drehen Sie den Rheostat auf die niedrigste Stufe, bevor Sie das Licht ausschalten
  • Ziehen Sie das Netzkabel gemäß den Anweisungen des Lehrers ab und wickeln Sie es ein
  • Mikroskop richtig zum Schrank tragen und in das richtige Regal zurückgeben

Reinigung nasser Halterungen

  • Objektträger in einem Becher mit Wasser ausspülen, Deckglas entfernen und zurückgeben und in die richtigen Gläser gleiten lassen
  • Legen Sie die vorbereiteten Objektträger wieder auf das richtige Tablett auf dem Demotisch
  • Ziehen Sie alle Reagenzflaschenverschlüsse fest.
  • Räumen Sie den Demo-Tisch auf
  • Alle Tische mit nassem Schwamm abwischen

Unterschrift des Lehrers

Studienfragen

  1. Beschriften Sie auf der nächsten Seite die Teile des Mikroskops und listen Sie ihre Funktion auf.
  2. Wie wird ein Mikroskop richtig getragen?
  3. Wie wird das Mikroskop richtig verstaut?
  4. Wie groß ist die Vergrößerungsleistung von:
    • Hochleistungsobjektiv?
    • Objektiv mit mittlerer Stärke?
    • Objektiv mit geringer Leistung?
    • Augenlinse?
  5. Wie wird die Gesamtvergrößerung einer Probe bestimmt?
  6. Wie ändert sich die Größe des Sichtfelds, wenn die Vergrößerung zunimmt?
  7. Warum ist es wichtig, das Medium auf einen Objektträger zu legen, bevor die zu montierende Probe ausgewählt wird?
  8. Nennen Sie eine Möglichkeit, um sicherzustellen, dass die Probe im Sichtfeld gefunden wird, wenn Sie die Vergrößerung ändern.
  9. Was sind die Unterscheidungsmerkmale einer Pflanzenzelle gegenüber einer tierischen Zelle?
  10. Wenn Sie die Größe des Sichtfelds mit einer der drei Vergrößerungslinsen kennen, können Sie die Größe einer beobachteten Probe bestimmen.

1.5: Mikroskopie - Biologie

Die Mikromanipulation von Mikropipetten zur Kraftmessung ist neu Technik

  • Der letzte Versuchsaufbau zur Mikromanipulation von Mikropipetten zur Kraftmessung wurde 1998 von Prof. Mike Poirier entwickelt und gebaut, um die Kraftantwort von mitotischen Chromosomen aus lebenden Newt-Zellen zu isolieren und zu messen.
  • Als Postdoc habe ich diese Technik angepasst, um einen einzelnen Kern aus einer lebenden Zelle zu isolieren und die Kraftantwort über die Ausdehnung des gesamten Kerns bei physiologischen Geschwindigkeiten zu messen.
  • Ich freue mich, Ihnen unser "Proof of Concept" Mikromanipulationsmikroskop 1.5 präsentieren zu können. Mit der Hilfe und dem Engagement von Vis, einem Studenten im Grundstudium, haben wir das erste Mikromanipulations-Kraftmessmikroskop seit zwei Jahrzehnten (1998 bis 2018) gebaut. Dieses Instrument wurde aus einem alten IX-81 Sockel zu einer voll funktionsfähigen Einheit gebaut. Wir werden bei UMass Amherst ein Mikromanipulationsmikroskop der Version 2.0 mit erweiterten Mikroskopabbildungsfunktionen bauen, die über die aktuellen Builds hinausgehen und mit Phasenabbildung und Weitfeldfluoreszenz ausgestattet sind. Bei Interesse beachten Sie bitte unsere kommenden Links zu MM 2.0 und People (WIR REKRUTIEREN!)
  • Danksagung: Wir danken dem NIH NRSA Postdoctoral Fellowship und dem NIH K99 Pathway to Independence Award für die Finanzierung des Baus dieses Mikroskops. Mein Mentor Prof. Marko war eine unschätzbare Ressource und stellte viele teure Ersatzteile zur Verfügung, die für den Bau dieses Instruments erforderlich waren. Vielen Dank an Vis für das Software-Upgrade, die Codierung, die Integration von Hard- und Software und das allgemeine Engineering, das für die Funktionalität dieses Instruments unerlässlich war.

Unten sind Bilder des Instrumentenbaus und Videos davon, die die volle Funktionalität zeigen

Vorkalibrierung der Mikropipettenkraft - Eine Mikropipette mit bekannter Biegesteifigkeit (unten) wird gegen eine Mikropipette mit unbekannter Biegesteifigkeit geschoben, um die Biegesteifigkeit zu bestimmen. Die Größe der Mikropipettenöffnung und die Kraft werden in einem engen Fenster gehalten und korrelieren, die Öffnung ist

3 um und 2 nN/um Biegekonstante.

(Wir entschuldigen uns, dass dieses Video bei der Übertragung der Website verloren gegangen ist. Wir werden es in Kürze bereitstellen. Weitere Videos finden Sie unten.)

Einzelkernisolierung aus einer lebenden Zelle in Minuten - Die obere Mikropipette sprüht verdünntes Detergens auf eine MEF V-/- lebende Zelle in Kultur, um die Zelle zu öffnen. Die andere Mikropipette greift den Zellkern und trennt ihn von der Zelle. Dieser Prozess ist schnell (1–2 Minuten) und setzt den Kern keinem scharfen, ständigen Reinigungsmittel und mechanischem Missbrauch aus, der normalerweise während der Isolierung des Kerns auftritt.

Mikromanipulationskraftdehnungsmessung eines einzelnen isolierten Kerns - Die "Pull"-Mikropipette (rechts) dehnt den Zellkern aus, während die "force"-Mikropipette die Kraft über die Auslenkung multipliziert mit der zuvor gemessenen Biegekonstante misst.


bietet Zugang zu fortschrittlichen Licht- und Elektronenmikroskopen sowie dem Fachwissen engagierter Imaging-Wissenschaftler. Wir bieten kundenspezifische Bildanalysen, umfassende Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie sowie Clearing und Erweiterung für die Lichtmikroskopie.

Bitte nutzen Sie auch unsere bildgebenden Lernressourcen.

„Für beste Ergebnisse lassen Sie sich von uns bei jedem Schritt des Bildgebungsprozesses unterstützen, von der Probenvorbereitung bis zur quantitativen Bildanalyse.“

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Die Epigenetik-Expertin Dana C. Dolinoy von der University of Michigan School of Public Health und Fakultätsdirektorin des BRCF Epigenomics Core beleuchtet, wie unser aufkommendes Verständnis des Epigenoms zu Durchbrüchen beim Verständnis der Ursachen – und möglichen Behandlung – einiger … . führt

Die Führung von Michigan Medicine gab kürzlich die Erklärung heraus, dass „wir Rassismus eindeutig als ein Problem der öffentlichen Gesundheit anerkennen und gemeinsam gegen Voreingenommenheit und Ungleichheit eintreten“. Hier im Office of Research der Medical School unterstützen wir diese Botschaft und die … . von ganzem Herzen


Inhalt

Immunhistochemie Bearbeiten

Immunhistochemie oder IHC-Färbung von Gewebeschnitten (oder Immunzytochemie, die Färbung von Zellen) ist vielleicht die am häufigsten angewandte Immunfärbungstechnik. [2] Während in den ersten Fällen der IHC-Färbung Fluoreszenzfarbstoffe verwendet wurden (siehe Immunfluoreszenz), andere nicht fluoreszierende Methoden mit Enzymen wie Peroxidase (siehe Immunperoxidase-Färbung) und alkalische Phosphatase verwendet. Diese Enzyme sind in der Lage, Reaktionen zu katalysieren, die ein farbiges Produkt ergeben, das durch Lichtmikroskopie leicht nachweisbar ist. Alternativ können radioaktive Elemente als Marker verwendet werden und die Immunreaktion kann durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden. [3]

Gewebepräparation oder Fixierung ist essentiell für die Erhaltung der Zellmorphologie und der Gewebearchitektur. Eine unangemessene oder verlängerte Fixierung kann die Antikörperbindungsfähigkeit erheblich verringern. Viele Antigene können in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten erfolgreich nachgewiesen werden. Einige Antigene überleben jedoch selbst mäßige Mengen an Aldehydfixierung nicht. Unter diesen Bedingungen sollten Gewebe in flüssigem Stickstoff schnell frisch eingefroren und mit einem Kryostaten geschnitten werden. Die Nachteile von Gefrierschnitten umfassen eine schlechte Morphologie, eine schlechte Auflösung bei höheren Vergrößerungen, Schwierigkeiten beim Überschneiden von Paraffinschnitten und die Notwendigkeit einer Gefrierlagerung. Alternativ erfordern Vibratomschnitte keine Verarbeitung des Gewebes durch organische Lösungsmittel oder hohe Hitze, die die Antigenität zerstören oder durch Gefrieren auftauen zerstört werden können. Der Nachteil von Vibratomschnitten besteht darin, dass der Schnittprozess bei weichem und schlecht fixiertem Gewebe langsam und schwierig ist und dass in den Schnitten oft Rattermarken oder Vibratomlinien sichtbar sind.

Der Nachweis vieler Antigene kann dramatisch verbessert werden durch Antigengewinnung Methoden, die wirken, indem sie einige der durch die Fixierung gebildeten Proteinquervernetzungen aufbrechen, um versteckte antigene Stellen aufzudecken. Dies kann durch unterschiedlich langes Erhitzen (wärmeinduzierte Epitop-Wiedergewinnung oder HIER) oder durch Verwendung von Enzymverdau (proteolytisch induzierte Epitop-Wiedergewinnung oder PIER) erreicht werden. [4]

Eine der Hauptschwierigkeiten bei der IHC-Färbung besteht darin, einen spezifischen oder unspezifischen Hintergrund zu überwinden. Die Optimierung der Fixierungsmethoden und -zeiten, die Vorbehandlung mit Blockierungsmitteln, die Inkubation von Antikörpern mit hohem Salzgehalt und die Optimierung von Waschpuffern und Waschzeiten nach der Antikörperbehandlung sind alle wichtig, um eine qualitativ hochwertige Immunfärbung zu erhalten. Darüber hinaus ist das Vorhandensein von positiven und negativen Kontrollen für die Färbung für die Bestimmung der Spezifität unerlässlich.

Durchflusszytometrie Bearbeiten

Ein Durchflusszytometer kann für die direkte Analyse von Zellen verwendet werden, die ein oder mehrere spezifische Proteine ​​exprimieren. Zellen werden in Lösung unter Verwendung von Verfahren ähnlich denen, die für die Immunfluoreszenz verwendet werden, immungefärbt und dann durch Durchflusszytometrie analysiert.

Die Durchflusszytometrie hat gegenüber der IHC mehrere Vorteile, darunter: die Fähigkeit, unterschiedliche Zellpopulationen anhand ihrer Größe und Granularität zu definieren, die Fähigkeit, tote Zellen auszuschließen, verbesserte Empfindlichkeit und Mehrfarbenanalyse, um mehrere Antigene gleichzeitig zu messen. Die Durchflusszytometrie kann jedoch beim Nachweis extrem seltener Zellpopulationen weniger effektiv sein, und es gibt einen Verlust von Architekturbeziehungen, wenn kein Gewebeschnitt vorhanden ist. [5] Die Durchflusszytometrie ist auch mit hohen Kapitalkosten verbunden, die mit dem Kauf eines Durchflusszytometers verbunden sind.

Western Blotting Bearbeiten

Western Blotting ermöglicht den Nachweis spezifischer Proteine ​​aus Extrakten aus Zellen oder Geweben vor oder nach Reinigungsschritten. Proteine ​​werden im Allgemeinen unter Verwendung von Gelelektrophorese nach Größe getrennt, bevor sie mittels Trocken-, Halbtrocken- oder Nass-Blotting-Verfahren auf eine synthetische Membran übertragen werden. Die Membran kann dann unter Verwendung von Antikörpern unter Verwendung von Methoden ähnlich der Immunhistochemie sondiert werden, jedoch ohne dass eine Fixierung erforderlich ist. Der Nachweis wird typischerweise unter Verwendung von Peroxidase-gebundenen Antikörpern durchgeführt, um eine Chemilumineszenz-Reaktion zu katalysieren.

Western Blotting ist eine molekularbiologische Routinemethode, die verwendet werden kann, um den Proteingehalt zwischen Extrakten halbquantitativ zu vergleichen. Die Größentrennung vor dem Blotting ermöglicht die Messung des Proteinmolekulargewichts im Vergleich zu bekannten Molekulargewichtsmarkern.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay Bearbeiten

Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay oder ELISA ist ein diagnostisches Verfahren zur quantitativen oder semiquantitativen Bestimmung von Proteinkonzentrationen aus Blutplasma, Serum oder Zell-/Gewebeextrakten im Multi-Well-Plattenformat (normalerweise 96 Wells pro Platte). Im Allgemeinen werden Proteine ​​in Lösung an ELISA-Platten adsorbiert. Antikörper, die für das interessierende Protein spezifisch sind, werden verwendet, um die Platte zu sondieren. Der Hintergrund wird durch optimierte Blockierungs- und Waschmethoden (wie bei IHC) minimiert und die Spezifität wird durch das Vorhandensein von Positiv- und Negativkontrollen sichergestellt. Nachweisverfahren basieren in der Regel auf kolorimetrischen oder chemilumineszenten Verfahren.

Immunelektronenmikroskopie Bearbeiten

Elektronenmikroskopie oder EM kann verwendet werden, um die detaillierte Mikroarchitektur von Geweben oder Zellen zu untersuchen. Immuno-EM ermöglicht den Nachweis spezifischer Proteine ​​in ultradünnen Gewebeschnitten. Mit Schwermetallpartikeln (z. B. Gold) markierte Antikörper können direkt mittels Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Immun-EM ist zwar leistungsstark beim Nachweis der subzellulären Lokalisation eines Proteins, kann jedoch technisch anspruchsvoll und teuer sein und eine rigorose Optimierung der Gewebefixierung und Verarbeitungsmethoden erfordern. Proteinbiotinylierung in vivo wurde vorgeschlagen, um die Probleme zu lindern, die durch die häufige Inkompatibilität der Antikörperfärbung mit Fixierungsprotokollen verursacht werden, die die Zellmorphologie besser erhalten. [6]

Bei Immunfärbungsverfahren wird ein Antikörper verwendet, um ein spezifisches Proteinepitop nachzuweisen. Diese Antikörper können sein monoklonal oder polyklonal. Erkennung dieses ersten oder primärer Antikörper kann auf mehrere Arten bewerkstelligt werden.

  • Der primäre Antikörper kann unter Verwendung eines Enzyms oder Fluorophors direkt markiert werden.
  • Der primäre Antikörper kann unter Verwendung eines kleinen Moleküls markiert werden, das mit einem hochaffinen Bindungspartner interagiert, der mit einem Enzym oder Fluorophor verknüpft werden kann. Das Biotin-Streptavidin ist eine häufig verwendete Wechselwirkung mit hoher Affinität.
  • Der primäre Antikörper kann für die Verwendung eines breiteren speziesspezifischen . sondiert werden sekundärer Antikörper die mit einem Enzym oder Fluorophor markiert ist.
  • Bei der Elektronenmikroskopie werden Antikörper mit einem Schwermetallpartikel (typischerweise Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 5-15 nm) verknüpft.

Wie zuvor beschrieben, werden üblicherweise Enzyme wie Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase verwendet, um Reaktionen zu katalysieren, die ein gefärbtes oder chemilumineszierendes Produkt ergeben. Fluoreszierende Moleküle können visualisiert werden mit Fluoreszenzmikroskopie oder konfokale Mikroskopie.

Die Anwendungen der Immunfärbung sind zahlreich, werden jedoch am häufigsten in klinische Diagnostik und Laborforschung.

Klinisch wird IHC in der Histopathologie zur Diagnose bestimmter Krebsarten anhand molekularer Marker eingesetzt.

In der Laborwissenschaft kann die Immunfärbung für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, basierend auf der Untersuchung des Vorhandenseins oder Fehlens eines Proteins, seiner Gewebeverteilung, seiner subzellulären Lokalisation und von Veränderungen der Proteinexpression oder des Proteinabbaus.


Kapitel 1.4-1.5 Quiz Biologie I Herr Cardona ID:A

3. Welche der folgenden Methoden verwenden häufig komplexe Studien, beispielsweise zur Untersuchung der Krankheitsübertragung beim Menschen?

A. Computermodellierung
B. mehrere Jungenexperimente
C. Tests am Menschen
D. Magnetresonanztomographie

4. Welcher Satz definiert ein Gen am besten?

A. Grundeinheit des Lebens
B. Schnitt einer Probe
C. vererbte Eigenschaft
D. DNA-Segment

A. tote oder lebendige Proben verwenden
B. Elektronen verwenden
C. 3D-Bilder erstellen
D. nur tote Exemplare verwenden

6. Biologiekenntnisse können Fortschritte fördern, indem sie allen Menschen helfen,

A. individuelle Werte
B. informierte Entscheidungen
C. profitable Produkte
D. starke Meinungen

7. Die Nutzung und Anwendung von Lebewesen und biologischen Prozessen ist bekannt als

A. Epidemiologie
B. Biotechnologie
C. Humanbiologie
D. medizinische Forschung

8. Welcher der folgenden ist ein Beispiel für transgene Organismen?

A. Bakterien, die Humaninsulin produzieren
B. Hefe zur Herstellung von Brot
C. käseproduzierende Mikroorganismen
D. Algen, die Wasserstoffgas produzieren

9. Die Biotechnologie wirft ethische Fragen auf, vor allem in Bezug auf die

A. Beste Verwendung der Mittel für die biologische Forschung
B. Art und Weise, wie Wissen genutzt werden sollte
C. Weisheit, Technologie weiter zu verwenden
D. Sicherheit beim Verzehr von einheimischen Pflanzen

10. Welche Aussage zu den unbeantworteten Fragen der Biologie ist richtig?

A. Es ist unwahrscheinlich, dass sich etwas ändert
B. in der Vergangenheit nur wenige existierten
C. sind selten technologieabhängig
D. viele bleiben ungefragt

11. Welcher Mikroskoptyp ist in der folgenden Abbildung dargestellt?

12. Beschriften Sie jede Komponente des Mikroskops, die in der Abbildung unten gezeigt wird.

Grenzen durchbrechen

Kryo-EM ist eine jahrzehntealte Technik, die die Form blitzgefrorener Proben bestimmt, indem sie Elektronen darauf abfeuert und die resultierenden Bilder aufzeichnet. Fortschritte in der Technologie zum Nachweis der abprallenden Elektronen und in der Bildanalysesoftware katalysierten eine „Auflösungsrevolution“, die um 2013 begann. Dies führte zu Proteinstrukturen, die schärfer denn je waren – und fast so gut wie die aus der Röntgenkristallographie gewonnenen. eine ältere Technik, die Strukturen aus Beugungsmustern von Proteinkristallen herleitet, wenn sie mit Röntgenstrahlen beschossen werden.

Nachfolgende Hardware- und Softwarefortschritte führten zu weiteren Verbesserungen in der Auflösung von Kryo-EM-Strukturen. Wissenschaftler mussten sich jedoch weitgehend auf die Röntgenkristallographie verlassen, um Strukturen mit atomarer Auflösung zu erhalten. Forscher können jedoch Monate bis Jahre damit verbringen, ein Protein zur Kristallisation zu bringen, und viele medizinisch wichtige Proteine ​​​​bilden keine brauchbaren Kristalle Kryo-EM erfordert dagegen nur, dass das Protein in einer gereinigten Lösung vorliegt.

Karten mit atomarer Auflösung sind präzise genug, um die Position einzelner Atome in einem Protein mit einer Auflösung von etwa 1,2 ångström (1,2 × 10 –10 m) eindeutig zu erkennen. Diese Strukturen sind besonders nützlich, um die Funktionsweise von Enzymen zu verstehen und diese Erkenntnisse zu nutzen, um Medikamente zu identifizieren, die ihre Aktivität blockieren können.

Um die Kryo-EM auf atomare Auflösung zu bringen, arbeiteten die beiden Teams an einem eisenspeichernden Protein namens Apoferritin. Aufgrund seiner felsähnlichen Stabilität hat sich das Protein zu einem Testfeld für Kryo-EM entwickelt: Eine Struktur des Proteins mit einer Auflösung von 1,54 ångström war der bisherige Rekord 3 .

Die Revolution wird sich nicht kristallisieren: Eine neue Methode fegt durch die Strukturbiologie

Die Teams nutzten dann technologische Verbesserungen, um schärfere Bilder von Apoferritin aufzunehmen. Starks Team erhielt eine 1,25-ångström-Struktur des Proteins mit Hilfe eines Instruments, das sicherstellt, dass sich die Elektronen mit ähnlichen Geschwindigkeiten bewegen, bevor sie auf eine Probe treffen, wodurch die Auflösung der resultierenden Bilder verbessert wird. Scheres, Aricescu und ihre Gruppe nutzten eine andere Technologie, um Elektronen abzufeuern, die sich mit ähnlichen Geschwindigkeiten fortbewegen. Sie profitierten auch von einer Technologie, die das Geräusch reduziert, das erzeugt wird, nachdem einige Elektronen von der Proteinprobe geschleudert wurden, sowie von einer empfindlicheren Elektronendetektionskamera. Ihre 1,2-ångström-Struktur sei so vollständig gewesen, sagt Scheres, dass sie einzelne Wasserstoffatome sowohl im Protein als auch in umgebenden Wassermolekülen ausmachen konnten.

Stark reckons that melding the technologies could push resolutions to around 1 ångström — but not much further. “Below 1 Å is almost impossible to reach for cryo-EM,” he says. Obtaining such a structure with existing state-of-the-art technology would take “several hundred years of data recording and a non-realistic amount of compute power and data-storage capacities”, his team estimates.


Light Microscopes

You will need to know:

how to prepare a slide for a light microscope.

label a light microscope and remember a brief description of what each of the components do.

  1. Using a pipette, place a drop of water in the centre of the slide.
  2. Using a scalpel and tweezers, carefully remove one thin layer of onion, trying to get only one or two layers of cells.
  3. Place the piece of onion in the water droplet using the tweezers.
  4. Using a pipette, place a drop of iodine over the onion slice.
  5. Carefully place a cover slide (a thin square piece of plastic/glass) over the onion and droplets. In order to prevent air bubbles from forming, place the cover slide upright on the larger slide and carefully tilt and lower the cover slide onto the water droplets.
  6. Place the slide onto the microscope stage, making sure the onion is in the centre of the stage.


Drawbacks of Second Harmonic Generation

Despite the effectiveness of SHG microscopy in imaging biological tissue, it still suffers from some limitations. One of these limitations is the restricted penetration depths (100–300 μm with laser excitation in the 800–1000 nm range). Consequently, this might make SHG microscopy inappropriate for some biological applications, mainly when the region of interest is deeply located within the tissue or organ thus, it is unreachable by SHG. The biggest issue in SHG microscopy is that it can image only a few structural proteins or harmonophores such as collagen types I & III, actomyosin complexes, cholesterol crystals (ChC), centrosomes and mitotic spindles. Unfortunately, to date, scientists could not find a method that can discriminate between fibrillar collagen types, which could enhance wound repair and regeneration biology [29]. However, these limitations might be controlled by finding suitable imaging solutions.


Super-resolution microscopy demystified

Super-resolution microscopy (SRM) bypasses the diffraction limit, a physical barrier that restricts the optical resolution to roughly 250 nm and was previously thought to be impenetrable. SRM techniques allow the visualization of subcellular organization with unprecedented detail, but also confront biologists with the challenge of selecting the best-suited approach for their particular research question. Here, we provide guidance on how to use SRM techniques advantageously for investigating cellular structures and dynamics to promote new discoveries.

In their pursuit of understanding cellular function, biologists seek to observe the processes that allow cells to maintain homeostasis and react dynamically to internal and external cues—on both a molecular scale and inside structurally intact, ideally living specimens. A pathway towards this goal was opened with the advent, and widespread application, of super-resolution microscopy (SRM) techniques that manage to surpass the ‘classical’ diffraction limit of optical resolution of about half the wavelength of the emitted light 1 . These fluorescence microscopy techniques are continuously pushing the resolution barrier towards nanometre scales, thereby enabling the imaging of cellular structures with a level of detail that was previously only achievable with electron microscopy (EM). At the same time, SRM techniques retain the advantages of optical microscopy with regard to sample preservation, imaging flexibility and target specificity. SRM allows the extraction of quantitative information on spatial distributions and often also on the absolute numbers of proteins or other macromolecules within subcellular compartments. SRM can also reveal three-dimensional (3D) structural details, and provides direct experimental feedback for modelling complex biological interactions 2 .


4.3 Elodea Leaf Wet Mount

Elodea canadensis (American or Canadian waterweed or pondweed) is a perennial aquatic plant, or submergent macrophyte, native to most of North America. It grows rapidly in favorable conditions and can choke shallow ponds, canals, and the margins of some slow-flowing rivers. It requires summer water temperatures of 10-25 °C and moderate to bright lighting. Young plants initially start with a seedling stem with roots growing in mud at the bottom of the water further adventitious roots are produced at intervals along the stem, which may hang free in the water or anchor into the bottom. It grows indefinitely at the stem tips, and single specimens may reach lengths of 3 m or more. The leaves are bright green, translucent, oblong, 6-17 mm long and 1-4 mm broad, borne in whorls of three (rarely two or four) round the stem. It lives entirely underwater, the only exception being the small white or pale purple flowers which float at the surface and are attached to the plant by delicate stalks. It is dioecious, with male and female flowers on different plants. The flowers have three small white petals male flowers have 4.5-5 mm petals and nine stamens, female flowers have 2-3 mm petals and three fused carpels. The fruit is an ovoid capsule, about 6 mm long containing several seeds that ripen underwater. The seeds are 4-5 mm long, fusiform, glabrous (round), and narrowly cylindrical. It flowers from May to October.


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