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Sei Km eine empirische Messung eines bestimmten Enzyms mit Konzentration [E]. Theoretisch ist dieser Wert konstant und sollte sich nicht ändern, wenn [E] nach oben oder unten geht. Sei nun [E']=10*Km. Bei dieser Enzymkonzentration ist klar, dass bei [S]=Km V0 nicht 1/2*Vmax sein kann (da nur genügend Substrat vorhanden ist, um 1/10 der Enzymmoleküle zu sättigen). Was passiert hier und wie hängt das mit der Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung zusammen?
Michaelis-Menten stellt für Studierende oft eine Herausforderung dar, da die Bedingungen wichtig sind, die vorhanden sein müssen, damit das Modell Bestand hat. Es kann hilfreich sein, die Herleitung und die Relevanz der Annahmen durchzugehen. Bergs Biochemie ist über NCBI verfügbar, und der Abschnitt zur Michaelis-Menten-Kinetik leistet hier gute Arbeit und veranschaulicht die folgenden Punkte:
Annahme 1: Die Geschwindigkeiten aller relevanten Reaktionen sind linear.
Diese Annahme ermöglicht es uns, die Gleichungen aufzuschreiben, mit denen die Ableitung beginnt. Wir betrachten jede einzelne Reaktion und sagen, dass die Geschwindigkeit dieser Reaktion gleich einer Geschwindigkeitskonstante mal der Konzentration jedes Dings auf der linken Seite ist. Aus der Gleichung $E + S ightleftharpoons ES ightarrow E + P$, erhalten wir folgendes
$E + S ightarrow ES$
- $Rate = k_1[E][S]$
$ES ightarrow E + S$
- $Rate = k_{-1}[ES]$
$ES ightarrow E + P$
- $Rate = k_2[ES]$
Diese Annahme (die Geschwindigkeit ist linear) entspricht nur den experimentellen Beweisen zu Beginn der Reaktion, während der größte Teil des Substrats frei ist $[S]$ (anstatt gebunden in $ES$). Merk dir das. Es wird ins Spiel kommen, wenn wir Annahme 3 bewerten.
Annahme 2: Die $ES ightarrow E + P$ Reaktion ist irreversibel
Damit wir die obigen Geschwindigkeitsgleichungen kombinieren können, um die Michaelis-Menten-Gleichung abzuleiten, ist die nur Quelle von ES sollte von . sein $E + S ightarrow ES$. Wir können keine messbaren haben $E + P ightarrow ES$. Experimentell gilt dies für Enzyme, die der Kinetik von Michaelis Menten folgen, wenn $[E]$ und $[P]$ sind klein im Vergleich zu [ES]. Hier haben wir also unsere erste Anforderung, dass $[E]$ klein sein. Biochemische Reaktionen beinhalten in der Regel keine sehr hohen Änderungen der freien Energie. Die freie In-situ-Energie der ATP-Hydrolyse ist das obere Ende einer Reaktion in der Zelle, und das setzt etwa $50kJmol^{-1}$. Wir reden hier nicht von Verbrennung. Also tatsächlich, diese Reaktionen sind oft reversibel bei nennenswerten Werten von $[E]$ und $[P]$
Annahme 3: ES-Bildung und -Abbau sind im stationären Zustand
Diese Annahme wird oft verwirrend beschrieben, d. h. die gesamte Reaktion ($E + S ightarrow E + P$) befindet sich im stationären Zustand. Lassen Sie uns auf das eingehen, wovon wir eigentlich sprechen. Um die MM-Gleichung herzuleiten. Wir brauchen die Bildungsrate von $ES$ gleich der Zerfallsrate von $ES$, das heißt für $frac{d[ES]}{dt} = 0$. Das ist ein stationärer Zustand. Sagen wir das in Worten: die Veränderung in $[ES]$ muss null sein. Wir erreichen nur zu einem frühen Zeitpunkt der Reaktion einen stationären Zustand (denken Sie daran, dass der größte Teil des Substrats frei sein muss $[S]$ damit Annahme 1 gilt), falls $[S]$ ist wesentlich größer als $[E]$. $E$ muss gesättigt sein mit $S$ während $S$ ist immer noch größtenteils in der freien Form. Dies ist die Schlüsselkombination von Annahmen, gegen die die von Ihnen beschriebene Situation verstößt.
Sobald wir die drei obigen Annahmen erfüllen, können wir die folgende Gleichheit aufschreiben:
$k_1[E][S] = (k_{-1} + k_2)[ES]$
Diese Gleichung besagt, dass die Bildungsrate von $ES$ (die Rate aus Gleichung 1 oben) ist gleich der kombinierten Rate der Aufteilung von $ES$, entweder in $E + S$ oder $E + P$ (Gleichungen 2 und 3 oben). Sobald wir diese Gleichheit haben, können wir die Michaelis-Menten-Gleichung herleiten: $V_o = V_{max} frac{[S]}{[S] + K_m}$, wo $K_m = frac{k_{-1} + k_2}{k_1}$. Siehe wieder Biochemie durch diese zu gehen.
Die Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung macht eine Reihe von Annahmen. Die genauen Annahmen hängen ein wenig davon ab, wie Sie die Ableitung tatsächlich durchführen, aber die meisten modernen Formulierungen hängen von der stationären Näherung ab. (Siehe zum Beispiel hier.)
In Ihrer Situation, in der die Enzymkonzentration die Substratkonzentration stark übersteigt, wird diese Annahme verletzt. Sie werden nie einen stationären Zustand erreichen. Daher führt die Anwendung der Michaelis-Menten-Gleichung auf diese spezielle Situation zu ungenauen Ergebnissen. Sie können die Reaktionskinetik unter diesen Bedingungen sicherlich modellieren, müssen jedoch andere Gleichungen und Ansätze verwenden.
Das soll nicht heißen, dass die Km gilt in solchen Situationen nicht. Das Km eines Enzyms ist eine Eigenschaft des Enzyms, die auch im enzymreichen Regime gilt - nur die "konventionelle" Interpretation von Km ("die Konzentration des Substrats, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit halb maximal ist") gilt nicht. Diese Aussage ist nur unter den besonderen Bedingungen wahr, die die Michaelis-Menten-Ableitung gilt.
Die Wirkung hoher Enzymkonzentrationen auf die Michaelis-Menten-Gleichung wurde von M. F. Chaplin betrachtet, "The effect of Enzymekonzentration auf die Michaelis-Menten-Gleichung", veröffentlicht in der Januar-Ausgabe 1981 von Trends in den biochemischen Wissenschaften, Seite VI, unter der Überschrift 'Lehrbuchfehler' (aber, soweit ich feststellen kann, ist dieser Artikel nicht in Pubmed oder ähnlichem indiziert).
Der Autor zieht zwei wichtige Schlussfolgerungen:
- Die Annahme, dass die Gesamtenzymkonzentration, $E_o$, muss kleiner sein als die anfängliche Substratkonzentration ($S_o$) ist unnötig restriktiv. Die Michaelis-Menten-Gleichung gilt in sehr guter Näherung, wenn $E_o$ ist größer als $S_o$ ist aber kleiner als die Michaelis-Konstante (!)
- Bei hohen Enzymkonzentrationen wird eine modifizierte Gleichung vorgeschlagen $$ v_i = frac{V_{max}[S_o]}{K_m + [S_o] + [E_o]}$$
Die Herleitung dieser Gleichung ist in der zitierten Referenz angegeben.
Bearbeiten
- Ein Dropbox-Link zur Chaplin-Referenz. Es scheint nirgendwo verfügbar zu sein, einschließlich der TIBS-Site (und es scheint nicht in PubMed oder ähnlichem indiziert zu sein).
- Ein Benutzer hat gefragt (Frage jetzt gelöscht), ob $K_m$ ist in irgendeiner Weise von E . abhängig${_o}$
Einstellung
$$ K^{'}_m = K_m + E_o$$
man sieht, dass die Substratkonzentration bei halber V$_{max}$ ist $K^{'}_m$
das ist die 'wahre' Michaelis-Konstante, von der tatsächlich abhängen wird $E_o$ "nur ein bisschen", wie der Benutzer unter den weniger restriktiven Annahmen von M.F. Chaplin (wo $K_m$ ist oben algebraisch definiert).
- Vielleicht würde der Benutzer erwägen, diese Frage rückgängig zu machen? IMO ein interessanter.
Enzyme
7.2.3 Spezifische Aktivität
Enzymkonzentrationen werden oft in "Einheiten" und nicht in Mol- oder Massenkonzentrationen angegeben. Wir kennen selten die genaue Masse des Enzyms in einer Probe, da es im Allgemeinen durch Isolierung des Enzyms aus Mikroorganismen oder tierischen oder pflanzlichen Geweben hergestellt wird und oft viel nichtkatalytisches Protein enthält, dessen Menge je nach Probe variieren kann zu proben. Daher muss ein anderer Ansatz gewählt werden, und die Enzymkonzentration wird in Einheiten von . angegeben spezielle Aktivität. Eine „Einheit“ ist definiert als die Enzymmenge (z. B. Mikrogramm), die unter bestimmten Bedingungen (z. B. 1,0 Mikromol Produkt pro Minute in einer Lösung mit einer ausreichend hohen Substratkonzentration, um in der „Sättigungs“-Bereich, wie in Abb. 7.9 gezeigt, wobei [ES] und [E] relativ invariant sind).
Daher können verschiedene Anbieter von Enzymen Präparate mit unterschiedlichen Aktivitätseinheiten haben, und bei der Analyse der kinetischen Daten ist Vorsicht geboten. Somit hat ein gereinigtes Enzympräparat eine höhere spezifische Aktivität als ein Rohpräparat, oft wird ein Protein als rein angesehen, wenn während der Reinigungsschritte eine konstante spezifische Aktivität erreicht wird.
Die Aktivität ergibt sich aus der gebildeten Produktmenge bzw. verbrauchten Substratmenge im Reaktionsgemisch unter den angegebenen Bedingungen (Temperatur, pH, Puffertyp, Substrat- und Enzymkonzentrationen etc.). Wenn das Molekulargewicht des Enzyms bekannt ist, kann die spezifische Aktivität auch definiert werden als
Auf einem Diagramm der Geschwindigkeit gegen die Substratkonzentration (V vs. [S]) ist die maximale Geschwindigkeit (bekannt als Vmax) der Wert auf der Y-Achse, dem sich die Kurve asymptotisch nähert. Es sollte beachtet werden, dass der Wert von V max von der Menge des in einer Reaktion verwendeten Enzyms abhängt. Verdoppeln Sie die Enzymmenge, verdoppeln Sie die Vmax. Wenn man die Geschwindigkeiten zweier verschiedener Enzyme vergleichen wollte, müsste man bei den verschiedenen Reaktionen, die sie katalysieren, die gleichen Enzymmengen verwenden. Es ist wünschenswert, ein Maß für die Geschwindigkeit zu haben, das von der Enzymkonzentration unabhängig ist. Dazu definieren wir den Wert Kcat , auch Umsatzzahl genannt. Mathematisch,
Um Kcat zu bestimmen, muss man natürlich die Vmax bei einer bestimmten Enzymkonzentration kennen, aber das Schöne an dem Begriff ist, dass er dank des Begriffs im Nenner ein von der Enzymkonzentration unabhängiges Maß für die Geschwindigkeit ist. Kcat ist somit eine Konstante für ein Enzym unter gegebenen Bedingungen. Die Einheiten von K cat sind ( ext
