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RACE PCR-Produkt

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Ich bin ein Molekularbio-Neuling und versuche, die Unterschiede zwischen regulärer PCR und RACE-PCR zu verstehen. Wenn ich mein PCR-Produkt sequenzieren wollte, das Hunderte, wenn nicht Tausende von bps lang sein könnte, sollte ich RACE PCR richtig verwenden? Mein Ziel ist es, das aktive Zentrum einiger Enzyme zu sequenzieren, an denen ich interessiert bin, aber ich bin mir nicht sicher, wie ich PCR-Primer für eine bestimmte Stelle an meinem Protein entwerfen soll. Außerdem ist das aktive Zentrum über 100 Aminosäuren lang, was bedeuten würde, dass mein PCR-Produkt über 300 bps lang sein muss. Reguläre PCR-Amplikons haben Probleme, lange DNA-Stränge richtig zu amplifizieren? Ich dachte darüber nach, mit RACE-PCR meinen gesamten cDNA-Strang mit einer Länge von 4000 bps zu amplifizieren und dann nur das RACE-Produkt zu sequenzieren. Würde RACE für so viele bps in meiner cDNA funktionieren?


Nach Ihrer Posthistorie zu urteilen, möchten Sie vielleicht ein Einführungsbuch in die Molekularbiologie nehmen. Diese Frage stellt wirklich viele Fragen. Ich werde versuchen, den Unterschied zwischen PCR und RACE zu beantworten, und ich würde vorschlagen, die anderen als separate Fragen zu stellen, wie @dd3 vorgeschlagen hat.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist die grundlegende Methode zur Amplifikation einer kleinen DNA-Menge (der Matrize) in eine exponentiell große DNA-Menge. Diese Methode setzt die Kenntnis der Sequenz von (mindestens) der DNA-Regionen voraus, die flankieren, was Sie amplifizieren möchten. Unter Verwendung dieser flankierenden Sequenzen werden zwei kurze Oligonukleotide (zB 18-24 Nukleotide), Primer genannt, so angeordnet, dass ein Primer mit dem 5'-Strang am Anfang der Sequenz übereinstimmt, während der andere Primer mit dem 3'-Strang am Ende übereinstimmt der Folge. Wenn diese Primer zusammen mit der Matrizen-DNA und einem DNA-Polymerase-Enzym gemischt und spezifischen Temperaturzyklen unterzogen werden, tritt eine Amplifikation auf.

Die RACE-PCR ist eine spezifische Art der PCR. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) PCR wird verwendet, wenn der zu amplifizierende Matrizenstrang eine spezifische mRNA-Botschaft ist. Mit anderen Worten, diese Form der PCR erzeugt eine DNA-Kopie der cDNA aus einem mRNA-Ausgangsprodukt. Die genauen Details von RACE hängen davon ab, welchen Typ Sie verwenden möchten und können an anderer Stelle nachgeschlagen werden.


Klonen von RACE-Produkten im TOPO-Vektor - (20. November 2006)

Ich versuche, 3' und 5' RACE-Fragmente im TOPO-Vektor zu klonen.

Ich amplifizierte Fragmente durch RACE-PCR mit einer Korrektur-Polymerase, reinigte die Fragmente und klonte sie A-tailed und dann klonierte ich sie in den PCR4 TOPO-Vektor von invitrogen. Ich überprüfte die Klone durch PCR mit den T3 T7-Primern. Die PCR zeigt das Vorhandensein eines Inserts in allen Klonen. Das Problem ist, dass ich keine Amplifikation erhalte, wenn ich meine spezifischen Primer auf den Klonen verwende, obwohl ich mit denselben spezifischen Primern auf dem PCR-Produkt vor dem Klonen eine gute Amplifikation habe.

Hat jemand eine Idee, was in diesem Klonexperiment vor sich geht? Was kann ich tun?

Ich weiß nicht, was los ist, aber der einfachste Weg, dies herauszufinden, besteht darin, einige Ihrer Klone mit T3- und T7-Primern zu sequenzieren und zu sehen, was da ist. Entweder zuvor oder parallel dazu möchten Sie möglicherweise einen Teil Ihrer DNA mit flankierenden Schneideenzymen verdauen, um sicherzustellen, dass Ihr Plasmid einheitlich ist und ein Insert der erwarteten Länge aufweist.


Rasse und Gene

Erforschung der Interaktion von Genen und Kultur bei der Erstellung des Rassebegriffs.

Kontext

In dieser Lektion werden die Schüler über das Konzept der "sozialen Konstruktion von Rasse" nachdenken. Dieser Satz bezieht sich auf die weit verbreitete Praxis, Menschen in eine Kategorie namens "Rasse" einzuteilen und zu glauben, dass es sich um eine wissenschaftliche Eigenschaft handelt. Es ist nicht. Rasse ist ein politisches Konzept und eine politische Praxis, die Menschen auf eine Weise gruppiert, die die vorherrschenden Machtinteressen einer Gesellschaft widerspiegelt, basierend auf oberflächlichen Merkmalen des Aussehens von Menschen.

Um zu verstehen, wie DNA, Umwelt und Kultur interagieren, um die menschliche Variation zu beeinflussen, untersucht die Klasse die grundlegenden Komponenten der modernen Biologie, indem sie sich das Video Our Molecular Selfs ansieht. Zuvor bereiten sie sich mit zwei schnellen, motivierenden Übungen vor. Anschließend sehen sie sich das Video gemeinsam an, um ein gemeinsames Basiswissen über DNA und das menschliche Genom zu entwickeln. Anschließend werden sie ein Schülerblatt ausfüllen, um die wichtigsten biologischen Merkmale des zentralen Dogmas der Biologie zu notieren: DNA macht RNA macht Proteine ​​und Proteine ​​​​übernehmen alle zellulären Aufgaben, die die Form und Funktion eines Organismus bestimmen.

Um ihr Verständnis zu entwickeln, wenden sie ihr Wissen und ihre Reflexionen in einer Schreibübung "Lernbrief" an. Dazu schreiben sie der ältesten Person, die sie kennen, mit ihren Gedanken zu diesem Zitat: "Wenn Sie beginnen, die Biologie der menschlichen Variation zu verstehen, müssen Sie sich fragen, ob Rasse eine gute Möglichkeit ist, dies zu beschreiben."

Beachten Sie, dass das Online-Video Our Molecular Selfs kurz ist, 3,5 Minuten, aber dennoch sehr informationsreich über die Grundlagen der DNA-, RNA- und Proteinproduktion ist. Es bewegt sich schnell. Planen Sie, es zweimal anzusehen. Erstens als Gruppe, zweitens, wenn die Schulressourcen dies zulassen und genügend Computerzugriff vorhanden ist, mit den Schülern, die alleine oder in kleinen Gruppen arbeiten. Sie können es aber auch als Gruppe ein zweites Mal als reflexive Vorbereitung auf das Ausfüllen des Schülerbogens anschauen, um sich mit den biologischen Grundlagen der Variation vertraut zu machen.

Es gibt viele falsche Vorstellungen über Gene und Rasse, seien Sie also wachsam für häufige Fehlannahmen wie:

  1. Falsch: Rasse ist ein wissenschaftlicher Begriff. Wahr: Rasse ist eine kulturelle Konstruktion, die beschreibende Meinungen verwendet, nicht wissenschaftliche Beweise.
  2. Falsch: Es gibt ein Rassegen und daher separate Genome für verschiedene Rassen. Wahr: Alle Menschen haben im Wesentlichen die gleichen Gene, die zusammenfassend als menschliches Genom bezeichnet werden. Wir sehen anders aus, weil in jedem von uns unterschiedliche merkmalsspezifische Gene aktiviert werden, die leicht unterschiedliche Proteine ​​​​bilden, die eine einzigartige Person schaffen.
  3. Falsch: Organismen und damit Menschen sind ausschließlich ein Produkt ihrer Gene. Wahr: In den letzten Jahren hat die Wissenschaft der Epigenetik harte, zuverlässige Laborbeweise für die Rolle von Umwelteinflüssen auf die Genexpression geliefert. Dies bedeutet, dass die DNA von "äußeren Akteuren" in der Umgebung jenseits der Zelle beeinflusst wird, wie z. B. Stress &mdasheither emotional oder physiologisch (zum Beispiel schlechte Ernährung).

Vorausplanen

Hier sind einige Websites, die Sie vor der Lektion konsultieren können, um Ihnen bei der Anleitung zu helfen:

Motivation

Beginnen Sie die Lektion mit diesen beiden Schnellstart-Übungen, die die Schüler visuell dazu anregen, die beiden Hauptideen dieser Einheit vorzustellen: 1) dass Menschen eine Spezies sind, die ein gemeinsames Genom haben, und 2) Menschen aufgrund von Unterschieden in der Genexpression und den Auswirkungen stark variieren Epigenetik und Kultureffekte.

Schnellstart 1: Einführung in das Konzept der biologischen Phänotypen. Der Phänotyp bezieht sich auf die äußeren anatomischen Merkmale eines Organismus und ist bestimmt durch den Genotyp&ndashden Satz von Genen&ndashdie Zellen des Organismus enthalten. Hören Sie auf die Vorurteile und Verwirrung der Schüler über Rassen, indem Sie das Familienporträt aus diesem Blogbeitrag Warum phänotypische Rassen nicht verschwinden können auf einem Overhead-Projektor oder SmartBoard anzeigen. Notiz: Der Text des Blogposts selbst ist in seinem Schreibstil und dem Grad der genetischen Analyse ziemlich fortgeschritten. Konzentrieren Sie sich während der Klassendiskussion auf das Bild und fragen Sie: "Was sehen Sie? Beschreiben Sie, wie diese Familie aussieht. Diese Mädchen sind Zwillinge, die zur gleichen Zeit von denselben Eltern geboren wurden. Sie sehen jedoch sehr unterschiedlich aus. Nennen Sie die Merkmale, die Sie sehen, und mit welcher geographischen Region der Erde du sie in Verbindung bringen könntest." Tipps zur Führung der Diskussion finden Sie in den Aufforderungen zu Renndiskussionen und Lehrpunkten.

Schnellstart 2: Erkunden Sie die Subjektivität von Rassenklassifizierungen. Projizieren Sie als Klasse eine Internet-Site-Übung auf den Overhead oder das SmartBoard, um die Herausforderung Sorting People anzunehmen, basierend auf einem von PBS im Fernsehen übertragenen Special über das Rennen. Es ist eine Drag-and-Drop-Übung, bei der die Teilnehmer gebeten werden, Gesichtsbilder von Menschen in eine von vier allgemein wahrgenommenen "Rassenkategorien" zu sortieren, die die Gesellschaft und nicht die Biologie organisiert hat. Die Site Sorting People bietet Feedback über das tatsächliche Erbe der Personen, deren Gesichter sortiert wurden. Dies entfacht eine produktive Diskussion über die Fehlbarkeit von rassischen Annahmen als sinnvolle Informationskategorie. Betonen Sie, dass Rasse eine kulturelle Kategorie ist, die von Menschen gebildet wird, und kein biologisch bedingtes wissenschaftliches Merkmal. Es gibt kein Rassegen oder eine Reihe von Genen.

Einige Diskussionsfragen, um Ihre Schüler zu motivieren und durch ihren Lernprozess zu führen:

  • Waren Sie überrascht, wie schwierig es war, bei dieser Aktivität Phänotypen (wie Menschen aussahen) mit ihren "Rassenkategorien" zuzuordnen?
  • Glaubst du, dass "Rasse" sozial konstruiert ist? Wenn ja, wie wirkt sich das Konzept der Rasse noch immer auf das Leben der Menschen aus? Wenn nicht, wie definieren Sie Rasse?
  • Warum, glauben Sie, haben Menschen und Gesellschaften Rassenkategorien geschaffen?
  • Diskutieren Sie: Wie stark beeinflusst die genetische Ausstattung die Rassenwahrnehmung? Wie viel Einfluss hat Kultur? Inwieweit spielen andere äußere Einflüsse (Stress, Umwelt etc.) eine Rolle?

(Die Antworten können variieren. Fordern Sie die Schüler auf, ihre Antworten zu erläutern.)

Als Gruppe durchgeführt, hat die Übung das Potenzial, eine laute Umgebung zu schaffen. Verwalten Sie es frühzeitig, indem Sie die Regeln der Übung erklären, bevor Sie beginnen, und sie durchsetzen. Die Schüler werden abwechselnd ein Gesicht sortieren, wie es von Ihnen aufgerufen wird. Wenn Schüler respektvoll in der Lage zu sein scheinen, als selbstregulierte Gruppe lockerer zu reagieren, ohne dass Sie jeweils einen Schüler aufsuchen, ist dies eine wünschenswerte Option. Die beiden festen Regeln dieser Übung sind 1) die Wahl der Kategorie jedes Schülers zum Sortieren zu respektieren und 2) keine abfälligen Bemerkungen über Gruppen, Einzelpersonen oder Eigenschaften zu tolerieren. Weitere Ideen zum Umgang mit sensiblen Themen im Unterricht finden Sie in unserer Ressource, Gespräche effektiv managen.

Am Ende dieser beiden Schnellstart-Motivationsübungen, im Unterricht oder als Hausaufgabe, sollten die Schüler über die Konzepte und Gefühle reflektieren, die die Übungen durch das Ausfüllen des Schülerblatts Race: Genes & Culture hervorgebracht haben. Dies ist eine hilfreiche Inhaltsressource, auf die sie beim Verfassen des Lernbriefs nach Hause verweisen können, der in Entwicklung beschrieben wird. Antworten auf die Fragen finden Sie auf dem Lehrerblatt Race: Genes & Culture. Die Schüler sollten diese Ressourcen verwenden, um das Schülerblatt auszufüllen:

Entwicklung

Der Fokus liegt hier auf der Rassenbiologie, die durch das Zusammenspiel von Genen und Umwelt bestimmt wird. In der Motivationssitzung entwickelten die Schüler ein Bewusstsein dafür, dass das Konzept der Rasse eine kulturelle Konstruktion aus Meinungen, Gewohnheiten und manchmal Vorurteilen ist und nicht in den biologischen Beweisen der DNA verwurzelt ist. Jetzt schauen wir uns wissenschaftliche Beweise für genetische Unterschiede an, um die Lernziele zu erforschen: 1) die genetische Ähnlichkeit aller Menschen zu verstehen, die ein einziges menschliches Genom teilen, und 2) die Grundlagen des zentralen Dogmas der modernen Biologie zu verstehen, wo DNA RNA produziert Proteine.

Sehen Sie sich als Klasse das DNA-Video mit dem Titel Our Molecular Selfs an.

Weisen Sie die Schüler dann einzeln, im Unterricht oder als Hausaufgabe zu arbeiten, um das Video noch einmal anzusehen, damit sie den Race: DNA-Schülerbogen ausfüllen können. Wenn die Computerressourcen begrenzt sind und dies nicht möglich ist, können Sie es sich auch als Gruppe erneut ansehen, indem Sie häufig pausieren, um das Video zu beschleunigen und den Schülern Zeit zu geben, Informationen für das Schülerblatt zu erfassen.

Das Ausfüllen des Schülerbogens hilft ihnen, die Schreib- und Wissenschaftskommunikationskomponente dieser Lektion auszuführen. Sie können ihre Bereitschaft mit dem Race: DNA-Lehrerblatt überprüfen. Sobald sie eine Wissensbasis aufgebaut haben, sollen sie einen Lernbrief an ein Familienmitglied oder ein erweitertes Familienmitglied schreiben.

In dem Lernbrief müssen sie: 1) drei wissenschaftliche Fakten über Gene und Rasse aus ihren Studien in dieser Einheit teilen 2) eine Illustration zeichnen, die die wichtigsten Elemente der DNA, RNA und des Proteinherstellungsprozesses kennzeichnet, und 3) eine Stellungnahme an die schreiben älteste Person, die sie kennen, gestützt auf Fakten, die auf diesem Zitat basieren: "Wenn Sie beginnen, die Biologie der menschlichen Variation zu verstehen, müssen Sie sich fragen, ob Rasse eine gute Möglichkeit ist, dies zu beschreiben." Sobald die Briefe geschrieben sind, sollten die Schüler ihre Briefe in kleinen Gruppen oder als Klasse teilen.

Bevor die Schüler ihre Briefe mit „der ältesten Person, die sie kennen“ teilen, möchten Sie die Schüler vielleicht darauf aufmerksam machen, dass sie möglicherweise heftige Reaktionen von dieser Person bekommen. Die Schüler können auch die Ressource „Konversation effektiv managen“ nutzen, um Hinweise darauf zu erhalten, wie sie ein respektvolles Gespräch über ein sensibles Thema führen können.

Gehen Sie einige Tage später das Thema noch einmal durch, indem Sie die neuen Informationen dazu hinzufügen, wie Familienmitglieder auf die Briefe und das Thema reagiert haben. Müssen die Schüler ihren Briefen noch mehr hinzufügen? Wenn ja, ist das Umschreiben eine ausgezeichnete Option.

Bewertung

Um das Verständnis der Schüler über die wichtigsten Benchmark-Ideen über die gemeinsame genetische Einheit der menschlichen Spezies und die Rolle von DNA und RNA bei der Bestimmung der Form und Funktion unseres Körpers zu beurteilen, sollten die Schüler ihr Schüler-E-Sheet verwenden, um die Online-Studie Human Variation . zu besuchen Quiz.

Wenn Sie fertig sind, projizieren Sie die Site auf den Overhead und gehen Sie die 10 Fragen und Antworten gemeinsam als Klasse durch, und prüfen Sie sowohl auf Wissensbeherrschung als auch auf Missverständnisse.

Erweiterungen

Diese Science NetLinks-Lektionen können als Erweiterungen verwendet werden:

Um eine persönlichere Lernerfahrung zu haben, bei der die Schüler ihren eigenen Standpunkt und ihre Erfahrungen mit Rasse und ihren sozialen Auswirkungen erkunden, versuchen Sie diese "Speed-Dating" -Konversationsaktivität. Dies ist eine nützliche Methode, um sensible Themen anzusprechen und gegenseitiges Verständnis und Empathie unter Ihren Schülern aufzubauen. Es erfordert eine respektvolle Umgebung, in der sich die Schüler sicher fühlen. Lassen Sie nach Abschluss der Aktivität genügend Zeit für Diskussion und Bearbeitung.

Die Schüler sitzen in zwei Reihen einander gegenüber. Ein Schüler hat zwei Minuten Zeit, um auf eine persönliche Frage zu Rasse und ihren sozialen Auswirkungen zu antworten. Der andere Schüler hört aktiv zu, ohne verbal zu antworten. Nach zwei Minuten spricht der zweite Schüler und der erste hört zu. Nach der ersten Runde bewegen die Schüler einer Reihe einen Stuhl nach rechts und die Aktivität wird mit einer neuen Frage wiederholt.


Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Biologische Hinweise zur PCR

Die PCR stellt ein einfaches und geniales Verfahren zur exponentiellen Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen durch in vitro-DNA-Synthese bereit, d. h. diese Technik hat es ermöglicht, große Mengen von DNA-Fragmenten zu synthetisieren, ohne sie zu klonen.

Kary Mulis entwickelte 1985 die Technik basierend auf der Verwendung eines Enzyms, das als Taq DNA Polymerase bezeichnet wird. Die PCR-Technik ist jetzt automatisiert und wird von einer speziell konstruierten Maschine durchgeführt.

Die Technik umfasst die folgenden drei Schritte (Abb. 22.16):

ich. Denaturierung des DNA-Fragments:

Die zu amplifizierende Ziel-DNA, die die zu amplifizierende Sequenz enthält, wird hitzedenaturiert (ca. 94°C für 15 Sekunden), um ihre komplementären Stränge zu trennen. Dieser Vorgang wird als Schmelzen der Ziel-DNA bezeichnet.

ii. Glühen von Primern:

Primer werden im Überschuss zugegeben und die Temperatur wird 60 Sekunden lang auf etwa 68 °C gesenkt, als Ergebnis bilden die Primer die Wasserstoffbrückenbindungen und annealen an die DNA auf beiden Seiten der DNA-Sequenz.

Schließlich werden der Reaktionsmischung verschiedene Nukleosidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) und eine thermostabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus und Vent-Polymerase aus Thermococcus litoralis) zugesetzt, die den Polymerisationsprozess von Primern unterstützt und somit , verlängert die Primer (bei 68 °C), was zur Synthese mehrerer Kopien der Ziel-DNA-Sequenz führt.

Nach Beendigung all dieser Schritte in einem Zyklus wird wiederum der zweite Zyklus nach demselben Verfahren wiederholt. Wenn 20 solcher Zyklen auftreten, werden etwa eine Million Kopien der Ziel-DNA-Sequenz hergestellt. In letzter Zeit wurde diese Technologie viel weiter verbessert, wobei anstelle der Taq-Polymerase die rTth-Polymerase verwendet wird, die RNA in DNA transkribiert und anschließend die DNA amplifiziert.

Modifizierte Formen der PCR:

Die konventionelle PCR ist die symmetrische PCR-Technik. Es gibt einige andere modifizierte Formen der PCR, die für verschiedene Zwecke verwendet werden:

AP-PCR (arbiträr geprimte Polymerase-Kettenreaktion):

Es erfordert nur einen einzigen Primer von relativ viel geringerer Länge im Vergleich zu den in der PCR verwendeten Primern. Diese Tech­nique wird für DNA-Profiling, in der Tier- und Pflanzenbiotechnologie sowie in der Rechtsmedizin eingesetzt.

Zielsequenzen eines Strangs können im Vergleich zu seinem komplementären Strang um mehrere Größenordnungen stärker amplifiziert werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich, um einzelsträngige DNA-Fragmente zu erzeugen, die zum Sequenzieren von DNA verwendet werden sollen.

IPCR (Invertierte Polymerase-Kettenreaktion):

Bei dieser Methode ermöglicht es die Amplifikation von DNA, die eine bekannte DNA-Sequenz flankiert, wobei die Primer nach außen zeigen. Unter Verwendung der inversen PCR können die unbekannten Sequenzen, die bekannte Sequenzen flankieren, leicht amplifiziert werden.

RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion):

Obwohl die PCR-Amplifikation im Allgemeinen an der DNA-Matrize durchgeführt wird, kann mit dieser Technik auch die RNA zur Amplifikation verwendet werden. Diese Technik ist besonders nützlich, um die Expression von Genen zu untersuchen und zu unterdrücken und um die obskuren Arten von mRNA zu überwachen.

Verschachtelte PCR-Primer sind solche, die sich innerhalb des ersten Primerpaars befinden. Die größeren Fragmente, die von der ersten PCR-Runde produziert wurden, werden als Matrize für die zweite PCR verwendet. Diese Technik eliminiert alle unechten unspezifischen Amplifikationsprodukte.

Anwendung der PCR in der Biotechnologie:

PCR hat viele Anwendungsmöglichkeiten.

1. Die Amplifikation von Genfragmenten als schnelle Alternative zum Klonen:

(a) Inserts von bakteriellen Plasmiden können mit Primern amplifiziert werden.

(b) DNA aus einer bekannten Sequenz kann durch Designen von Primern erhalten werden.

(c) PCR hilft bei der Identifizierung von homologen Sequenzen von verwandten Organismen.

(d) Unter Verwendung von RT-PCR kann das 3′ Ende der cDNA amplifiziert werden (RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends).

(e) Reverse PCR hilft, die flankierenden Sequenzen eines bekannten DNA-Klons zu kennen.

2. Modifikation von DNA-Fragmenten:

Ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden als PCR-Primer bietet einen leistungsfähigen Ansatz zur Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung.

3. Diagnose von pathogenen Mikroorganismen:

DNA aus den infizierten Teilen einer Person oder eines Tieres kann einer PCR mit dem Primer-spezifischen Gen des Pathogens unterzogen werden, und die Diagnose kann bei der Amplifikation der DNA durchgeführt werden.

4. DNA-Analyse von archäologischen Proben:

Da DNA relativ stabil ist und über einen langen Zeitraum intakt bleibt, kann die PCR bei der Analyse von DNA aus diesen eingebetteten Materialien helfen.

5. Nachweis von Mutationen, die für Erbkrankheiten relevant sind:

Jede Punktmutation, eine Deletion oder eine Insertion und ein erweitertes Tandem-Trinukleotid-Repeat können durch PCR nachgewiesen werden. Somatische Mutationen in Onkogenen oder Tumorrepressorgenen können auch durch PCR mit Primern, die die Insertionen oder Deletionen flankieren, nachgewiesen werden.

6. Analyse genetischer Marker für forensische Anwendungen, für Vaterschaftstests und für die Kartierung erblicher Merkmale.

(b) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) mit willkürlichen, oft kurzen (10 bp) Primern.

7. Speziesspezifische Amplifikation von DNA-Segmenten zwischen interspersed repeat elements (IRS) unter Verwendung des Primers basierend auf der SINE-Sequenz (Short Interspersed Nuclear Elements).

8. Gentechnik mit PCR:

Mit Hilfe von PCR können wir Veränderungen oder Mutationen in das Endprodukt integrieren, indem wir Sequenzen am 5′ Ende des Primers ändern, entfernen oder hinzufügen. Durch die rekombinante PCR-Technik ist es möglich, zwei DNA-Fragmente an einer spezifischen Stelle durch komplementäre Überlappungen zu verbinden (diese Technik wird als Spleißen bezeichnet). Durch die Synthese zweier mutagener Primer, die die zu ändernde interne Stelle überspannen, ist es möglich, Mutationen innerhalb eines Fragments einzuführen.


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Das Rennen um einen ultrasensiblen Coronavirus-Test

Januar 2021 – fast ein Jahr nachdem die Centers for Disease Control and Prevention (CDC) und der Bundesstaat Washington den ersten bestätigten Fall von Covid-19 in den USA gemeldet hatten – hatte die Zahl der Todesopfer in den USA mehr als 351.000 erreicht Personen. 1 Beamte können argumentieren, was zu einer so hohen Fallzahl in diesem Land geführt hat, aber eines ist sicher: Eine SARS-CoV-2-Infektion ist wie die Krankheit, die sie verursacht, schwer zu erkennen, zurückzuverfolgen und zu besiegen.

Ein Grund für diese Wahrheit ist, dass die Infektiosität nicht unbedingt mit der Symptomatik korreliert. In vielen Fällen können Patienten das Virus lange vor oder nach dem Auftreten von Symptomen in sich tragen und es möglicherweise verbreiten, während sie selbst anscheinend gesund sind. Und laut CDC zeigen bis zu 40% der SARS-CoV-2-Träger zu keinem Zeitpunkt ihrer Infektion Symptome. 2

Für diejenigen, die Symptome zeigen, schafft die verlängerte Inkubationszeit (2 Tage bis 14 Tage) ein Fenster, in dem sich das Virus unentdeckt ausbreiten kann. 3 Darüber hinaus können rekonvaleszente Patienten, die keine klinischen Symptome mehr aufweisen, das Virus weiterhin in sich tragen und drohen vorzeitig aus der Isolation entlassen zu werden. 4

Zusammen zeigen diese Daten, dass sich die Behörden nicht allein auf klinische Symptome verlassen können, um die Ausbreitung von SARS-CoV-2 in einer Bevölkerung zu verfolgen, zu verfolgen und einzudämmen. Es ist wichtig, dass Krankenhäuser Zugang zu einem hochsensiblen Diagnosetest haben, der verdächtigen Patienten, Ärzten und Gesundheitsbehörden Gewissheit darüber geben kann, ob jemand das Virus in einem Ausmaß trägt, das eine Bedrohung für ihre Gemeinschaft darstellt.

Eine Gemeinschaft, die SARS-CoV-2-Träger genau erkennen kann, unabhängig davon, ob diese Personen Symptome aufweisen oder nicht, kann schneller handeln, um infizierte Personen unter Quarantäne zu stellen und gezielte Regeln und Richtlinien zur sozialen Distanzierung auferlegen. Leider ist die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) – die aktuelle Goldstandardmethode zum Nachweis der Viruslast bei Patienten – nicht sensitiv genug, um ein definitives Ergebnis zu liefern.

Die meisten der heute weltweit eingesetzten SARS-CoV-2-Tests basieren auf der qPCR-Technologie. Die qPCR unterliegt jedoch erheblichen Schwankungen – aus zwei Gründen. Erstens sind die Ergebnisse nur qualitativ, nicht quantitativ. Sie werden durch Vergleich mit einer Standardkurve interpretiert, deren Generierung Fehlern und Verzerrungen unterliegt. Zweitens ist die Metrik, die verwendet wird, um das Ergebnis des Tests zu definieren, unzuverlässig. qPCR bestimmt die SARS-CoV-2-RNA-Konzentration, indem die Anzahl der Amplifikationszyklen gezählt wird, die die RNA benötigt, um eine bestimmte Fluoreszenzintensitätsschwelle zu erreichen. Aber die Amplifikation kann durch PCR-Inhibitoren verringert werden, die die Zählung stören. Zusammengenommen verringern diese Probleme die Sensibilität von qPCR – und diese Probleme verursachen echte Bedenken, da die Behörden versuchen, Covid-19-Träger in den Vereinigten Staaten zu identifizieren.

Zu Beginn der Pandemie führten inkonsistente qPCR-Ergebnisse zu Massenverwirrung und Panik. Zwei frühe Patienten zeigten keine Symptome von Covid-19 und wurden zweimal mit qPCR negativ getestet, was zu ihrer Entlassung aus einem Krankenhaus in San Antonio führte. Die CDC stellte später fest, dass die Patienten immer noch ansteckend waren. 5 Seitdem ist es üblich, dass Krankenhäuser Testergebnisse mit einem Haftungsausschluss über die potenzielle Ungenauigkeit der qPCR liefern.

Aktuellen Studien zufolge liegt die Falsch-Positiv-Rate der qPCR-Covid-Diagnostik zwischen 10 und 40 %, und es ist gängige Praxis, verdächtige Patienten wiederholt zu testen, insbesondere wenn sich Symptome und Testergebnisse widersprechen. 6 Einige Patienten, die zunächst negativ testen, testen später positiv. Aufgrund der Unzuverlässigkeit von qPCR-basierten Tests sind zwei aufeinanderfolgende negative Atemwegsproben, die im Abstand von 24 Stunden entnommen wurden, das vorherrschende Kriterium, um jemanden als frei von dem Virus zu erklären. 7

All diese Verwirrung macht es schwierig, echte Covid-19-Fälle zu identifizieren und diese Informationen zu verwenden, um gezielte Eindämmungsstrategien umzusetzen. Damit Ärzte, Epidemiologen und Beamte ihre Arbeit effektiv erledigen können, müssen sie feststellen können, ob eine Person tatsächlich SARS-CoV-2 in sich trägt.

Ein sensibleres Werkzeug

Ein hochsensibles Werkzeug – die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) – kann helfen, die diagnostische Sicherheit zu erhöhen, wenn es als Ergänzung zur qPCR verwendet wird.

Im Gegensatz zur qPCR liefert ddPCR eine absolute Zählung des Virustiters, unabhängig von einer Standardkurve. Es ist auch weniger anfällig für PCR-Inhibitoren, was die ddPCR-Technologie empfindlicher macht. Die Technologie selbst wurde in der Klinik zur Überwachung von Nukleinsäure-Biomarkern bei Krebspatienten und in Forschungslabors zur Zählung von Virustitern in Pflanzen eingesetzt. Als die Pandemie ausbrach, fanden Forscher bald heraus, dass die ddPCR-Technologie ideal geeignet ist, um den SARS-CoV-2-Virustiter in Atemwegsproben zu erkennen und zu überwachen.

In der Praxis beinhaltet ddPCR die Aufteilung einer Probe in Zehntausende von Nanoliter-Tröpfchen, wobei in jedem eine separate PCR-Reaktion stattfindet. Tröpfchen, die die interessierende Sequenz enthalten, beispielsweise eine Sequenz aus dem SARS-CoV-2-Virom, fluoreszieren hell, während die Tröpfchen, die diese Sequenz nicht enthalten, nur eine schwache Hintergrundfluoreszenz emittieren. Durch Zählen der Anzahl der hellen, fluoreszierenden Tröpfchen unter allen Tröpfchen kann man die Konzentration des Virus in der Probe berechnen. Die Stärke dieser Methode liegt darin, wie die quantitativen Ergebnisse verwendet werden, um eine genauere qualitative Diagnose zu stellen. 8 Droplet Digital PCR ist hochempfindlich, was die Technologie ideal macht, um die Bestätigung von qPCR-Ergebnissen zu unterstützen und unabhängig zur Früherkennung und laufenden Überwachung des Virus bei Patienten beizutragen.

Viele Forscher, die vor der Pandemie ddPCR-Plattformen in ihren Labors hatten, untersuchten die Kinetik von SARS-CoV-2 bei menschlichen Patienten und korrelierten ihre Ergebnisse mit klinischen Symptomen. Besorgt über die Häufigkeit falsch positiver Ergebnisse bei qPCR-Tests und bereits mit der überlegenen Sensitivität von ddPCR bei anderen Anwendungen vertraut, begannen einige Forscher, die Fähigkeit der beiden Plattformen zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in menschlichen Proben zu vergleichen.

Forscher der Universität Wuhan in China untersuchten die Sensitivität von qPCR und ddPCR für den Nachweis des Virus bei verdächtigen und rekonvaleszenten Patienten. 9 Aufgrund der Prävalenz asymptomatischer Träger und negativer qPCR-Tests bei Patienten mit klinischen Symptomen in ihrem Krankenhaus befürchtete das Forschungsteam, dass Ärzte, die qPCR zum Nachweis des Virus verwendeten, eine erhebliche Anzahl von Fällen übersehen. Gleichzeitig gab es Bedenken, dass rekonvaleszente Patienten aus dem Krankenhaus entlassen wurden, bevor das Virus abgeklungen war und die Menschen um sie herum dem Lebendvirus ausgesetzt waren.

In ihrer Studie testeten die Forscher Rachenabstriche von 63 verdächtigen ambulanten Patienten und 14 mutmaßlichen Rekonvaleszenten. Jede Probe wurde gleichzeitig unter Verwendung der qPCR- und ddPCR-Technologie mit den gleichen Primern und Sonden getestet. Unter den 63 verdächtigen Patienten wies qPCR 21 positive Fälle und ddPCR 49 auf. 24 Patienten, die anfangs negativ mit qPCR, aber positiv mit ddPCR getestet wurden, entwickelten später klinische Symptome der Krankheit. Sie wurden schließlich ins Krankenhaus eingeliefert und frühestens 2 Tage nach ihrem Krankenhausaufenthalt mit qPCR positiv getestet. Weitere sieben Patienten, deren Proben falsch positive Ergebnisse lieferten, wurden unter Quarantäne gestellt und eine Woche oder später schließlich positiv mit qPCR getestet.

Die Wuhan-Forscher führten auch serielle Verdünnungen durch, um die Nachweisgrenze von qPCR bzw. ddPCR zu testen. qPCR konnte nur 837,2 Kopien der Virussequenz pro Reaktion nachweisen, während ddPCR nur 1,8 Kopien pro Reaktion nachweisen konnte. In einer zweiten Studie an der Universität Wuhan grenzten Forscher die Parameter der Sensitivität von ddPCR beim Nachweis des Coronavirus ein. 10 ddPCR konnte SARS-CoV-2 in 10 –4 und 10 –3 verdünnten Patientenproben nachweisen, während qPCR dies nicht war.

Unterdessen beschäftigten sich Forscher der Johns Hopkins University mit der Möglichkeit, dass qPCR falsch positive Ergebnisse liefert, insbesondere bei wiederholten Tests bei einzelnen Patienten. 8 Zwischen dem 11. März und dem 11. Mai 2020 führte das Johns Hopkins Hospital Microbiology Laboratory etwa 500 Covid-19-Tests pro Tag durch. Etwa 2.194 verdächtige Patienten wurden mehr als einmal getestet und lieferten oft inkonsistente oder unerwartete Ergebnisse. 1.788 verdächtige Patienten, die wiederholt mit qPCR getestet wurden, ergaben beispielsweise jedes Mal negative Ergebnisse, aber als die Forscher 198 dieser negativen Proben mit der ddPCR-Technologie testeten, waren 11 positiv.

Forschungen an der Universität Mailand zeigten außerdem die Fähigkeit von ddPCR, SARS-CoV-2 in qPCR-negativen Nasen-Rachen-Abstrichen von Patienten mit Verdacht auf Covid-19 nachzuweisen. 11 Der hauseigene ddPCR-Assay der Forscher wies SARS-CoV-2-RNA in nasopharyngealen Proben von 19 Patienten nach, die zuvor mit qPCR negativ getestet wurden. 15 dieser Patienten entwickelten eine Lungenentzündung und 14 zeigten Anzeichen einer schweren Infektion.

Monica Herrara, MD, Bio-Rad Laboratories.

Zusammengenommen unterstreichen diese Daten die Nützlichkeit von ddPCR als Ergänzung zur qPCR, die in der Lage ist, niedrige Viruslasten bei verdächtigen oder rekonvaleszenten Patienten zu erkennen. Da Bedenken hinsichtlich der Genauigkeit die Veröffentlichung jeder neuen Diagnose überschatten, kann ddPCR Laboren helfen, bei der Diagnose von Covid-19-Fällen Vertrauen in die Qualität ihrer Ergebnisse zu haben.

Carolyn Reifsnyder, Bio-Rad Laboratories.

Eine sensible Covid-19-Diagnostik hilft nicht nur bei der Erkennung von Fällen, sondern hilft Ärzten auch bei der Einschätzung, ob ein Patient das Virus wahrscheinlich auf andere übertragen wird. Es kann Patienten bei der Entscheidung helfen, in Quarantäne zu bleiben, bevor sie das Virus auf andere übertragen. Es kann auch Regierungsbehörden helfen, SARS-CoV-2-Träger besser im Auge zu behalten, was möglicherweise spezifischere Abschaltbefehle und die Verteilung von Ressourcen auf die Gebiete ermöglicht, die am meisten Hilfe benötigen. Insgesamt kann die ddPCR-Technologie in Kombination mit Therapeutika und Impfstoffen dazu beitragen, die Ausbreitung des Virus einzudämmen.

Um mehr über die Verwendung von ddPCR zur Überwachung von Covid-19 in einer größeren Bevölkerung zu erfahren, lesen Sie Tests auf SARS-CoV-2 in Abwasser.

Monica Herrera, MD, ist Programmleiter für Humangenetik und Infektionskrankheiten in der Digital Biology Group der Bio-Rad Laboratories.

Carolyn Reifsnyder ist Direktor für globales Produktmarketing in der Digital Biology Group bei Bio-Rad Laboratories.

Ausgewähltes Bild: Ein Techniker verwendet das digitale Tröpfchen-PCR-System QX200 von Bio-Rad.

1. New York Times. Covid in den USA: Neueste Karte und Fallzahl. Abgerufen am 4. Januar 2021. Verfügbar unter: https://www.nytimes.com/interactive/2020/us/coronavirus-us-cases.html.

2. Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten. Planungsszenarien für die COVID-19-Pandemie. Abgerufen am 25. September 2020. Verfügbar unter: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/planning-scenarios.html.

3. Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten. Klinische Fragen zu COVID-19: Fragen und Antworten. Abgerufen am 25. September 2020. Verfügbar unter: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/faq.html.

4. Ling Y, Xu S-B, Lin Y-X, et al. Persistenz und Clearance von viraler RNA bei Rehabilitationspatienten mit neuartiger Coronavirus-Krankheit 2019. Kinn Med J. 2020133(9):1039-1043. doi: 10.1097/CM9.00000000000000774.

5. Caruba L. Zwei Coronavirus-Patienten, die aus einem Krankenhaus in San Antonio entlassen wurden, begleiteten zum Flughafen. Mein San Antonio. March 6, 2020. Available at: https://www.mysanantonio.com/news/local/article/CDC-releases-two-coronavirus-patients-from-San-15111294.php.

6. Weissleder R, Lee H, Ko J, Pittet MJ. COVID-19 diagnostics in context. Sci Transl Med. 202012(546):eabc1931. doi: 10.1126/scitranslmed.abc1931.

7. Centers for Disease Control and Prevention. Discontinuation of Transmission-Based Precautions and Disposition of Patients with COVID-19 in Healthcare Settings (Interim Guidance). Accessed September 25, 2020. Available at: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/disposition-hospitalized-patients.html.

8. Gniazdowski V, Morris CP, Wohl S, et al. Repeat covid-19 molecular testing: correlation with recovery of infectious virus, molecular assay cycle thresholds, and analytical sensitivity. MedRxiv. Published August 6, 2020. doi: 10.1101/2020.08.05.20168963.

9. Suo T, Liu X, Feng J, et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.Emerg Microbes Infect. 20209(1):1259-1268. doi: 10.1080/22221751.2020.1772678.

10. Liu X, Feng J, Zhang Q, et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerg Microbes Infect. 20209(1):1175-1179. doi: 10.1080/22221751.2020.1772679.


    1. Briefly centrifuge the Template Switching RT Enzyme Mix to collect the solution to the bottom of tube, then place on ice.
    2. Thaw the Template Switching RT Buffer at room temperature completely. Vortex and centrifuge briefly to collect the solution to the bottom of tube, then place on ice.

    CDNA Synthesis and Template Switching

    Please note that the volume needed for each reagent is based on a final cDNA Synthesis and Template Switching reaction volume of 10 &mul. If desired, the reaction can be scaled up proportionally, while observing the RNA input amount limit, to a final volume of 20 &mul.

    1. Primer Annealing for First Strand Synthesis

    1.1 To anneal the RT primer with RNA templates, in a 0.2 ml nuclease free PCR tube, prepare the reaction as follows (on ice):

    Mix thoroughly by gently pipetting up and down at least 10 times, then centrifuge briefly to collect the solution to the bottom of the tube.

    1.2 Incubate for 5 minutes at 70°C in a thermocycler with the lid temperature set at &ge85°C, then hold at 4°C until the next step.

    2. Reverse Transcription (RT) and Template Switching

    2.1 During the primer annealing reaction, vortex the Template Switching RT Buffer briefly followed by a quick spin to collect the solution to the bottom of the tube, then prepare the RT reaction mix as follows (adding RT Enzyme Mix last):

    Template Switching RT Buffer (4X)

    Template Switching Oligo (TSO) (75 &muM)

    Mix thoroughly by gently pipetting up and down at least 10 times, then centrifuge briefly to collect solution to the bottom of the tube.

    2.2 Combine 4 &mul RT reaction mix (above) with 6 &mul of the annealed mix from step 1.2, mix well by pipetting up and down gently at least 10 times, then centrifuge briefly to collect the solution to the bottom of the tube.

    2.3 Incubate the 10 &mul combined reaction in a thermocycler with the following steps:

    90 minutes at 42°C
    5 minutes at 85°C
    Hold at 4°C

    If not proceeding to the PCR Amplification step immediately, samples can be stored at 4°C overnight or at -20°C for up to a week.

    PCR Amplification of 5&rsquo Region of Transcripts

    1. PCR Template Preparation

    Dilute the RT reaction from step 2.3 above by 2-fold with water and use 1 &mul of the diluted cDNA in a subsequent 25 &mul PCR reaction. For low abundant RNA targets, up to 2.5 &mul of undiluted cDNA can be used in a 25 &mul PCR reaction.

    2.PCR Reaction Set up

    2.1 Assemble the PCR reaction on ice as follows:

    Diluted template switching cDNA product

    Q5 Hot Start High-Fidelity Master Mix (2X) (NEB #M0494)

    Gene-specific reverse primer (10 &muM)

    2.2 Mix gently by pipetting up and down at least 10 times, then centrifuge briefly to collect solution to the bottom of the tube.

    2.3 Incubate the reaction in a thermocycler with the lid temperature set at &ge100°C, and perform PCR with the following cycling condition:

    *To determine the optimal PCR cycles, it can be useful to set up duplicate reactions, one with 20 cycles and one with 30 cycles.

    **Annealing temperatures are determined by the primer sequences. Optimal results are observed with primers that have high Tms, preferably 68°C or higher. For Tm calculations, please visit: http://tmcalculator.neb.com.

    2.3 Store the PCR product at -20°C or proceed directly to downstream applications. For example, to clone the PCR product, proceed directly to the NEB® PCR Cloning Kit (NEB #E1202). The PCR product can also be directly sequenced by Sanger sequencing after a PCR product cleanup step has been performed using Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit (NEB #E1050).


    Calculations for Molecular Biology and Biotechnology

    Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory, Second Edition, provides an introduction to the myriad of laboratory calculations used in molecular biology and biotechnology. The book begins by discussing the use of scientific notation and metric prefixes, which require the use of exponents and an understanding of significant digits. It explains the mathematics involved in making solutions the characteristics of cell growth the multiplicity of infection and the quantification of nucleic acids. It includes chapters that deal with the mathematics involved in the use of radioisotopes in nucleic acid research the synthesis of oligonucleotides the polymerase chain reaction (PCR) method and the development of recombinant DNA technology. Protein quantification and the assessment of protein activity are also discussed, along with the centrifugation method and applications of PCR in forensics and paternity testing.

    Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory, Second Edition, provides an introduction to the myriad of laboratory calculations used in molecular biology and biotechnology. The book begins by discussing the use of scientific notation and metric prefixes, which require the use of exponents and an understanding of significant digits. It explains the mathematics involved in making solutions the characteristics of cell growth the multiplicity of infection and the quantification of nucleic acids. It includes chapters that deal with the mathematics involved in the use of radioisotopes in nucleic acid research the synthesis of oligonucleotides the polymerase chain reaction (PCR) method and the development of recombinant DNA technology. Protein quantification and the assessment of protein activity are also discussed, along with the centrifugation method and applications of PCR in forensics and paternity testing.


    16.2 Biotechnology Products

    1. Genetically engineered organisms can produce biotechnology products.
    2. Organisms that have had a foreign gene inserted into them are transgen.

    A. Transgenic Bacteria

    1. Bacteria are grown in large vats where they can make products such as insulin and human growth hormone, and vaccines
    2. Transgenic bacteria have been produced to improve the health of plants and degrade substances, such as oil
    3. Transgenic bacteria can produce chemical products, such as phenylalanine (artificial sweeteners)

    B. Transgenic Plants
    1. Foreign genes now give cotton, corn, and potato strains the ability to produce insect toxin s
    2. Plants are being engineered to produce human proteins including hormones, clotting factors, and antibodies

    C. Transgenic Animals

    Animal use requires methods to insert genes into eggs of animals (early in development). Using this technique, many types of animal eggs have been injected with bovine growth hormone (bGH) to produce larger fishes, cows, pigs, rabbits, and sheep.

    Gene pharming” is the use of transgenic farm animals to produce pharmaceuticals the product is obtainable from the milk of females.

    D. Cloning Transgenic Animals

    1. The cloning of Dolly in 1997 showed that mammals could be cloned.
    2. Cloning of mammals involves injecting the nucleus of an adult cell into an enucleated egg.
    3. The cloned eggs begin development in vitro and are then returned to host mothers until the clones are born.

    Scenario 1: A well-loved horse named Barbero breaks his leg in a race. Many people were praying for his well being and thousands of dollars were spent trying to get him to recover. Mail and flowers poured into the animal hospital and stable where Barbero lived. Alas, after a year of poor recovery, the decision was made to euthanize Barbero. The owners save sample of his DNA so that Barbero can be cloned. Do you think they should clone him? Why or why not.

    Scenario 2: Melissa is a happy 5 year old who is loved by her family. She becomes ill and is diagnosed with childhood leukemia. A desperate search ensues to find a bone marrow donor whose type matches Melissa. After a year of searching, Melissa’s outlook is grim. Her family decides to clone Melissa so that her clone could be the bone marrow donor. Do you think this is a god idea? Why or why not.

    16.3 Genomics

    Genetics in the 21st century concerns Genomik: the study of genomes of humans and other organisms.

    A. Sequencing the Bases

    • The Human Genome Project has produced a working draft of all the base pairs in all our chromosomes.
    • The task took 13 years to learn the sequence of the three billion base pairs along the length of our chromosomes.
    • Other organisms are being sequenced to compare genes and located genes responsible for disorders.

    Die HapMap Project -- catalogs sequence differences, called haplotypes, in humans.

    The Genetic Profile

    1. DNA microarrays identify a person’s complete genotype this is called the genetic profile.
    2. DNA profiles can determine if a person has an increased risk for a particular disease
    3. The genetic profile can be used to determine if a particular drug therapy is appropriate in a specific clinical condition.
    1. Proteomik is the study of the structure, function, and interaction of cellular proteins.
    2. The information obtained from proteomic studies can be used in designing better drugs, and to correlate drug treatment to the particular genome of the individual.

    Bioinformatik

    1. Bioinformatik is the application of computer technologics to the study of the genome.
    2. Information obtained from computer analysis of the genome can show relationships between genetic profiles and genetic disorders.

    16.4 Gene Therapy

    1. Gentherapie involves procedures to give patients healthy genes to make up for a faulty gene.
    2. Gene therapy also includes the use of genes to treat genetic disorders and various human illnesses.
    3. There are Ex-vivo (outside body) and in vivo (inside body) methods of gene therapy.

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    Pathologic complete response in breast cancer patients receiving anthracycline- and taxane-based neoadjuvant chemotherapy: evaluating the effect of race/ethnicity

    Hintergrund: The current study was conducted to evaluate the influence of race/ethnicity and tumor subtype in pathologic complete response (pCR) following treatment with neoadjuvant chemotherapy.

    Methoden: A total of 2074 patients diagnosed with breast cancer between 1994 and 2008 who were treated with neoadjuvant anthracycline- and taxane-based chemotherapy were included. pCR was defined as no residual invasive cancer in the breast and axilla. The Kaplan-Meier product-limit was used to calculate survival outcomes. Cox proportional hazards models were fitted to determine the relationship of patient and tumor variables with outcome.

    Ergebnisse: The median patient age was 50 years 14.6% of patients were black, were 15.2% Hispanic, 64.3% were white, and 5.9% were of other race. There were no differences in pCR rates among race/ethnicity (12.3% in black, 14.2% in Hispanics, 12.3% in whites, and 11.5% in others, P = .788). Lack of pCR, breast cancer subtype, grade 3 tumors, and lymphovascular invasion were associated with worse recurrence-free survival (RFS) and overall survival (OS) (P </= .0001). Differences in RFS by race/ethnicity were noted in the patients with hormone receptor-positive disease (P = .007). On multivariate analysis, Hispanics had improved RFS (hazard ratio [HR], 0.69 95% confidence interval [95% CI], 0.49-0.97) and OS (HR, 0.63 95% CI, 0.41-0.97) blacks had a trend toward worse outcomes (RFS: HR, 1.28 [95% CI, 0.97-1.68] and OS: HR, 1.32 [95% CI, 0.97-1.81]) when compared with whites.

    Schlussfolgerungen: In this cohort of patients, race/ethnicity was not found to be significantly associated with pCR rates. On a multivariate analysis, improved outcomes were observed in Hispanics and a trend toward worse outcomes in black patients, when compared with white patients. Further research was needed to explore the potential differences in biology and outcomes.


    Schau das Video: Nested PCR. Principle and usage (Dezember 2022).