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Was sind mehrzellige Sphäroide?

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Ich habe einen mathematischen Hintergrund und forsche an mathematischen Krebsmodellen. Ich bin auf eine Menge Literatur gestoßen, in der "multizellige Sphäroide" im Zusammenhang mit avaskulären Tumoren erwähnt werden. Ich weiß, dass avaskulär einen Mangel an Blutgefäßen bedeutet, aber ich habe Schwierigkeiten, eine Erklärung für mehrzellige Sphäroide zu finden. Handelt es sich dabei um eine Art Modell/Annäherung an eine bestimmte Art von Tumoren oder sind sie tatsächlich ein echtes Phänomen an sich? Es wäre toll, wenn mir jemand erklären könnte, was sie eigentlich mit mehrzelligen Sphäroiden sind!


Die klassische Zellkultur ist eine Monoschicht von Zellen auf der Oberfläche einer Zellkulturschale. Diese Kulturen unterscheiden sich stark von der Mikroumgebung, die Zellen in Tumoren haben, da die Zellen nur mit ihren direkten Nachbarn interagieren, ansonsten aber relativ optimal mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt werden.

In einem Real-Lige-Tumor wächst eine Zellmasse unkontrolliert in allen drei Dimensionen des Raumes und produziert diese typischen "Knoten" von Tumoren. Solange diese nicht durch eigene Blutgefäße versorgt (also vaskularisiert) werden, unterscheidet sich die Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und Wachstumsfaktoren und Hormonen zwischen den Zellen in den äußeren Schichten des Tumors und den Zellen im Inneren sehr stark. Dies führt zu unterschiedlichem Stress und auch zu physiologischen Reaktionen der Zellen. Dies sieht in der folgenden Abbildung (von hier) aus:

Um diese Mikroumgebungen für die Forschung zu ähneln (und 2D- und 3D-Zellkulturen unterscheiden sich in den Ergebnissen ziemlich stark), versucht man, diese zu simulieren. Technisch wird dies dadurch erreicht, dass kleine Zellmengen (typischerweise einige Hundert) in eine hart werdende Gelmatrix (zB Matrigel oder Collagen) eingebettet werden und die Zellen in kleinen Tropfen wachsen lassen. Wenn die Bedingungen stimmen, entwickeln sich die Zellen zu diesen vielzelligen Sphäroiden.

Sie können sogar verschiedene Zelltypen mischen (zum Beispiel Tumorzellen und Zellen, die normalerweise in dem Gewebe vorhanden sind, in dem der Tumor wächst), um eine noch bessere Simulation zu erhalten. Weitere Details finden Sie in den Referenzen.

Verweise:

  1. Dreidimensionale Zellkulturen: Von molekularen Mechanismen bis hin zu klinischen Anwendungen.
  2. Jüngste Fortschritte bei der dreidimensionalen multizellulären Sphäroidkultur für die biomedizinische Forschung.
  3. Sphärische Krebsmodelle in der Tumorbiologie.
  4. Entwicklung der 3D-in-vitro-Technologie für medizinische Anwendungen.

Es handelt sich um dreidimensionale Zellkulturen nach H Ma et al. 2012.

Multizelluläre Tumorsphäroide sind eines der klassischen 3D-Kulturmodelle, die zur Entwicklung von Krebsmedikamenten und -behandlungen verwendet werden können. Durch die Nachahmung des 3D-Netzwerks der Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen ähneln Tumorsphäroide vielen Aspekten der pathophysiologischen Umgebung im menschlichen Tumorgewebe.

Klassische Zellkulturen sind in der Regel einschichtig. Viele der Unterschiede zwischen diesen Kulturen und echten Geweben wurden durch 3D-Kulturen nach Carver et al. 2014.

Das multizelluläre Tumorsphäroid (MCTS), ein dreidimensionales Modell, das kleinen avaskulären Tumoren und Mikrometastasen sehr ähnelt, wurde als Zwischenprodukt zwischen Monolayer-Kultur und In-vivo-Studien für das Screening von niedermolekularen Wirkstoffen verwendet.

Handelt es sich also um eine Entität aus dem „realen Leben“ oder handelt es sich um etwas, das computergeneriert ist? Es ist das wahre Leben. Denken wir an eine Orgel. Es besteht aus einem bestimmten Gewebe und einem Stroma, das vaskuläre, nervöse und andere Komponenten enthält, die Nährstoffe liefern und das spezifische Gewebe des Organs begrenzen. Diese Struktur entwickelt sich in vivo in 3D. Die Blutgefäße folgen der Gewebeentwicklung in einer baumartigen 3D-Struktur, um alle Zellen zu erreichen. Aber was macht man mit Laborzellkulturen? Da sind keine Blutgefäße. Wie versorgt man alle Zellen mit Nährstoffen? Aus diesem Grund werden die meisten In-vitro-Zellkulturen in Monolayer-Struktur entwickelt. Zellen sind jedoch 3D-Strukturen. Sie sind in einem Gewebe durch interzelluläre Verbindungen miteinander verbunden. Monolayer beschränkt diese Verbindung auf eine einzige Ebene. Bei Krebszellen mit spezifischen Eigenschaften (sie verlieren Verbindungen und beginnen sich zu bewegen) wird das Monolayer-Modell zudem eingeschränkt. Auf diese Weise sind Sphäroide zu einem besseren Modell für die Untersuchung von in-vivo-Prozessen unter Verwendung von in-vitro-Zellkulturen geworden.


Sphäroide: Eigenschaften, Bildanalyse und Kulturmethoden

Seit Jahrzehnten werden isolierte Zellen, die in 2D-Monolayern auf Kunststoff oder Glas gewachsen sind, verwendet, um eine Reihe biologischer Prozesse zu untersuchen. Obwohl diese Kultivierungsbedingungen leicht zu kontrollieren sind und einer Vielzahl von Analysetechniken förderlich sind, repräsentieren sie nicht die komplexe 3D-Umgebung, der Zellen tatsächlich ausgesetzt sind in vivo.

Es wurden eine Reihe von 3D-Zellkulturmethoden entwickelt, die die native Umgebung von Zellen genauer rekapitulieren 1 . Während der Embryonalentwicklung aggregieren Zellen und bauen sich selbst zu komplexen mehrzelligen Strukturen zusammen 2 .

Der gleiche Aggregationsprozess kann auch in in vitro Kultursysteme, wenn die Zell-Zell-Kohäsion gegenüber der Zellanheftung an ein Substrat bevorzugt wird 2 . Die resultierenden Zellaggregate werden als Sphäroide 2 bezeichnet.

Sphäroide sind dichte 3D-Aggregate von Zellen, die eine ausgeprägte Zell-Zell-Adhäsion aufweisen, typischerweise ihre endogene extrazelluläre Matrix beibehalten und Eigenschaften haben, die ihrer . sehr ähnlich sind in vivo Gewebe Gegenstücke. Obwohl Wissenschaftler seit Jahrzehnten Zellaggregate kultivieren 3,4, erst 1971 wurde das Wort „Sphäroid“ zum ersten Mal verwendet 5. Die 3D-Zellkultur wurde durch die Arbeit von Mina Bissell in den 1980er Jahren weiter populär 6.

Seitdem sind Sphäroide zu einem aufregenden Zellkulturmodell geworden, da sie besser imitieren in vivo Gewebeeigenschaften und weisen im Vergleich zu 2D-Kultursystemen eine überlegene Differenzierungsfähigkeit auf 1. Diese Eigenschaften machen sie gut geeignet für den Einsatz in Medikamentenentwicklung und Tissue-Engineering-Studium, sowie für das Studium von biologische Grundprinzipien.

  1. Eigenschaften von Sphäroiden
  2. Markierungsfreie Mikroskopie zur Beurteilung der Sphäroideigenschaften
  3. Beurteilung der Sphäroidqualität
  4. Kultivierungsmethoden
    1. Hängender Tropfen
    2. Flüssigkeitsüberzug
    3. Pelletkultur
    4. Spinnerkultur
    5. Biomaterialien
    6. Kulturbedingungen
    7. Tumorsphäroide: Beispielprotokoll
    1. Tumorsphäroide
    2. Gewebe-Engineering und -Reparatur
    3. Grundlagenforschung in der Biologie

    Ein mathematisches Modell wird vorgeschlagen, um die beobachtete Internalisierung von Mikrosphären und 3H-Thymidin-markierten Zellen in mehrzelligen Sphäroiden im Steady-State zu erklären. Das Modell verwendet die herkömmlichen Vorstellungen von Nährstoffdiffusion und -verbrauch durch die Zellen. Darüber hinaus wird ein sehr einfaches Modell des Fortschritts der Zellen durch den Zellzyklus betrachtet. Zellen werden in zwei Klassen eingeteilt, in die sich proliferierenden (in G1-, S-, G2- oder M-Phasen) und in solche, die ruhen (in G0). Darüber hinaus wird angenommen, dass die beiden Kategorien unterschiedliche chemotaktische Reaktionen auf den Nährstoffgradienten haben. Das Modell berücksichtigt die räumlichen und zeitlichen Variationen in den Zellkategorien zusammen mit Mitose, Konversion zwischen Kategorien und Zelltod. Numerische Lösungen zeigen, dass das Modell das Verhalten ähnlich wie bei bestehenden Modellen vorhersagt, aber einige neue Effekte hat. Es ermöglicht Sphäroiden, sich auf nicht monotone Weise einer stationären Größe zu nähern, es sagt die Selbstsortierung der Zellklassen voraus, um eine dünne Schicht schnell proliferierender Zellen nahe der äußeren Oberfläche zu erzeugen und eine signifikante Anzahl von Zellen innerhalb des Sphäroids ins Stocken zu bringen ein wuchernder Staat. Das Modell sagt voraus, dass das gesamte Tumorwachstum nicht nur durch die Proliferationsraten bestimmt wird, sondern auch durch die Fähigkeit der Zellen, sich leicht zwischen den Klassen umzuwandeln. Darüber hinaus weist die Steady-State-Struktur des Sphäroids darauf hin, dass der Tumor schnell wächst, indem er Zellen rekrutiert, die in einem proliferierenden Zustand blockiert sind, wenn die äußeren Schichten entfernt werden. Es werden Fragen zur chemotaktischen Reaktion von Zellen in unterschiedlichen Phasen und zur Abhängigkeit der Zellzyklusraten vom Nährstoffgehalt aufgeworfen.

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    Tiefenabhängige nanomechanische Analyse der extrazellulären Matrix in mehrzelligen Sphäroiden

    Die Nanotechnologie hat das Gebiet der Krebsbiologie revolutioniert und neue Wege zum Verständnis nanomechanischer Variationen in schnell wachsenden Tumoren eröffnet. In den letzten zehn Jahren hat das Rasterkraftmikroskop (AFM) eine wichtige Rolle beim Verständnis der nanomechanischen Eigenschaften verschiedener Krebszelllinien gespielt. Diese Studie konzentriert sich auf Lewis-Lungenkarzinomzellen (LLC)-Tumoren als 3D-Multizell-Sphäroid (MCS). Solche mehrzelligen Strukturen haben die Untersuchung verschiedener Bestandteile von Tumoren ermöglicht in-vitro. Um die mechanischen Eigenschaften von Zellen und ihrer umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) besser zu verstehen, wurde ein tiefenabhängiges Eindringprofil (DDIP) mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) durchgeführt. Auf Kraftvolumen basierende Kraft-gegen-Eindrückungs-Kurven wurden verwendet, um Steifigkeitsprofile in verschiedenen Tiefen zu erstellen. AFM-Untersuchungen der Probe MCS-1 und MCS-2 ergaben drei nanomechanische Topographien, Typ A-Kollagen-Spannungsfasern, Typ B – hohe Steifigkeit an der Zellmembran - ECM-Schnittstelle und Typ C – Identifizierung der tief in der Matrix liegenden Zelle in einer Tiefe von 1,44 Mikrometer. Die hohe Steifigkeit der Merkmale sowohl des Typs A als auch des Typs B bei der ECM wirkt als steuernder Faktor bei der Abgabe von Therapeutika von der Proliferationszone in die Ruhezone in einem MCS. Verschiedene nanomechanische Heterogenitäten, die in dieser Untersuchung aufgedeckt wurden, können neues Licht in die Entwicklung des richtigen Dosierungsschemas verschiedener tumorlösender Medikamente und die Entwicklung kontrollierterer künstlicher extrazellulärer Matrixsysteme zur Replikation des Gewebewachstums in-vitro werfen.

    Die meisten tumorlösenden Medikamente zielen darauf ab, in einem mehrzelligen Sphäroid in die äußerste proliferative Schicht einzudringen. Die nanomechanische Untersuchung mit dem Rasterkraftmikroskop hat neue Details bezüglich verschiedener nanomechanischer Heterogenitäten bei der Einbettung von Zellen in eine extrazelluläre Matrix in einer Multicell-Sphäroidkultur ergeben. Diese Untersuchung liefert neue Einblicke in die Wachstumsmechanik von Tumoren in In-vivo- und In-vitro-Umgebungen.


    Werkzeuge

    Mathematische Modelle des avaskulären Tumorwachstums

    . [25, 29, 44, 49, 50, 58, 59, 66, 72]. Die späteren Modelle haben unterschiedliche Komplexitätsgrade für die Zellbewegung eingebaut. Zellen bewegen sich beispielsweise entweder konvektiv =-=[37, 45, 62, 67, 79]-=- oder aktiv diffus [65, 71, 75, 77, 80], oder diffusiv/chemotaktisch [56, 62, 65]. Die meisten Modelle betrachten die Proliferation und den Tod von Tumorzellen als von nur einem Generikum abhängig.

    Eine Hierarchie von Krebsmodellen und ihre mathematischen Herausforderungen

    . nach außen normale Richtung. Schreiben wir ∂Ω(t) lokal in die Form, dann hat (2.15) die Form Φ(x, t) = 0 wobei ∇xΦ(x, t) = 0, (2.16) ∂σ ∂n = Φt |∇xΦ | . Das Modell (2.9)-(2.15) basiert auf Pettet et al =-=[27]-=- siehe auch §3. Aufgabe (M3). Gegeben Anfangsbereich Ω(0) und Anfangsdaten p0(x), q0(x) in Ω(0) mit p0(x) 0, q0(x) 0, p0(x) +q0(x) ≤ 1, finde eine Familie von Domänen Ω(t) und Funktionen p(x, t), q(x.

    Ein hyperbolisches Problem der freien Grenze, das das Tumorwachstum modelliert

    EIN MODELL MIT MEHREREN SKALA FÜR DAS TUMORWACHSTUM

    . unter einer Nährstoffverteilung vorgeschlagen [41]. Auf dem speziellen Gebiet des Tumorwachstums wurde kürzlich in =-=[53]-=- ein Modell vorgeschlagen, das die Progression durch den Zellzyklus und die Zellmigration kombiniert. Dieser Artikel ist wie folgt aufgebaut. In Abschnitt 2 präsentieren wir eine allgemeine Beschreibung des Modells, wobei wir uns auf seine allgemeine Struktur konzentrieren und erklären, wie die verschiedenen Elemente (entsprechend diff.

    Asymptotische Stabilität der stationären Lösung für ein hyperbolisches Free-Boundary-Problem zur Modellierung des Tumorwachstums

    Das minimale Phasenübergangsmodell für die Zellzahlerhaltung durch die Hyperplasie-erweiterte Homöorhese

    . 1952, 1992, sowie Levin und Segel, 1985, für eine Übersicht). Nach obigem Rezept berücksichtigt man den entsprechenden Diffusionsterm (vgl. Burton, 1966 De Angelis und Preziosi, 2000 =-=Pettet et al., 2001-=- Akabani et al., 2002 Ferreira et al., 2002 Kar et al., 2002 Jiang et al., 2002). Dies erweitert ODE (7.29) auf die folgende Reaktions-Diffusions-Gleichung (RDE) , , (10.1) wobei der Diffusionsparameter ist.

    Mathematische Modellierung der Rolle der Haptotaxis bei Tumorwachstum und -invasion

    . schuld. Die inerten Mikrokügelchen zeigten nur Internalisierung. Es war diese experimentelle Arbeit, die zu den mathematischen Arbeiten von McElwain und Pettet [82], Thompson und Byrne [137] und Pettet et al. =-=[113]-=- mögliche Erklärungen für Zellen zu untersuchen, die an der Peripherie von Sphäroiden verbleiben. Während diese Untersuchungen Chemotaxis und Unterschiede in der Kinetik markierter und unmarkierter Zellen als möglich betrachten.

    Radunskaya, „Räumliche Tumor-Immunmodellierung“

    . Modelle von Burton [11] und Greenspan [31] und hat sich zu einem umfangreichen Literaturgebiet mit Studien entwickelt, die mit partiellen und gewöhnlichen Differentialgleichungen (PDEs und ODEs) präsentiert werden (siehe zum Beispiel =-=[12,13,41,46, 54]-=-), zelluläre Automaten (CA) (siehe zum Beispiel [2,7,26,36,43,49]) und viele statistisch fundierte Studien. Eine ausgezeichnete Übersicht über mathematische Modelle des Tumorwachstums und einige der eng verwandten Literatur.

    ERHALTUNGSGESETZE IN DER MATHEMATISCHEN BIOLOGIE

    . Tumore. Wir gehen davon aus, dass der Tumor drei Zelltypen umfasst: proliferierende Zellen mit (Massen-)Dichte p(x, t), ruhende Zellen mit Dichte q(x, t) und tote Zellen mit Dichte n(x, t). Nach =-=[36]-=- nehmen wir an, dass ruhende Zellen mit einer von der Nährstoffkonzentration c abhängigen Geschwindigkeit KP (c) proliferieren und mit der Todesrate KD(c) nekrotisch werden. Wir gehen auch davon aus, dass Proliferin.

    Räumlich

    . Modelle von Burton [11] und Greenspan [31] und hat sich zu einem umfangreichen Literaturgebiet mit Studien entwickelt, die mit partiellen und gewöhnlichen Differentialgleichungen (PDEs und ODEs) präsentiert werden (siehe zum Beispiel =-=[12,13,41,46, 54]-=-), zelluläre Automaten (CA) (siehe zum Beispiel [2,7,26,36,43,49]) und viele statistisch fundierte Studien. Eine ausgezeichnete Übersicht über mathematische Modelle des Tumorwachstums und einige der eng verwandten Literatur.


    Abstrakt

    Dreidimensionale mehrzellige Tumorsphäroide (MCTS) bieten ein experimentelles Modell, mit dem der Einfluss von Mikroumgebungsbedingungen auf die Proteinexpression bestimmt werden kann. Sequentielle Trypsinverdauung von HT29-Kolonkarzinom MCTS ermöglichte die Aufteilung in vier Populationen, bestehend aus proliferierenden Zellen von der Oberfläche (SL), einer intermediären Region (IR), nicht proliferierenden hypoxischen Zellen aus der perinekrotischen Region (PN) und einem nekrotischen Kern (NC). Das Gesamtprotein wurde aus jeder Population extrahiert und einer iTRAQ-basierten quantitativen Proteomik-Analyse unterzogen. Von insgesamt 887 identifizierten Proteinen wurde beobachtet, dass 209 hochreguliert und 114 in den PN- und NC-Regionen relativ zum SL herunterreguliert waren. Unter den hochregulierten Proteinen nahmen Komponenten der Glykolyse, des TCA-Zyklus, des Lipidstoffwechsels und der Steroidbiosynthese progressiv in Richtung der PN- und NC-Regionen zu. Western-Blotting, Immunhistochemie und Enzymassays bestätigten, dass signifikante Veränderungen in der Expression von Proteinen, die am Zellstoffwechsel beteiligt sind, in der nicht proliferierenden Fraktion der Zellen innerhalb des lebensfähigen Randes auftreten. Das Vorhandensein von funktionellen Proteinen voller Länge innerhalb des NC war unerwartet und eine weitere Analyse zeigte, dass diese Region Zellen enthält, die einer Autophagie unterzogen werden. Diese Studie hat mögliche Targets identifiziert, die für eine therapeutische Intervention geeignet sein könnten, und es sind weitere Studien erforderlich, um diese zu validieren.


    Eine andere Antwort: Multizellanalyse

    Während die Einzelzellanalyse einen beispiellosen Einblick in die Pharmakologie und Physiologie einer einzelnen seltenen Zelle liefern kann – entlarvt durch heterogene Populationsreaktionen – muss jede Zelle im Assay aus der Mikroumgebung isoliert werden. Ein wesentlicher Nachteil dieses Ansatzes besteht daher darin, dass sich die Einzelzellpharmakologie in vitro von der in einer größeren Population vorliegenden unterscheiden kann, insbesondere in einer Architektur, die nicht dreidimensionale (3D) ist, bei der der Zell-Zell-Kontakt entscheidend ist. Im Gegensatz dazu bieten 3D-Zellaggregate, einschließlich Sphäroiden und Organoiden, einen viel physiologisch relevanteren Kontext für das Screening von Verbindungen. Tatsächlich wurde die 3D-Zellkultur schnell bei der Identifizierung und Optimierung von Verbindungen eingesetzt, da sie die menschliche Physiologie und Pathophysiologie in vivo besser modellieren. Viele Techniken werden mittlerweile routinemäßig eingesetzt und neuere Übersichten betonen die Verwendung von 3D-Kulturen als präklinische Modelle als gängige Praxis sowohl in der Wirkstoffforschung als auch in der grundlegenden Krankheitsforschung (7).

    Um ein aktuelles Beispiel zu nennen, wurde Ultra-High-Throughput-Screening (uHTS) unter Verwendung von 1536-Well-Mikrotiterplattenformaten verwendet, um zelluläre Sphäroide gegen Verbindungen zu untersuchen, die auf eine kritische KRAS-Kinase-Mutation abzielen, die an mehreren Krebsarten beteiligt ist (8). Zuvor war es aufgrund der Enzymbiologie und der beteiligten Komplexitätswege, einschließlich nachgeschalteter Effektoren und vorgeschalteter regulatorischer Netzwerke, schwierig, direkt auf Mutationen der onkogenen Gruppe von RAS abzuzielen. Ebenso wichtig ist, dass mit uHTS in 2D-adhärenten Monolayer-Zellkulturen assoziierte Störfaktoren zu falschen Assay-Negativen führten, wobei viele Wirkstoffe unentdeckt blieben. Im Gegensatz dazu ermöglichte uHTS unter Verwendung einer 3D-Sphäroidkultur die Identifizierung von Proscillaridin A als selektiven Inhibitor von Zellen, die das onkogene KRasG12V-Allel beherbergen. Wichtig ist, dass Proscillaridin A, das durch die 3D-Screening-Plattform identifiziert wurde, nicht durch Standard-2D-Kultivierungsmethoden identifiziert wurde.

    Multizelluläre Organoide sind selbstorganisierte, dreidimensionale Gewebekulturen, die oft aus adulten Stammzellen oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen werden. Sie können ein gewisses Maß an Organkomplexität in höherem Maße nachbilden, als dies bei Einzelzellen, 2D-Kulturen und einfachen 3D-Kulturen wie Sphäroiden der Fall ist. Da Organoide unter Verwendung von Zellen eines bestimmten Individuums kultiviert werden, können sie darüber hinaus verwendet werden, um die individuelle Reaktion des Patienten auf ein bestimmtes Medikament oder eine bestimmte Dosis vorherzusagen. Damit verbunden ist der Vorteil, dass Krebserkrankungen und viele andere Erkrankungen in vivo anhand von Biopsieproben modelliert und anschließend für das Wirkstoffscreening verwendet werden können (Tabelle 1).

    Als Beispiel präsentiert eine aktuelle Studie Daten für mehr als 80 getestete Verbindungen, die registriert oder in klinischer Bewertung sind, die gegen eine Darmkrebs-Organoid-Biobank gescreent werden und die Nützlichkeit eines Hochdurchsatz-Ansatzes demonstrieren (9).


    Hintergrund

    Zellen von aktiv wachsenden Tumoren sind aufgrund einer inhomogenen Gefäßversorgung unterschiedlichen Mikroumgebungsbedingungen ausgesetzt [1], was zur Entwicklung lokalisierter Regionen in Tumoren mit niedriger Sauerstoffspannung, niedriger Glukosekonzentration und saurem extrazellulärem pH aufgrund der Akkumulation von metabolischen Nebenprodukte wie Milchsäure. Infolgedessen sind Zellen in diesen Regionen unterschiedlich starken Hypoxie, Anoxie und Azidose ausgesetzt [2]. Aus strahlenbiologischer Sicht stellen hypoxische Zellen die wichtigste zelluläre Subpopulation dar, da sie aufgrund der reduzierten Bildung von strahlungsinduzierten reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS strahlenresistenter sind als die euoxischen Zellen [3, 4]. Die hypoxische Zellfraktion nimmt mit fortschreitender Tumorgröße und -grad erheblich zu und bietet eine signifikante Resistenz gegen die Strahlentherapie. Die derzeit verwendeten hypoxischen Zellsensibilisatoren (Nitroimadazol-Verbindungen) haben aufgrund des Fehlens einer differentiellen Wirkung neben der systemischen Toxizität nur begrenzten Erfolg. Daher besteht ein Bedarf, wirksame Strategien zu entwickeln, um die Strahlenempfindlichkeit dieser Zellen selektiv zu erhöhen, was eine detaillierte Charakterisierung der Natur und der Reaktionen dieser resistenten Zellfraktionen erfordert. Da hypoxische Zellen in dreidimensionalen Tumoren existieren, die sich als heterogene Systeme verhalten, die Veränderungen in vielen lebenswichtigen genotypischen und phänotypischen Eigenschaften zeigen, die verschiedene biologische Prozesse regulieren, und in vitro Ein Zellmodell, das diese Bedingungen genau simuliert, ist für die Durchführung von Studien über hypoxische Zell- und Tumorreaktionen auf therapeutische Mittel wesentlich.

    Monolayer-Kulturen etablierter Zelllinien aus humanen Tumoren werden häufig zur Untersuchung der verschiedenen molekularen Prozesse verwendet, einschließlich der Identifizierung spezifischer molekularer Läsionen im Zusammenhang mit der Dysregulation der Zellproliferation und dem Zelltod, den beiden wichtigen funktionellen Zielen für die Entwicklung von Therapien. Leider können mit diesem am weitesten verbreiteten Laborsystem Untersuchungen, die für die Entwicklung und/oder Bewertung einiger therapeutischer Strategien notwendig sind, nicht durchgeführt werden, da Komplexitäten, die sich aus der dreidimensionalen Organisation solider Tumoren (nämlich Zelle-Zelle/Zelle) ergeben, -Matrix-Interaktionen und Variationen im Gefäßsystem und der Nährstoffversorgung), die zu subtilen Veränderungen der phänotypischen Expression (insbesondere der metabolischen Veränderungen) führen, werden in den Monolayer-Kulturen, die aus Tumorzellen gewonnen werden, nicht bereitgestellt. Im Gegensatz dazu bieten mehrzellige Sphäroide von Tumorzellen eine hervorragende dreidimensionale in vitro Modell, in dem hypoxische Bedingungen erzeugt werden können, um detaillierte Untersuchungen einschließlich der Reaktion auf verschiedene chemische Agenzien und Strahlung zu erleichtern [5, 6].

    Sphäroide zeichnen sich durch eine hohe Zelldichte und eine dicht gepackte, tumorähnliche 3-D-Struktur aus, die zu starken Diffusionseinschränkungen für Moleküle so klein wie Glukose und Sauerstoff führt, wodurch heterogene Zellsubpopulationen mit aktiv proliferierenden sowie ruhenden, hypoxische und nekrotische Zellen, wie sie in soliden Tumoren vorkommen [7]. Verfügbare Beweise deuten darauf hin, dass eine niedrige Konzentration von Glukose und Sauerstoff in den inneren Regionen von Sphäroiden zur Bildung von ruhenden, hypoxischen, anoxischen und nekrotischen Zellsubpopulationen beitragen kann [8–10]. Die Charakterisierung der Natur dieser Zell-Subpopulationen sowie ihrer Reaktionen auf Strahlung und radioaktive Stoffe kann bei der Entwicklung wirksamerer Strategien zur Radiosensibilisierung helfen. Beispielsweise ist bekannt, dass hypoxische Zellen einen großen Teil ihrer Energie aus glukoseabhängigen anaeroben Stoffwechselwegen beziehen. Daher könnten Inhibitoren der Glykolyse die Reaktionen dieser resistenten Subpopulation von Krebszellen spezifisch modifizieren. Eine Anzahl von in vitro Studien haben tatsächlich gezeigt, dass 2-DG, ein Glucoseanalogon und Inhibitor der glykolytischen ATP-Produktion [11-13], selektiv energieabhängige DNA-Reparatur- und Zellwiederherstellungsprozesse in Krebszellen hemmt [14-16], was zu einem verstärkten Zelltod führt [11 , 13, 17, 18]. Sphäroide könnten ein sehr nützliches Modell sein, um die Mechanismen der durch diesen glykolytischen Inhibitor in soliden Tumoren induzierten Strahlenempfindlichkeit weiter zu verstehen, da Sphäroide die soliden Tumoren genauer nachahmen als die Monolayer-Kultur.

    Sphäroide wurden für ein breites Spektrum von Studien in der Krebsbiologie verwendet und in strahlenbiologischen Untersuchungen ausgiebig eingesetzt [19], da sie eine gute in vitro System zur Nachahmung der strahlenresistenten hypoxischen Zellpopulation, die im Allgemeinen in Tumoren gefunden wird. Leider sind jedoch detaillierte Informationen über die interzelluläre Variation der mitochondrialen Masse, Aktivität und ROS-Spiegel (oxidativer Stress, der hauptsächlich für durch niedrige LET-Strahlung verursachte Schäden verantwortlich ist) als Funktion des Sphäroidwachstums und in Bezug auf andere Parameter wie Zelltod der Lebensfähigkeit usw. in Kultur verfügbar mangelt. Diese Parameter beeinflussen die Endergebnisse von in vitro Studien, die darauf abzielen, die Tumorreaktion auf verschiedene zytotoxische Wirkstoffe und metabolische Inhibitoren zu verstehen. Daher wurde die vorliegende Studie durchgeführt, um aus einer humanen Gliomzelllinie BMG-1 etablierte Sphäroide [11, 20] in Bezug auf Organisation, Wachstum, Lebensfähigkeit und Zellüberleben, Zelltod, metabolischen und mitochondrialen Status, oxidativen Stress und Strahlung systematisch zu charakterisieren Reaktion mit Alter und Sphäroidgröße unter Verwendung von Mikroskopie, Durchflusszytometrie und enzymatischen Assays.

    Die Ergebnisse der vorliegenden Studien zeigen die Entwicklung von S-negativen Zellen, reduzierte endogene und strahlungsinduzierte ROS neben Veränderungen der Spiegel von anti-(Bcl2)- sowie pro-(Bax)-apoptotischen Regulatoren, die in Sphäroiden beobachtet wurden, was auf die komplizierte/komplexe Natur von endogene sowie induzierte Stressresistenz, die in Tumoren vorhanden sein könnte, die zur Therapieresistenz beitragen.


    Methoden: Krebssphäroidkultur

    Krebszelllinien wurden in Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks gehalten, bevor sie einer Sphäroidkultur unterzogen wurden. Um Krebssphäroide zu bilden, wurden Zellen in Nunclon Sphera 96-Well-U-Boden-Platten mit einer Dichte von 100–5.000 Zellen/Well in 200 μl/Well Gibco DMEM mit GlutaMAX Supplement und 10 % FBS, 1X MEM Non-Essential Amino Acids ausgesät , 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 25 mM HEPES. Unbehandelte Platten wurden in ähnlicher Weise in das komplette DMEM-Medium, das 3% Methylcellulose enthielt, ausgesät. Die Platten wurden kurz bei 250 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden dann bei 37 °C und 5 % CO . inkubiert2, und alle 72 Stunden durch vorsichtiges Entfernen von 100 ul Medium aus jeder Vertiefung und Auffüllen mit 100 ul frischem Wachstumsmedium mit einer Mehrkanalpipette gefüttert. Die Bildung und das Wachstum von Sphäroiden wurden unter Verwendung eines Invitrogen EVOS-Bildgebungssystems untersucht.


    Einführung

    In den letzten drei Jahrzehnten wurden dreidimensionale (3-D) Zellkulturen sowohl normalen als auch bösartigen Ursprungs zunehmend als in vitro Systeme in der Organogenese und biomedizinischen Forschung. Im Gegensatz zu konventionellen, homogenen Monolayer- oder Suspensionskulturen können dreidimensionale Kulturen spezifische biochemische und morphologische Merkmale ähnlich den entsprechenden Geweben erhalten in vivo und kann über viele Wochen in einem differenzierten, aktiven Funktionszustand verbleiben. Ein großer Vorteil der Etablierung dreidimensionaler, kugelförmiger Aggregate aus permanenten Zelllinien besteht darin, dass grundlegende Mechanismen des Zellwachstums, der Zellproliferation und der Differenzierung in einem reproduzierbaren Format mit einer internen Umgebung, die durch den Stoffwechsel und die adaptiven Reaktionen der Zellen bestimmt wird, untersucht werden können. Somit besitzen Aggregate ein dreidimensional organisiertes komplexes Netzwerk, das Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen in Verbindung mit einer wohldefinierten morphologischen und physiologischen Geometrie zeigt, die interne Kriterien wie Zellform, Größe, Verteilung von Organellen oder . beeinflusst enzymatische Aktivität. Diese „säkulare Heterogenität“ ( 78 ) sollte von der klonalen Zellheterogenität unterschieden werden und spiegelt sich eher in 3D- als in 2D-Kultursystemen wider.

    Seit ihrer ersten Einführung in den frühen 70er Jahren durch Sutherland und Mitarbeiter ( 189 ,B 86 ) haben multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS) eine grundlegende Bedeutung in der experimentellen Krebsforschung gewonnen, wobei sich die überwiegende Mehrheit der bisherigen Studien auf das Ansprechen von Tumorzellen auf verschiedene Behandlungsmodalitäten konzentrierte ( Rezensionen siehe: 135 187 99 31 31 58 ). Neben therapeutisch orientierten Untersuchungen hat sich der Einsatz von MCTS auf andere Bereiche der grundlegenden Zellbiologie und Pathophysiologie wie interzelluläre Kommunikation, Zellinvasion, Angiogenese und Neovaskularisation ausgeweitet (Rezension: 22 48 141 ). In ähnlicher Weise wurden in den letzten 10 Jahren Untersuchungen zu mikroökologischen und epigenetischen Mechanismen intensiviert, die an der Regulation von Zellproliferation, Differenzierung, Zelltod und Genexpression beteiligt sind (1 102 136 ).

    Obwohl 3D-Kultursysteme wie multizelluläre Tumorsphäroid-Monokulturen als nachahmend angesehen werden, in vivo Mikromilieu kleiner avaskulärer Tumoren, ein Großteil der biologischen Komplexität der in vivo Situation geht verloren. In der Organogenese wurden beispielsweise zahlreiche Berichte veröffentlicht, die sich mit der Rolle des Mesenchyms und seiner extrazellulären Matrix befassen. Es ist bekannt, dass fibroblastisches Mesenchym nicht nur prä- und postnatal entscheidend für die Entwicklung des Integumental-, Harn-, Magen-Darm-, Skelett- und Urogenitalsystems ist, sondern auch spezifische Muster der epithelialen Morphogenese und Zytodifferenzierung wie die Expression gewebespezifischer sekretorischer Proteine ​​( zur Überprüfung: 42 ). Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass das komplizierte makromolekulare Netzwerk der ECM, das überwiegend von Stromazellen produziert und sezerniert wird, eine entscheidende Rolle bei der Zell-/Epitheldifferenzierung und der gewebespezifischen Genexpression als positiver oder negativer Regulator spielt. Für parenchymale Organe kann die Mikroumgebung somit als eine Funktionseinheit definiert werden, die aus dem Epithel, der darunter liegenden Basalmembran und dem darunter liegenden Stroma besteht. Dennoch wurden Fibroblasten eher als Ziele der Tumorzellinvasion als bei der Tumorzelldifferenzierung untersucht. Die Möglichkeit, dass neu auftretende oder etablierte Karzinome durch ihre bindegewebige Umgebung reguliert werden können, ist erst seit kurzem in den Fokus gerückt.

    Neben Endothelzellen, die hauptsächlich an der Tumorangiogenese und Neovaskularisation beteiligt sind (zur Übersicht: 52 129 22), stellen tumorassoziierte immunkompetente Zellen eine wichtige Zellpopulation dar, die als negative oder positive Einflussfaktoren auf das Wachstum und die Vermehrung von Tumorzellen angesehen werden kann ( 128 ) .

    Neben aktuellen Daten zu klassischen Forschungsthemen zu MCTS-Monokulturen wird dieser Review die Arbeit mit heterologen Kokulturen hervorheben. Ein Überblick über die technischen Aspekte der Arbeit mit homologen und heterologen Kulturen wird gegeben, um einen Einblick in die Praktikabilität der Gewebekulturmethode zu geben. Wir beabsichtigen zu zeigen, dass ein dreidimensionales kontrolliertes Modellsystem, das sowohl normale als auch Tumorzellen und deren Produkte umfasst, ein Verständnis des Tumormikromilieus bietet, das geeignet ist, um neue Strategien zur Krebsbekämpfung zu testen in vitro, was zwei therapeutische Ziele ermöglicht, die Tumorzelle und ihre Umgebung.


    Maligne Zelllinien zeichnen sich oft dadurch aus, dass sie mehrzellige Sphäroide bilden können. Sphäroide können durch Aussäen einer Zellsuspension auf einer mit Agarose beschichteten Petrischale erzeugt werden. Nach einigen Tagen bilden sich mehrere kleine Tumorsphäroide, die jedoch unterschiedliche Durchmesser haben und nach Größe getrennt werden müssen. Um eine einheitliche Sphäroidgröße zu gewährleisten, werden in einer alternativen Versuchsanordnung gleiche Volumina von Tumorzellsuspensionen in mit Agarose beschichtete Wells einer Mikrotiterplatte pipettiert. Am tiefsten Punkt der Krümmung dieser Agarose-Oberflächen wird letztlich nur ein Sphäroid pro Well gebildet. Darüber hinaus können Sphäroide nach der Initiierung auch in Spinnerflaschen umgefüllt werden, was für eine bessere Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff sorgt. Einige Zelllinien können auch direkt aus einer in Spinnerflaschen kultivierten Zellsuspension Sphäroide bilden.

    MCTS haben eine kugelförmige Struktur. Die Proliferationsrate der Zellen in einem Sphäroid korreliert mit der Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff. Die äußere Schicht des Sphäroids besteht aus proliferierenden Tumorzellen. Die mittlere Schicht besteht aus Zellen, die sich in der G0-Phase befinden. Due to the gradients of nutrients, metabolites and oxygen falling towards the center, central necrosis develops in the vicinity of the center.