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12.5: Übung 1 - Hefetransformation - Biologie

12.5: Übung 1 - Hefetransformation - Biologie


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Das folgende Protokoll ist eine leichte Modifikation des von Amberg . beschriebenen Transformationsprotokolls „Quick and Dirty“. et al. (2005). Modifikationen dieser Methode können ihre Effizienz um mehrere Größenordnungen steigern (Gietz und Schiestl, 2007), was erforderlich wäre, wenn lineare DNA-Stücke zur Transformation von Hefe verwendet würden.

Bereiten Sie einen Transformations-Mastermix vor

1. Bereiten Sie einen Transformations-Mastermix vor. Die folgenden Bestandteile liefern genügend Reagenzien für fünf Transformationsreaktionen. Kombinieren und in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen:

100 μL steril 2 M Lithiumacetat (frisch zubereitet)
400 μL steril 50% PEG-3350
4 μL 2-Mercaptoethanol (STINKY!! füge dies in den Abzug!)

Individuelle Transformationsreaktionen einrichten - für jede Transformation:

2. Geben Sie 15 μl der denaturierten Lachssperma-DNA (2 mg/ml) in ein neues Mikrozentrifugenröhrchenbeschriftetmit dem Namen (oder Code) des Plasmids.

Hinweis: Es ist wichtig, dass die Lachssperma-DNA einzelsträngig ist, damit dieses Verfahren gut funktioniert. Kochen Sie die DNA für 5 Minuten, um die DNA zu denaturieren. Kühlen Sie die DNA schnell ab, indem Sie sie sofort auf Eis legen. Bewahren Sie die DNA auf Eis, bis Sie bereit sind, sie zu verwenden.

3. 5 µl Miniprep-Plasmid-DNA in das entsprechend gekennzeichnete Mikrozentrifugenröhrchen geben.

4. Geben Sie 100 µl Transformationsmischung aus Schritt 1 in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Vortexen Sie für 10-15 Sekunden, um den Inhalt zu mischen.

5. Kratzen Sie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Mikropipettenspitze eine große Hefekolonie (oder das Äquivalent eines „Streichholzkopfes“ aus Hefe) von einer YPD-Platte. Übertragen Sie die Hefe in das Mikrozentrifugenröhrchen mit der Transformations-/DNA-Lösung (Schritt 4), indem Sie den Zahnstocher mehrmals drehen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig suspendiert sind, bevor Sie fortfahren.

Wiederholen Sie die Schritte 2-5 für jede Ihrer Transformationsreaktionen. Achten Sie darauf, eine Kontrolle mitzuführen, die keine Plasmid-DNA enthält.

6. Inkubieren Sie die Transformationsmischungen bei 37 °C unter Schütteln für 30-45 Minuten.

Ausplattieren der transformierten Zellen auf selektiven Medien ohne Uracil.

7. Entnehmen Sie 10 µl der resuspendierten Zellen und geben Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu 90 µl sterilem Wasser. Diese Probe wird seriell für eine Spot-Platte verdünnt (Schritt 9), die Sie zur Berechnung der Transformationseffizienz verwenden.

8. Verteilen Sie den Rest der Mischung auf einer selektiven Medienplatte ohne Uracil. Übertragen Sie die Transformationsreaktion auf die Platte und schütteln Sie dann ~ 4 sterile Glasperlen aus, die die Zellen verteilen. Decken Sie die Platten ab und verbringen Sie 0,5-1 Minuten damit, die Platten zu bewegen, so dass die Perlen die Transformationsmischung gleichmäßig über die Oberfläche der Platte verteilen. Entsorgen Sie die Glasperlen in die entsprechenden Abfallbehälter, damit sie sterilisiert und wieder verwendet werden können. Die Platten bei 30 °C inkubieren, bis Kolonien nachgewiesen werden können. Kolonien sind in der Regel frühestens nach 2 Tagen sichtbar. Wenn die Kolonien klein sind, lassen Sie sie einen oder mehrere weitere Tage bei 30 °C wachsen. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf der Platte.

Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Transformationsmischung.

9. Bereiten Sie eine Reihe von 4 zusätzlichen Verdünnungen der in Schritt 7 beiseite gelegten Zellen vor. Verwenden Sie diese Verdünnungen
für eine Spot-Platte auf YPD-Medien. Jede Reihe auf der Platte sollte Zellen aus einer anderen Transformationsreaktion enthalten. Inkubieren Sie die Zellen bei 30 °C oder Raumtemperatur, bis einzelne Kolonien nachgewiesen werden können. Lassen Sie die Platte nicht überwachsen, da Sie einzelne Kolonien unterscheiden müssen.

Berechnen Sie die Transformationseffizienz. Die Effizienz der Transformation wird sowohl von der Qualität der verwendeten DNA als auch von den genauen Details des Transformationsverfahrens beeinflusst.

10. Berechnen Sie die Fraktion der Zellen, die wie unten gezeigt transformiert wurden. Das Gesamtvolumen der Transformationsmischung betrug ~120 μl, einschließlich Hefezellen. Zehn µL wurden für das Spot-Plating verwendet und die restlichen 100 µL wurden für die Transformation verwendet.

11. Transformationseffizienzen werden normalerweise durch die Anzahl der pro µg DNA transformierten Zellen ausgedrückt. Im letzten Labor (Kapitel 11) haben Sie Ihre Plasmidpräparationen auf Agarosegelen analysiert und eine grobe Schätzung der DNA-Konzentrationen Ihrer Plasmidpräparationen erhalten. Beachten Sie, dass Sie 7 ul Plasmidpräparation auf diesen Gelen analysiert haben. In diesem Transformationslabor haben Sie 5 µl Ihrer Plasmidpräparationen verwendet.

Berechnen Sie die Transformationseffizienz:

A. Multiplizieren Sie die Anzahl der transformierten Zellen auf der YC-Platte mit 1,1
(Nur 100 von 110 μL in der Transformationsreaktion wurden ausplattiert.)

B. Wandeln Sie die ng des Plasmids in Ihrer Transformationsreaktion in μg um.

C. Teilen Sie den berechneten Wert in A durch den in B.


Entwicklung von synthetischen Biologiewerkzeugen für Ingenieure Pichia pastoris als Chassis zur Herstellung von Naturprodukten

Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris (alias Komagataella phaffii) ist einer der am häufigsten verwendeten Wirte für die industrielle Produktion rekombinanter Proteine. Als nicht-konventionelle Hefe, P. pastoris hat einzigartige biologische Eigenschaften und sein Expressionssystem ist gut entwickelt. Mit den Fortschritten in der synthetischen Biologie wurden mehr Anstrengungen auf die Entwicklung von P. pastoris in ein Chassis für die Herstellung verschiedener hochwertiger Verbindungen, wie zum Beispiel Naturprodukte. Diese Übersicht beginnt mit der Einführung von Werkzeugen der synthetischen Biologie für das Engineering von P. pastoris, einschließlich Vektoren, Promotoren und Terminatoren für die heterologe Genexpression sowie Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated System (CRISPR/Cas) für die Genom-Editierung. Dieser Übersicht folgen dann Beispiele für die Herstellung von wertschöpfenden Naturstoffen in stoffwechseltechnisch hergestellten P. pastoris Stämme. Schließlich Herausforderungen und Perspektiven in der Entwicklung P. pastoris als synthetisches Biologie-Chassis werden prospektiert.


Transformation-assoziierte Rekombination (TAR) Klonierung für Genomikstudien und synthetische Biologie

Die Klonierung mit Transformation-assoziierter Rekombination (TAR) stellt ein einzigartiges Werkzeug zur Isolierung und Manipulation großer DNA-Moleküle dar. Die Technik nutzt ein hohes Maß an homologer Rekombination in der Hefe Sacharomyces cerevisiae. Bisher ist die TAR-Klonierung die einzige verfügbare Methode, um chromosomale Segmente mit einer Länge von bis zu 300 kb selektiv aus komplexen und einfachen Genomen zu gewinnen. Darüber hinaus ermöglicht die TAR-Klonierung den Zusammenbau und das Klonen ganzer Mikrobengenome bis zu mehreren Mb sowie das Engineering großer Stoffwechselwege. In diesem Übersichtsartikel fassen wir Anwendungen der TAR-Klonierung für funktionelle/strukturelle Genomik und synthetische Biologie zusammen.

Schlüsselwörter: HAC Humanes künstliches Chromosom Synthetische Biologie TAR-Klonierung Transformations-assoziierte Rekombination.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht. Dieser Artikel enthält keine Studien mit menschlichen Teilnehmern oder Tieren, die von einem der Autoren durchgeführt wurden.


Hefe-Transformation

Dieses Protokoll wurde von Matt Kaeberlein eingereicht.

Dieses Protokoll funktioniert gut für die Transformation von Plasmiden und PCR-Disruptionskassetten.

  • TE + 100 mM LiAc (Verdünnung der Stammlösung mit 1 M LiAc und 10X TE in Wasser 1:1:8).
  • PLATTE (1X TE, 100 mM LiAc 40% PEG)
  1. Wachsen Sie Hefe, die über Nacht in YPD transformiert werden soll.
  2. Übernachtkultur 1:100 in frischem YPD verdünnen und 4-6 Stunden bei 30 °C kultivieren.
  3. Spin-down 15 ml Zellen.
  4. Zellen 2X in 0,5 ml TE + 100 mM LiAc . waschen
  5. Zellen in 200uL TE + LiAc . resuspendieren
  6. Füge transformierende DNA hinzu.
  7. Fügen Sie 20 uL frisch gekochte ssDNA hinzu.
  8. Fügen Sie 1 ml PLATE-Lösung hinzu. Durch Umdrehen mehrmals mischen.
  9. 30 min bei 30 °C inkubieren.
  10. 15 min bei 37 °C inkubieren. Alle 5 Minuten durch Umdrehen mischen.
  11. Spin-down-Zellen und Platte auf selektiven Medien.

Zur Transformation von DNA verwende ich 1 µl Mini-Prep-DNA für ein Plasmid und 30-50 µl PCR-Produkt für eine PCR-Disruption.

In der Praxis skaliere ich normalerweise 45 ml Zellen in einem 50-ml-Röhrchen nach oben und schleudere sie herunter. Ich mache die 2X-Waschungen und teile die Zellen dann zur Transformation in 3 einzelne Eppendorf-Röhrchen auf.


Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation: Biologie und Anwendungen

Die genetische Transformation von Pflanzen beruht stark auf dem bakteriellen Pathogen Agrobacterium tumefaciens als leistungsfähiges Werkzeug, um interessierende Gene in eine Wirtspflanze zu bringen. Innerhalb des Pflanzenkerns ist die übertragene DNA in der Lage, sich in das Pflanzengenom zu integrieren und an die nächste Generation zu vererben (d. h. stabile Transformation). Alternativ kann die Fremd-DNA vorübergehend im Kern verbleiben, ohne sich in das Genom zu integrieren, aber dennoch transkribiert werden, um wünschenswerte Genprodukte zu erzeugen (d. h. vorübergehende Transformation). Von der Entdeckung von A. tumefaciens bis zu seiner breiten Anwendung in der Pflanzenbiotechnologie wurden zahlreiche Aspekte der Interaktion zwischen A. tumefaciens und Pflanzen aufgeklärt. Dieser Artikel zielt darauf ab, einen umfassenden Überblick über die Biologie und die Anwendungen der Agrobacterium-vermittelten Pflanzentransformation zu geben, der sowohl für Mikrobiologen als auch für Pflanzenbiologen nützlich sein kann, die ein besseres Verständnis der Pflanzentransformation, der Proteinexpression in Pflanzen und der Pflanzen-Mikroben-Interaktion wünschen .

Figuren

Wichtige Schritte des Agrobakteriums…

Wichtige Schritte des Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Pflanzentransformationsprozesses. (1) Anlage von A.…


Hefeumwandlung - geringe Effizienz (15. Dezember 2008)

Hallo alle zusammen,
Ich transformiere die Hefe mit der LiOAc/PEG-Methode. Die Effizienz war gering, etwa 10^3-10^4 Kolonien/ug Plasmid.

Das Protokoll lautete:
240 ul 50% w/v PEG3350
35 ul 1M LiOAc
25 ul Träger-ssDNA
1 µl Plasmid
Gut mischen und zu den gewaschenen Zellen geben.
30 Grad C, 30 Minuten
42 Grad C, 20 Minuten
abschleudern, in Wasser resuspendieren
Überzug

mit was für hefe arbeitest du?

Wenn dies S. pombe ist, würde ich sagen, dass Sie die Dauer der Inkubation bei 30 ° C auf 1 Stunde erhöhen sollten, den Hitzeschock (42 ° C) auf etwa 10-5 Minuten reduzieren (ich persönlich benutze 5 Minuten) und 42 ul DMSO hinzufügen, um den Hitzeschock zu verbessern .

Und wie stark drehst du deine Zellen? Schleudern Sie so kurz wie möglich bei der niedrigsten Geschwindigkeitsstufe, die Ihre Maschine erreichen kann. Die Hefezellen sind nach dem Transformationsprotokoll fragil.

Wenn Sie das DMSO hinzufügen, waschen Sie es vor dem Ausplattieren der Zellen ab.

Nachdem Ihre Zellen ausplattiert sind, halten Sie Ihren Inkubator befeuchtet. S.pombe mag keine getrockneten Plattenoberflächen. Dies trägt dazu bei, die Wachstumsrate und in geringerem Maße die Erholungsrate zu verbessern. Wenn Sie also Feuchtigkeit verwenden und Kolonien zählen, stellen Sie sicher, dass Sie dies für alle Ihre Experimente tun.

Könnten Sie mir etwas mehr darüber erzählen, was Sie tun, wenn Ihre Zellkultur fertig ist? Waschen Sie Ihre Zellen in TE+LiAc ein, bevor Sie eine endgültige DNA+Zellmischung herstellen?

Schließlich ist das LiAc-Transformationsprotokoll etwas grob und kann vielleicht auf etwa 10^5 Kolonien/ug DNA geschoben werden, aber nicht viel mehr. Es gibt bessere Protokolle, die jedoch komplexer und zeitaufwändiger sind.

Danke, perneseblue,
Ich arbeite mit Bäckerhefe. Die Zellen wurden durch cfg bei 3000 U/min, 5 Minuten, pelletiert. Einmal mit 1x Volumen Wasser gewaschen. Das Transformationsgemisch (Plamsid, ssDNA, PEG3350, LiOAc) wurde dann zum Zellpellet gegeben. Durch Vortexen für 10 Sekunden gemischt. Nach 30 Minuten 30°C und 20 Minuten 42°C Inkubation wurden die Zellen pelletiert, in Wasser resuspendiert und auf Selektionsplatten ausplattiert.
Ich werde versuchen, DMSO das nächste Mal hinzuzufügen.


Hefeumwandlung

Dieses Protokoll basiert auf Gietz, R.D. und R.A. Wald. (2002) TRANSFORMATION VON HEFE DURCH DIE Liac/SS-TRÄGER-DNA/PEG-METHODE. Methods in Enzymology 350: 87-96. Einige Schritte dieses Protokolls basieren auf Informationen von:

Dieses Protokoll ist verallgemeinert und nicht für alle Stämme, Bedingungen und Anwendungen als optimal anzusehen. Einige Aspekte dieses Protokolls müssen möglicherweise erheblich geändert werden, um Ihren speziellen Anforderungen zu entsprechen. Es funktioniert für einfache Transformation, Targeting in Hefe, GAP-Reparatur und Multi-Plasmid-Transformationen für Zwei-Hybrid.

1) Hefe auf YAPD für 24-48 Stunden ausstreichen oder patchen. Kann auch Hefe von älteren Platten (3 Monate? bei 4°) verwenden, wenn die Effizienz kein Problem ist und der Stamm kooperiert.

2) 2 x 3-5 ml Kulturen in 2 x YAPD- oder SC-Medien (15 ml Schnappdeckelröhrchen) aus dem frischen Ausstrich inokulieren und O/N 30°, 200 U/min inkubieren. SC-Medien müssen möglicherweise stärker ausgesät werden (oder es sind möglicherweise mehr Röhrchen erforderlich).

YAPD kann durch 2xYAPD ersetzt werden, aber die Effizienz wird etwas sinken und die Hefe braucht länger zum Wachsen.

1) 50ml 2xYAPD auf 30deg in 500ml Kolben vorwärmen (mindestens 10min). Schalten Sie das 42-Grad-Wasserbad ein (dauert 30 Minuten oder länger).

2) Verdünnen Sie die O/N-Kultur 1:10 in Wasser und nehmen Sie eine OD bei 600 nm. Verwenden Sie 2xYAPD (oder YAPD oder SC, falls zutreffend) 1:10 in Wasser verdünnt als Blindwert. Die verdünnte Kultur hat normalerweise eine OD zwischen 0,1 und 1,0.

3) Verdünnen Sie die Kultur auf ungefähr 0,1 OD in 50 ml vorgewärmtem 2xYAPD und inkubieren Sie 3-6 Stunden, bis die OD 1,0 (oder nahe) erreicht. Die Wachstumsraten der Hefe variieren, also seien Sie bereit zu warten. Es dauert normalerweise 5-6 Stunden, kann aber auch etwas länger dauern.

BEISPIEL: Die verdünnte Kultur in Schritt 2 hat eine OD von 0,2, so dass die Kultur OD 2,0 beträgt. Um eine OD von ungefähr 0,1 für Schritt 3 zu erhalten, würden Sie 2,5 ml Kultur zu Ihrem vorgewärmten 50 ml 2xYAPD (20x Verdünnung) hinzufügen. Offensichtlich ist es nicht genau, da Sie jetzt 52,5 ml anstelle von 50 ml haben, aber es ist nahe genug. Wenn Sie es genau wollen, können Sie einfach 2,5 ml 2xYAPD aus dem Kolben entfernen, bevor Sie Ihre 2,5 ml Kultur hinzufügen, aber dies ist nicht erforderlich.

4) Pellet 3000 U/min, 10 min bei RT in RT6000 oder einer ähnlichen Zentrifuge.

5) Während des Schleuderns der Hefe Lachssperma-DNA 5 min mit Siedekappe kochen und auf Eis abkühlen lassen. Verwenden Sie 3-4 Mal (Lagerung bei -20) und besorgen Sie sich eine neue Tube. Nicht immer wieder kochen.

6) In 1 ml ddH2O resuspendieren und in ein 1,5 ml-Röhrchen überführen.

7) Vortexen Sie 1min oder bis die Hefe in Suspension ist (keine Klumpen).

8) Pellet bei maximaler Geschwindigkeit, 30 Sek., RT und in 1 ml ddH2O durch Vortexen wie zuvor resuspendieren. Für jede Transformation werden 100 μl verwendet, sodass genügend Hefe für 10 Transformationen vorhanden ist.

9) 100 ul Hefe für jede Transformation in ein separates 1,5-ml-Röhrchen überführen und bei maximaler Geschwindigkeit, 30 Sekunden, RT pelletieren und den Überstand entfernen.

10) Stellen Sie für jede Transformation Folgendes zusammen (Master-Mix oder separat):

50 ul 2 mg/ml Lachssperma-DNA

34 µl oder Ihr(e) Plasmid(e) + Wasser (1 µl bakterielle Miniprep-DNA ist ausreichend)

11) Fügen Sie die Transformationsmischung(en) zu den Hefepellets aus Schritt 9 hinzu und verwirbeln Sie 1 Minute oder bis die Hefe in Suspension ist (keine Klumpen).

12) Stellen Sie die Hefe 40 Minuten lang auf 42 Grad. Für beste Effizienz muss die optimale Schockzeit empirisch bestimmt werden und kann von 10 min bis 60 min variieren. Für eine einfache Einzelselektions-Plasmidtransformation funktionieren 20-30min normalerweise gut.

13) Pellet bei maximaler Geschwindigkeit, 30 Sek., RT und entfernen Sie die Transformationsmischung.

14) Fügen Sie 1 ml ddH2O hinzu und verwenden Sie eine 1 ml Pipettenspitze, um die Zellen in Lösung zu rühren. Wenn nötig, pipettieren Sie die Hefe ganz vorsichtig auf und ab.

15) 200 ul auf geeigneten selektiven 100-mm- oder 150-mm-Platten ausplattieren und 3-4 Tage bei 30° wachsen lassen. *Anstelle von 1 ml in Schritt 14 können Sie die Hefe auch in 400 ul resuspendieren und die gesamte Menge auf eine 150-mm-Platte geben, wenn Sie möchten.

Die Effizienz variiert stark je nach Stamm und transformierender DNA. Sie kann von 1吆^3 bis 1吆^5 (oder so) Kolonien pro µg der zugeführten DNA (für Plasmid-DNA) variieren.

10g BactoHefe-Extrakt

100mg Adeninhemisulfat

Autoklavieren Sie 20 Minuten im Flüssigkeitszyklus.

Das selektive Medium variiert je nach Belastung und Anwendung.

2 mg/ml in TE. Sigma D1626. Mit einem Magnetrührer 100 ml in einen Kolben füllen. Das Auflösen dauert 2-4 Stunden. Aliquot in 1,5 ml-Röhrchen (1 ml/Röhrchen).

50 g Polyethylenglykol, MW 3350 (Sigma) in ein 150-ml-Becherglas geben und 35 ml ddH20 hinzufügen. 1-2 Stunden mit einem Magnetrührstäbchen rühren, bis es aufgelöst ist. q.s. auf 100 ml auffüllen und zum Mischen mindestens 10 min weiterrühren. Unter Verwendung eines 0,45-um-Filters filtrieren und in konischen 15 ml (jeweils 10 ml) aliquotieren und bei RT aufbewahren.

1,0 M Lithiumacetat. Kein pH-Wert erforderlich.

Tim Schedl, Ph.D
Abteilung für Genetik
Campus-Box #8232
Medizinische Fakultät der Washington University
4566 Scott Ave.
St. Louis, MO 63110


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