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Kann mRNA, die für ein krankheitsspezifisches Antigen kodiert, zu einem Prion mutieren?

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Kann die mRNA (die für ein krankheitsspezifisches Antigen kodiert), insbesondere wenn sie abgebaut wird, zu einem Prion oder einem anderen Krankheitserreger mutieren?

RNA-Impfstoffe: eine Einführung | PHG-Stiftung

Abgabe: Die effektive Abgabe des Impfstoffs an die Zellen ist eine Herausforderung, da freie RNA im Körper schnell abgebaut wird. Um die Abgabe zu unterstützen, wird der RNA-Strang in ein größeres Molekül eingebaut, um es zu stabilisieren, und/oder in Partikel oder Liposomen verpackt.

Grenzen | Fortschritte bei mRNA-Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten | Immunologie

Obwohl mRNA-Impfstoffe zum ersten Mal in den frühen 1990er Jahren getestet wurden, wurden diese Impfstoffe aufgrund von Bedenken hinsichtlich ihrer fragilen Stabilität, die durch allgegenwärtige Ribonukleasen und die Produktion in kleinem Maßstab verursacht wird, zunächst nicht umfassend eingesetzt. Ein erster Nachweis, dass die mRNA-Stabilität durch Optimierung und Formulierung verbessert werden kann, wurde 1995 von Ross und Kollegen veröffentlicht (21). Seitdem sind die Studien zu mRNA-Impfstoffen explodiert und mRNA kann jetzt durch eine zellfreie enzymatische Transkriptionsreaktion synthetisch hergestellt werden.

[… ] Verbesserte Verabreichungstechnologien wie die Elektroporation haben die Wirksamkeit von DNA-Impfstoffen beim Menschen erhöht (12), aber nicht das potenzielle Risiko der Integration exogener DNA in das Wirtsgenom verringert, was schwere Mutagenese verursachen und neue Krankheiten auslösen kann (13, 14).

[… ]

Es wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um die Stabilität und Liefereffizienz von zu verbessern in vivo mRNA-Impfstoff, einschließlich Einbau von 5'- und 3'-terminalen untranslatierten Regionen und chemisch modifizierten Nukleosiden (162-164).


Nein, Prionen sind Proteine, daher macht es keinen Sinn, dass eine mRNA zu einem Prion „mutiert“. Keine einzelnen mRNA-Moleküle, insbesondere wenn sie abgebaut sind, können nicht „pathogen“ sein. Sie müssen entweder Bestandteil eines Virus oder eines anderen Organismus sein, um eine pathogene Rolle zu spielen.


Warum es eine große Sache ist, wenn der erste Covid-Impfstoff „genetisch“ ist

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Foto: Carlo Allegri/Getty Images

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Am Montagmorgen, als Vertreter des Pharmaunternehmens Pfizer sagten, dass sein Covid-19-Impfstoff zu mehr als 90 Prozent wirksam zu sein scheint, stiegen die Aktien, Beamte des Weißen Hauses beeilten sich, (fälschlicherweise) Kredite zu beanspruchen, und Seufzer der Erleichterung stiegen überall Internet. „Liebe Welt. Wir haben einen Impfstoff! Die beste Nachricht seit dem 10. Januar“, twitterte Florian Krammer, Virologe und Vakzinologe an der Mount Sinai School of Medicine (der zufällig auch an der Pfizer Covid-19-Impfstoffstudie teilnimmt).

Alles, was Sie über das Coronavirus wissen müssen

Aber eine Pressemitteilung eines Pharmaunternehmens zu haben, die besagt, dass ein Impfstoff funktioniert, ist ganz anders als tatsächlich haben ein Impfstoff, der wirkt. Pfizer und sein deutscher Partner für den Impfstoff BioNTech haben noch keine Daten aus ihrer Phase-III-Studie veröffentlicht. Die Ergebnisse dieser Woche basieren auf der ersten Zwischenanalyse der Studie, die von einem externen Expertengremium durchgeführt wurde, nachdem sich 94 der 43.538 Teilnehmer mit dem Coronavirus infiziert hatten. Diese Analyse legt nahe, dass die meisten erkrankten Menschen ein Placebo anstelle des Impfstoffs erhalten hatten. Aber darüber hinaus sagt es nicht viel aus. (Mehr darüber, warum das so wichtig ist, später.)

Und logistisch gibt es noch viel Das muss passieren, bevor auch Nicht-Studierende die Ärmel hochkrempeln können. Pfizer-Forscher sammeln jetzt Sicherheits-Follow-up-Daten von mindestens zwei Monaten. Wenn diese Ergebnisse keine Warnsignale auslösen, könnte das Unternehmen eine Notfallgenehmigung bei der US-amerikanischen Food and Drug Administration beantragen. Erst dann könnten Führungskräfte damit beginnen, die etwa 50 Millionen Dosen zu verteilen, die sie bis Ende des Jahres erwarten, ein Prozess, der durch die Tatsache kompliziert wird, dass der Pfizer-Impfstoff bei Temperaturen nach unten gehalten werden muss, bis er bereit ist, jemandem in den Arm geschossen zu werden von -80 Grad Fahrenheit, was viel kälter ist als die übliche Kühlkette für Impfstoffe. Der Abschluss der Immunisierung erfordert auch zwei Dosen im Abstand von drei Wochen. Oh ja, und stellt fest, dass Sie im Moment versuchen, all die anderen Dinge zu tun, die Sie tun müssen, um sich auf einen so komplizierten Impfschub vorzubereiten – Impfungen einzustellen, digitale Register einzurichten, zu entscheiden, wer die Impfpriorität erhält – tun dies ohne irgendwelche zusätzliches Geld für die Bemühungen.

Das sind viele Vorbehalte. Aber dennoch gibt es Grund zur Hoffnung. Wenn die Ergebnisse halten, wird ein zu 90 Prozent wirksamer Covid-19-Impfstoff die von der FDA festgelegte Wirksamkeitsgrenze weit überschritten haben. Dieses Schutzniveau würde es mit der Masernimpfung, einem der wirksamsten Impfstoffe, die bisher entwickelt wurden, erreichen.

Die Einführung eines wirksamen Impfstoffs zur Bekämpfung von SARS-CoV-2 weniger als ein Jahr nach dem Auftreten des neuartigen Coronavirus würde jeden Rekord brechen, der jemals von Impfstoffherstellern aufgestellt wurde. „Historisch ist nicht einmal das richtige Wort“, sagt Larry Corey von der Abteilung für Impfstoffe und Infektionskrankheiten am Fred Hutchinson Cancer Center. Als renommierter Virologe hat Corey die letzten drei Jahrzehnte damit verbracht, die Suche nach einem Impfstoff gegen das AIDS-Virus zu leiten. Er hat in weniger als fünf Jahren noch nie eine Impfung gegen einen neuen Fehler gesehen, geschweige denn eine. „Das ist noch nie passiert, nie, nicht einmal annähernd“, sagt er. "Es ist einfach eine erstaunliche Leistung der Wissenschaft."

Und vielleicht noch monumentaler ist die nett des Impfstoffs, den Pfizer und BioNTech über die Ziellinie bringen. Der Wirkstoff in ihrem Schuss ist mRNA – mobile Stränge des genetischen Codes, die die Baupläne für Proteine ​​enthalten. Zellen verwenden mRNA, um diese Spezifikationen aus dem harten DNA-Speicher in ihre Proteinfabriken zu holen. Die mRNA im Impfstoff von Pfizer und BioNTech leitet alle Zellen, die sie erreicht, an, ein Programm zum Aufbau von Coronavirus-Spikes durchzuführen. Die viralen Proteine, die diese Zellen produzieren, können keine anderen Zellen infizieren, aber sie sind fremd genug, um die Abwehrsysteme des Körpers auszulösen. Sie sehen dem echten Virus auch genug ähnlich, um das Immunsystem darauf zu trainieren, SARS-CoV-2 zu erkennen, sollte sein Besitzer in Zukunft auf das infektiöse Virus stoßen. Bisher ist diese Technologie noch nie für den Einsatz am Menschen zugelassen. Ein erfolgreicher mRNA-Impfstoff wird nicht nur ein Triumph über das neue Coronavirus sein, sondern ein großer Fortschritt für die Wissenschaft der Impfstoffherstellung.

Edward Jenner und Jonas Salk waren nicht nur Pioniere, sie waren Cowboys. Sie verwendeten grobe Methoden (wie das Aufstechen von Eiter aus der Kuhpockenblase einer Milchmagd bei Kindern), die ihnen nur die Ergebnisse am Ende ihrer Forschung zeigten, nicht den Mechanismus, nach dem die Impfung funktionierte. Im Laufe der Jahrhunderte wurden die Methoden etwas verfeinert, aber die Vakzinologie hat diese Kultur des empirischen Revolverkampfes weitgehend beibehalten.

Bei wirksamen Impfungen geht es darum, das Immunsystem einer harmlosen Version eines Krankheitserregers auszusetzen, damit es im Falle einer zukünftigen Invasion schneller reagieren kann. Impfstoffe müssen echt aussehen, um eine robuste Immunantwort hervorzurufen. Aber zu nah eine Ähnlichkeit und der Impfstoff könnte dazu führen, dass Menschen krank werden. Um das Gleichgewicht herzustellen, haben Wissenschaftler versucht, Viren mit Hitze und Chemikalien zu inaktivieren und zu lähmen. Sie haben Hefe manipuliert, um Teile von viralen Proteinen zu produzieren. Und sie haben diese Kleinigkeiten in Frankenstein zu harmloseren viralen Verwandten gemacht, wie Schafe im Wolfskleid. Diese Ersatzstoffe für ein funktionierendes Virus waren nicht genau – Wissenschaftler konnten nicht genau vorhersagen, wie das Immunsystem reagieren würde –, aber sie waren nahe genug, dass sie manchmal funktionierten.

Aber in den letzten zehn Jahren hat das Feld begonnen, sich von diesem Ansatz des Sehens, was bleibt, hin zu etwas zu bewegen, das Pharma-Leute „rational Drug Design“ nennen. Es geht darum, die Struktur und Funktion des Ziels zu verstehen – wie beispielsweise das stachelige Protein, das SARS-CoV-2 verwendet, um in menschliche Zellen einzudringen – und den Aufbau von Molekülen, die entweder direkt an dieses Ziel binden oder andere Moleküle produzieren können, die dies können. Genetische Impfstoffe sind ein wichtiger Schritt in dieser wissenschaftlichen Evolution. Ingenieure können jetzt mRNA-Stränge auf Computern entwerfen, die von Algorithmen geleitet werden, die vorhersagen, welche Kombination genetischer Buchstaben ein virales Protein mit genau der richtigen Form ergibt, um den menschlichen Körper zur Produktion von schützenden Antikörpern anzuregen. In den letzten Jahren ist es viel einfacher und billiger geworden, mRNA und DNA in großem Maßstab herzustellen, was bedeutet, dass Wissenschaftler, sobald sie Zugang zum Genom eines neuen Krankheitserregers haben, Hunderte oder Tausende von mRNA-Schnipseln zum Testen zusammenstellen können – jeden ein potenzieller Impfstoff. Die chinesische Regierung hat Mitte Januar die genetische Sequenz von SARS-CoV-2 veröffentlicht. Bis Ende Februar hatte BioNTech 20 Impfstoffkandidaten identifiziert, von denen vier dann für Humanstudien in Deutschland ausgewählt wurden.

Seit kleine Unternehmen wie BioNTech, Moderna und Inovio vor etwa 10 Jahren mit der Entwicklung genetischer Impfstoffe begannen, war diese Geschwindigkeit immer das hellste Versprechen. Je schneller Sie Impfstoffe herstellen und testen können, desto schneller können Sie auf Ausbrüche neuer Krankheiten reagieren. Aber mit jedem neuen Ansatz gehen Risiken einher – das Risiko, dass der Impfstoff nicht gut funktioniert oder, schlimmer noch, jemandem schadet und Millionen von Dollar für eine Technologie verschwendet werden, die sich als Flop herausstellt. Bis zu diesem Jahr scheuten große Impfstoffentwickler genetische Impfstoffe. Vor 2020 haben es nur 12 mRNA-Impfstoffe in Studien am Menschen geschafft. Keine wurden genehmigt. Dann kam das Coronavirus.

„Vor der Pandemie gab es weder die finanziellen Anreize noch die Möglichkeiten für die großen Pharmaunternehmen, sich zu engagieren“, sagt Peter Hotez, Impfstoffforscher und Dekan der National School of Tropical Medicine am Baylor College of Medicine. Aber da die Regierungen sich beeilen, nicht nur klinische Studien zu finanzieren, sondern auch die Produktion anzukurbeln, wie bei der Operation Warp Speed ​​in den USA, wurde es viel weniger riskant, etwas Neues auszuprobieren. Die Beute dieser Investition und der potenzielle Erfolg eines Pfizer/BioNTech-Impfstoffs werden diese Pandemie lange überleben, sagt Hotez. „Es bietet einen Gleitpfad für die Verwendung der mRNA-Technologie für andere Impfstoffe, einschließlich Krebs, Autoimmunerkrankungen und andere Infektionskrankheiten, sowie als Vehikel für Gentherapien. Es hilft wirklich, das gesamte biomedizinische Feld zu beschleunigen.“

Neben Pfizer/BioNTech hat Moderna auch einen mRNA-basierten Covid-19-Impfstoff in Phase-III-Studien und erwartet noch in diesem Monat erste Zwischenergebnisse. Der DNA-basierte Impfstoff von Inovio ist aufgrund von Bedenken hinsichtlich des zur Injektion verwendeten Geräts ins Stocken geraten. Beamte des Impfstoffherstellers gaben diese Woche bekannt, dass sie erwarten, dass die FDA eine Entscheidung darüber trifft, ob die Phase-II/III-Studie Ende dieses Monats fortgesetzt werden kann oder nicht. Alle Augen bleiben also vorerst auf Pfizer und BioNTech gerichtet. Und alle wollen mehr sehen.

„Bis der vollständige Datensatz verfügbar ist, ist es schwer, das wahre Potenzial zu interpretieren“, sagt Carlos Guzman, Leiter der Abteilung für Vakzinologie und Angewandte Mikrobiologie am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Deutschland. Wichtig zu beachten sei, sagt er, dass die Wirksamkeitsaussage von Pfizer auf einer relativ kleinen Anzahl von Studienteilnehmern beruht, die positiv auf Covid-19 getestet wurden, und dass bisher niemand etwas über sie weiß. Wie alt sind die erkrankten Personen? Wie alt sind die, die es nicht tun? Das sind wichtige Informationen, um zu verstehen, wie gut der Impfstoff in verschiedenen Altersgruppen wirkt, was darüber informieren könnte, wer ihn zuerst erhält.

Ein weiteres Fragezeichen ist, was mit den Symptomen und Viruslasten der Menschen passiert. Laut dem Studienprotokoll von Pfizer würde man zu dem Schluss kommen, dass der Impfstoff verhindert, dass Menschen schwere Fälle von Covid-19 bekommen – aber bedeutet das, dass sie sich überhaupt nicht infizieren? Die Antwort könnte der Unterschied zwischen einem Impfstoff sein, der eine Schutzmauer der Immunität in Gemeinden aufbaut, und einem, der Menschen nur vom Krankenhaus (und der Leichenhalle) fernhält. Eine weitere unbeantwortete Frage ist, wie lange eine solche Immunität andauern könnte. Erwarten Sie dafür, noch etwas länger zu warten, sagt Guzman: "Die Daten in den kommenden Monaten werden ein besseres Bild von der längerfristigen Wirksamkeit des Impfstoffs liefern und ob dieser Impfstoff auch vor schweren Formen von Krankheiten und Todesfällen schützen kann."

Lesen Sie hier alle unsere Coronavirus-Berichterstattung.

Die Verbreitung solcher Informationen wird für jeden Impfstoff von entscheidender Bedeutung sein, um das Vertrauen der Öffentlichkeit zu gewinnen – ein entscheidender Schritt in jeder Impfkampagne, insbesondere jedoch einer, der angesichts der zunehmenden Impfstoffskepsis und Fehlinformationen eingeführt würde. „Die wissenschaftliche Gemeinschaft muss in der Lage sein, die Ergebnisse der Studie durch Peer-Review und transparenten Datenaustausch zu bewerten“, sagt Ariadne Nichol, Forscherin für Medizinethik an der Stanford University. Bisher haben Pfizer und BioNTech Sicherheitsdaten aus früheren Studien des Impfstoffs veröffentlicht. Es wurden keine ernsthaften Sicherheitsbedenken beobachtet.

Wenn die Pfizer-Formel von der FDA zugelassen wird, werden die USA an vorderster Front stehen, um die ersten Chargen des Impfstoffs zu erhalten. Im Juli stimmte die Trump-Administration zu, fast 2 Milliarden US-Dollar für 100 Millionen Dosen Pfizer und BioNTechs Schuss zu zahlen, oder genug, um etwa 50 Millionen Menschen zu immunisieren. Entsprechend Das Wall Street Journal, wird Pfizer den Vertrieb seiner Produkte übernehmen und sich nicht auf die Bundesregierung verlassen. Dies wirft jedoch auch die Frage auf, wie lange es dauern könnte, bis der Impfstoff weniger wohlhabende Länder erreicht, insbesondere wenn die extreme Kühlkette, die erforderlich ist, um die Formel stabil zu halten, nicht mit der lokalen Infrastruktur kompatibel ist. „Dies ist ein Sprint, bei dem Pfizer möglicherweise Erster wird“, sagt Nichol. „Aber wir haben noch einen Marathon vor uns, um Fragen der Produktion und gerechten Verteilung innerhalb unserer Weltbevölkerung anzugehen.“

Genetische Impfstoffe könnten beweisen, dass sie funktionieren können – aber es ist immer noch nicht endgültig und sie funktionieren möglicherweise noch nicht bei jedem. Aus diesem Grund ist es nach Ansicht von Experten so wichtig, die laufenden Studien für die mehr als 60 anderen Impfstoffkandidaten, die sich noch in verschiedenen Phasen der Humantests befinden, weiterhin zu unterstützen. Was älteren Technologien an Geschwindigkeit fehlt, machen sie durch Langlebigkeit wett. Impfstoffe wie die gegen Masern, Gelbfieber und Tollwut können gefriergetrocknet werden, damit sie lagerstabil sind und überall verwendet werden können. Das macht sie auch günstiger. „Wir können die Welt nicht nur mit mRNA allein schnell immunisieren“, sagt Corey. Um die Pandemie zu beenden und den Würgegriff des Virus auf die Weltwirtschaft zu durchbrechen, wird mehr als ein Impfstoff benötigt, und wahrscheinlich mehr als zwei oder drei. „Die Notwendigkeit, das Pedal auf dem Metall zu halten, ist kein bisschen verschwunden“, sagt er.


Kann mRNA, die für ein krankheitsspezifisches Antigen kodiert, zu einem Prion mutieren? - Biologie

Russ Altmans Forschung konzentriert sich auf die Interaktion von Genen und Arzneimitteln und auf Methoden zur Entschlüsselung dieser komplexen Zusammenhänge mit Informatiktechnologien . Er ist außerdem PI des Simbios National Center for Physics-Based Simulation of Biological Structure, das die molekularen Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und ihren Zielgenprodukten untersucht. Seine Gruppe verwendet auch Text-Mining-Methoden, um Informationen über Gen-Wirkstoff-Interaktionen aus der veröffentlichten Literatur zu extrahieren und verwendet Data-Mining- und maschinelle Lernmethoden, um Hinweise auf die molekulare Grundlage von Arzneimittelwirkung und Nebenwirkungen zu extrahieren. Er hat mit Euan Ashely und Atul Butte zusammengearbeitet, um Methoden zur Annotation ganzer menschlicher Genome zu entwickeln (sein Schwerpunkt liegt auf der Vorhersage von Arzneimittelreaktionen). Er ist der Leiter des Ausbildungsprogramms Biomedizinische Informatik.

Das Labor von Euan Ashley entwickelt neue Methoden zur Interpretation genomischer Varianten in der Medizin mit besonderem Fokus auf die kardiovaskuläre Biologie. Er leitete das Team, das 2010 die erste klinische Interpretation eines menschlichen Genoms durchführte, und leitet heute den Clinical Genome Service and Center for Inherited Cardiovascular Disease in Stanford. Sein Labor untersucht auch Varianten, die mit sportlicher Spitzenleistung verbunden sind. Ungefähr die Hälfte seines Labors widmet sich experimentellen Tests der Genfunktion unter Verwendung einer Vielzahl von Zellkultur-, transgenen und induzierten Stammzellmodellen, um Hypothesen zu testen, die durch klinische Sequenzierungs- und Assoziationsstudien generiert wurden.

Im Zentrum der Forschung von Julie Baker steht das Verständnis der molekularen Regulation der ersten Zellschicksalsentscheidungen im Embryo. Ihr Labor umfasst Froschembryologie, Mausgenetik und humane embryonale Stammzelltechnologie, um zu untersuchen, wie Gennetzwerke das Zellschicksal steuern und wie eine falsche Spezifikation dieser Zellen – insbesondere des Trophoblasten – zu Krankheiten führt. Sie war eine der leitenden Ermittler am Stanford March of Dimes Prematurity Center und leitete die Bemühungen, Plazentationsfehler mit Schwangerschaftserkrankungen in Verbindung zu bringen. Sie und Bustamante arbeiten auch an einer Studie zur Höhenanpassung im Hochland von Peru und ihren Auswirkungen auf die Präeklampsie. Sie sind Co-Mentor eines M.D./Ph.D. Student.

Das Labor von Maria Barna konzentriert sich darauf, die zellulären und molekularen Grundlagen dafür zu verstehen, wie komplexe dreidimensionale Gewebe während der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren gebildet werden. Ihre Arbeit an klassischen Maus-Skelettmutanten hat gezeigt, dass grundlegende Aspekte der Gewebemusterung von „spezialisierten Ribosomen“ gesteuert werden, die selektiv Untergruppen von mRNAs mit einzigartigen cis-regulatorischen Elementen translatieren. Ihr Labor hat neuartige translationale Profilierungstechnologien entwickelt, um zu beschreiben, wie die genomische Vorlage in funktionelle Proteine ​​innerhalb einzigartiger Zell- und Gewebetypen übersetzt wird. Ein zweiter wichtiger Forschungsschwerpunkt ist die Entwicklung und Anwendung modernster Bildgebung und transgener Hühner-Reporter-Stämme, um die frühesten morphogenetischen Ereignisse während der Embryonalentwicklung aufzudecken. Sie visualisieren die Aktivierung der Signalgebung während der Organogenese bei der Auflösung einzelner und subzellulärer Zellen und liefern neue Einblicke in die Gewebemusterung.

Das Labor von Michael Bassik untersucht, wie endozytische Krankheitserreger wie Toxine, Viren und Proteinaggregate in Zellen eindringen, die Homöostase stören und Apoptose verursachen. Sein Labor hat neuartige ultrakomplexe shRNA-Bibliotheken und CRISPR-basierte Ansätze entwickelt, die es ermöglichen, Genpaare in Hochdurchsatz-Screenings in kultivierten Zellen systematisch zu zerstören. Diese Arbeit hat die ersten systematischen genetischen Interaktionskarten in Säugerzellen ermöglicht. Diese Interaktionskarten helfen, koordinierte Genfunktionen zu verstehen, können neue Funktionen für nicht charakterisierte Gene vorhersagen und ermöglichen die Suche nach neuen Wirkstoffzielen.

Philip Beachy untersucht die Biologie und den Mechanismus der Signalübertragung von Hedgehog-Proteinen. Frühere Forschungen haben gezeigt, wie sich Hedgehog-Proteine ​​von lokalisierten Expressionsstellen ausbreiten, um die embryonale Entwicklung von Gehirn, Rückenmark, Achsenskelett und anderen Organen zu mustern. Derzeit untersucht er die Signalgebung von Igeln während der Reparatur und Regeneration einer Vielzahl von Geweben im Erwachsenenalter und deren Auswirkungen auf die Physiologie von Stammzellen und Krebsstammzellen. Auf mechanistischer Ebene untersucht das Labor, wie lipidmodifizierte Hedgehog-Signale verpackt und als multivalente Partikel freigesetzt werden, die das transporterähnliche Protein Patched und seine Co-Rezeptoren angreifen.

Das Labor von Gill Bejerano untersucht die cis-regulatorische Architektur des menschlichen Genoms. Zu den Hauptinteressen gehören die Kartierung regulatorischer Elemente, die an der Entwicklung der frühen Gliedmaßen, des Vorderhirns und der Plazenta beteiligt sind, die Identifizierung regulatorischer Veränderungen, die zu linienspezifischen evolutionären Merkmalen beigetragen haben, und die Interpretation menschlicher Sequenzvarianten, die während der persönlichen Genomsequenzierung und der klinischen Medizin gefunden wurden.

Das Labor von Ami Bhatt charakterisiert die Dynamik des Mikrobioms bei immungeschwächten Personen mit hämatologischen Malignomen und untersucht, wie Veränderungen im Mikrobiom mit idiopathischen Erkrankungen bei Patienten verbunden sind. Ihre auf Mikrobiomsequenzen basierende Analyse hat zur Entdeckung eines neuartigen Bakteriums in erkranktem menschlichem Gewebe geführt.

Das Labor von Alistar Boettiger will verstehen, wie weitreichende Interaktionen zwischen nicht aufeinanderfolgenden Teilen des Genoms reguliert werden, um die Genexpression zu kontrollieren. Solche Interaktionen zwischen cis-regulatorischen Elementen (wie Enhancern und Promotoren) sind für alle entwicklungsregulierten Gene essentiell und bilden den Kern der Zelldifferenzierung. Unterschiede in der CRE-Aktivität und CRE-Interaktionen sind wahrscheinlich für einen Großteil der genetischen Variation zwischen Individuen in Bezug auf Aussehen und Gesundheit verantwortlich, da die transkribierte Sequenz der Gene hoch konserviert ist. Wir glauben, dass die Antworten auf diese Fragen das Verständnis der 3-D-Organisation des Genoms erfordern.

Das Boyd-Labor untersucht gesunde und pathogene menschliche Immunantworten im Zusammenhang mit Impfungen, Infektionskrankheiten und Allergien, indem es eine Kombination aus Antigenrezeptorsequenzanalyse, funktioneller Antikörpercharakterisierung und zellulären Immunologieexperimenten verwendet.

Das Labor von Anne Brunet verwendet eine Kombination aus genetischen und genomischen Ansätzen, um die genetischen und epigenetischen Mechanismen zu untersuchen, die die Langlebigkeit in einer Vielzahl von Modellsystemen, von Würmern bis hin zu Säugetieren, regulieren. Ihr Labor untersucht einen entscheidenden genetischen Weg, der die Lebensdauer auf evolutionär konservierte Weise kontrolliert (den Insulin-Foxo-Weg) und die Bedeutung von Chromatin-Modifikatoren für Langlebigkeit und Regeneration. Sie haben auch Pionierarbeit für neue genetische Kartierungs-, Sequenzierungs- und CRISPR-Ansätze beim afrikanischen Killifischen N. furzeri geleistet, der große Langlebigkeitsvariationen und die kürzeste bekannte Lebensdauer von Wirbeltieren als neues Modellsystem für das Altern aufweist.

Carlos Bustamante ist Populationsgenetiker mit Expertise in der Analyse großer genomischer Datensätze. Ein Großteil seiner Forschung liegt an der Schnittstelle von Computerbiologie, mathematischer Genetik und Genomik. Beispiele für unsere Forschungsleistungen sind (1) die Entwicklung von Selektionskarten des menschlichen Genoms, die sich schnell entwickelnde Gene sowie genomische Regionen, die starken Selektionsbeschränkungen unterliegen, lokalisieren (2) die Entwicklung einer hochdichten Karte der genetischen Variation im Hundegenom und deren Verwendung um genomische Regionen zu identifizieren, die morphologischen Unterschieden zwischen Haushunderassen zugrunde liegen (3) Untersuchung der genetischen Struktur menschlicher Populationen und ihrer Auswirkungen auf die genomische Medizin (siehe Programmverwaltung für weitere Details)

Das Labor von Michele Calos entwickelt neue Methoden für das Genom-Engineering für Säugerzellen. Ihr Labor hat eine Reihe von Vektoren und Technologien entwickelt, die heute weit verbreitet für die Modifikation von Säugetiergenomen verwendet werden, einschließlich prokaryontischer Phagenintegrasen, um neue sequenzspezifische Integrationswerkzeuge zu schaffen. Ihre aktuelle Forschung kombiniert Rekombinasen und homologe Rekombinationstechniken, um die an genetischen Erkrankungen beteiligten Mutationen zu korrigieren. Sie entwickeln auch neuartige Methoden zur Differenzierung und Transplantation korrigierter iPS-Zellen, um Stammzelltherapien für Muskeldystrophie zu entwickeln.

Howard ist Arzt und Wissenschaftler mit einer Ausbildung in Genomwissenschaften. Seine Forschung konzentriert sich auf Mechanismen, die die Aktivitäten einer Vielzahl von Genen bei der Kontrolle des Zellschicksals koordinieren. Sein Labor machte eine Reihe von Entdeckungen, die die wichtige und allgegenwärtige Rolle langer, nicht kodierender RNAs in der biologischen Regulation bekannt machten. Howard verfügt über umfangreiche Erfahrung in Epigenetik und RNA-Biologie, einschließlich der Erfindung neuer Methoden für epigenomisches Profiling, Kartierung der RNA-Belegung auf Chromatin und Definition von RNA-Strukturen im gesamten Genom. Sein Labor leistete Pionierarbeit bei Methoden zur Identifizierung von Schlüsselregulatoren groß angelegter Transkriptionsprogramme. Diese Methoden waren für Studien zu Entwicklung, Krebs und Alterung sehr fruchtbar. Das langfristige Ziel meines Labors ist es, die regulatorischen Informationen im menschlichen Genom für die Diagnose und Therapie von Krankheiten zu entschlüsseln.

Das Labor von James Chen hat Pionierarbeit bei der Verwendung chemischer Werkzeuge zur Untersuchung von Entwicklungssignalwegen geleistet. Sie haben mehrere niedermolekulare Modulatoren des Hedgehog-Signalwegs entdeckt und/oder charakterisiert, wie die ersten Smoothened-Antagonisten (Cyclopamin, SANT-1 bis 4, SANT-75) und Agonisten (SAG und Purmorphamin) den ersten Hedgehog-Proteinblocker (Robotnikinin ) und Antagonisten epistatisch zu Suppressor of Fused (HPI-1 bis -4), das den ersten chemischen Inhibitor von Dynein (HPI-4) enthält. Sie haben auch neue Technologien für embryologische Studien mit Zebrafischen entwickelt, darunter die ersten Morpholinos in Käfigen, die lichtgesteuertes Gen-Silencing mit raumzeitlicher Präzision ermöglichen. Durch die Integration photoaktivierbarer Reagenzien mit photoaktivierbaren Fluorophoren, Durchflusszytometrie und Microarray-Studien haben sie während der Embryogenese dynamisch profilierte Transkriptionsfaktor-Targets, die einen überraschenden Grad an funktioneller Plastizität innerhalb einer einzelnen Zelllinie zeigen.

Das Labor von Michael Cherry ist auf das Design und die Pflege von weltweiten öffentlichen Datenbanken mit biologischen Informationen für Saccharomyces cerevisiae und den Menschen spezialisiert. Aktuelle Projekte konzentrieren sich auf das Design von Datenbanken und Software für die effektive Integration komplexer experimenteller Ergebnisse, die Standards für eukaryotische Genomdaten definieren, die die Zuverlässigkeit und Qualität messen. Seine Gruppe stellt drei wichtige Bioinformatik-Ressourcen bereit: die Saccharomyces Genome Database, das Gene Ontology Consortium und das ENCODE Data Coordination Center.

Das Forschungsprogramm von Thomas Clandinin konzentriert sich auf drei zentrale Fragen der Neurobiologie. Wie bauen sich neuronale Schaltkreise während der Entwicklung zusammen? Wie werden die Funktionen dieser Schaltkreise während des Erwachsenenlebens aufrechterhalten? Wie vermitteln solche Schaltkreise die komplexen Berechnungen, die für das Verhalten von Tieren unerlässlich sind? Unsere Arbeit nutzt das Zusammenspiel zwischen den Zellen und Genen, die diesen Prozessen zugrunde liegen, um neue molekulare Mechanismen zu definieren, die die Spezifität neuronaler Verbindungen und die Aufrechterhaltung von Synapsen steuern, und um die Rechenfunktionen spezifischer Schaltkreise zu charakterisieren. Das langfristige Ziel unseres Programms ist es zu verstehen, wie das Genom neuronale Schaltkreise im Erwachsenenleben programmiert, um die Berechnungen zu implementieren, die angeborenes Verhalten untermauern, wobei das visuelle System der Fruchtfliege als Modell verwendet wird.

Das Labor von Stan Cohen untersucht die posttranskriptionelle Kontrolle der Genexpression in Bakterien durch kleine nicht-kodierende RNAs und die Mechanismen, die den Zerfall und die Verarbeitung bakterieller RNA steuern. Sein Labor untersucht die Evolution und Verbreitung bakterieller Antibiotikaresistenzen, die Ausbeutung von Wirtsgenen durch Krankheitserreger und ihre Toxine, die Auswirkungen der Wirtsgenvariation auf diese Prozesse und die Mechanismen, die die Transkription von Genen mit erweiterten Trinukleotid-Wiederholungssequenzen beeinflussen. Sein Labor hat ein neuartiges System von Computerprogrammen (Genetic Analysis By Rules Incorporating Expert Logic GABRIEL) entwickelt und implementiert, das Expertenwissen und statistische Algorithmen zur Analyse der bei ihren Untersuchungen gewonnenen genetischen Daten verwendet.

Das Labor von Gerald Crabtree verwendet Genomanalyse und Mausgenetik, um grundlegende Prozesse der Chromatinregulierung zu untersuchen. Sie interessieren sich besonders für die molekularen Mechanismen, die von Chromatin-Remodeling-Komplexen verwendet werden, einschließlich der ATP-abhängigen Chromatin-Regulierung durch BAF-Komplexe (ein entfernter Verwandter von Hefe-SWI/SNF). Diese polymorphe Familie von Chromatin-Remodeling-Komplexen ist in etwa 16% aller menschlichen Tumoren mutiert und spielt eine genetisch dominante Rolle bei der Entwicklung des menschlichen und murinen Nervensystems. Das Labor hat neuartige Stämme von "Chromatin Indicator and Assay" Mäusen entwickelt, die eine schnelle Regulierung des Chromatins an bestimmten Loci ermöglichen und eine neue Modellierung der Chromatindynamik in lebenden Zellen ermöglichen.

Das Labor von Christina Curtis untersucht evolutionäre Dynamiken, neue therapeutische Ziele und die Karte von Genotyp zu Phänotyp bei Krebs. Ihre umfangreichen genomischen Studien von Tumorproben haben zu einem neuartigen "Urknall"-Modell der intratumoralen Heterogenität geführt und bieten einen neuen quantitativen Rahmen für die Interpretation von Tumorwachstum und DNA-Sequenzsignaturen bei Krebspatienten.

Das multidisziplinäre Forschungsprogramm von Ron Davis entwickelt neuartige Technologien zur Erleichterung der Genomanalyse. Sein Labor integriert Elektrotechnik, Biologie/Medizin und Informatik/Statistik und er ist Direktor des Stanford Genome Technology Center. Die meisten Projekte innerhalb des Zentrums erfordern einen multidisziplinären Ansatz, um erfolgreich zu sein. Studierende, die am Zentrum arbeiten, erhalten im Rahmen ihrer Ausbildung wertvolle Erfahrungen in Technologieentwicklung, Teamforschung und interdisziplinärer Kommunikation. Das Davis-Labor wird häufig „head-gejagt“, wo Studenten vor Abschluss ihrer Ausbildung Jobangebote erhalten. Die multidisziplinäre und Teamforschungsausbildung scheint der Schlüssel zu ihrer erfolgreichen Arbeitsvermittlung zu sein.

Das Labor von Andrew Fire untersucht eine Vielzahl natürlicher Mechanismen, die von Zellen genutzt werden, die sich an genetische Veränderungen anpassen. Dazu gehören Mechanismen, die während der normalen Entwicklung aktiviert werden, und Systeme zum Nachweis und zur Reaktion auf fremde oder unerwünschte genetische Aktivitäten. An der Wurzel dieser Studien stehen Fragen, wie eine Zelle "Selbst" gegenüber "Nicht-Selbst" und "gewünschte" gegenüber "unerwünschte" Genexpression unterscheiden kann. Ein Großteil der aktuellen Bemühungen im Labor zielt auf ein molekulares Verständnis der RNAi-Maschinerie und ihrer Rolle in der Zelle ab. RNAi ist nicht die einzige zelluläre Abwehr gegen unerwünschte Nukleinsäuren, und erhebliche aktuelle Anstrengungen im Labor richten sich auch auf die Identifizierung anderer Auslöser und Mechanismen, die bei der Erkennung und Reaktion auf Fremdinformationen sowohl in Modellsystemen als auch in der Überwachung von Humanpathogenen verwendet werden.

Dominique ist Pflanzenwissenschaftlerin mit besonderem Fokus auf Entwicklungsbiologie und Pflanzenbiologie. Entsprechend ist sie Professorin für Biologie an der Stanford University und in Kooperation mit dem Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine

Polly Fordyce entwickelt neue Methoden zur quantitativen Messung von molekularen Wechselwirkungen im Systemmaßstab. Mit neuartigen mikrofluidischen Assays hat sie die Beziehung zwischen Transkriptionsfaktoren, Bindungsaffinitäten und Zielgennetzwerken in S. cerevisiae, C. albicans und Menschen untersucht. Diese Arbeit hat dazu beigetragen, völlig neue Klassen von DNA-bindenden Transkriptionsfaktoren zu identifizieren und zeigte, wie Aminosäureunterschiede zwischen bestimmten Mitgliedern der TF-Familie die Bindungsspezifität und Gennetzwerk-Interaktionen verändern können. Derzeit entwickelt sie automatisierte spektrale Kodierungsmethoden, um neuartige Polymer-Bead-Bibliotheken zu erstellen, die Millionen verschiedener Codes enthalten und neue Multiplex-Assays im genomischen Maßstab ermöglichen, die derzeit unmöglich sind.

Hunter Fraser untersucht die Regulation und Evolution der Genexpression mit einer Kombination aus experimentellen und computergestützten Ansätzen. Seine Arbeit vereint quantitative Genetik, Genomik, Epigenetik und Evolutionsbiologie, um ein tieferes Verständnis dafür zu erlangen, wie genetische Variation innerhalb und zwischen Arten die genomweite Genexpression beeinflusst und letztendlich die phänotypische Vielfalt des Lebens prägt.

Das Labor von Margaret Fuller untersucht die Mechanismen, die die Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung in adulten Stammzelllinien regulieren. Sie verwenden das männliche Keimbahnmodell von Drosophila, um zu untersuchen, wie adulte Stammzellen ihre Stützzellnische erkennen, ihre Anhaftung aufrechterhalten und sich an ihr orientieren und wie die Töchter der Stammzellteilungen in das Differenzierungsprogramm eintreten und es dann ausführen. Sie untersuchen auch die Mechanismen, die die Proliferationskapazität von transitamplifizierenden Zellen einschränken und den Wechsel von der Proliferation zur terminalen Differenzierung in adulten Stammzelllinien auslösen und vermitteln. Darüber hinaus untersuchen sie die Mechanismen, die den zelltypspezifischen Zellzyklus der Meiose beim Mann regulieren und das zelltypspezifische terminale Differenzierungsprogramm aktivieren, sobald aus Keimzellen Spermatozyten werden.

Die Forschung von Aaron Gitler beschäftigt sich mit der Definition der Mechanismen menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der amyotrophen Lateralsklerose (ALS). Sie verwenden Hefe als Modellsystem, um die Auswirkungen der Proteinaggregation auf die Zellbiologie zu untersuchen und ein genomweites Screening auf Modifikatoren durchzuführen. Diese Studien haben es ihnen ermöglicht, konservierte zelluläre Signalwege zu definieren, die von aggregationsanfälligen Proteinen bei Parkinson und ALS betroffen sind, und zu einem gemeinsamen humangenetischen Risikofaktor für ALS.

Hank Greely ist Professor an der Stanford Law University und eine gemeinsame Fakultät für Genetik. Seine aktuellen Interessen in der Humangenetik konzentrieren sich auf die pränatale genetische Diagnostik, die Auswirkungen der klinischen Sequenzierung des gesamten Genoms sowie ethische, rechtliche und soziale Fragen in genomischen Biobanken. Sein Interesse an Stammzellen umfasst rechtliche Herausforderungen der Stammzellforschung und ethische Fragen im Zusammenhang mit menschlichen/nicht-menschlichen Chimären. Er untersucht auch den Schutz der Humanforschung, die biologische Verbesserung und die Zukunft der Reproduktionstechnologien.

Das Labor von William Greenleaf nutzt die Leistungsfähigkeit von Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden und modernster optischer Mikroskopie, um die Beziehung zwischen Genomsequenz und Funktion zu untersuchen. Das Labor untersucht die Beziehung zwischen RNA-Sequenz und -Funktion und mithilfe einer neu entwickelten RNA-Array-Methode erkennt und quantifiziert seltene genetische und epigenetische Variationen in Zellen und Einzelmolekülen durch die Entwicklung neuer molekularbiologischer und mikrofluidischer Methoden und kartiert die Struktur von Chromatin in vivo unter Verwendung eines leistungsstarken neuen "Quotassays für Transposase-zugängliches Chromatin" (ATAC-seq), der schnell und einfach auf eine kleine Anzahl von Zellen angewendet werden kann.

Stefhan Hellers Labor interessiert sich dafür, wie sich das Innenohr aus einer frühen Anlage bildet, der sogenannten Ohrplakode. Unser Ziel ist es, die otische Abstammungslinie von einem frühen plakodalen Vorläufer bis zur Aufspaltung in mehrere Zelltypen zu beschreiben, die das sensorische Epithel, innervierende Ganglien und akzessorische Strukturen bilden. Parallel dazu wenden wir Erkenntnisse an, die wir aus der Führung embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen entlang der otischen Abstammungslinie gewonnen haben, um Wege zur Behandlung von Hörverlust zu finden. Dies beinhaltet die Identifizierung von Mechanismen der sensorischen Haarzellregeneration bei Tieren wie Hühnern, die sich vom Hörglanz erholen, das Screening auf potenzielle regenerative Ziele, die mit Medikamenten aktiviert werden können, und die Erforschung von Umprogrammierungs- und Zelltransplantationsstrategien.

Das Labor von Lenore Herzenberg konzentriert sich auf die Genregulation im Immunsystem, die Entwicklung und Funktion von B-Zell-Subpopulationen und Anwendungen des Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierens (FACS), das sie und Len Herzenberg erfunden haben. Die jüngsten Arbeiten von Lenore konzentrieren sich auf fetale Zellen im mütterlichen Kreislauf und die HIV-Forschung.

Das Labor von KC Huang verwendet verschiedene interdisziplinäre Untersuchungsmethoden, um die Zusammenhänge zwischen der Erkennung, Bestimmung und Erhaltung der Zellform in Bakterien zu verstehen. Aktuelle Themen von Interesse sind (i) Zellwandbiosynthese, (ii) Regulation und Mechanik der Zellteilung, (iii) Membranorganisation und (iv) membranvermittelte Proteininteraktionen. Letztendlich kann die Manipulation der Zellform ein direktes Werkzeug für die Entwicklung komplexer zellulärer Verhaltensweisen sein. Aktuell interessieren uns (i) die Rolle der Zellwand bei der Bestimmung der Zellform, (ii) die Regulation und Mechanik des Zellzyklus und der Zellteilung, (iii) die räumliche und zeitliche Organisation der Membran, (iv ) die Rolle der Membran bei Transmembran-Protein-Wechselwirkungen und Ionenkanal-Gating und (v) kollektives Verhalten in Bakterien.

Das Forschungsprogramm von Daniel Jarosz konzentriert sich auf ein zentrales Paradoxon der Biologie: Organismen können über lange Zeiträume gleich bleiben, müssen sich aber auch diversifizieren, um in wechselnden Umgebungen zu überleben. Das Labor untersucht Mechanismen, die zu diesem Gleichgewicht zwischen Robustheit und Veränderung beitragen. Das Verständnis dieses Paradoxons auf molekularer Ebene bietet das Potenzial, menschliche Pathologien zu vereiteln, die von Krebs bis hin zu Neurodegeneration und multiresistenten Infektionen reichen. Das Labor verwendet multidisziplinäre Ansätze, darunter Biochemie, Genomanalysen, Hochdurchsatz-Screening und quantitative genetische Techniken. Aktuelle Untersuchungen verwenden groß angelegte Screening-Experimente, um Prionen-ähnliche phänotypische Schalthefe zu untersuchen, neue molekulare Mechanismen phänotypischer Plastizität zu identifizieren und zu untersuchen, wie Moleküle mit Umweltfluktuationen interagieren, um biologische Neuheiten zu erzeugen. Ein langfristiges Ziel ist es, Methoden zu identifizieren, um diese Mechanismen zum therapeutischen Nutzen zu manipulieren und ihre Leistungsfähigkeit zu nutzen, um synthetische Signalschaltkreise zu entwickeln.

Das Labor von Mark Kay untersucht neue Gentransfervektoren für die Gentherapie. Ein Hauptinteresse bestand darin, die grundlegenden Mechanismen der Vektortransduktion in vivo aufzuklären. Seine Arbeit an rekombinanten AAV-Vektoren spielte eine wichtige Rolle in einer klinischen Studie mit Faktor IX am Menschen, die die erste systemische Verabreichung von rAAV an den Menschen beinhaltete. Sein Labor hat auch an der Entwicklung von RNA-Interferenzvektoren für therapeutische Anwendungen bei Lebererkrankungen gearbeitet. Ihre Arbeit an ganzen Säugetieren hat wichtige mechanistische Erkenntnisse aufgedeckt, die zu neuen Arten von Studien geführt haben, um den Mechanismus der miRNA-Beladung in Säugetier-RISC, die Identifizierung neuer Klassen kleiner RNAs, die von tRNAs abgeleitet sind, und kleiner RNAs, die durch RNA erzeugt werden können -gerichtete RNA-Transkription bei Wirbeltieren.Zu den wichtigsten Errungenschaften zählen die Hemmung der Replikation des humanen Virus (HBV) bei ganzen Tieren und der Nachweis der Toxizität der shRNA-Überexpression bei Säugetieren, was zur Entdeckung geschwindigkeitsbegrenzender Prozesse für RNAi-basierte Therapeutika führte.

Der experimentelle Fokus von Paul Khavari liegt auf der Umgebung von Säugetieren, einschließlich Mausgenetik, Humangenetik, Einzelzellstudien und neuen menschlichen Gewebeplattformen. Letztere umfassen menschliche Haut, die auf immundefizienten Mäusen regeneriert wurde, sowie organotypische Konstrukte mit Epithel- und Stromazellen, die in vitro in ein architekturtreues Mesenchym eingebettet sind. Diese neuen Modelle, die wir als multifunktionale menschliche Gewebegenetik bezeichnen, ermöglichen die gleichzeitige Veränderung von bis zu 10 Allelen oder mehr und ermöglichen genetische Experimente mit einer beispiellosen Geschwindigkeit und Komplexität.

Das Labor von Seung Kim untersucht grundlegende Wege der Hormonsekretion, Glukosekontrolle und Entwicklung von Pankreasinseln mit Drosophila, Mäusen und Menschen. Seine Entwicklung empfindlicher Assays zur Glukosekontrolle bei Fliegen hat es ermöglicht, GWAS-Varianten des menschlichen Diabetes für wahrscheinliche Zielgene und Signalwege zu modellieren und neue Hormonwege zu entdecken, die die Insulinsekretion kontrollieren. Seine Arbeit an Mäusen und Menschen hat die wichtige Rolle der Menin-, Wnt-, PDGF- und NFAT-Signalgebung bei der Kontrolle der â-Zell-Proliferation während der Neugeborenenentwicklung, Schwangerschaft und Alterung identifiziert. Dr. Kims Labor kombiniert auch detaillierte Genomik-Profile mit Zellkulturmethoden, um die Entwicklung der Bauchspeicheldrüse in vitro zu dekonstruieren und zu rekonstruieren, mit dem langfristigen Ziel, verbesserte Strategien für den Ersatz oder die Regeneration von Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse zu entwickeln.

David Kingsley verwendet Genetik und Genomik, um die molekularen Grundlagen evolutionärer Veränderungen bei Wirbeltieren zu identifizieren. Ursprünglich als Mausgenetiker ausgebildet, hat Dr. Kingsley hat in jüngerer Zeit Pionierarbeit bei der Entwicklung sowohl genetischer als auch genomischer Werkzeuge für Dreistachelige Stichlinge geleistet. Durch die Kombination von genetischer Kartierung, positionellem Klonen und transgenen Rettungsexperimenten hat sein Labor spezifische Hauptgene und Mutationen identifiziert, die dramatischen morphologischen Unterschieden zwischen kürzlich entwickelten Meeres- und Süßwasserfischarten zugrunde liegen. Er leitet eine internationale Zusammenarbeit, um eine mehrstufige Sicht auf die Evolution von Wirbeltieren zu entwickeln, indem er die Sequenzierung des gesamten Genoms, die Entwicklungsbiologie und die Populationsgenetik des evolutionären Wandels bei Stichlingen kombiniert und die Lehren aus diesem System auf mehrere andere sich entwickelnde Organismen, einschließlich des Menschen, anwendet.

Das Labor von Karla Kirkegard untersucht virale, zelluläre und Wirtsfaktoren, die die Replikation, Rekombination, die Ausbreitung von Zelle zu Zelle und die Immunantwort des Wirts auf Positivstrang-RNA-Viren wie Polio kontrollieren. Ihre Arbeit hat gezeigt, dass sich defekte Versionen viraler Produkte, die oligomere Komplexe wie Kapside und Polymerasen bilden, in infizierten Zellen oft als genetische Dominanten verhalten können. Dies hat besondere Bedeutung für das antivirale Arzneimitteldesign, da potenziell arzneimittelresistente Viren normalerweise in Zellen erzeugt werden, die bereits arzneimittelempfindliche Genome beherbergen. Ihr Labor entwickelt das Prinzip des "quotdominanten Wirkstoff-Targeting" für Poliovirus, Dengue und Hepatitis C. Ihr Labor hat auch die Funktion der ersten langen, nicht-kodierenden RNA aufgeklärt, die die Anfälligkeit für Krankheitserreger kontrolliert, basierend auf einem klassischen Maus-Locus, der die Fähigkeit zur Klärung kontrolliert Theiler-Virus über Veränderungen in der Interferon-gamma-mRNA-Synthese. Sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen ist die lncRNA hochgradig polymorph, und es wird daran gearbeitet, die Konsequenzen dieser Polymorphismen für Infektions- und Entzündungskrankheiten zu bestimmen.

Das Labor von Anshul Kundaje entwickelt statistische und maschinelle Lernmethoden, um groß angelegte funktionelle Genom- und genetische Daten zu integrieren, neue Modelle der Genregulation zu erlernen und die regulatorischen Auswirkungen natürlicher und krankheitsassoziierter genetischer Varianten zu entschlüsseln. Er leitete die Computeranalyse-Bemühungen von zwei der bisher größten funktionellen Genomik-Projekte, dem Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE)-Konsortium und dem Roadmap Epigenomics Project. Sein Labor hat die größte Sammlung regulatorischer Elemente im menschlichen Genom entschlüsselt und grundlegende Einblicke in die regulatorische Dynamik und Variation bei Individuen, Zelltypen, Arten und Krankheiten gewonnen. Seine Arbeit hat dazu beigetragen, die Zelltypen und -wege zu identifizieren, die am wahrscheinlichsten von der häufigen krankheitsassoziierten SNPS betroffen sind, und zeigt beispielsweise die wichtige Rolle von Immunwegen bei der Gestaltung der Anfälligkeit für die Alzheimer-Krankheit.

Das Labor von Jin Billy Li ist in erster Linie daran interessiert, Sequenzvariationen in RNA und DNA zu identifizieren und zu verstehen. Sie konzentrieren sich insbesondere auf das RNA-Editing, bei dem genomisch kodierte Informationen in der RNA verändert werden. Ihr langfristiges Ziel ist es, Sequenzänderungen in Transkriptomen zu kartieren, ihre Mechanismen aufzuklären und ihre Funktionen bei Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Ihre Ansätze umfassen Molekulargenetik, Genomik, Computerbiologie, Evolutionsanalyse, präzises CRISPR-Engineering bei Drosophila und die Entwicklung neuer Technologien.

Kyle Loh: Embryonale Stammzellen können jede Art von menschlicher Zelle in einer Schale produzieren. Somit bieten sie die Möglichkeit, grundlegende Entwicklungsphänomene (Liniendiversifizierung, Gewebeselbstorganisation und Multilinienkompetenz), die in einem sich entwickelnden Embryo schwer zu untersuchen sind, nachzubilden und damit zu untersuchen. Diese Möglichkeit muss jedoch noch vollständig genutzt werden, da die Differenzierung von Stammzellen oft heterogene Zellmischungen ergibt, die für molekulare Analysen oder Zelltherapien schlecht geeignet sind. Wir haben ein reduktionistisches System entwickelt, um die minimalen essentiellen induktiven und repressiven Signale zu definieren, die für die Entwicklungsinduktion einer gegebenen embryonalen Linie von differenzierenden ESCs notwendig sind. Diese Bemühungen gipfelten in systematischen Roadmaps, die die extrinsischen Signale beschreiben, die menschliche ESCs über eine Reihe von sich verzweigenden Zwischenschritten in eine Vielzahl von Endoderm- und Mesoderm-Keimschichtderivaten (einschließlich Leber-, Darm-, Knochen- und Herzvorläufern) führen. Übergeordnetes Ziel ist es, die resultierenden hochreinen Populationen menschlicher Gewebevorläuferzellen für die Erforschung klassischer entwicklungsbiologischer Fragestellungen zu nutzen, wobei die Stammzelldifferenzierung als technologische Plattform genutzt wird.

Das Labor von Stephen Montgomery konzentriert sich auf die Identifizierung der molekularen Ursachen der phänotypischen Diversität, indem genetische Varianten aufgedeckt werden, die die Genexpression beeinflussen. Sie nutzen und entwickeln Techniken, die genetische und transkriptomische Daten aus der Next-Generation-Sequenzierung in Beziehung setzen, und haben Modelle entwickelt, um gemeinsam den Einfluss regulatorischer und proteinkodierender Variation zu untersuchen. Sie nutzen diese Forschung, um ihre Erkenntnisse in pathologische Proben zu übersetzen, und arbeiten daran, pfadbasierte Risikovorhersagen zu erstellen, die verschiedene Schichten zellulärer Phänotypen umfassen. Darüber hinaus arbeiten sie daran, die Krankheitsdefinition zu verbessern, indem sie die wichtigsten Zelltypen identifizieren, die am meisten für ein Merkmal verantwortlich sind.

Das Mourrain-Labor kombiniert Expertise in Neurowissenschaften, Genetik, Epigenetik, Entwicklungsbiologie und Technik, um zu verstehen, warum wir schlafen und wie Schlaf unsere synaptische Verbindung verändert, um unsere kognitive Leistung zu verbessern. Zur Aufdeckung von synaptischen Defiziten bei neurologischen (Fragiles-X-Syndrom, Autismus) und neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer, Parkinson) sowie während des normalen Alterns. Entdecken Sie Gene und Prozesse, die für die neuronale Regeneration wichtig sind, um totes oder mangelhaftes Gewebe im Gehirn einschließlich der Netzhaut zu ersetzen. Um unser Verständnis der Genregulation weiter voranzutreiben und wie nicht-kodierende SNPs für menschliche Krankheiten verantwortlich sein können.


Ergebnisse

Der DEPTH-Algorithmus zeigt, dass in einem Tumor, wenn die meisten Gene gleichzeitig hohe oder gleichzeitig niedrige Expressionsabweichungen von ihren mittleren Expressionswerten in normalen oder Tumorproben aufweisen, der Tumor einen niedrigen DEPTH-Score (niedrige ITH) aufweist. Im Gegensatz dazu weist in einem Tumor, wenn viele Gene hohe Expressionsabweichungen aufweisen, und während viele andere Gene geringe Expressionsabweichungen von ihren mittleren Expressionswerten aufweisen, der Tumor einen hohen DEPTH-Score (hohe ITH) auf. Somit repräsentiert das durch DEPTH definierte ITH in gewisser Weise die Asynchronität von Transkriptomveränderungen in Tumorzellen.

In silico Proof of Concept von DEPTH-Scores

Wir führten die In-silico-Simulation durch, um zu untersuchen, ob DEPTH-Scores tatsächlich ITH in Tumoren repräsentieren. Wir erstellten Genexpressionsprofile von 202, 40 und 1375 simulierten Tumorproben basierend auf drei Zelllinien- oder Einzelzell-RNA-Seq (scRNA-seq)-Datensätzen (Krebszelllinien 27, GSE69405 28, GSE113660 29,30). Wir definierten den Expressionswert eines Gens in einer simulierten Probe als den maximalen Expressionswert des Gens in allen Zellen, aus denen die Probe besteht. Basierend auf den Genexpressionsprofilen berechneten wir den DEPTH-Score jeder simulierten Tumorprobe. Wir beobachteten starke Korrelationen zwischen den DEPTH-Scores der simulierten Tumorproben und der Anzahl der darin enthaltenen Zelllinien oder Einzelzellen (ρ = 0,94, 0,97 bzw. 0,998) (Abb. 1a). Diese Ergebnisse zeigen, dass die heterogeneren Tumorproben (bestehend aus mehr unterschiedlichen Zellen) höhere DEPTH-Werte aufweisen. Darüber hinaus haben wir basierend auf dem Datensatz der Krebszelllinie 27 10 Sätze simulierter Tumorproben hergestellt, wobei jeder Satz simulierter Proben aus einer gleichen Anzahl (m) von Zelllinien. Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte in den simulierten Tumorproben eine starke positive Korrelation mit der Anzahl der verschiedenen Krebsarten aufweisen, aus denen die Zelllinien stammen (ρ = 0,999, 0,999, 1, 1, 0,999, 0,999, 1, 1, 0,999 und 1 für m = 62, 49, 46, 42, 35, 32, 31, 30, 29 bzw. 27) (Abb. 1b). Wir führten ein ähnliches Experiment im scRNA-seq-Datensatz GSE578721 31 durch. Ebenso beobachteten wir in den simulierten Tumorproben eine starke positive Korrelation zwischen den DEPTH-Scores und der Anzahl der verschiedenen Zelllinien, zu denen die einzelnen Zellen gehörten (ρ = 1, 1, 0,952, 0,952, 0,881, 0,976 und 0,810 für m = 44, 58, 65, 70, 73, 75 bzw. 94). Diese Ergebnisse zeigen, dass die heterogeneren Tumorproben (bestehend aus mehr verschiedenen Arten von Zelllinien oder Krebsarten) höhere DEPTH-Werte aufweisen. Zusammengenommen zeigen diese Experimente, dass DEPTH-Werte tatsächlich ITH in Tumoren repräsentieren.

ein Korrelationen zwischen DEPTH-Scores und der Anzahl von Zelllinien oder Einzelzellen in den simulierten Tumorproben. B Korrelationen zwischen DEPTH-Scores und der Anzahl der verschiedenen Krebsarten, von denen die Zelllinien abstammen, oder Zelllinien, zu denen die einzelnen Zellen in den simulierten Tumorproben gehörten. ρ, Spearman-Korrelationskoeffizient. Dies gilt auch für die folgenden Abbildungen.

Assoziation von DEPTH-Scores mit genomischer Instabilität

Genomische Instabilität führt oft zu einem erhöhten TMB 32 . Wir fanden heraus, dass TMB positiv mit DEPTH-Werten bei Pan-Krebs korreliert war (P = 1.26 × 10 −115 , ρ = 0,26) und bei 11 einzelnen Krebsarten (False Discovery Rate (FDR)-adjustierter Spearman-Korrelationstest P (FDRsp) < 0,05) (Fig. 2a). Die Krebsarten mit höherem TMB zeigten tendenziell höhere DEPTH-Werte als diejenigen mit niedrigerem TMB. Zum Beispiel SKCM, das einen signifikant höheren TMB als PRAD (P = 7,61 × 10 –116 medianer TMB: 461,5 vs. 52), zeigte höhere DEPTH-Werte als PRAD (P = 5,18 × 10 –160 medianer DEPTH-Score: 17,73 vs. 2,95). p53 spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität 33 . Wir haben das gefunden TP53-mutierte Tumoren wiesen bemerkenswert höhere DEPTH-Werte auf als TP53-Wildtyp-Tumoren bei Pan-Krebs (P = 2,21 × 10 –13 ) und bei mehreren individuellen Krebsarten, einschließlich BLCA, BRCA, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD und UCEC (FDR < 0,05) ( 2b ). Auch DNA-Mismatch-Reparatur-Defizienz (dMMR) oder Mikrosatelliten-Instabilität (MSI) ist ein weit verbreitetes Muster genomischer Instabilität 32 . Wir fanden heraus, dass MSI-hohe (MSI-H)-Tumoren signifikant höhere DEPTH-Werte aufwiesen als MSI-niedrige (MSI-L) oder Mikrosatelliten-Stabilitäts-(MSS)-Tumoren bei den Krebsarten mit einer hohen Prävalenz von MSI, einschließlich COAD, STAD und ESCA (P < 0,05) (Fig. 2c). Darüber hinaus beobachteten wir, dass drei DNA-Mismatch-Reparaturproteine ​​(PCNA, MSH6 und MSH2) bei mindestens 8 Krebsarten (zweiseitige T Test, FDR < 0,05) (Fig. 2d). Wir fanden viele DNA-Schadensreaktion-assoziierte Signalwege, die bei mindestens fünf Krebsarten durch GSEA 34 in Tumoren mit hohem DEPTH-Score stärker angereichert waren als in Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score 34 . Diese Wege umfassten DNA-Replikation, Basenexzisionsreparatur, homologe Rekombination und Fehlpaarungsreparatur ( 2e ).

ein Die positiven Korrelationen zwischen Tumormutationslast (TMB) und DEPTH-Scores bei Pan-Krebs und bei 11 einzelnen Krebsarten. Korrelationstest nach Spearman, Rate der falschen Entdeckungen (FDR) und Korrelationskoeffizient (ρ) werden gezeigt. Die FDR wurde nach der Benjamini- und Hochberg-Methode 66 geschätzt, um P-Werte in mehreren Tests. TMB, die Gesamtzahl der somatischen Mutationen im Tumor. B TP53-mutierte Tumoren weisen signifikant höhere DEPTH-Werte auf als TP53-Wildtyp-Tumoren bei Pan-Krebs und bei mehreren individuellen Krebsarten (FDR < 0,05). C MSI-hohe (MSI-H)-Tumoren haben signifikant höhere DEPTH-Werte als MSI-niedrige (MSI-L)/Mikrosatelliten-Stabilitäts-(MSS)-Tumoren bei COAD, STAD und ESCA (P 0,05). MSI, Mikrosatelliten-Instabilität. D Die positiven Assoziationen zwischen der Expression von DNA-Mismatch-Reparaturproteinen (PCNA, MSH6 und MSH2) und DEPTH-Scores innerhalb mehrerer individueller Krebsarten (zweiseitige Student’s T Test, FDR < 0,05). e Die vier mit der DNA-Schadensreaktion assoziierten Wege reicherten sich bei Tumoren mit hohem DEPTH-Score innerhalb mehrerer individueller Krebsarten, die von GSEA 34 identifiziert wurden (FDR < 0,05), stärker an als bei Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score. High-DEPTH-Score, DEPTH-Score im oberen Drittel. Low-DEPTH-Score, DEPTH-Score im unteren Drittel. Sie gelten auch für die folgenden Abbildungen. F Vergleich der DEPTH-Scores zwischen den Pathway-Gen-mutierten und Pathway-Gen-Wildtyp-Gruppen für neun DDR-Wege. DDR, Reparatur von DNA-Schäden. BER, Basenexzisionsreparatur. MMR, Mismatch-Reparatur BER, Basen-Exzisions-Reparatur. NER, Nukleotidexzisionsreparatur. FA, Fanconi-Anämie. HDR, homologieabhängige Rekombination. NHEJ, nicht-homologe DNA-Endverbindung. DR, direkte Schadensumkehr/Reparatur. TLS, Transläsions-DNA-Synthese. g Die positive Korrelation zwischen DEPTH-Scores und HRD-Scores bei Pan-Krebs und bei 11 einzelnen Krebsarten. HRD, homologe Rekombinationsdefizienz. *FDR < 0,05, **FDR < 0,01, ***FDR < 0,001, NS: nicht signifikant. Dies gilt auch für die folgenden Abbildungen.

In einer aktuellen Studie 35 haben Knijnenburg et al. identifizierten funktionell schädliche Mutationen in den Genen in neun Hauptwegen der DNA-Schadensreparatur (DDR) bei TCGA-Pankrebs. Die neun DDR-Pfade umfassten Mismatch-Reparatur, Basen-Exzisions-Reparatur, Nukleotid-Exzisions-Reparatur, Fanconi-Anämie (FA)-Weg, homologieabhängige Rekombination, nicht-homologe DNA-Endverbindung, direkte Schadensumkehr/Reparatur, Transläsions-DNA-Synthese und Schadenssensor. Basierend auf den Mutationen in den Genen in den DDR-Wegen haben wir Pan-Krebs für jeden der neun DDR-Wege in die Gruppen Pathway-Gen-Wildtyp und Pathway-Gen-mutiert eingeteilt. Der Pathway-Gen-Wildtyp zeigt keine funktionell schädlichen Mutationen in den Pathway-Genen an, und der Pathway-Gen-mutiert zeigt mindestens eine funktionell schädliche Mutation in den Pathway-Genen an. Auffallenderweise fanden wir, dass die DEPTH-Werte in der Pathway-Gen-mutierten Gruppe durchwegs für die neun DDR Pathways signifikant höher waren als in der Pathway-Gen-Wildtyp-Gruppe (P < 0,05) (Fig. 2f). Diese Ergebnisse zeigen, dass die erhöhten DEPTH-Werte mit einem DDR-Mangel verbunden sind, was wiederum die positive Assoziation von DEPTH-Werten mit genomischer Instabilität zeigt. Homologer Rekombinationsmangel (HRD) kann zu großräumiger genomischer Instabilität führen 35 . Knijnenburget al. bewerteten HRD-Scores für 9125 TCGA-Krebsproben, indem die Scores von HRD-Verlust der Heterozygotie, groß angelegten Zustandsübergängen und der Anzahl der telomerischen Allel-Ungleichgewichte kombiniert wurden. Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte eine signifikant positive Korrelation mit den HRD-Werten bei Pan-Krebs und 11 individuellen Krebsarten (FDRSp < 0,05) (Fig. 2g).

Insgesamt legen diese Daten nahe, dass der DEPTH-Spiegel eine starke positive Assoziation mit genomischer Instabilität bei Krebs hat.

Assoziationen von DEPTH-Scores mit klinischen Merkmalen

ITH ist bei Krebs mit einer schlechten Prognose verbunden 36 . Überlebensanalysen zeigten, dass höhere DEPTH-Werte mit einem schlechteren Überleben bei Pan-Krebs verbunden waren (Log-Rank-Test, P = 3,31 × 10 –38 , 2,88 × 10 –31 , 7,4 × 10 –14 , 2,32 × 10 –50 für Gesamtüberleben (OS), krankheitsspezifisches Überleben (DSS), krankheitsfreies Intervall (DFI) und Progression- freies Intervall (PFI) bzw.) (Abb. 3a). Außerdem waren bei 5 einzelnen Krebsarten (BRCA, COAD, KIRC, LUAD und UCEC) höhere DEPTH-Werte mit einem schlechteren OS verbunden (Log-Rank-Test, P < 0,05) (Ergänzende Abb. 1a). Unter ihnen sind BRCA, COAD, LUAD und KIRC weit verbreitete Krebsarten.

ein Kaplan-Meier-Überlebenskurven, die die negative Korrelation zwischen DEPTH-Scores und Überleben (OS, DSS, PFI und DFI) bei Pan-Krebs zeigen. Der Log-Rank-Test P-Werte, Hazard Ratio (HR) und 95 % Konfidenzintervall (CI) werden angezeigt. OS, Gesamtüberleben. DSS, krankheitsspezifisches Überleben. PFI, progressionsfreies Intervall. DFI, krankheitsfreies Intervall. B Vergleich der DEPTH-Scores zwischen verschiedenen Brustkrebs-Subtypen (luminal A&B, HER2-angereichert und basal-like) in TCGA- und METABRIC-Datensätzen. C DEPTH-Werte sind signifikant höher in BRAF-mutiert als in BRAF-Wildtyp-COAD und sind bei den invasiven COAD-Subtypen signifikant höher als bei den MSI- und CIN-Subtypen. CIN, Chromosomeninstabilität. D DEPTH-Scores sind in der TRU signifikant niedriger als in den PP- und PI-Subtypen von LUAD, und TRU hat ein günstiges Gesamtüberleben als die PP- und PI-Subtypen DEPTH-Scores sind signifikant niedriger in EGFR-mutiert als in EGFR-Wildtyp LUAD. TRU, terminale Beatmungseinheit. PI, proximal-entzündlich. PP, proximal-proliferativ. e Die DEPTH-Werte sind bei MSI und CIN signifikant höher als bei GS-GI-Karzinomen. GS, genomstabil. GI, Magen-Darm. HM-SNV, hypermutiertes-SNV. EBV, Epstein-Barr-Virus. F Die DEPTH-Werte steigen mit der Tumorprogression bei Pan-Krebs und bei mehreren individuellen Krebsarten. Die DEPTH-Scores liegen zwischen Spätstadium (Stadium III-IV) und Frühstadium (Stadium I-II), zwischen großer Tumorgröße (T3-4) und kleiner Tumorgröße (T1-2) und zwischen hochgradiger (G3 -4) und niedriggradige (G1-2) Tumoren wurden verglichen. Der einseitige Mann-Whitney-U-Test FDR < 0,05 zeigt die statistische Signifikanz an. g Die positiven Korrelationen von DEPTH-Scores mit den Expressionsniveaus von Zellproliferationsmarkergenen (MKI67, TOP2A, und RACGAP1) und Proliferationssignatur-Scores bei Pan-Krebs und bei mehreren individuellen Krebsarten (FDRsp < 0,05). h Die positiven Korrelationen zwischen DEPTH-Scores und Tumor-Stemness-Scores bei Pan-Krebs und bei 20 einzelnen Krebsarten (FDRsp < 0,05). Proliferationssignatur und Tumorstammness-Scores wurden durch die Single-Sample-Gen-Set-Anreicherungsanalyse 34 berechnet. FDRsp, Korrelationstest nach Spearman angepasst P-Wert (FDR). Dies gilt auch für die folgenden Abbildungen.

Darüber hinaus korrelierten wir die DEPTH-Scores mit klinischen Merkmalen innerhalb und zwischen Subtypen mehrerer vorherrschender Krebsarten, einschließlich BRCA, COAD, LUAD und gastrointestinalem (GI) Pan-Krebs. Bei BRCA verglichen wir DEPTH-Scores zwischen dreifach-negativem Brustkrebs (TNBC) und Nicht-TNBC, die basierend auf immunhistochemischen (IHC) Tests klassifiziert wurden. Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte bei TNBC signifikant höher waren als bei Nicht-TNBC (P = 8,24 × 10 –9 ). Darüber hinaus fanden wir, dass die DEPTH-Werte bei Nicht-TNBC-Tests negativ mit dem OS assoziiert waren (Log-Rank-Test, P = 0,002) aber nicht in TNBC (P = 1). Eine mögliche Erklärung ist, dass die Variation der DEPTH-Scores bei TNBC viel geringer war als bei Nicht-TNBC (2,07 vs. 3,09), sodass die Tumorproben mit hohem DEPTH-Score und mit niedrigem DEPTH-Score in TNBC nicht so klar getrennt waren wie in Nicht-TNBC. Außerdem verglichen wir DEPTH-Scores zwischen luminalen A&B (ER+), HER2-angereicherten und basal-ähnlichen Brustkrebs-Subtypen, die durch den PAM50-Assay bestimmt wurden 37 . Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte bei luminalem A&B signifikant niedriger waren als bei HER2-angereicherten oder basal-ähnlichen Subtypen (P < 0,001) und dass die DEPTH-Werte beim HER2-angereicherten im Vergleich zum basal-ähnlichen Subtyp niedriger waren (P = 0,07) (Abb. 3b). Wir beobachteten ähnliche Ergebnisse in einem anderen groß angelegten Datensatz zur Brustkrebsgenomik METABRIC 38 (Abb. 3b). Darüber hinaus zeigten die DEPTH-Scores eine signifikant negative Korrelation mit dem OS in Luminal A&B (Log-Rank-Test, P = 0,005) aber nicht im HER2-angereicherten oder basal-ähnlichen Subtyp (P >0,1). Auch hier ist die mögliche Erklärung, dass die Variation der DEPTH-Werte bei luminalem A&B viel höher war als bei HER2-angereicherten oder basal-ähnlichen Subtypen (2,86 gegenüber 1,26 oder 2,06). Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die DEPTH-Scores dem prognostischen Risiko bei Brustkrebs entsprechen, da der luminale A&B-Subtyp oft eine bessere Prognose hat als die HER2-angereicherten und basal-like/TNBC-Subtypen und der basal-like/TNBC-Subtyp die schlechteste hat Prognose bei allen Brustkrebs-Subtypen 39 . Interessanterweise fanden wir heraus, dass die DEPTH-Werte in Luminal A deutlich niedriger waren als in Luminal B-Subtyp (P = 8,31 × 10 –20 ). Dieses Ergebnis weist erneut auf den positiven Zusammenhang zwischen DEPTH-Werten und dem Brustkrebsrisiko hin, da luminale A-Karzinome die beste Prognose haben und luminale B-Karzinome tendenziell etwas schneller entwickeln und eine etwas schlechtere Prognose haben als luminale A-Karzinome 40 .

In COAD haben wir die DEPTH-Werte zwischen BRAF-mutiert und BRAF-Wildtyp-Tumoren und stellte fest, dass die BRAF-mutiertes COAD hatte signifikant höhere DEPTH-Werte als BRAF-Wildtyp COAD (P = 0,03) (Abb. 3c). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die erhöhten DEPTH-Werte angesichts des signifikanten Zusammenhangs zwischen mit schlechteren klinischen Ergebnissen verbunden sind BRAF Mutationen und schlechtere Prognose bei COAD 41 . Beim Vergleich der DEPTH-Scores zwischen drei mRNA-Subtypen (MSI, chromosomale Instabilität (CIN), invasiv) von COAD 42 fanden wir, dass der invasive Subtyp höhere DEPTH-Scores aufwies als die anderen beiden Subtypen (P < 0,05) (Fig. 3c), was wiederum einen signifikanten Zusammenhang zwischen hohen DEPTH-Werten und ungünstigen klinischen Ergebnissen bei COAD nahelegt. Darüber hinaus zeigten Überlebensanalysen, dass die erhöhten DEPTH-Werte mit schlechteren OS-Trends bei Nicht-MSI und MSI-COAD verbunden waren (Ergänzende Abb. 1b). In LUAD verglichen wir DEPTH-Scores zwischen drei transkriptionellen Subtypen: terminale Atmungseinheit (TRU), proximal-inflammatorisch (PI) und proximal-proliferativ (PP). Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte bei TRU-Tumoren am niedrigsten waren (P = 6,95 × 10 –17 , 4,96 × 10 –11 für TRU gegenüber PP bzw. TRU gegenüber PI) (Abb. 3d). Diese Ergebnisse legen einen negativen Zusammenhang zwischen DEPTH-Scores und klinischen Ergebnissen bei LUAD nahe, da TRU im Vergleich zu den anderen Subtypen prognostisch günstig ist (Abb. 3d). Die EGFR Mutation ist bei Lungenkrebs mit einer günstigeren Prognose verbunden 43,44 . Wir haben das gefunden EGFR-mutiertes LUAD hatte niedrigere DEPTH-Werte als EGFR-Wildtyp LUAD (P = 0,004) (Abb. 3d). Auch dieses Ergebnis deutet auf einen negativen Zusammenhang zwischen DEPTH-Scores und Prognose bei LUAD hin. Der GI-Pan-Krebs umfasste GI-Trakt-Adenokarzinome (GIACs), bestehend aus 79 Ösophagus-, 383 Magen-, 341 Kolon- und 118 Rektumkarzinomen, die in fünf Subtypen eingeteilt wurden: Epstein-Barr-Virus (EBV), MSI, hypermutiertes SNV (HM -SNV), CIN und genomstabil (GS) 45 . DEPTH-Scores waren bei MSI und CIN im Vergleich zu GS-Tumoren signifikant höher (P = 1,21 × 10 –8 , 9,10 × 10 –8 für MSI gegenüber GS bzw. CIN gegenüber GS) (Abb. 3e), was bestätigt, dass die durch DEPTH definierte ITH mit genomischer Instabilität assoziiert ist.

Das Tumorstadium bezieht sich auf die Reichweite des Primärtumors und die Ausdehnung der Tumorzellen im Körper. Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte im Spätstadium (Stadium III-IV) signifikant höher waren als im Frühstadium (Stadium I-II) von Tumoren bei Pan-Krebs (P = 9,09 × 10 –8 ) und bei 5 individuellen Krebsarten (LIHC, THCA, KIRC, LUAD und HNSC) (FDR < 0,05) (Abb. 3f). Darüber hinaus verglichen wir die DEPTH-Scores zwischen verschiedenen Substadien der Krebsarten mit den entsprechenden verfügbaren Daten. Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte innerhalb desselben Stadiums wahrscheinlich mit dem Fortschreiten des Substadiums bei Pan-Krebs zunahmen, z. B. Stadium Ib > Ia, IIc > IIa oder IIb und IIIb > IIIa (P < 0,001) (Ergänzende Abb. 1c) der gleiche Trend wurde bei einzelnen Krebsarten beobachtet, wie Ib > Ia bei ESCA, LUAD, LUSC und CESC, IIb > IIa bei CESC und IIIb > IIIa bei BRCA und UCEC (P < 0,05). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die DEPTH-Werte wahrscheinlich mit dem Fortschreiten des Tumors zunehmen. Wir klassifizierten Tumoren in zwei Gruppen basierend auf der Tumorgröße (T) und verglichen die DEPTH-Scores zwischen zwei Gruppen (T1-2 versus T3-4). Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte in T3-4-Tumoren signifikant höher waren als in T1-2-Tumoren bei Pan-Krebs (P = 5,20 × 10 –16 ) und bei 8 einzelnen Krebsarten (THCA, LIHC, PRAD, CHOL, KIRC, HNSC, LUSC und LUAD) (FDR < 0,05) (Abb. 3f). Der Tumorgrad gibt an, wie schnell ein Tumor wahrscheinlich wächst und sich ausbreitet, basierend auf dem Abnormalitätsgrad von Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen. Bei 9 Krebsarten mit verfügbaren Informationen zum Tumorgrad waren die DEPTH-Werte bei hochgradigen (G3-4) signifikant höher als bei niedriggradigen (G1-2) Tumoren bei 4 einzelnen Krebsarten (HNSC, KIRC, LIHC und UCEC). (FDR < 0,05) (Fig. 3f). Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die auf dem DEPTH-Score basierende ITH mit der Tumorprogression zunimmt, insbesondere bei LIHC, HNSC und KIRC.

Der Ausdruck von Ki67 (kodiert durch die MKI67 Gen) ist ein Marker für die Tumorzellproliferation 46 . Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Werte positiv korrelierten mit MKI67 Expressionsspiegel bei 13 einzelnen Krebsarten (FDRSp < 0,05) (Fig. 3g). In der Pan-Krebs-Analyse korrelierten die DEPTH-Werte signifikant positiv mit MKI67 Ausdrucksstärke (P = 4.16 × 10 −127 , ρ = 0,25). Wir untersuchten auch den Zusammenhang zwischen zwei anderen Proliferationsmarkern (TOP2A und RACGAP1 47 ) und DEPTH-Werte bei Krebs. Ebenso beobachteten wir signifikante positive Korrelationen von TOP2A und RACGAP1 Expressionsspiegel mit DEPTH-Scores bei 13 bzw. 15 Krebsarten (FDRsp < 0,05) (Abb. 3g), sowie bei Pan-Krebs (TOP2A: P = 6.98 × 10 −93 , ρ = 0.21 RACGAP1: P = 4.14 × 10 −157 , ρ = 0,28). Darüber hinaus analysierten wir die Korrelation zwischen DEPTH-Scores und einer aus 7 Markergenen zusammengesetzten Proliferationssignatur 48 und fanden heraus, dass sie eine signifikant positive Korrelation bei Pan-Krebs und bei 21 einzelnen Krebsarten (FDRsp < 0,05) (Fig. 3g). Tumorstammzell-assoziierte Merkmale („Stammheit“) sind mit ITH und schlechten Ergebnissen bei Krebs assoziiert 11 . Interessanterweise beobachteten wir signifikant positive Korrelationen zwischen DEPTH-Scores und Tumor-Stemness-Scores bei Pan-Krebs (P = 4.86 × 10 −52 , ρ = 0,16) und bei 20 einzelnen Krebsarten (FDRsp < 0,05) (Fig. 3h).

Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass der hohe DEPTH ITH-Spiegel wahrscheinlich mit schlechteren klinischen Ergebnissen bei Krebs verbunden ist. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die zeigten, dass ITH ein ungünstiger prognostischer Faktor war 11 .

Assoziationen von DEPTH-Scores mit Antitumor-Immunantwort

Viele Studien haben gezeigt, dass ITH mit einer reduzierten Antitumor-Immunantwort verbunden ist 10,11,13 . Wir analysierten die Korrelationen zwischen DEPTH-Scores und Immunsignatur-Scores bei Pan-Krebs und innerhalb von 25 einzelnen Krebsarten. Die Immunsignatur-Scores, die die Anreicherungsniveaus von Immunsignaturen in Tumoren darstellen, waren die durchschnittlichen Expressionsniveaus aller Markergene von Immunsignaturen. Insgesamt wurden fünf Antitumor-Immunsignaturen analysiert, darunter B-Zellen, CD8+-T-Zellen, humanes Leukozyten-Antigen (HLA), Interferon (IFN)-Antwort und tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs). Wie erwartet, beobachteten wir signifikante inverse Korrelationen der DEPTH-Scores mit B-Zell-, CD8+-T-Zell-, HLA-, IFN- und TIL-Scores bei Pan-Krebs (FDR < 1,0 × 10 –100 , ρ ≤ −0,25) und bei 23, 18, 17, 19 bzw. 19 individuellen Krebsarten (FDRsp < 0,05) (Fig. 4a). Darüber hinaus korrelierten die DEPTH-Scores invers mit den Verhältnissen der immunstimulatorischen Signatur (CD8+ T-Zellen) zur immuninhibitorischen Signatur (CD4+ regulatorische T-Zellen) bei Pan-Krebs (P = 5.14 × 10 −181 , ρ = −0,31) und bei 12 einzelnen Krebsarten (FDRsp < 0,05) (Fig. 4b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der hohe DEPTH ITH-Spiegel mit einer verringerten Antitumorimmunität verbunden ist, was mit der inversen Korrelation zwischen ITH und der Antitumorimmunantwort übereinstimmt 10,11,13. Da Antitumor-Immunsignaturen eine positive Assoziation mit der Überlebensprognose bei Krebs aufweisen 49,50 und DEPTH-Scores negativ damit assoziiert waren, könnte die negative Korrelation zwischen DEPTH-Scores und Überlebensprognose bei Krebs eine Folge der reduzierten Antitumor-Immunsignaturen bei High-DEPTH . sein -Tumoren punkten. Um diese Möglichkeit auszuschließen, verwendeten wir das Cox-Proportional-Hazards-Modell für die multivariate Überlebensanalyse (DEPTH-Score und TILs-Score) bei TCGA-Pankrebs und bei einzelnen Krebsarten. Wir fanden heraus, dass die erhöhten DEPTH-Werte negativ mit dem Überleben bei Pan-Krebs (OS, DSS, DFI und PFI) und drei individuellen Krebsarten (BRCA, COAD und KIRC) assoziiert waren (P < 0,02) (Ergänzende Abb. 2), im Einklang mit den Ergebnissen der vorherigen univariaten Überlebensanalyse. Dies legt nahe, dass der DEPTH-Score allein eine prognostische Kraft hat.

ein Die signifikanten inversen Korrelationen der DEPTH-Scores mit der Immunsignatur (B-Zellen, CD8+ T-Zellen, HLA, IFN und TILs)-Scores bei Pan-Krebs und vielen individuellen Krebsarten (FDRsp < 0,05). Die Scores der Immunsignaturen sind die mittleren Expressionsniveaus ihrer Markergene im Tumor. HLA, menschliches Leukozyten-Antigen. IFN, Interferon. TILs, tumorinfiltrierende Lymphozyten. B Die signifikanten inversen Korrelationen der DEPTH-Scores mit den Verhältnissen von immunstimulatorischer Signatur (CD8+ T-Zellen) zu immuninhibitorischer Signatur (CD4+ regulatorische T-Zellen) bei Pan-Krebs und bei 12 individuellen Krebsarten (FDR .)sp < 0,05). Die Verhältnisse sind die log2-transformierten Werte der mittleren Expressionsniveaus von CD8+ T-Zell-Markergenen geteilt durch die mittleren Expressionsniveaus von CD4+ regulatorischen T-Zell-Markergenen. C Die signifikanten inversen Korrelationen zwischen DEPTH-Scores und PD-L1 Expressionsspiegel bei Pan-Krebs und bei acht einzelnen Krebsarten (FDRsp < 0,05). D Die inverse Korrelation von DEPTH-Scores mit dem Ansprechen auf die Immuntherapieantwort in einer Melanom-Kohorte (Hugo-Kohorte 51) und einer Nierenkrebs-Kohorte (Miao-Kohorte 52), die die Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie erhielten. Die DEPTH-Scores wurden zwischen den ansprechenden und nicht ansprechenden Gruppen unter Verwendung des einseitigen Mann-Whitney-U-Tests verglichen. Die Immuntherapie-Ansprechraten bei Tumoren mit hohem DEPTH-Score (DEPTH-Score > Median) und bei Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score (DEPTH-Scores < Median) werden dargestellt.

Wir fanden heraus, dass die DEPTH-Scores umgekehrt mit PD-L1 Expressionsspiegel bei Pan-Krebs (P = 1.7 × 10 −38 , ρ = −0,14 und bei 8 einzelnen Krebsarten (FDRsp < 0,05) (Fig. 4c). Da sowohl die PD-L1-Expression 17 als auch die TIL-Infiltrationsspiegel 20 positive prädiktive Faktoren für das Ansprechen der Immuntherapie sind und die DEPTH-Scores mit beiden eine negative Korrelation aufweisen, erwarteten wir, dass die hohen DEPTH-Scores mit einem reduzierten Ansprechen auf die Immuntherapie verbunden sein würden. Wie erwartet, hatte in einer Melanom-Kohorte (Hugo-Kohorte 51) und einer KIRC-Kohorte (Miao-Kohorte 52), die die ICB-Immuntherapie erhielten, die ansprechende Gruppe signifikant niedrigere DEPTH-Werte als die nicht-ansprechende Gruppe (P = 0,03, 0,09 für Hugo- bzw. Miao-Kohorten) (Abb. 4d). Darüber hinaus teilten wir die Patienten auf der Grundlage der DEPTH-Scores in zwei Gruppen ein (High-DEPTH-Score (DEPTH-Scores > Median) versus Low-DEPTH-Scores (DEPTH-Scores < Median)) und verglichen die ICB-Ansprechrate zwischen beiden Gruppen. Wir fanden, dass die Gruppe mit hohem DEPTH-Score eine niedrigere Ansprechrate aufwies als die Gruppe mit niedrigem DEPTH-Score (0 % versus 38 % in der Hugo-Kohorte 37,5% versus 62,5 % in der Miao-Kohorte) (Abb. 4d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der hohe DEPTH-ITH-Spiegel wahrscheinlich mit dem verringerten Ansprechen auf die Immuntherapie bei Krebs verbunden ist.

Assoziation von DEPTH-Scores mit dem Ansprechen auf Arzneimittel bei Krebs

Basierend auf den Daten des Projekts Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) (https://www.cancerrxgene.org) fanden wir heraus, dass die DEPTH-Werte zu 180 (68 %) signifikant mit der Arzneimittelsensitivität (IC50-Werte) korrelierten 265 in Krebszelllinien getestete Verbindungen (FDRsp < 0,05) (Ergänzende Daten 1). Von den 180 Verbindungen zeigten 144 eine signifikante negative Korrelation der IC50-Werte mit DEPTH-Werten gegenüber 36, die eine signifikante positive Korrelation in den Krebszelllinien zeigten (Fig. 5a und Ergänzende Daten 1). Diese Daten legen nahe, dass das auf dem DEPTH-Score basierende ITH mit der Empfindlichkeit gegenüber einem breiten Spektrum von Krebsmedikamenten verbunden ist. Interessanterweise fanden wir viele Verbindungen, bei denen die erhöhte Empfindlichkeit mit dem hohen ITH verbunden war (Ergänzende Daten 1). Eine mögliche Erklärung ist, dass die erhöhte Expression onkogener Signaturen in Tumoren mit hohem ITH deren Sensitivität gegenüber relevanten Inhibitoren erhöht. Darüber hinaus haben wir die Korrelation zwischen DEPTH-Scores und dem Ansprechen auf Arzneimittel bei Krebspatienten anhand von TCGA-, TARGET- und drei GEO-Datensätzen (GSE1379, GSE107850 und GSE123728) analysiert. Da in der TCGA verschiedene Krebspatienten mit unterschiedlichen Medikamenten behandelt wurden und die Daten zum Medikamentenverbrauch bei vielen einzelnen Krebsarten unvollständig waren, führten wir die Analyse nur bei Pan-Krebs durch. Wenn alle Medikamente berücksichtigt wurden, hatte die ansprechende Gruppe signifikant niedrigere DEPTH-Werte als die nicht ansprechende Gruppe (P = 0,0001) (Abb. 5b). In TARGET fanden wir, dass Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) mit minimaler Resterkrankung (MRD) am Ende der zweiten Induktionstherapie signifikant höhere DEPTH-Werte aufwiesen als Patienten ohne MRD (P = 0,059) (Abb. 5c). Darüber hinaus korrelierten die DEPTH-Werte bei den Phase-II-Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) nach 8 Tagen Remissionsinduktionstherapie signifikant positiv mit den MRD-Prozentsätzen (P = 0.012, ρ = 0,25) (Abb. 5c). In GSE1379 53 wiesen Brustkrebspatientinnen, die auf Tamoxifen ansprachen, niedrigere DEPTH-Werte auf als die Patientinnen, die nicht auf Tamoxifen ansprachen (P = 0,03) (Abb. 5d). In GSE107850 54 wiesen die Patienten mit niederem Gliom, die auf die Kombinationstherapie aus Chemotherapie (Temozolomid) und Strahlentherapie ansprachen, niedrigere DEPTH-Werte auf als die Patienten, die auf eine solche Therapie nicht ansprachen (P = 0,0007) (Abb. 5d). In GSE123728 55 hatten die Melanompatienten mit günstigem Ansprechen auf Pembrolizumab niedrigere DEPTH-Werte als die Patienten mit einem ungünstigen Ansprechen auf das Arzneimittel (P = 0,088) (Abb. 5d). Insgesamt weisen diese Daten darauf hin, dass die DEPTH-Werte wahrscheinlich einen signifikanten Zusammenhang mit dem Ansprechen auf Arzneimittel bei Krebs haben.

ein Korrelationen zwischen DEPTH-Werten und Arzneimittelempfindlichkeit (IC50-Werte) von 265 Verbindungen in Krebszelllinien. Die Namen von Verbindungen mit |ρ | > 0,3 werden angezeigt. B Vergleich der DEPTH-Werte zwischen der auf Arzneimittel ansprechenden Gruppe und der nicht ansprechenden Gruppe bei TCGA-Pan-Krebs. C Vergleich der DEPTH-Scores zwischen den AML-Patienten mit MRD am Ende der zweiten Induktionstherapie und denen ohne MRD und die Korrelation zwischen den DEPTH-Scores und den MRD-Prozentsätzen nach 8 Tagen Remissionsinduktionstherapie bei den ALL-Phase-II-Patienten unter Verwendung von die TARGET-Datensätze. AML, akute myeloische Leukämie. ALL, akute lymphatische Leukämie. MRD, minimale Resterkrankung. D Die DEPTH-Werte sind bei Krebspatienten mit besserem Arzneimittelansprechen signifikant höher als bei Patienten mit schlechterem Arzneimittelansprechen, wie in drei GEO-Datensätzen gezeigt (GSE1379 53 , GSE107850 54 und GSE123728 55 ).

Molekulare Merkmale im Zusammenhang mit DEPTH-Scores

Wir identifizierten 262 Gene, deren Expressionsänderung bei mindestens fünf Krebsarten (FDR < 0,05, ρ > 0,5) (Fig. 6a und ergänzende Daten 2). Bemerkenswerterweise kodieren viele dieser Gene für menschliche Zytokine und Wachstumsfaktoren, einschließlich CCL14, CCL21, CTSG, CXCL12, FGF10, FGF7, GDF10, GREM2, IL33, KL, OGN, PDGFD, und PDGFRA. Die wesentliche Rolle von Wachstumsfaktoren und Zytokinen bei der Förderung der Proliferation und Invasion von Krebszellen ist gut bekannt 56,57 . Zu den 262 Genen gehörten auch viele Markergene der humanen Leukozyten- und Stromazelldifferenzierung, darunter ABCB1, ACKR1, CD1C, CD34, CLEC10A, GYPC, JAM2, KIT, PDGFRA, SELP, SIGLEC6, und TEK. Eine beträchtliche Anzahl von Transkriptionsfaktor-Genen befand sich auch in der 262-Gen-Liste, darunter AFF3, CBX7, FHL1, FHL5, FOXF1, HLF, LDB2, LMO3, MEF2C, MEOX1, MEOX2, NR2F1, PGR, PKNOX2, RUNX1T1, TCF21, ZBTB16, ZEB1, und ZNF208. Die Pathway-Analyse durch GSEA 34 zeigte, dass diese Gene hauptsächlich an Signalwegen von Calcium, Zelladhäsionsmolekülen, ABC-Transportern, fokaler Adhäsion, Regulation des Aktinzytoskeletts, Chemokin-Signalweg, Leukozyten-transendotheliale Migration, Signalwegen bei Krebs, Tight Junction, MAPK-Signalweg beteiligt sind, ECM-Rezeptor-Interaktion, Tyrosin-Metabolismus und Gap Junction (Abb. 6a).Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expressionsänderungen in den Genen, die an Zellwachstum und -proliferation beteiligt sind, Tumor-Stroma-Crosstalk und Immunsignaturen signifikant zum DEPTH-Score-basierten ITH beitragen können.

ein Gene, deren Expressionsänderung bei mindestens fünf Krebsarten (FDR < 0,05, ρ > 0,5) und ihre assoziierten Wege, identifiziert durch GSEA 34 (FDR < 0,05). B Die immunbezogenen Signalwege waren bei Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score im Vergleich zu Tumoren mit hohem DEPTH-Score bei mindestens fünf Krebsarten, die von GSEA 34 identifiziert wurden (FDR < 0,05), stark angereichert.

Wir fanden 15 Gene, deren somatische Mutationen bei mindestens fünf Krebsarten (FDR < 0,1) mit erhöhten DEPTH-Werten assoziiert waren. Diese Gene enthalten AHNAK2, TP53, PLEC, COL5A1, FAT3, PCDH17, FELGEN1, ASH1L, CDH23, DNAH17, DYNC2H1, MYCBP2, SLIT3, TRRAP, und USH2A. Interessanterweise fanden wir 9 der 15 Gene, deren Mutationen signifikant mit einem schlechteren OS bei Pan-Krebs assoziiert waren (Log-Rank-Test, P < 0,05) (Ergänzende Fig. 3). Dies stimmt mit früheren Beobachtungen überein, dass der hohe DEPTH ITH-Spiegel mit ungünstigen klinischen Ergebnissen bei Krebs verbunden war. Bemerkenswerterweise waren viele dieser Gene am Kalzium-Signalweg beteiligt, einschließlich AHNAK2, PLEC, COL5A1, FAT3, PCDH17, FELGEN1, CDH23, und SLIT3. Außerdem mehrere Gene, darunter TP53 und TRRAP, waren an der DDR-Regulierung beteiligt, um die genomische Stabilität zu erhalten.

Wir identifizierten 40 Proteine, deren Expressionsspiegel bei Tumoren mit hohem DEPTH-Score signifikant höher waren als bei Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score bei mindestens fünf Krebsarten (zweiseitige T Test, FDR < 0,05) (Ergänzende Daten 3). Diese Proteine ​​waren hauptsächlich an der Zellzyklusregulation (wie Cyclin_B1, Cyclin_E1, Cyclin_E2, FoxM1 und Chk2), DDR (wie PCNA, MSH6, MSH2, XRCC1, BAP1 und Ku80) und dem Stoffwechsel (wie GAPDH, ACC1 .) beteiligt , TIGAR und FASN). Außerdem gab es 33 Proteine, deren Expressionsspiegel bei Tumoren mit hohem DEPTH-Score signifikant niedriger waren als bei Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score bei mindestens fünf Krebsarten (zweiseitige T Test, FDR < 0,05) (Ergänzende Daten 3). Einige dieser Proteine ​​waren Tumorsuppressoren, einschließlich Rb, FOXO3 und p27, und viele Proteine ​​waren Kinasen und an der Regulierung der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt, wie c-KIT, AKT, EGFR, MAPK1/3, PRKCA , SRC, ACVRL1 und JNK2.

GSEA 34 identifizierte eine Reihe von KEGG-Signalwegen, die in Tumoren mit hohem DEPTH-Score und Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score (FDR < 0,05) stark angereichert waren. Die in Tumoren mit hohem DEPTH-Score stark angereicherten Signalwege bei mindestens fünf Krebsarten sind hauptsächlich mit der Reaktion auf DNA-Schäden und dem Zellzyklus verbunden, was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt, dass die hochregulierten Proteine ​​in Tumoren mit hohem DEPTH-Score mit der Zellzyklusregulation und DDR . in Verbindung stehen . Die in Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score hoch angereicherten Signalwege waren hauptsächlich immunrelevant, einschließlich Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Interaktion, Jak-STAT-Signalweg, Leukozyten-transendotheliale Migration, Chemokin-Signalweg, hämatopoetische Zelllinie und intestinales Immunnetzwerk für die IgA-Produktion (Abb. 6b ). Auch diese Ergebnisse zeigen die starke inverse Assoziation zwischen DEPTH-Scores und Antitumor-Immunsignaturen.

DEPTH-Scores über und innerhalb einzelner Krebsarten

Wir haben den Shannon-Diversity-Index (SDI) verwendet, um die Diversität des DEPTH-Scores in jeder Krebsart zu definieren, wobei ein hoher Indexwert eine sehr vielfältige ITH-Verteilung und ein niedriger Wert eine homogene ITH-Verteilung in einer Krebsart anzeigt. Unter den 25 Krebsarten hatten PAAD, CHOL, SKCM, GBM und LIHC die höchsten SDI-Werte, während OV, KICH, ESCA, THCA und UCEC die niedrigsten SDI-Werte aufwiesen (Abb. 7a). Der SDI-Score spiegelt die Variation der DEPTH-Scores innerhalb einer Krebsart wider, indem sie eine starke positive Korrelation zwischen den 25 Krebsarten aufwiesen (ρ = 0,96) (Abb. 7a). Der SDI-Score zeigt auch die Intertumorheterogenität über die Tumorproben der gleichen Krebsart an. Wir fanden, dass die SDI-Scores eine negative Korrelation mit der medianen Tumorreinheit aufwiesen (ρ = −0,42 und eine positive Korrelation mit den medianen Ploidie-Scores über die 25 Krebsarten (ρ = 0,41) (Abb. 7a). Darüber hinaus hatten die Krebsarten mit hohen SDI-Werten (> Median) einen höheren medianen TMB als die Krebsarten mit niedrigen SDI-Werten (< Median) (P = 0,06) (Abb. 7b). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Diversität der auf dem DEPTH-Score basierenden ITH-Verteilung positiv mit genomischer Instabilität, während sie negativ mit der Tumorreinheit verbunden ist. Darüber hinaus berechneten wir wie bestimmte DNA-basierte ITH-Bewertungsmethoden 5,58 die Anzahl der Klone in jeder Tumorprobe basierend auf DEPTH-Scores. Wir definierten die Klonzahl in einer Tumorprobe als das Verhältnis (gerundete Zahl) ihres DEPTH-Scores zum kleinsten DEPTH-Score bei Pan-Krebs. Bei Pan-Krebs lagen die abgeleiteten Klonzahlen zwischen 1 und 24, wobei 98% der Tumoren mindestens 3 Klone umfassten und 80% weniger als 10 Klone aufwiesen ( 7c und ergänzende Daten 4). Wir korrelierten die von DEPTH abgeleiteten Klonzahlen mit denen von zwei DNA-basierten Methoden 5,58 bei Pan-Krebs und stellten fest, dass sie signifikante Korrelationen aufwiesen (P < 0,001, ρ = 0,34 bzw. 0,13) (Fig. 7d). Innerhalb einzelner Krebsarten wiesen SKCM und TGCT relativ hohe Klonzahlen auf, während PRAD und THCA niedrige Klonzahlen aufwiesen ( 7e ), was mit den von EXPANDS 4,5 abgeleiteten Ergebnissen übereinstimmt. Die Klonzahlen in SKCM lagen zwischen 7 und 23 (Median = 19), wobei 98% der Tumoren mindestens 10 Klone umfassten, die Klonzahlen in TGCT lagen zwischen 8 und 24 (Median = 20), wobei 99% der Tumoren mehr als 10 Klone. Im Gegensatz dazu lagen die Klonzahlen in PRAD zwischen 1 und 14 (Median = 3), wobei 93% der Tumoren nicht mehr als 5 Klone hatten, die Klonzahlen in THCA lagen zwischen 1 und 10 (Median = 5), wobei 68% von Tumore mit nicht mehr als 5 Klonen. Interessanterweise hatte SKCM hohe SDI- und Klonzahlen, was darauf hindeutet, dass diese Krebsart durch hohe Intertumor- und ITH-Werte gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu zeigte THCA niedrige SDI- und Klonzahlen, was auf einen niedrigen Intertumor und ITH hindeutet. Die geringe Tumorheterogenität kann erklären, warum THCA im Allgemeinen nicht aggressiv ist und eine ausgezeichnete Prognose hat 59 .

ein Die Shannon Diversity Index (SDI)-Werte und ihre Assoziation mit der Variation der DEPTH-Scores, dem Median der Tumorreinheit und dem Median der Tumorploidie bei 25 Krebsarten. B Die Krebsarten mit hohen SDI-Werten (> Median) zeigen einen höheren Median TMB als die Krebsarten mit niedrigen SDI-Werten (< Median). C Klonzahlverteilung, abgeleitet von DEPTH über Krebsarten. D Korrelationen zwischen den von DEPTH abgeleiteten Klonzahlen und denen von EXPANDS 4, 5 und PhyloWGS 6 bei Pan-Krebs. e Klonzahlverteilung, abgeleitet von DEPTH innerhalb einzelner Krebsarten.

Assoziation von DEPTH-Scores mit Tumorreinheit

Wir fanden heraus, dass hohe DEPTH-Werte bei 15 Krebsarten (FDR .) signifikant mit einer erhöhten Tumorreinheit verbunden warensp < 0,05) (Fig. 8a). Dies stimmt mit der Erkenntnis überein, dass hohe DEPTH-Werte mit reduzierten TIL-Werten verbunden waren. Unterdessen weist dies darauf hin, dass das durch DEPTH definierte ITH in Tumorzellen stärker ausgeprägt ist als in Nicht-Tumorzellen. Um den Effekt der Tumorreinheit auf die Assoziationen von DEPTH-Scores mit Immunsignaturen und genomischer Instabilität zu korrigieren, haben wir eine logistische Regression mit zwei Prädiktoren (DEPTH-Score und Tumorreinheit) verwendet, um die fünf Antitumor-Immunsignatur-Scores und TMB bei Pan-Krebs und 25 . vorherzusagen einzelne Krebsarten. Wir beobachteten, dass der DEPTH-Score in den meisten Fällen ein signifikant negativer Prädiktor für die Antitumor-Immunsignaturen war (Abb. 8b und ergänzende Abb. 4). Unterdessen war der DEPTH-Score in den meisten Fällen ein positiver Prädiktor für TMB, wenn der β-Wert größer als 1 von 10 individuellen Krebsarten war (Abb. 8c). Bei Pan-Krebs war der DEPTH-Score ein signifikant positiver Prädiktor für TMB (TMB: β = 0,63, P = 2,66 × 10 -13 ). Außerdem zeigten die DEPTH-Scores immer noch eine signifikante inverse Korrelation mit der Überlebensprognose bei Pan-Krebs und mehreren individuellen Krebsarten nach Korrektur der Tumorreinheit ( 8d ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DEPTH-Scores unabhängig von der Tumorreinheit in einem prominenten Zusammenhang mit Immunsignaturen, genomischer Instabilität und Überlebensprognose bei Krebs stehen. Um weiter zu zeigen, dass der DEPTH-Score ein authentisches Maß für ITH ist, berechneten wir die DEPTH-Scores im TCGA- und GTEx-Normalgewebe, dessen Tumorreinheit Null sein soll. Wie erwartet wiesen die Tumoren bei Pan-Krebs und 25 einzelnen Krebsarten viel höhere DEPTH-Werte auf als normales Gewebe (P < 0,05) (Fig. 8e).

ein Die positive Korrelation zwischen DEPTH-Scores und Tumorreinheit bei 15 Krebsarten (FDRsp < 0,05). b, c Logistische Regressionsanalyse, die zeigt, dass DEPTH-Scores eine signifikant negative und eine signifikant positive Korrelation mit Antitumor-Immunsignaturen aufweisen (B) und TMB (C) in den meisten Fällen nach Korrektur der Tumorreinheit. D Cox-Proportional-Hazards-Regressionsanalyse, die zeigt, dass die DEPTH-Werte nach Korrektur der Tumorreinheit eine signifikante inverse Korrelation mit der Überlebensprognose bei Pan-Krebs und bei mehreren individuellen Krebsarten aufweisen. Die Hazard Ratio für den hohen DEPTH-Score (oberes Drittel) wurde relativ zum Hazard für die Personen im niedrigen DEPTH-Score (unteres Drittel) berechnet und sein 95 %-KI ist als Whiskers dargestellt. e Vergleich der DEPTH-Werte zwischen Tumoren und normalem Gewebe.

Zusammenhang zwischen verschiedenen ITH-Maßnahmen

Wir untersuchten die Korrelation zwischen ITH-Scores, die durch sieben verschiedene Methoden (DEPTH, tITH 24, sITH 26, PhyloWGS 6, EXPANDS 4,5, ABSOLUTE 2 und MATH 3) bei TCGA-Pankrebs und einzelnen Krebsarten definiert wurden. Wie erwartet waren 19 der 21 paarweisen Korrelationen beim Pan-Krebs signifikant positiv (P < 0,01, 0,09 ρ ≤ 0,55) (Abb. 9). Die stärkste Korrelation wurde zwischen DEPTH und tITH beobachtet (ρ = 0,55), und der nächste lag zwischen DEPTH und sITH (ρ = 0,50), was darauf hindeutet, dass die DEPTH-Scores eine stärkere Korrelation mit den anderen mRNA-basierten ITH-Scores aufweisen als mit den DNA-basierten ITH-Scores. Überraschenderweise war die Korrelation zwischen DEPTH und sITH stärker als die zwischen tITH und sITH (ρ = 0,30), obwohl sowohl tITH als auch sITH auf der Grundlage des Jensen-Shannon-Divergenzmaßes 24,26 entwickelt wurden. Unter den DNA-basierten Methoden hatten PhyloWGS und ABSOLUTE die stärkste Korrelation (ρ = 0,30), und die Korrelationen von PhyloWGS mit EXPANDS und MATH waren ebenfalls stärker als die zwischen EXPANDS, ABSOLUTE und MATH. Ein möglicher Grund dafür ist, dass PhyloWGS die ITH sowohl auf Mutationen als auch auf CNAs in Tumorzellen bewertet, um sie sowohl mit mutationsbasierten (EXPANDS und MATH) als auch mit CNAs-basierten (ABSOLUTE) Methoden korrelativ zu machen.

Die paarweisen Korrelationen zwischen den ITH-Werten, die durch sieben verschiedene Methoden (DEPTH, tITH 24, sITH 26, PhyloWGS 6, EXPANDS 4, 5, ABSOLUTE 2 und MATH 3) abgeleitet wurden, werden bei Pan-Krebs gezeigt.

Innerhalb der einzelnen Krebsarten waren die Korrelationen zwischen den aus den verschiedenen Methoden abgeleiteten ITH-Scores überwiegend positiv und nur wenige negativ (Ergänzende Daten 5). Die DEPTH-Werte korrelierten positiv mit den ITH-Werten von tITH, sITH, PhyloWGS, EXPANDS, MATH und ABSOLUTE bei 25, 15, 6, 3, 4 bzwsp < 0,05). DEPTH zeigte bei fast allen 25 Krebsarten die stärkste Korrelation mit tITH (0,53 ≤ ρ ≤ 0,90) und zeigte bei 15 Krebsarten eine starke Korrelation mit sITH (0,28 ≤ ρ 0,71). Die Korrelation zwischen tITH und sITH war bei 9 Krebsarten signifikant (0,16 ≤ ρ ≤ 0,61), dürfte aber bei fast allen analysierten individuellen Krebsarten schwächer ausfallen als zwischen DEPTH und sITH (Ergänzende Daten 5). Die anderen signifikanten Korrelationen bei mehr als 10 Krebsarten waren die zwischen den ITH-Scores der DNA-basierten Methoden, einschließlich MATH vs. ABSOLUTE, MATH vs. PhyloWGS und ABSOLUTE vs. PhyloWGS. Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die ITH-Messungen innerhalb der DNA- oder mRNA-Ebene stärker korreliert sind als die zwischen DNA- und mRNA-Ebenen.

Validierung von DEPTH-Scores in anderen Datensätzen

Um die Zuverlässigkeit und Robustheit des DEPTH-Algorithmus zu demonstrieren, haben wir die Korrelationen von DEPTH-Scores mit klinischen Merkmalen und Immunsignaturen in 42 anderen Genexpressionsprofil-Datensätzen analysiert, die von verschiedenen Technologien und Plattformen generiert wurden und eine unterschiedliche Anzahl von Genen enthalten. In 37, 33, 37, 27, 34 Datensätzen zeigten die DEPTH-Scores signifikante positive Korrelationen mit den Stemness-Scores, MKI67, TOP2A, und RACGAP1 Expressionsniveaus bzw. Proliferationssignatur-Scores (Spearman-Korrelationstest, P < 0,05) (Fig. 10a). In 22 Datensätzen korrelierten die DEPTH-Werte signifikant mit mindestens drei der fünf Immunsignaturen und in 17 Datensätzen korrelierten die DEPTH-Werte signifikant mit den Verhältnissen der regulatorischen CD8+/CD4+-T-Zellen (Spearmans Korrelationstest, P < 0,05) (Fig. 10b). In drei groß angelegten Datensätzen, darunter Brustkrebsdatensätze E-MTAB-6703 (Stichprobengröße n = 2302) und METABRIC (n = 1980) und Magenkrebs-Datensatz ACRG (n = 300), zeigten die Tumoren mit hohem DEPTH-Score ein signifikant schlechteres OS als die Tumoren mit niedrigem DEPTH-Score (Log-Rank-Test, P < 0,05) (Fig. 10c). Darüber hinaus waren in 11 Datensätzen mit Phänotypdaten von Tumorgrad die DEPTH-Werte in 7 Datensätzen bei hochgradigen Tumoren bemerkenswert höher als bei niedriggradigen Tumoren (P < 1,0 × 10 –4 ) (Fig. 10d).

ein DEPTH-Scores korrelieren signifikant positiv mit Stemness-Scores, den Expressionsniveaus von Proliferationsmarkergenen (MKI67, TOP2A, und RACGAP1) und Verbreitungssignaturwerte in einer Fülle von Validierungsdatensätzen. B DEPTH-Scores weisen signifikante inverse Korrelationen mit mindestens drei der fünf Immunsignaturen in 22 Validierungsdatensätzen und signifikante inverse Korrelationen mit den Verhältnissen von CD8+/CD4+ regulatorischen T-Zellen in 17 Validierungsdatensätzen auf (Spearman’s Korrelationstest, P < 0,05). C Kaplan-Meier-Überlebenskurven, die die negative Korrelation zwischen DEPTH-Scores und dem Gesamtüberleben in mehreren großen Validierungsdatensätzen zeigen. Der Log-Rank-Test P-Werte, HR und 95 % CI werden angezeigt. D Die hochgradigen (G3-4) Tumoren weisen in mehreren Validierungsdatensätzen (einseitiger Mann-Whitney-U-Test, P < 0,001). e Die AML-Patienten mit zytogenetischen Anomalien (t(911)(p22q23), t(1011)(p11.2q23), del5q, Trisomie 21 oder MLL1 Translokation) haben signifikant höhere DEPTH-Werte als solche ohne solche Anomalien. F Die DEPTH-Scores zeigen eine positive Korrelation mit den prozentualen Anteilen der leukämischen Knochenmarkblasten von AML-Patienten. Die DEPTH-Werte sind bei AML-Patienten im undifferenzierten Stadium (M0) höher als im differenzierten Stadium (M1-7) und bei AML-Patienten mit anderen Rezidivstellen höher als bei ohne andere Rezidivstellen. g Die Hochrisiko-Krebspatienten haben bei AML und NBL höhere DEPTH-Werte als Niedrigrisiko-Krebspatienten. NBL, Neuroblastom. h Kaplan-Meier-Überlebenskurven, die die negative Korrelation zwischen den DEPTH-Scores und dem Gesamtüberleben bei Pan-Krebs zeigen. Die Ergebnisse in (eh) wurden durch Analyse des TARGET-Datensatzes erhalten.

In TARGET die AML-Patienten mit bestimmten zytogenetischen Anomalien, wie t(911)(p22q23), t(1011)(p11.2q23), del5q, Trisomie 21 und MLL1 Translokation, hatten signifikant höhere DEPTH-Werte als die AML-Patienten ohne solche Anomalien (P < 0,05) (Fig. 10e), was die positive Korrelation zwischen DEPTH-Werten und chromosomaler/genomischer Instabilität bestätigt. Darüber hinaus korrelierten die DEPTH-Werte signifikant positiv mit den prozentualen Anteilen der Knochenmark-Leukämie-Blasten von AML-Patienten (P = 0.003, ρ = 0,27) (Abb. 10f). Die DEPTH-Werte waren bei den AML-Patienten im undifferenzierten Stadium (M0) höher als bei denen im differenzierten Stadium (M1-7) und bei den AML-Patienten mit anderen Rezidivorten höher als bei denen ohne andere Rezidivorte (P < 0,05) (Fig. 10f). Darüber hinaus zeigten die AML-Patienten mit hohem Risiko höhere DEPTH-Werte als die AML-Patienten mit niedrigem Risiko, und wir beobachteten ein ähnliches Ergebnis bei Patienten mit Neuroblastom (NBL) (P = 0,04, 0,003 für AML bzw. NBL) (Abb. 10g). Die Pan-Krebs-Analyse zeigte, dass die hohen DEPTH-Werte mit einem schlechteren OS verbunden waren (Log-Rank-Test, P = 0,014) (Abb. 10h). Diese Ergebnisse bestätigten die positive Korrelation zwischen DEPTH-Werten und dem klinischen Krebsrisiko.

Insgesamt stimmten diese Ergebnisse aus Validierungsdatensätzen mit den Ergebnissen in TCGA-Datensätzen überein und demonstrieren die Zuverlässigkeit und Robustheit des DEPTH-Algorithmus bei der Bewertung des ITH-Niveaus.


Modelle der ersten Generation für den Proteomic Code

Die Modelle der ersten Generation (bis 2006) des neuartigen Proteomic Code basieren auf einer perfekten Codon-Komplementaritätscodierung von interagierenden Aminosäurepaaren.

Mekler

Mekler beschrieb eine Idee von Sense- und komplementären Peptiden, die in der Lage sein könnten, spezifisch zu interagieren, vermittelt durch spezifische durch den Raum hindurch, paarweise Wechselwirkungen zwischen Aminosäureresten [20]. Er schlug vor, dass Aminosäuren von spezifisch wechselwirkenden Proteinen in ihren spezifisch wechselwirkenden Domänen aus zwei parallelen Sequenzen von Aminosäurepaaren bestehen, die räumlich komplementär zueinander sind, ähnlich den Watson-Crick-Basenpaaren in Nukleinsäuren. Die Protein/Nukleinsäure-Analogie in seiner Theorie wurde aufrechterhalten und er schlug vor, dass diese räumlich komplementären Aminosäuren durch revers-komplementäre Codons kodiert werden (translationales Lesen in 5'→3'-Richtung).

Es ist möglich, 64 (die Anzahl der verschiedenen Codons, einschließlich der drei Stoppcodons) aller möglichen mutmaßlichen Aminosäurepaare (20 × 20/2 = 200) in drei sich nicht überlappende Gruppen aufzuteilen [21].

Ich wurde auch von der Komplementarität von Nukleinsäuren inspiriert und entwickelte eine Theorie der komplementären Kodierung spezifisch interagierender Aminosäuren [9–11]. Ich hatte keine Kenntnis von den Veröffentlichungen von Mekler oder Idlis (veröffentlicht in zwei russischen Zeitungen). Ich war auch davon überzeugt, dass Aminosäurepaare, die durch komplementäre Codons kodiert werden (entweder in der gleichen 5'→3'/5'→3'- oder entgegengesetzten 5'→3'/3'→5'-Orientierung) etwas Besonderes sind und schlug vor, dass diese Aminosäurepaare könnten für spezifische intra- und intermolekulare Peptidwechselwirkungen verantwortlich sein.

Ich habe eine Methode zur paarweisen Computersuche von Proteinsequenzen nach komplementären Aminosäuren entwickelt und festgestellt, dass diese speziell kodierten Aminosäurepaare in Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie miteinander interagieren, statistisch überrepräsentiert sind.Außerdem konnte ich kurze komplementäre Aminosäuresequenzen innerhalb derselben Proteinsequenzen finden und schlussfolgerten, dass diese eine Rolle bei der Bildung oder Stabilisierung von 3D-Proteinstrukturen spielen könnten (Abbildung 3). Molecular Modeling zeigte die Größenkompatibilität komplementärer Aminosäuren und dass sie 5–7 Atome lange Brücken zwischen den Alpha-C-Atomen von Aminosäuren bilden könnten. Es war eine ziemlich ehrgeizige Theorie zu einer Zeit, als die Antisense-DNA-Sequenzen als Nonsense bezeichnet wurden, und es war eine noch ehrgeizigere Methode, als Computer mit Lochkarten programmiert wurden und die Proteindatenbanken auf Dayhoffs drei Bänden von Proteinsequenzen basierten [8] .

Ursprung des Proteomic Codes. Threonin (Thr) wird von 4 verschiedenen synonymen Codons kodiert. Komplementäre Tripletts kodieren verschiedene Aminosäuren parallel (3'→5') und antiparallel (5'→3') Ablesungen. Aminosäuren, die von symmetrischen Codons kodiert werden, werden als "primäre" und andere als "sekundäre" Antisense-Aminosäuren bezeichnet (modifiziert nach [9].

Blalock-Smith

Diese Theorie heißt die molekulare Erkennungstheorie Synonyme sind Hydropathie-Komplementarität oder Antikomplementaritätstheorie. Es basiert auf der Beobachtung [22], dass Codons für hydrophile und hydrophobe Aminosäuren im Allgemeinen durch Codons für hydrophobe bzw. hydrophile Aminosäuren ergänzt werden. Dies ist selbst dann der Fall, wenn die komplementären Codons in 3'→5"'-Richtung gelesen werden. Durch komplementäre RNAs spezifizierte Peptide binden mit Spezifität und hoher Affinität aneinander [23, 24]. Die Theorie erwies sich als sehr fruchtbar in Neuroendokrine und Immunforschung [25, 26].

Eine sehr wichtige Beobachtung ist, dass Antikörper gegen komplementäre Antikörper auch spezifisch miteinander interagieren. Bost und Blalock [27] synthetisierten zwei komplementäre Oligopeptide (d. h. Peptide, die von komplementären mRNAs in entgegengesetzte Richtungen übersetzt wurden). Die beiden Peptide Leu-Glu-Arg-Ile-Leu-Leu (LERILL) und sein komplementäres Peptid Glu-Leu-Cys-Asp-Asp-Asp (ELCDDD) erkannten einander im Radioimmunoassay spezifisch. Gegen beide Peptide wurden Antikörper hergestellt. Jeder Antikörper erkannte spezifisch sein eigenes Antigen. Unter Verwendung von Radioimmunoassays wurde gezeigt, dass Anti-ELCDDD-Antikörper mit 125 I-markierten Anti-LERILL-Antikörpern interagieren, jedoch nicht mit 125 I-markierten Kontrollantikörpern. Noch wichtiger war, dass die Wechselwirkung der beiden Antikörper unter Verwendung eines der beiden Peptidantigene blockiert werden konnte, jedoch nicht durch Kontrollpeptide. Darüber hinaus konnte die 125 I-markierte anti-LERILL-Bindung an LERILL mit anti-ELCDDD-Antikörper blockiert werden und umgekehrt. Daraus wurde geschlossen, dass die Antikörper/Antikörper-Bindung an oder in der Nähe der Antigen-Kombinationsstelle auftrat, was zeigt, dass dies eine idiotypische/anti-idiotypische Wechselwirkung war.

Dieses Experiment zeigte deutlich die Existenz (und Funktion) eines komplizierten Netzwerks komplementärer Peptide und Wechselwirkungen. Es werden große Anstrengungen unternommen, um dieses Netzwerk zu beherrschen und es für die Proteinreinigung, Bindungsassays, medizinische Diagnose und Therapie zu nutzen.

Kürzlich hat Blalock [28] betont, dass Nukleinsäuren Aminosäuresequenzen im Hinblick auf Hydropathie binär kodieren und dass das genaue Muster von polaren und unpolaren Aminosäuren und nicht die genaue Identität bestimmter R-Gruppen ein wichtiger ist Treiber für Proteinform und Wechselwirkungen. Perfekte Codon-Komplementarität hinter der Codierung interagierender Aminosäuren ist für seine Theorie keine zwingende Voraussetzung mehr.

Aminosäuren, die aus komplementären Codons übersetzt wurden, zeigen fast immer eine entgegengesetzte Hydropathie (Abbildung 4). Die Gültigkeit von Hydrophob-Hydrophyl-Wechselwirkungen bleibt jedoch unbeantwortet.

Hydropathieprofil eines Proteins. Eine künstlich konstruierte Nukleinsäuresequenz wurde randomisiert und in die vier möglichen Richtungen (D, Direct RC, Reverse Complementary R, ​​Reverse C, Komplementär) translatiert. Die D-Sequenz wurde entworfen, um gleiche Zahlen der 20 Aminosäuren zu enthalten.

Wurzel-Bernstein

Eine weitere Hypothese zur Aminosäurepaarung wurde von Root-Bernstein vorgestellt [29, 30]. Er konzentrierte sich darauf, ob es möglich sei, Aminosäurepaare aufzubauen, die Standardkriterien für die Bindung erfüllen. Er kam zu dem Schluss, dass dies nur in 26 Fällen (von 210 Paaren) möglich war. Von diesen 26 wurde gefunden, dass 14 genetisch durch perfekt komplementäre Codons kodiert wurden (in der gleichen Orientierung gelesen (5' → 3'/3' → 5'), während in 12 Fällen eine Fehlpaarung an der Wobble-Position der Paarungscodons gefunden wurde.

Siemion

Es besteht ein regelmäßiger Zusammenhang zwischen Aktivierungsenergien (gemessen als Enthalpien (Δh ++ ) und Entropien (ΔS ++ ) der Aktivierung für die Reaktion von 18 n"-Hydroxysuccinimidester von N-geschützten proteinartigen Aminosäuren mit P-Anisidin) und den genetischen Code [31–33]. Diese periodische Änderung der Aminosäurereaktivität innerhalb des genetischen Codes veranlasste ihn, eine Peptid-Anti-Peptid-Paarung vorzuschlagen. Dies ist der Hypothese von Root-Bernstein ziemlich ähnlich.

Müller

Die praktische Anwendung ist der beste Test einer Theorie. Technologien auf Basis wechselwirkender Proteine ​​haben einen bedeutenden Markt in verschiedenen Bereichen der Biochemie sowie in der medizinischen Diagnostik und Therapie. Das 2001 gegründete Genetic Therapies Centre (GTC) am Imperial College (London, UK) mit maßgeblicher finanzieller Unterstützung eines japanischen Unternehmens, der Mitsubishi Chemical Corporation, und der britischen Wohltätigkeitsorganisation Wolfson Foundation) ist eines der ersten akademischen Zentren die offen in Proteomic Code-basierte Technologien investieren. Mit der klaren Absicht, dass ihre Wissenschaft "auf dem Markt verwendet wird", leistet Andrew Miller, der erste Direktor von GTC und Mitbegründer des ersten Spin-off-Unternehmens Proteom Ltd., wichtige Beiträge auf diesem Gebiet [34–38] .

Miller und seine Kollegen stellten jedoch fest, dass die Aminosäurepaare, die durch perfekt komplementäre Codons bereitgestellt werden, nicht immer die besten Paare sind und Abweichungen vom ursprünglichen Design die Qualität einer Protein-Protein-Interaktion manchmal erheblich verbesserten. Daher ist die derzeitige Ansicht von Miller, dass es „strategische Paare von Aminosäureresten gibt, die Teil eines neuen, durch den Raum verlaufenden zweidimensionalen Aminosäure-Interaktionscodes (Proteomischer Code) sind. Der proteomische Code und Derivate davon könnten ein neues molekulares Erkennungscode, der die 1D-Welt der Gene mit der 3D-Welt der Proteinstruktur und -funktion in Beziehung setzt. ".

Der Proteomische Code und die 3D-Struktur von Proteinen

Es ist allgemein anerkannt, dass die 3D-Strukturen von Proteinen eine bedeutende Rolle bei ihren spezifischen Interaktionen und Funktionen spielen. Das Gegenteil ist weniger offensichtlich, nämlich dass spezifische und individuelle Aminosäurepaare oder Sequenzen dieser Paare die Faltung von Proteinen bestimmen könnten. Die Komplementarität auf Aminosäureebene in den Proteinen und die entsprechende interne Komplementarität innerhalb der kodierenden mRNA (der Proteomische Code) werfen die faszinierende Möglichkeit auf, dass einige Proteinfaltungsinformationen in den Nukleinsäuren vorhanden sind (zusätzlich zu oder innerhalb der bekannten und redundanten genetischer Code). Reale Proteinsequenzen zeigen eine höhere Häufigkeit komplementär kodierter Aminosäuren als Translationen randomisierter Nukleotidsequenzen. [9–11]. Die interne Aminosäurekomplementarität ermöglicht es den Polypeptiden, die durch komplementäre Codons kodiert werden, die Sekundärstrukturmuster des translatierten Strangs (mRNA) beizubehalten. Somit könnte die genetische Code-Redundanz mit dem evolutionären Druck in Verbindung gebracht werden, Proteinstrukturinformationen in komplementären Codons und Nukleinsäure-Subsequenzen zu behalten [39–44].


Impfstoffe gegen ganze Krankheitserreger

Herkömmliche Impfstoffe bestehen aus ganzen Krankheitserregern, die abgetötet oder so abgeschwächt wurden, dass sie keine Krankheiten verursachen können. Solche Impfstoffe mit ganzen Krankheitserregern können starke schützende Immunantworten hervorrufen. Viele der heute im klinischen Einsatz befindlichen Impfstoffe fallen in diese Kategorie. Allerdings kann nicht jede krankheitserregende Mikrobe mit einem Impfstoff gegen ganze Krankheitserreger wirksam bekämpft werden.

Wissenschaftler beschrieben erstmals im 19. Jahrhundert die Fähigkeit von inaktivierten oder abgetöteten Mikroben, Immunität zu induzieren. Dies führte zur Entwicklung von inaktivierte Impfstoffe, die durch Abtöten des Erregers mit Chemikalien, Hitze oder Strahlung entstehen. Ein aktuelles Beispiel ist Havrix, ein inaktivierter Impfstoff gegen das Hepatitis-A-Virus, der von NIAID und Partnern entwickelt und 1995 in den USA zugelassen wurde.

Fortschritte bei Gewebekulturtechniken in den 1950er Jahren ermöglichten die Entwicklung von Lebendimpfstoffe, die eine im Labor abgeschwächte Version der lebenden Mikrobe enthalten. Der Impfstoff gegen Masern, Mumps und Röteln (MMR) ist ein Beispiel. Diese Impfstoffe rufen starke Immunreaktionen hervor, die nach nur einer oder zwei Dosen eine lebenslange Immunität verleihen können. Abgeschwächte Lebendimpfstoffe sind für bestimmte Viren relativ einfach herzustellen, für komplexere Krankheitserreger wie Bakterien und Parasiten jedoch schwer herzustellen.

Moderne gentechnologische Techniken haben die Erzeugung chimärer Viren ermöglicht, die genetische Informationen von verschiedenen Elternviren enthalten und biologische Eigenschaften verschiedener Elternviren aufweisen. Ein von NIAID entwickeltes live-abgeschwächtes chimärer Impfstoff bestehend aus einem Dengue-Virus-Rückgrat mit Zika-Virus-Oberflächenproteinen wird im Frühstadium am Menschen getestet.


Gefahren des COVID-19-Impfstoffs

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sputnik_V_Vaccine_Representation.jpg

Von ROMEO F. QUIJANO, M.D.
Professor (im Ruhestand)
Institut für Pharmakologie und Toxikologie
College of Medicine, Universität der Philippinen Manila

Der Impfstoff COVID-19 (SARS-Cov-2) ist mit Gefahren verbunden. Dies sollte die offensichtliche, rationale Schlussfolgerung eines jeden sein, der die verfügbaren wissenschaftlichen und anderen relevanten Informationen darüber objektiv studieren möchte. Es gibt viele sachliche Gefahrensignale, die leicht erkennbar sind.

Während des SARS-1-Ausbruchs 2002-2003 dauerte es etwa 20 Monate, bis ein Impfstoff in klinischen Studien am Menschen getestet werden konnte, obwohl die Sicherheitsbedenken immer noch ungelöst waren. Dies war bereits viel zu schnell im Vergleich zu der üblichen Zeit, die benötigt wird, um präklinische Studien oder Tierstudien zufriedenstellend abzuschließen, bevor ethische Experimente am Menschen oder klinische Studien begonnen werden können. Für Covid-19-Impfstoffkandidaten wurden jedoch kaum fünf Monate nach dem Auftreten von SARS-Cov-2 klinische Studien begonnen, wobei die normalerweise erforderlichen präklinischen Studien umgangen wurden und die schwerwiegenden Sicherheitsbedenken bei dem vorherigen Versuch, einen SARS-1-Impfstoff zu überstürzen ( die schließlich verschrottet wurde).

Ein wichtiges Sicherheitsproblem bei der Entwicklung eines Impfstoffs besteht darin, die Gefahr zu umgehen, dass der Impfstoff die Pathogenität des Virus tatsächlich „verstärkt“ oder es möglicherweise aufgrund einer antikörperabhängigen Verstärkung (ADE) aggressiver macht, als dies bei früheren Fällen der Fall war Studien zu Testimpfstoffen bei Tieren. Sollte dies in einer großen Studie am Menschen passieren, könnte das Ergebnis katastrophal sein. (1,2,3,4) Diese schwerwiegende Nebenwirkung kann möglicherweise nicht einmal durch eine klinische Prüfung festgestellt werden, insbesondere bei stark verzerrten klinischen Prüfungen, die mit Interessenkonflikten zwischen Impfstoffherstellern behaftet sind. Selbst wenn ein schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis festgestellt wird, wird dieses in der Regel unter den Teppich gekehrt.

Zum Beispiel zeigten erste klinische Studienergebnisse für den COVID-19-Impfstoff von Moderna Berichten zufolge, dass drei der 15 menschlichen Versuchspersonen in der Hochdosisgruppe unter schweren und medizinisch signifikanten Symptomen litten. Moderna kam jedoch zu dem Schluss, dass der Impfstoff „im Allgemeinen sicher und gut verträglich“ sei, worüber die von Unternehmen dominierten Medien pflichtbewusst berichteten, um die wahre Gefahr des Impfstoffs zu vertuschen.(5,6,7,8) In einem dreisten Akt von unethisches Verhalten hat Moderna sogar einen freiwilligen Impfstoffempfänger, Ian Haydon, eingesetzt, um in vielen Medienauftritten für den experimentellen COVID-19-Impfstoff von Moderna zu werben. Moderna ermutigte Haydon, im Fernsehen aufzutreten, um die Öffentlichkeit und ihre Aktionäre zu täuschen. Weniger als 12 Stunden nach der Impfung litt Haydon unter Muskelschmerzen, Erbrechen, Fieber von 103,2 Grad und hatte das Bewusstsein verloren.(9) Der Impfstoff wurde von Dr. Anthony Fauci, Direktor des US-amerikanischen National Institute of Allergy and Infectious Diseases, und von Bill Gates finanziert, nutzte eine experimentelle mRNA-Technologie, die angeblich einen schnellen Einsatz ermöglichen würde, und verzichtete auf die üblichen präklinischen und Tierstudien.

Die Tatsache, dass eine völlig neue RNA-Impfstofftechnologie, die noch nie zuvor beim Menschen eingesetzt wurde, ein Gefahrensignal ist, das nicht ignoriert werden sollte. Mehrere der US-Kandidaten (Moderna, Pfizer/BioNTech und Arcturus Therapeutics) verwenden diese noch nie zuvor zugelassene Technologie. Exogene mRNA ist von Natur aus immunstimulatorisch, und diese Eigenschaft der mRNA könnte nützlich oder schädlich sein. Es kann eine adjuvante Aktivität bereitstellen und es kann die Antigenexpression hemmen und die Immunantwort negativ beeinflussen. Die paradoxen Auswirkungen der angeborenen Immunabtastung auf verschiedene Formate von mRNA-Impfstoffen sind unvollständig verstanden. Mögliche Sicherheitsbedenken umfassen lokale und systemische Entzündungen, Bioverteilung und Persistenz des exprimierten Immunogens, Stimulation autoreaktiver Antikörper und potenzielle toxische Wirkungen nicht-nativer Nukleotide und Komponenten des Verabreichungssystems. Ein mRNA-basierter Impfstoff könnte auch starke Typ-I-Interferon-Reaktionen induzieren, die nicht nur mit Entzündungen, sondern möglicherweise auch mit Autoimmunität in Verbindung gebracht wurden. Ein weiteres potenzielles Sicherheitsproblem könnte von der extrazellulären RNA herrühren, die nachweislich die Permeabilität dicht gepackter Endothelzellen erhöht und die Blutgerinnung und pathologische Thrombusbildung fördern kann. (10)

Eine weitere Gefahr von mRNA-Impfstoffen ist der Einsatz biotechnologischer „Trägersysteme“ mit Lipid-Nanopartikeln (LNPs). LNPs „verkapseln die mRNA-Konstrukte, um sie vor dem Abbau zu schützen und die zelluläre Aufnahme zu fördern“ und kurbeln zusätzlich das Immunsystem an. Die LNP-Formulierungen in den drei mRNA-Covid-19-Impfstoffen sind ebenfalls „PEGyliert“, was bedeutet, dass die Impfstoff-Nanopartikel
beschichtet mit einem synthetischen, biologisch nicht abbaubaren und zunehmend umstrittenen Polymer namens Polyethylenglykol (PEG). LNPs können zu einem oder mehreren der folgenden Faktoren beitragen: Immunreaktionen, Infusionsreaktionen, Komplementreaktionen, Opsonationsreaktionen, Antikörperreaktionen oder Reaktionen auf das PEG von einigen Lipiden oder PEG, die anderweitig mit dem LNP assoziiert sind, sowie Nebenwirkungen innerhalb der Leberwege oder Abbau der mRNA oder des LNP, die alle zu erheblichen unerwünschten Ereignissen führen können. Darüber hinaus kann PEG bei Nachkommen auch schwere neuropsychiatrische Symptome wie Stimmungsschwankungen, Wut, Phobien und Paranoia hervorrufen. Forscher, die einst davon ausgingen, dass das Polymer weitgehend „inert“ sei, stellen nun seine Biokompatibilität in Frage und warnen vor der Förderung des Tumorwachstums und der nachteiligen Immunantwort durch PEGylierte Partikel, die eine „wahrscheinlich unterdiagnostizierte“ lebensbedrohliche Anaphylaxie einschließt. Dies ist ein erhebliches Problem, da eine US-Studie aus dem Jahr 2016 nachweisbare und manchmal hohe Konzentrationen von Anti-PEG-Antikörpern (einschließlich IgM-Antikörpern der ersten Verteidigungslinie und IgG-Antikörpern im späteren Stadium) in etwa 72 % der heutigen menschlichen Proben und etwa 56 % der historischen Exemplare aus den 1970er bis 1990er Jahren. Auch die Hersteller von gentechnisch veränderten adenoviralen Vektor-COVID-19-Impfstoffen, die sich in klinischen Studien befinden (Johnson & Johnson, Oxford und CanSino), verwenden PEG als kostengünstigen Zusatzstoff für die Impfstofflagerung. Wenn einer der PEGylierten mRNA-Impfstoffe gegen Covid-19 die Zulassung erhält, wird die erhöhte Exposition gegenüber PEG beispiellos und möglicherweise katastrophal sein. (11,12)

Wie die mRNA-Impfstoffe sind die adenoviralen Vektor-COVID-19-Impfstoffe noch experimentell und wurden bisher noch nicht bei der Massenimpfung gegen Infektionskrankheiten eingesetzt. Angesichts der schlechten Sicherheitsbilanz vieler Impfstoffe in der Vergangenheit ist das Risiko unvorhersehbarer und potenziell katastrophaler Nebenwirkungen von größter Bedeutung.

Zum Beispiel könnten die virusvektorierten Impfstoffe neben anderen Gefahren eine Rekombination mit natürlich vorkommenden Viren erfahren und Hybridviren erzeugen, die unerwünschte Eigenschaften haben könnten, die die Übertragung oder Virulenz beeinflussen. Die zahlreichen Variablen, die die Wahrscheinlichkeit, dass eine Rekombination stattfindet, und die möglichen Ergebnisse der Rekombination beeinflussen, sind mit den vorhandenen Werkzeugen und Kenntnissen praktisch unmöglich genau zu quantifizieren. Die Risiken sind jedoch real, wie das Auftauchen mutierter Virentypen, eine verstärkte Pathogenität und unerwartete schwerwiegende unerwünschte Ereignisse (einschließlich Tod) nach planlosen Massenimpfkampagnen und früheren gescheiterten Versuchen zur Entwicklung chimärer Impfstoffe unter Verwendung von Gentechnologie zeigt.

Gentechnisch hergestellte Impfstoffe bergen eine erhebliche Unvorhersehbarkeit und eine Reihe von inhärenten schädlichen potentiellen Gefahren, einschließlich unbeabsichtigter und unerwünschter Nebenwirkungen in Bezug auf die anvisierten oder nicht anvisierten Personen. Zu den möglichen unerwünschten immunologischen Wirkungen gehören unerwartete immunpathologische Reaktionen, Autoimmunreaktionen, Langzeittoleranz, persistierende Infektionen und latente Infektionen. Es besteht auch die Möglichkeit, genetisches Material von gentechnisch veränderten Viren oder GE-Virus-Vektor-Impfstoffen auf die gezielten einzelnen Keimbahnzellen zu übertragen oder zu rekombinieren. Es kann auch eine chromosomale Integration oder Insertionsmutagenese durchlaufen, was zu zufälligen Insertionen von Impfstoffkonstrukten in das zelluläre Genom des Wirts führt, was zu Veränderungen der Genexpression oder Aktivierung von zellulären Onkogenen führt, wodurch die Möglichkeit der Induktion von Tumoren erhöht wird. Selbst geringfügige genetische Veränderungen oder Unterschiede zwischen Viren können zu dramatischen Veränderungen der Übertragungsfähigkeiten, Wirtspräferenzen und Virulenz führen. Die aus solchen Ereignissen resultierenden neuen Hybridvirus-Nachkommen können völlig unvorhersehbare Eigenschaften aufweisen. Die Virulenzreversion wurde zum Beispiel dokumentiert, als ein rekombinanter rekombinanter Vaccinia-Tollwut-Glykoproteinvirus-Impfstoff, der für wilde Waschbären und Füchse hergestellt wurde, eine 28-jährige schwangere Frau infizierte. (13) Die Virulenzreversion wurde auch dokumentiert, als die Rekombination zwischen kommerziellen Impfstoffen gegen das infektiöse Laryngotracheitisvirus (ILTV) bei Geflügel zu virulenten rekombinanten Viren führte, die schwere Krankheiten verursachten und sich in wichtigen Geflügelerzeugungsregionen in Australien als vorherrschende Feldstämme erwiesen haben. (14)

Die Risiken einer Rekombination wurden bereits früher in einer von der Weltgesundheitsorganisation einberufenen Sitzung im Jahr 2003 angesprochen, bei der Regulierungsbehörden der Europäischen Union, der USA, Chinas und Kanadas das spezifische Thema der Rekombination zur Sprache brachten: „Rekombination eines lebenden Virus-Vektors“ Impfstoff mit einem zirkulierenden oder reaktivierten latenten Virus könnte theoretisch einen stärker pathogenen Stamm erzeugen&8230Das Risiko einer Rekombination sollte nach Möglichkeit in einem nichtklinischen Modellsystem untersucht werden, sollte aber auch in klinischen Studiendesigns berücksichtigt werden.&8221 Dies wurde unter . aufgeführt die „Empfehlungen an die WHO und Prioritäten für die künftige Arbeit“ als eines von mehreren „weiter zu untersuchenden Fragen von entscheidender Bedeutung“. (15) Offenbar haben die WHO, Regierungen und die Impfstoffindustrie diese Empfehlung jedoch nie ernst genommen.Dies ist angesichts der Geschichte der schnellen Zulassung und Billigung mehrerer solcher Lebendimpfstoffe mit Virusvektoren ohne die erforderlichen und gründlichen Sicherheitsstudien nicht überraschend, die insbesondere während des derzeitigen wahnsinnigen Gerangels um einen COVID-19-Impfstoff durchgeführt wurden.

Es gibt auch Bedenken, dass einige Menschen möglicherweise bereits immun gegen das Adenovirus sind, das das Coronavirus-Gen in den Körper trägt, da Adenoviren durch die menschliche Bevölkerung zirkulieren und den Impfstoff unwirksam machen. (16) Die im Lancet veröffentlichten Daten aus der ersten klinischen Studie mit dem adenoviralen Vektor-COVID-19-Impfstoff von CanSino Biologics of China zeigten, dass die Anzahl der Nebenwirkungen bei der höchsten der drei in der Studie verwendeten Dosen hoch war — 75 % der Personen in der höchsten Dosisgruppe berichteten über mindestens eine Nebenwirkung. Zu den Nebenwirkungen gehörten unter anderem Fieber – Schmerzen an der Injektionsstelle, Kopfschmerzen, Müdigkeit. Zehn Freiwillige (9 % der gesamten Studiengruppe) hatten Nebenwirkungen vom Grad 3, definiert als „schwerwiegende und medizinisch signifikante Symptome“, sechs (17 %) in der höchsten Dosisgruppe und jeweils zwei (6 %) in der niedrigen und mittleren Dosis Gruppen. Die Studie ergab auch, dass eine Dosis des Impfstoffs, die auf drei verschiedenen Ebenen getestet wurde, bei einigen Probanden eine gute Immunantwort hervorrief. Aber etwa die Hälfte der Freiwilligen – Menschen, die bereits eine Immunität gegen das Rückgrat des Impfstoffs hatten – hatte eine gedämpfte Immunantwort. (17)

Das Dengvaxia-Impfstofffiasko auf den Philippinen veranschaulicht auch die Gefahr, einen Impfstoff zu überstürzen und es den von Marktkräften getriebenen Unternehmensinteressen zu ermöglichen, auf die Gesundheitsbedürfnisse der Menschen einzugehen. Infolgedessen litten oder starben viele der Geimpften nach einem verpatzten Massenimpfprogramm.(18) Nach Angaben des Chefpathologen der Staatsanwaltschaft waren bis zum 18. Februar 2020 153 der mit Dengvaxia Geimpften gestorben. (19)

Ein weiteres Beispiel für die Gefahr, dass Unternehmen klinische Sicherheitsstudien mit Impfstoffen schneller verfolgen, ist der HPV-Impfstoff (Human Papilloma Virus). Zwei der größten Impfstoffhersteller haben ihre Placebos mit einem neurotoxischen Aluminium-Adjuvans versetzt und die Beobachtungszeit verkürzt. Zahlreiche unerwünschte Ereignisse, darunter lebensbedrohliche Verletzungen, bleibende Behinderungen, Krankenhausaufenthalte und Todesfälle, wurden später nach der Impfung mit bivalenten, quadrivalenten oder neunvalenten HPV-Impfstoffen gemeldet. Die Wissenschaftler des Unternehmens haben diese Verletzungen routinemäßig abgetan, minimiert oder verschwiegen, indem sie statistische Spielereien und ungültige Vergleiche verwendeten, um ihre relative Signifikanz zu verringern. Einige Aufsichtsbehörden waren mitschuldig daran, ein erhöhtes Auftreten von Nebenwirkungen in Überwachungsstudien nach der Markteinführung zu vertuschen. (20, 21)

Ein weiteres Problem besteht darin, dass mit Zellkulturen hergestellte Impfstoffe oft mit nackten Nukleinsäuren, genomischen Fragmenten, Retroviren und anderen Fremdmaterialien kontaminiert sind, die ungewisse, aber potenziell ernsthafte Gefahren bergen. Diese Kontamination kann im Ausgangsmaterial vorhanden sein, z.B. menschliches Blut, menschliches oder tierisches Gewebe, Zellbanken oder durch die Verwendung von Tierseren in den Herstellungsprozess eingebracht werden. Viele COVID-19-Impfstoffkandidaten werden auf sogenannten „unsterblichen“ Zelllinien oder krebsartigen Zelltypen (z. Hersteller und Behörden versichern uns, dass diese per se keine Tumore verursachen. Wissenschaftliche Studien sagen uns jedoch, dass diese Zellen, nachdem sie eine bestimmte Anzahl von Malen wiederholt kultiviert wurden, in einen krebsartigen Zustand übergehen können. Unsterbliche Zelllinien zeigen im Vergleich zu normalen Zellen eine 100-mal höhere Anzahl von DNA-Rekombinationsereignissen. Dies könnte zu viral-viralen oder viral-zellulären Interaktionen führen, die neue Viren erzeugen und zu pathologischen Folgen, einschließlich Autoimmunität und Krebs, führen können. (22) Auch die US-amerikanische FDA hat diese Gefahr erkannt. In einem auf seiner Website veröffentlichten Papier heißt es: „In einigen Fällen können die verwendeten Zelllinien tumorerzeugend sein, das heißt, sie bilden Tumore, wenn sie Nagetieren injiziert werden. Einige dieser tumorbildenden Zelllinien können krebserregende Viren enthalten, die sich nicht aktiv vermehren. Solche Viren sind mit Standardmethoden schwer zu erkennen. Diese latenten oder „stillen“ Viren stellen eine potenzielle Bedrohung dar, da sie unter den Bedingungen der Impfstoffherstellung aktiv werden könnten.“ (23)

Noch ein weiteres Anliegen, nicht nur im Hinblick auf Sicherheitsfragen, sondern auch aus moralischen Gründen, ist die Verwendung abgetriebener fötaler Zellen bei der Impfstoffherstellung. Impfstoffe, die aus menschlichen fötalen Zellen hergestellt werden, enthalten Zelltrümmer und kontaminierende fötale DNA (zusammen mit ihrer epigenetischen Modifikation), die während der nachfolgenden Reinigung nicht vollständig eliminiert werden können. Dies könnte eine Insertionsmutagenese (die möglicherweise Krebs verursacht) und Autoimmunität bei den Geimpften verursachen. Mindestens sechs der COVID-19-Impfstoffkandidaten (Cansino, AstraZeneca/Oxford, Janssen, ImmunityBio/NantKwest, University of Pittsburgh und Altimmune) verwenden eine von zwei humanen fötalen Zelllinien: HEK-293, eine Nierenzelllinie, die aus einer Fötus etwa 1972 abgetrieben und PER. C6, eine proprietäre Zelllinie von Janssen, wurde aus Netzhautzellen eines 18 Wochen alten Fötus entwickelt, der 1985 abgetrieben wurde. (24)

Es gibt viele plausible biologische Mechanismen für potenzielle Nebenwirkungen aller in der Pipeline befindlichen Impfstoffe gegen COVID-19. Die Geschichte der Impfung ist voll von wissenschaftlichen Beweisen für Nebenwirkungen durch verstärkte Pathogenität, Mutation, Rekombination, induzierte Dysfunktion des Immunsystems und verschiedene unspezifische Wirkungen nach der Impfung trotz behördlicher Zulassung und früherer klinischer Studien und anderer von Unternehmen gesponserter Studien, die als Sicherheitsnachweis. Die inhärente Gefahr der Injektion von mikrobiellen Proteinfragmenten, Kontaminanten, DNA und anderen Fremdmaterialien in den menschlichen Körper ist in der wissenschaftlichen Literatur gut dokumentiert. Praktisch alle Impfstoffe enthalten solche gefährlichen Fremdfragmente und Materialien und sind unvermeidlich unsicher. Darüber hinaus ist die Exposition des Geimpften gegenüber anderen Umweltgefahren (Pestizide, Luftschadstoffe, 5G-Strahlung, ionisierende Strahlung usw.), die zu synergistischen Nebenwirkungen führt, die nicht durch von Unternehmen finanzierte „Sicherheitsstudien“ erfasst wurden, ein weiterer plausibler Mechanismus, der zu akuten oder Langzeitverletzungen bis hin zum Tod.

Sicherheitsbewertungen unter dem von Unternehmen dominierten wissenschaftlichen Milieu sind völlig unzureichend und oft fehlerhaft. Präklinische Studien und klinische Studien werden von den Unternehmen durchgeführt oder gesponsert, die die Impfstoffe verkaufen, und sie gehen nicht angemessen auf die plausiblen Nebenwirkungen ein, die durch die von den Unternehmen gesponserten Studien nicht nachgewiesen werden können. Es gibt keine unabhängigen Studien, die die Behauptungen der Impfstoffhersteller bestätigen könnten. Daher gibt es keinen Grund zu der Annahme, dass der potenzielle Nutzen eines bevorstehenden COVID-19-Impfstoffs die potenziellen Nebenwirkungen überwiegen würde, trotz Zusicherungen der Sicherheit durch die Impfstoffindustrie, internationale Institutionen, Regierungen und die etablierten medizinischen Wissenschaftsgruppen.


6. Muskeldystrophie

Die Muskeldystrophie Duchenne wird durch Mutationen im DMD Gen, das für ein Protein kodiert, das für die Muskelkontraktion notwendig ist. Kinder, die mit dieser Krankheit geboren werden, erleiden eine fortschreitende Muskeldegeneration, und die bestehenden Behandlungen sind auf einen Bruchteil der Patienten mit dieser Erkrankung beschränkt.

Die Forschung an Mäusen hat gezeigt, dass die CRISPR-Technologie verwendet werden könnte, um die mehreren genetischen Mutationen hinter der Krankheit zu beheben. Im Jahr 2018 hat eine Gruppe von Forschern in den USA CRISPR verwendet, um an 12 strategischen „Mutations-Hotspots“ zu schneiden, die die Mehrheit der geschätzten 3.000 verschiedenen Mutationen abdecken, die diese Muskelerkrankung verursachen. Um diesen Ansatz weiterzuentwickeln, wurde ein Unternehmen namens Exonics Therapeutics ausgegliedert.

Editas Medicine arbeitet auch an einer CRISPR-Therapie für Duchenne-Muskeldystrophie. Das Unternehmen verfolgt einen breiteren Ansatz, bei dem anstelle spezifischer Mutationen die CRISPR-Genbearbeitung verwendet wird, um ganze Abschnitte des mutierten Proteins zu entfernen, wodurch das Protein kürzer, aber noch funktionsfähig wird.


Softwaretools sind wichtig, aber unzureichend

Die Notwendigkeit, Mutationsvarianten in einzelnen Genomen vorherzusagen und zu kommentieren, um molekulare Ziele genau zu identifizieren, ist dringend. Die steigende Flut von Big Data, maschinellem Lernen und Datenanalyse hat den allgemeinen Eindruck erweckt, dass effiziente und leistungsfähige Programme die meisten Fragen lösen können und es möglicherweise nicht notwendig ist, tiefer in die zugrunde liegende Biologie einzusteigen [205]. Aktuelle Umfragen bestätigen die zunehmende Wertschätzung und Leidenschaft für leistungsstarke Softwareentwicklung. Zu den Rechenanforderungen gehören Hochleistungsrechnen, Bioinformatik, Workflows und aktuelle Analysecodes und/oder Server und Datenintegration mit der Überzeugung, dass datenwissenschaftliche Komponenten und Fähigkeiten für ein tiefes Verständnis der Prozesse innerhalb und zwischen den erforderlich sind Zellen [206]. Maschinelles Lernen kann eine Abkürzung sein, um Korrelationen zwischen Prozessen auf verschiedenen Ebenen zu entdecken. Allerdings kann in Biologie und Medizin allein auf Big Data basierenden Ansätzen der Verzicht auf eine konzeptionelle Darstellung scheitern [205]. Unabhängig von ihrer Ausgereiftheit, ihrem Know-how und ihrer Klugheit funktionieren die Methoden der künstlichen Intelligenz schließlich durch Anpassung. Wenn die Daten „groß“ sind, können sie statistisch zuverlässig sein. Wenn Sie jedoch versuchen, seltene Ereignisse zu erfassen und vorherzusagen, können sie fehlschlagen. Biologisches Wissen und konzeptionelle Erkenntnisse sollten mit Big Data-basierten Methoden kombiniert werden, um genauere und zuverlässigere Schlussfolgerungen zu komplexen Systemen zu erhalten, wie sie hier benötigt werden.

Software kann genomische, proteomische, Microarray- und klinische Daten analysieren [206–210]. Bei massiven Datenmengen ist es möglich, die Ergebnisse mit experimentellen Beobachtungen zu korrelieren [211, 212], jedoch können ausschließlich statistische Ergebnisse nicht erklären, warum die Korrelationen beobachtet werden. Ein statistisches Ergebnis ist das Ergebnis der vielen Parameter, die in das Training der Software einfließen. Auch wenn Strategien wie Bootstrapping und Leave-One-Out-Kreuzvalidierung bei der Ermittlung der Schlüsselvariablen helfen können, trüben die vielfältigen Parameter immer noch die Interpretation und verringern die Genauigkeit der prädiktiven Präzisionsmedizin [213]. Leistungsstarke Genomik-, Transkriptomik- und Proteomik-Software kann jedoch mit computergestützter, theoretischer und experimenteller Strukturbiologie gekoppelt werden. Diese überzeugende Kombination kann die zugrunde liegenden Mechanismen von Veränderungen in proteinkodierenden Regionen und deren Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, Lipiden, DNA und RNA sowie Medikamenten effektiver aufdecken. Wenn Ressourcen verfügbar sind, können Berechnungen mechanistische Details erreichen, die für Experimente derzeit eine Herausforderung darstellen. Integrative Multiskalenansätze können zunehmend auf einer Reihe von Skalen angewendet werden, um Theorien und Konzepte anzubieten und zu testen, und insbesondere werden die Vorhersagen und Beobachtungen, die sie machen, quantifiziert.

Die Präzisionsonkologie würde von der Zusammenführung genetischer Daten und Analysen mit den zugrunde liegenden strukturellen Grundlagen profitieren. Strukturen helfen nicht nur, genetische Aberrationen zu verstehen, sondern können auch Hypothesen aufstellen und Mechanismen anbieten, um genauere maßgeschneiderte Behandlungen zu ermöglichen. Es wurden Methoden zusammengestellt, die die Auswirkungen von Mutationen auf die Proteinstabilität, das Wasserstoffbrückennetzwerk, die pH-Abhängigkeit, die Konformationsdynamik und die Proteinfunktion vorhersagen [214]. Im Folgenden diskutieren wir ihre möglichen Auswirkungen auf die freie Energielandschaft der Proteine, wie sich Fahrermutationen im Vergleich zu Passagiermutationen auf sie auswirken können, und stellen das Konzept der „latenten Fahrer“ vor. Annotations- und Vorhersagemethoden basierend auf strukturellen und biophysikalischen Informationen wurden ebenfalls zusammengestellt [215].


Antwort des Autors

1) Mögliche alternative Erklärungen für die BeobachtungenEin Hauptproblem dieses Manuskripts ist, dass alternative Erklärungen auch Sinn machen könnten. Der Autor muss nachweisen, dass seine Erklärungen die einzigen oder zumindest plausibelsten sind. Abbildung 2b ist von zentraler Bedeutung für das vorgeschlagene Verfahren. Es zeigt eine erhöhte Fehlerrate am Uracil in der 5'-Spleißstelle der vom Autor ausgewählten kanonischen GU-AG-Introns. Die gegebene Erklärung ist, dass Pol II-Fehler im U zu einer Intronretention führen. Warum ist dann die Fehlerrate des Guanins nicht ähnlich erhöht? Man würde dann auch erhöhte Fehlerraten für das konservierte AG-Motiv der 3'-Spleißstelle und im gut konservierten Verzweigungspunkt-Motiv erwarten. Die Analyse dieser Motive sollte die Interpretation des Autors bestätigen. Da diese Daten nicht angezeigt werden, bedeutet dies, dass kein erhöhtes Signal beobachtet wurde? Wie kann dies im Lichte der Interpretation des Autors von Pol-II-Fehlern beim Spleißen von Motiven erklärt werden, die zu beibehaltenen Introns führen? Da die einzige Position mit erhöhter Fehlerrate das U am 5'-SS zu sein scheint, könnte eine alternative Erklärung (wahrscheinlich nicht die einzig mögliche) sein, dass ein Faktor so stark an das Uracil bindet, dass die reverse Transkription im Das RNA-seq-Protokoll führt dazu, dass Uracil falsch gelesen wird. Beachten Sie, dass U->C-Mutationen auch in PAR-CLIP beobachtet werden und bekanntermaßen während der reversen Transkription der RNA entstehen.

Ich stimme zu, dass es seltsam war, dass nur Mutationen am U in Reads angereichert waren, die Intron-Exon-Verbindungen überspannen. Unter Verwendung eines neueren Datensatzes mit einer weitaus geringeren Gesamtfehlpaarungshäufigkeit finde ich, dass sowohl G und U an der 5'-Stelle als auch A an der 3'-Stelle höhere Fehlpaarungsraten bei Exon-Intron-übergreifenden Reads aufweisen (Abbildung 2B und Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 1).

2) Wahl des NullmodellsAbbildung 2b zeigt relativ Fehlerraten auf der y-Achse. Die beobachteten Fehlerraten um die 5'-Spleißstellen herum werden durch die Fehlerraten normalisiert, die für dieselben Dinukleotide, GT, an anderen Stellen im Transkriptom beobachtet werden. Die 4-fach erhöhte Fehlerrate hängt daher vom Nullmodell ab. Es wäre wichtig, die relative Fehlerrate am Uracil mit verfeinerten Trimer-Null-Modellen zu berechnen, um zu sehen, ob die 4-fache Erhöhung hält. Es sollten zwei Versionen verwendet werden, eine mit dem mutierten Nukleotid an der ersten Position und ein weiteres Modell mit dem mutierten Nukleotid an der letzten der drei Trimerpositionen. Die letztere Version könnte sequenzabhängige Effekte während der reversen Transkription modellieren. Für jedes Trimer im Transkriptom kann man die Fehlerrate am ersten und dritten Nukleotid berechnen. Dann werden die Gesamtmutationen für jede Position um die 5'-Spleißstelle (und die 3'-Spleißstelle und Verzweigungsstelle) durch die erwartete Anzahl von Mutationen dividiert, die einfach die Summe der Fehlerraten für jeden der Trimerkontexte für die Position ist .

Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 1 zeigt die 3mer-Fehlerraten für jede Base in jedem 3mer. Bei Verwendung dieses neuen Experiments mit höherwertigen RNA-Seq-Daten gibt es nur stark erhöhte Fehlerraten sowohl bei C als auch bei G in CG-Dinukleotiden. Dies legt nahe, dass die erhöhten Fehlerraten an den Donor- und Akzeptorstellen ein biologisches Signal und kein technischer Fehler sind.

3) Wirkungen von Rpb9 Der Autor zeigt, dass die Expression von Rpb9 negativ mit Fehlerraten in menschlichen Zelllinien korreliert, was darauf hindeutet, dass die unterschiedliche Expression von Rpb9 die RNA-Polymerase-Fidelität in vivo beeinflusst. Das Niveau der mRNA-Expression korreliert nicht unbedingt mit dem Proteinniveau und, was noch wichtiger ist, der Autor sollte die Expression von Rpb9 mit einer anderen Untereinheit von Pol II (z. B. Rpb3) in jeder für die Analyse verwendeten Zelllinie normalisieren (Abbildung 2c).

Ich stimme zu, dass der RNA-Spiegel nicht unbedingt den Proteinspiegel bestimmt. Dies ist ein häufiger Vorbehalt bei der Interpretation von RNA-seq-Ergebnissen. Darüber hinaus wird der Aufbau des RNA-Polymerase-Komplexes stark reguliert, da die zelluläre Konzentration einer bestimmten Untereinheit weder über ihren Phosphorylierungsstatus noch darüber informiert, wie viel von dieser Untereinheit in die Polymerase eingebaut ist. Ich habe der Diskussion einen Text dazu hinzugefügt.

Die Normalisierung durch die Expression anderer Untereinheiten ist eine gute Idee. Ich habe eine Abbildung (Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 2) hinzugefügt, die zeigt, dass die RPB9-Expression negativ mit den RNA-Seq-Mismatch-Raten korreliert, wenn sie entweder durch RPB3 oder durch die mediane Expression aller Untereinheiten normalisiert wird.

Eine alternative Erklärung für Abbildung 2c und Abbildung 3b wäre, dass eine Änderung der Rpb9- und TFIIS-Konzentration von ihrem fein regulierten Wert die Dehnung beeinträchtigt, was wiederum die Spleißraten und die Spleißeffizienz beeinflussen kann. (Siehe z. B. Lacadie et al., In vivo Commitment to Hefe Cotranscriptional Splicing is sensitive totranscription elongation mutants, Genes Dev. 2006.) Können solche alternativen Erklärungen ausgeschlossen werden?

Ich kann mir kein gutes Experiment vorstellen, um festzustellen, ob der Unterschied beim Spleißen aufgrund von RBP9- und DST1-Unterexpression (Abbildung 3b) auf eine Änderung der Dehnungsraten, Fehlerraten oder beides zurückzuführen ist. Ich glaube, dass die neuen Daten, die erhöhte Fehlpaarungsfrequenzen sowohl an den 5’- als auch an den 3’-Spleißstellen zeigen, weitere Unterstützung dafür liefern, dass RNA-Polymerase-Fehler zumindest für einen Teil des Unterschieds beim Spleißen verantwortlich sind.

Darüber hinaus zeigt der Autor in Abbildung 3b, dass die Intronretention unter Bedingungen geringer Rpb9/Dst1-Induktion höher ist. Beeinflusst die geringe Induktion von Rpb9 oder Dst1 dieselben Introns? Findet der Autor eine höhere Fehlerrate in der GT 5´-Donorstelle in den mRNAs, die Intronretention zeigen?

Da die Fehlerraten an einer beliebigen Position niedriger sind als die Abdeckung, wird die Fehlerrate an einem bestimmten Exon leider von der Stichprobenverzerrung dominiert. Um genau diese Frage zu stellen, entwickeln wir derzeit die Kombination von Einzelmolekül-Unique-IDs mit gezielter Sequenzierung, können dies jedoch nicht mit Standard-RNA-Sequenzierungsdaten tun.4) Mögliche Verzerrung durch Konservierung Um die Fehlerraten an Splicing-Junctions zu messen, zählt der Autor Fehler an jeder Position relativ zu 5´-Donorstellen unter Verwendung von Reads, die Intron-Exon-Junctions umspannen, die auf GT-Donorstellen zentriert sind. Als Ergebnis sind die Fehler am T-Nukleotid im Vergleich zu anderen Positionen stärker angereichert. Es ist nicht klar, ob die Analyse durchgeführt wird, indem die durchschnittliche GT-Fehlerrate gemessen wird, indem alle Ablesungen an Intron-Exon-Verbindungen oder einzelnen mRNAs verglichen werden (Abbildung 2a, 2b). Wenn die Analyse unter Verwendung aller Gene erfolgt, da GT am Intron-Exon eine konservierte Sequenz ist und die flankierenden Regionen es nicht sind, könnte dies zu einem Bias führen. Dies muss geklärt werden.

Die Fehlerraten an Exon-Intron-Übergängen (Abbildung 2b) werden mit Fehlerraten innerhalb von Exons verglichen (Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 1). Ich stimme zu, dass dies nicht klar war und habe es im Abschnitt Materialien und Methoden klargestellt.5) Vorschläge für zusätzliche Kontrollen Eine positive Kontrolle wäre, RNA-seq-Daten eines Organismus mit einer mutierten Polymerase zu analysieren, von der bekannt ist, dass sie eine erhöhte Mutationsrate hat, und zu zeigen, dass diese Mutationsrate zu höheren relativen Fehlerraten bei konservierten Spleißmotiven führt.

Ich habe keinen Grund zu der Annahme, dass eine RNA-Polymerase-Fidelity-Mutante eine größere Zunahme der Fehlerraten bei konservierten Spleißmotiven im Vergleich zu der Zunahme an anderen Positionen aufweisen wird. Bei den Mutanten sollte die Zunahme der Fehlerraten an Spleißstellen gleich sein wie bei anderen ähnlichen Sequenzen. Die größere Fehlerrate an Spleißstellen besteht darin, dass diese Fehler zu einer Intronretention führen können.

Eine negative Kontrolle wäre, RNA-seq-Daten eines mutierten Organismus mit einem bekannten Transkriptionselongationsdefekt zu analysieren und zu zeigen, dass der Elongationsdefekt die mutmaßliche Pol II-Fehlerrate nicht in ähnlicher Weise beeinflusst wie die Überexpression von Rbp9 und TFIIs. Wenn möglich, ermutigen wir den Autor, diese Kontrollen durchzuführen.

Das war ein sehr schöner Vorschlag. Ich habe es getan (Abbildung 3 – Abbildungsergänzung 1).

Um festzustellen, ob Elongationsdefekte zu erhöhten RNA-Seq-Mismatch-Frequenzen führen, habe ich RNA-Seq-Daten von spt4- und elc1-Stämmen analysiert, die, wie in Lacadie et al. gezeigt, keine Fehler bei der Wiedergabetreue aufweisen. Ich sehe keinen Unterschied in der Häufigkeit von RNA-Seq-Fehlpaarungen, was darauf hindeutet, dass Störungen, die die Elongation beeinflussen, nicht zu einer Zunahme der RNA-Seq-Fehlpaarungen führen würden.6) Wiederholte Lesevorgänge In Absatz 4 wird das Verfahren des Ausrichtungsqualitätsfilters erklärt. Es wird jedoch nicht erwähnt, wie repetitive Reads (oder potenziell repetitive Reads in z. B. unbekannten Duplikationen von Genen) gehandhabt werden und das Ergebnis beeinflussen könnten. Dies muss geklärt werden.

Reads, die mehreren Stellen im Genom zugeordnet sind, werden verworfen. Das habe ich im Text klargestellt.7) Mögliche Verzerrung durch die AbdeckungEs ist problematisch, identische Fehlpaarungen, die zweimal oder öfter an derselben Position auftreten (Absatz 4) nicht zu zählen, aus folgenden Gründen:– Dies muss durch die Abdeckungstiefe an jeder Position angepasst werden. Positionen mit hoher Abdeckung weisen mit höherer Wahrscheinlichkeit zweimal denselben „echten“ RNApol-Fehler auf als Positionen mit geringer Abdeckung. (Dies scheint so offensichtlich zu sein, dass wir die Erklärung des Normalisierungsverfahrens möglicherweise übersehen haben) – RNA-Polymerasefehler scheinen z. C->T (siehe Abbildung 3c), wodurch es für C->T/G->A wesentlich wahrscheinlicher ist, genau denselben RNApol-Fehler zweimal an einer Position zu sehen schwach exprimierte Gene) sollte viel schlechter sein als bei hoher Abdeckung (stark exprimierte Gene). Wird dies im Algorithmus berücksichtigt? (Vielleicht wurde dieses Problem diskutiert, aber von den Gutachtern übersehen.) Falls nicht, bedarf es einer Klärung, wie unterschiedliche Abdeckungstiefe und Mutationsbias bei der Schätzung der Fehler oder der Entfernung von Fehlpaarungen desselben Typs berücksichtigt werden.

Ich habe eine zusätzliche Abbildung hinzugefügt, die sowohl zeigt, dass (1) diese Filterung die Ergebnisse nicht beeinflusst, als auch (2) die statistische Begründung für diesen Filter (Abbildung 1 – Abbildungsergänzung 2). Kurz gesagt liegt die Fehlerrate der RNA-Polymerase in der Größenordnung von 10 –5 , während 90% der Positionen eine Abdeckung von <10 2 aufweisen. Obwohl viele Positionen im Genom mehrere identische Fehler aufweisen, ist die Wahrscheinlichkeit, mehrere identische Fehler zu beobachten, daher sehr gering.


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