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11.4: Glykolyse - Biologie

11.4: Glykolyse - Biologie


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Lernziele

Am Ende dieses Abschnitts können Sie:

  • Erklären Sie, wie ATP von der Zelle als Energiequelle verwendet wird
  • Beschreiben Sie das Gesamtergebnis in Form von Molekülen, die beim Abbau von Glukose durch Glykolyse entstehen

Sogar exergonische, energiefreisetzende Reaktionen erfordern eine geringe Menge an Aktivierungsenergie, um ablaufen zu können. Betrachten Sie jedoch endergonische Reaktionen, die viel mehr Energie erfordern, weil ihre Produkte mehr freie Energie haben als ihre Reaktanten. Woher kommt innerhalb der Zelle die Energie, um solche Reaktionen anzutreiben? Die Antwort liegt in einem energieliefernden Molekül namens Adenosintriphosphat, oder ATP. ATP ist ein kleines, relativ einfaches Molekül, das jedoch in seinen Bindungen das Potenzial für einen schnellen Energieschub enthält, der genutzt werden kann, um zelluläre Arbeit zu verrichten. Dieses Molekül kann man sich als primäre Energiewährung der Zellen vorstellen, so wie Geld die Währung ist, die Menschen gegen Dinge tauschen, die sie brauchen. ATP wird verwendet, um die meisten energieverbrauchenden Zellreaktionen anzutreiben.

ATP in lebenden Systemen

Eine lebende Zelle kann keine nennenswerten Mengen an freier Energie speichern. Überschüssige freie Energie würde zu einem Anstieg der Wärme in der Zelle führen, was Enzyme und andere Proteine ​​denaturieren und somit die Zelle zerstören würde. Vielmehr muss eine Zelle in der Lage sein, Energie sicher zu speichern und nur bei Bedarf zur Nutzung freizugeben. Lebende Zellen erreichen dies mithilfe von ATP, mit dem jeder Energiebedarf der Zelle gedeckt werden kann. Wie? Es funktioniert als wiederaufladbare Batterie.

Beim Abbau von ATP, in der Regel durch die Entfernung seiner endständigen Phosphatgruppe, wird Energie frei. Diese Energie wird von der Zelle verwendet, um Arbeit zu verrichten, in der Regel indem das freigesetzte Phosphat an ein anderes Molekül gebunden und somit aktiviert wird. Bei der mechanischen Arbeit der Muskelkontraktion liefert ATP beispielsweise Energie, um die kontraktilen Muskelproteine ​​zu bewegen.

ATP-Struktur und -Funktion

Das Herzstück von ATP ist ein Molekül Adenosinmonophosphat (AMP), das aus einem Adeninmolekül besteht, das sowohl an ein Ribosemolekül als auch an eine einzelne Phosphatgruppe gebunden ist (Abbildung 1). Ribose ist ein Zucker mit fünf Kohlenstoffatomen, der in RNA vorkommt und AMP ist eines der Nukleotide in RNA. Die Addition einer zweiten Phosphatgruppe an dieses Kernmolekül führt zu Adenosindiphosphat (ADP); die Addition einer dritten Phosphatgruppe bildet Adenosintriphosphat (ATP).

Die Anlagerung einer Phosphatgruppe an ein Molekül erfordert viel Energie und führt zu einer hochenergetischen Bindung. Phosphatgruppen sind negativ geladen und stoßen sich daher ab, wenn sie wie in ADP und ATP in Reihe geschaltet sind. Diese Abstoßung macht die ADP- und ATP-Moleküle von Natur aus instabil. Die Freisetzung einer oder zweier Phosphatgruppen aus ATP, ein Vorgang, der als Hydrolyse bezeichnet wird, setzt Energie frei.

Glykolyse

Sie haben gelesen, dass fast die gesamte von Lebewesen verbrauchte Energie in den Bindungen des Zuckers Glukose zu ihnen kommt. Glykolyse ist der erste Schritt beim Abbau von Glukose, um Energie für den Zellstoffwechsel zu gewinnen. Viele lebende Organismen führen im Rahmen ihres Stoffwechsels Glykolyse durch. Die Glykolyse findet im Zytoplasma der meisten prokaryontischen und aller eukaryontischen Zellen statt.

Die Glykolyse beginnt mit der ringförmigen Struktur eines einzelnen Glukosemoleküls mit sechs Kohlenstoffatomen und endet mit zwei Molekülen eines Zuckers mit drei Kohlenstoffatomen namens Pyruvat. Die Glykolyse besteht aus zwei unterschiedlichen Phasen. Im ersten Teil des Glykolysewegs wird Energie verwendet, um Anpassungen vorzunehmen, damit das Zuckermolekül mit sechs Kohlenstoffatomen gleichmäßig in zwei Pyruvatmoleküle mit drei Kohlenstoffatomen aufgespalten werden kann. Im zweiten Teil der Glykolyse werden ATP und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) produziert (Abbildung 2).

Wenn die Zelle die Pyruvatmoleküle nicht weiter abbauen kann, wird sie nur zwei ATP-Moleküle aus einem Glukosemolekül gewinnen. Beispielsweise sind reife rote Blutkörperchen von Säugern nur zur Glykolyse fähig, die ihre einzige ATP-Quelle ist. Wenn die Glykolyse unterbrochen wird, sterben diese Zellen schließlich ab.

Abschnittszusammenfassung

ATP fungiert als Energiewährung für Zellen. Es ermöglicht den Zellen, Energie kurzzeitig zu speichern und in sich selbst zu transportieren, um endergonische chemische Reaktionen zu unterstützen. Die Struktur von ATP ist die eines RNA-Nukleotids mit drei gebundenen Phosphatgruppen. Bei der energetischen Nutzung von ATP wird eine Phosphatgruppe abgelöst und ADP produziert. Energie, die aus dem Glukose-Katabolismus gewonnen wird, wird verwendet, um ADP in ATP wieder aufzuladen.

Die Glykolyse ist der erste Weg, der beim Abbau von Glukose zur Gewinnung von Energie verwendet wird. Da es von fast allen Organismen auf der Erde verwendet wird, muss es sich früh in der Geschichte des Lebens entwickelt haben. Die Glykolyse besteht aus zwei Teilen: Der erste Teil bereitet den Sechs-Kohlenstoff-Ring der Glucose auf die Trennung in zwei Drei-Kohlenstoff-Zucker vor. Während dieses Schrittes wird Energie aus ATP in das Molekül investiert, um die Trennung anzuregen. Die zweite Hälfte der Glykolyse extrahiert ATP und hochenergetische Elektronen aus Wasserstoffatomen und bindet sie an NAD+. In der ersten Hälfte werden zwei ATP-Moleküle investiert und in der zweiten Hälfte werden vier ATP-Moleküle gebildet. Dies führt zu einem Nettogewinn von zwei ATP-Molekülen pro Glukosemolekül für die Zelle.

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Zusätzliche Frage zum Selbsttest

1. Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Organismen führen eine Form der Glykolyse durch. Inwiefern unterstützt diese Tatsache die Behauptung, dass die Glykolyse einer der ältesten Stoffwechselwege ist, oder nicht?

Antworten

1. Wenn sich die Glykolyse relativ spät entwickeln würde, wäre sie wahrscheinlich nicht so universell in Organismen wie sie ist. Es entwickelte sich wahrscheinlich in sehr primitiven Organismen und blieb bestehen, mit der Hinzufügung anderer Wege des Kohlenhydratstoffwechsels, die sich später entwickelten.

Versuch es

ATP: (auch Adenosintriphosphat) die Energiewährung der Zelle

Glykolyse: der Prozess der Aufspaltung von Glukose in zwei Drei-Kohlenstoff-Moleküle mit der Produktion von ATP und NADH


4.5 Verbindungen zu anderen Stoffwechselwegen

Sie haben den Katabolismus von Glukose kennengelernt, der lebende Zellen mit Energie versorgt. Aber Lebewesen verbrauchen mehr als nur Glukose als Nahrung. Wie versorgt ein proteinhaltiges Truthahnsandwich Ihre Zellen mit Energie? Dies geschieht, weil alle Abbauwege für Kohlenhydrate, Proteine ​​und Lipide schließlich mit der Glykolyse und dem Zitronensäurezyklus verbunden sind (Abbildung 4.20). Stoffwechselwege sollten als porös betrachtet werden – das heißt, Substanzen treten von anderen Wegen ein und andere Substanzen gehen auf andere Wege. Diese Wege sind keine geschlossenen Systeme. Viele der Produkte in einem bestimmten Weg sind Reaktanten in anderen Wegen.

Verbindungen anderer Zucker zum Glukosestoffwechsel

Glykogen, ein Polymer aus Glukose, ist ein kurzzeitiges Energiespeichermolekül bei Tieren. Wenn ausreichend ATP vorhanden ist, wird überschüssige Glukose zur Speicherung in Glykogen umgewandelt. Glykogen wird in der Leber und im Muskel gebildet und gespeichert. Glykogen wird aus dem Lager genommen, wenn der Blutzuckerspiegel sinkt. Das Vorhandensein von Glykogen in den Muskelzellen als Glukosequelle ermöglicht es, während des Trainings über einen längeren Zeitraum ATP zu produzieren.

Saccharose ist ein Disaccharid aus Glucose und Fructose, die miteinander verbunden sind. Saccharose wird im Dünndarm abgebaut, Glukose und Fruktose werden getrennt aufgenommen. Fruktose ist neben Glukose und Galaktose (ein Teil des Milchzuckers, dem Disaccharid Laktose) eines der drei Nahrungsmonosaccharide, die während der Verdauung direkt in den Blutkreislauf aufgenommen werden. Der Katabolismus von Fructose und Galactose produziert die gleiche Anzahl von ATP-Molekülen wie Glucose.

Verbindungen von Proteinen zum Glukosestoffwechsel

Proteine ​​werden in Zellen durch eine Vielzahl von Enzymen abgebaut. Meistens werden Aminosäuren zu neuen Proteinen recycelt. Wenn jedoch ein Überschuss an Aminosäuren vorhanden ist oder sich der Körper in einer Hungersnot befindet, werden einige Aminosäuren in Stoffwechselwege des Glukoseabbaus umgeleitet. Bei jeder Aminosäure muss ihre Aminogruppe entfernt werden, bevor sie in diese Wege eintreten kann. Die Aminogruppe wird in Ammoniak umgewandelt. Bei Säugetieren synthetisiert die Leber Harnstoff aus zwei Ammoniakmolekülen und einem Kohlendioxidmolekül. Somit ist Harnstoff das wichtigste Abfallprodukt bei Säugetieren aus dem Stickstoff, der aus Aminosäuren stammt, und verlässt den Körper mit dem Urin.

Verbindungen von Lipiden zum Glukosestoffwechsel

Die Lipide, die mit den Glukosewegen verbunden sind, sind Cholesterin und Triglyceride. Cholesterin ist ein Lipid, das zur Flexibilität der Zellmembranen beiträgt und eine Vorstufe von Steroidhormonen ist. Die Synthese von Cholesterin beginnt mit Acetyl-CoA und verläuft nur in eine Richtung. Der Prozess kann nicht rückgängig gemacht werden und es wird kein ATP produziert.

Triglyceride sind eine Form der langfristigen Energiespeicherung bei Tieren. Triglyceride speichern etwa doppelt so viel Energie wie Kohlenhydrate. Triglyceride bestehen aus Glycerin und drei Fettsäuren. Tiere können die meisten der benötigten Fettsäuren selbst herstellen. Triglyceride können durch Teile der Glukoseabbauwege sowohl hergestellt als auch abgebaut werden. Glycerin kann phosphoryliert werden und verläuft durch Glykolyse. Fettsäuren werden in Zwei-Kohlenstoff-Einheiten zerlegt, die in den Zitronensäurezyklus eintreten.

Evolution-Verbindung

Wege der Photosynthese und des zellulären Stoffwechsels

Photosynthese und Zellstoffwechsel bestehen aus mehreren sehr komplexen Stoffwechselwegen. Es wird allgemein angenommen, dass die ersten Zellen in einer wässrigen Umgebung entstanden sind – einer „Suppe“ von Nährstoffen. Wenn sich diese Zellen erfolgreich reproduzierten und ihre Zahl stetig anstieg, folgte daraus, dass die Zellen beginnen würden, die Nährstoffe aus dem Medium, in dem sie lebten, zu verbrauchen, da sie die Nährstoffe in ihre eigenen Zellen verlagerten. Diese hypothetische Situation hätte dazu geführt, dass die natürliche Selektion diejenigen Organismen begünstigt hätte, die existieren könnten, indem sie die in ihrer Umgebung verbliebenen Nährstoffe nutzten und diese Nährstoffe in Materialien umwandelten, die sie zum Überleben verwenden könnten. Darüber hinaus würde die Selektion diejenigen Organismen begünstigen, die den maximalen Nutzen aus den verfügbaren Nährstoffen ziehen könnten.

Es entwickelte sich eine frühe Form der Photosynthese, die die Sonnenenergie nutzte, indem andere Verbindungen als Wasser als Quelle für Wasserstoffatome verwendet wurden, aber dieser Weg erzeugte keinen freien Sauerstoff. Es wird angenommen, dass sich die Glykolyse vor dieser Zeit entwickelt hat und die Produktion von Einfachzuckern nutzen könnte, aber diese Reaktionen waren nicht in der Lage, die in den Kohlenhydraten gespeicherte Energie vollständig zu extrahieren. Eine spätere Form der Photosynthese nutzte Wasser als Quelle für Wasserstoffionen und erzeugte freien Sauerstoff. Im Laufe der Zeit wurde die Atmosphäre mit Sauerstoff angereichert. Lebewesen passten sich an diese neue Atmosphäre an und ermöglichten die Entwicklung der Atmung, wie wir sie kennen. Als sich der vollständige Prozess der Photosynthese, wie wir ihn kennen, entwickelte und die Atmosphäre mit Sauerstoff angereichert wurde, konnten die Zellen endlich den durch die Photosynthese ausgestoßenen Sauerstoff nutzen, um mithilfe des Zitronensäurezyklus mehr Energie aus den Zuckermolekülen zu gewinnen.


Laktat ist ein natürlicher Suppressor der RLR-Signalgebung, indem es auf MAVS . abzielt

Die RLR-vermittelte Typ-I-IFN-Produktion spielt eine zentrale Rolle bei der Erhöhung der Wirtsimmunität für die Virus-Clearance und die Krebsimmunüberwachung. Hier berichten wir, dass die Glykolyse, die während der RLR-Aktivierung inaktiviert wird, als Barriere dient, um die Typ-I-IFN-Produktion bei der RLR-Aktivierung zu behindern. RLR-getriggerte MAVS-RIG-I-Erkennung entführt Hexokinase-Bindung an MAVS, was zu einer Beeinträchtigung der Hexokinase-Mitochondrien-Lokalisierung und -Aktivierung führt. Lactat dient als Schlüsselmetabolit, der für die Glykolyse-vermittelte RLR-Signalhemmung verantwortlich ist, indem es direkt an die MAVS-Transmembran(TM)-Domäne bindet und die MAVS-Aggregation verhindert. Insbesondere kehrt die Laktatwiederherstellung die durch Laktatmangel verursachte erhöhte IFN-Produktion um. Mit pharmakologischen und genetischen Ansätzen zeigen wir, dass die Laktatreduktion durch die Inaktivierung der Laktatdehydrogenase A (LDHA) die Produktion von IFN Typ I erhöht, um Mäuse vor Virusinfektionen zu schützen. Unsere Studie stellt eine kritische Rolle von Glykolyse-abgeleitetem Laktat bei der Begrenzung der RLR-Signalgebung fest und identifiziert MAVS als einen direkten Sensor für Laktat, der den Energiestoffwechsel und die angeborene Immunität verbindet.

Schlüsselwörter: MAVS RLR signalisiert Glukosestoffwechsel Interferonlactat.


Elektronenträger

In lebenden Systemen fungiert eine kleine Klasse von Verbindungen als Elektronenshuttles: Sie binden und transportieren hochenergetische Elektronen zwischen Verbindungen in Pfaden. Die wichtigsten Elektronenüberträger, die wir betrachten werden, stammen von der B-Vitamingruppe und sind Derivate von Nukleotiden. Diese Verbindungen lassen sich leicht reduzieren (dh sie nehmen Elektronen auf) oder oxidieren (sie verlieren Elektronen). Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) (Abbildung 4.13) wird von Vitamin B3, Niacin, abgeleitet. NAD + ist die oxidierte Form des Moleküls NADH ist die reduzierte Form des Moleküls, nachdem es zwei Elektronen und ein Proton aufgenommen hat (die zusammen einem Wasserstoffatom mit einem zusätzlichen Elektron entsprechen).

NAD + kann Elektronen von einem organischen Molekül nach der allgemeinen Gleichung aufnehmen:

RH (Reduktionsmittel) + NAD + (Oxidationsmittel) —-> NADH (reduziert) + R (oxidiert)

Wenn Elektronen zu einer Verbindung hinzugefügt werden, werden sie reduziert. Eine Verbindung, die eine andere reduziert, wird als Reduktionsmittel bezeichnet. In der obigen Gleichung ist RH ein Reduktionsmittel und NAD + wird zu NADH reduziert. Wann Elektronen werden aus der Verbindung entfernt, sie wird oxidiert. Eine Verbindung, die eine andere oxidiert, wird als Oxidationsmittel bezeichnet. In der obigen Gleichung ist NAD + ein Oxidationsmittel und RH wird zu R oxidiert.

In ähnlicher Weise wird Flavinadenindinukleotid (FAD + ) aus Vitamin B . abgeleitet2, auch Riboflavin genannt. Seine reduzierte Form ist FADH2. Eine zweite Variation von NAD, NADP, enthält eine zusätzliche Phosphatgruppe. Sowohl NAD + als auch FAD + werden in großem Umfang bei der Energiegewinnung aus Zuckern verwendet, und NADP spielt eine wichtige Rolle bei anabolen Reaktionen und der Photosynthese.

Abbildung 4.13 Die oxidierte Form des Elektronenträgers (NAD+) ist links und die reduzierte Form (NADH) rechts dargestellt. Die stickstoffhaltige Base in NADH hat ein Wasserstoffion mehr und zwei Elektronen mehr als in NAD+.

Ergebnisse der Glykolyse

Ein Glucosemolekül produziert während der Glykolyse vier ATP-, zwei NADH- und zwei Pyruvatmoleküle.

Lernziele

Beschreiben Sie die Energie, die aus einem Glukosemolekül gewonnen wird, das die Glykolyse durchläuft

Die zentralen Thesen

Wichtige Punkte

  • Obwohl in der zweiten Hälfte vier ATP-Moleküle produziert werden, beträgt der Nettogewinn der Glykolyse nur zwei ATP, da in der ersten Hälfte der Glykolyse zwei ATP-Moleküle verwendet werden.
  • Enzyme, die die Reaktionen katalysieren, die ATP produzieren, sind geschwindigkeitsbestimmende Schritte der Glykolyse und müssen in ausreichenden Mengen vorhanden sein, damit die Glykolyse die Produktion von vier ATP-, zwei NADH- und zwei Pyruvatmolekülen für jedes Glukosemolekül, das in den Stoffwechselweg eintritt, vervollständigt.
  • Rote Blutkörperchen benötigen zum Überleben die Glykolyse als einzige ATP-Quelle, da sie keine Mitochondrien besitzen.
  • Krebszellen und Stammzellen nutzen auch die Glykolyse als Hauptquelle für ATP (ein Prozess, der als aerobe Glykolyse oder Warburg-Effekt bekannt ist).

Schlüsselbegriffe

  • Pyruvat: jedes Salz oder Ester der Brenztraubensäure das Endprodukt der Glykolyse vor Eintritt in den TCA-Zyklus

Ergebnisse der Glykolyse

Die Glykolyse beginnt mit einem Molekül Glucose und endet mit zwei Pyruvat-Molekülen (Brenztraubensäure), insgesamt vier ATP-Molekülen und zwei Molekülen NADH. Zwei ATP-Moleküle wurden in der ersten Hälfte des Weges verwendet, um den Sechs-Kohlenstoff-Ring für die Spaltung vorzubereiten, so dass die Zelle einen Nettogewinn von zwei ATP-Molekülen und 2 NADH-Molekülen für ihre Verwendung hat. Wenn die Zelle die Pyruvatmoleküle nicht weiter abbauen kann (über den Zitronensäurezyklus oder den Krebszyklus), wird sie nur zwei ATP-Moleküle aus einem Glukosemolekül gewinnen.

Die Glykolyse produziert 2 ATP-, 2 NADH- und 2 Pyruvatmoleküle: Die Glykolyse oder der aerobe katabole Abbau von Glukose produziert Energie in Form von ATP, NADH und Pyruvat, das selbst in den Zitronensäurezyklus eintritt, um mehr Energie zu produzieren.

Reife rote Blutkörperchen von Säugetieren haben keine Mitochondrien und sind nicht in der Lage, aerob zu atmen, den Prozess, bei dem Organismen Energie in Gegenwart von Sauerstoff umwandeln. Stattdessen ist die Glykolyse ihre einzige ATP-Quelle. Wenn die Glykolyse unterbrochen wird, verlieren die roten Blutkörperchen daher ihre Fähigkeit, ihre Natrium-Kalium-Pumpen aufrechtzuerhalten, die ATP benötigen, um zu funktionieren, und sterben schließlich ab. Da zum Beispiel die zweite Hälfte der Glykolyse (die die Energiemoleküle produziert) in Abwesenheit von NAD+ verlangsamt oder stoppt, wenn NAD+ nicht verfügbar ist, werden rote Blutkörperchen nicht in der Lage sein, eine ausreichende Menge an ATP zu produzieren, um zu überleben.

Außerdem wird der letzte Schritt der Glykolyse nicht stattfinden, wenn die Pyruvatkinase, das Enzym, das die Bildung von Pyruvat katalysiert, nicht in ausreichenden Mengen verfügbar ist. In dieser Situation wird der gesamte Glykolyseweg weiterlaufen, aber in der zweiten Hälfte werden nur zwei ATP-Moleküle hergestellt (statt der üblichen vier ATP-Moleküle). Somit ist Pyruvatkinase ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym für die Glykolyse.


Das Enzym Triosephosphat-Isomerase wandelt die Moleküle Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) schnell um. Glyceraldehydphosphat wird entfernt / im nächsten Schritt der Glykolyse verwendet.

Einzelheiten:

GAP ist das einzige Molekül, das den glykolytischen Weg fortsetzt. Als Ergebnis werden alle produzierten DHAP-Moleküle weiter durch das Enzym Triosephosphat-Isomerase (TIM) beeinflusst, das das DHAP in GAP umorganisiert, damit es in der Glykolyse weiterlaufen kann. An diesem Punkt des glykolytischen Weges haben wir zwei 3-Kohlenstoff-Moleküle, haben aber Glucose noch nicht vollständig in Pyruvat umgewandelt.


Zellatmung Stufe II: Der Krebs-Zyklus

Denken Sie daran, dass die Glykolyse zwei Moleküle Pyruvat (Brenztraubensäure) produziert, die dann während der kurzen Übergangsreaktion in Acetyl-CoA umgewandelt werden. Diese Moleküle dringen in die Matrix eines Mitochondriums ein, wo sie die Krebs Zyklus (auch bekannt als Zitronensäurezyklus). Der Grund, warum diese Phase als Zyklus angesehen wird, liegt darin, dass ein Molekül namens Oxalacetat sowohl am Anfang als auch am Ende dieser Reaktion vorhanden ist und verwendet wird, um die beiden Moleküle von Acetyl-CoA abzubauen. Die als nächstes auftretenden Reaktionen sind in Abbildung 4.10.6 dargestellt.

Abbildung 4.10.6 Reaktanten und Produkte des Krebs-Zyklus.

Der Krebs-Zyklus selbst beginnt tatsächlich, wenn sich Acetyl-CoA mit einem Vier-Kohlenstoff-Molekül namens OAA (Oxalacetat) verbindet (siehe Abbildung 4.10.6). Dabei entsteht Zitronensäure mit sechs Kohlenstoffatomen. Deshalb wird der Krebs-Zyklus auch Zitronensäure-Zyklus genannt.

Nachdem sich Zitronensäure gebildet hat, durchläuft sie eine Reihe von Reaktionen, die Energie freisetzen. Die Energie wird in Molekülen von NADH, ATP und FADH . eingefangen2, ein weiteres energietragendes Coenzym. Als Abfallprodukt dieser Reaktionen wird auch Kohlendioxid freigesetzt.

Der letzte Schritt des Krebs-Zyklus regeneriert OAA, das Molekül, das den Krebs-Zyklus begann. Dieses Molekül wird für die nächste Runde durch den Zyklus benötigt. Zwei Umdrehungen sind erforderlich, da die Glykolyse zwei Brenztraubensäuremoleküle, wenn es Glukose spaltet.


11.2.3 Ergebnisse der Glykolyse

Die Glykolyse beginnt mit Glukose und endet mit zwei Pyruvat Moleküle, insgesamt vier ATP-Moleküle und zwei Moleküle NADH. Da in der ersten Stufe des Stoffwechselwegs zwei ATP-Moleküle investiert wurden, hat die Zelle einen Nettogewinn von 2 ATP-Molekülen und 2 NADH-Molekülen. Wenn die Zelle die Pyruvatmoleküle nicht weiter abbauen kann, wird sie nur zwei ATP-Moleküle aus einem Glukosemolekül gewinnen.

SCHNELLE ÜBERPRÜFUNG DER GLYKOLYSE:

    • Teilt ein Glukosemolekül mit sechs Kohlenstoffatomen in zwei Pyruvatmoleküle mit drei Kohlenstoffatomen, unter Verwendung von 10 enzymkatalysierten Reaktionen
    • Ergibt einen Nettogewinn von 2 ATP und 2 NADH
    • Findet im Zytoplasma statt
    • Kann ohne Sauerstoff erfolgen ist ein anaerober Prozess

    Schritt 7: Umwandlung von 1,3-Biphosphoglycerat in 3-Phosphoglycerat

    • Das Enzym Phosphoglyceratkinase überträgt die energiereiche Phosphorylgruppe von der Carboxylgruppe von 1,3-Bisphosphoglycerat auf ADP, wobei ATP und 3-Phosphoglycerat gebildet werden.
    • Dies ist ein einzigartiges Beispiel, bei dem ATP auf Substratebene hergestellt werden kann, ohne an der Elektronentransportkette teilzunehmen. Diese Reaktionsart, bei der ATP auf Substratebene gebildet wird, wird als Phosphorylierung auf Substratebene bezeichnet.

    Materialen und Methoden

    Stämme, Medien und Kultivierungsbedingungen

    Wir verwendeten S. cerevisiae Stamm T73 (CECT 1894), isoliert aus Mosten aus Alicante (Spanien) [48], der von Lallemand Inc. (Montreal, Kanada) vertrieben wird. Dieser Stamm wurde in mehreren Studien häufig verwendet und hat sich als gutes Weinhefemodell erwiesen. Dieser Stamm wurde zuvor genetisch zu T73ura3 [49] modifiziert, um andere Stämme zu konstruieren, da in natürlichen Weinhefen keine Auxotrophien vorhanden sind. Diese Stämme sind ebenfalls aneuploide und haben eine Chromosomenzahl, die kein Vielfaches der haploiden Zahl ist, und sie erfordern mehrere Transformationsrunden für die Konstruktion von Deletionsgenen.

    Das YEp-TRX2-Plasmid wurde durch Subklonieren einer 0,7 kb Öko RI-Fragment, das die Hefe enthält TRX2 Gen und Promotor im episomalen Hefeplasmid Yep352 mit selektierbarem Marker URA3. Das TTRX2 Stamm [2] ist ein genetisch modifizierter T73ura3 Stamm nach dem Lithiumacetat-Verfahren, modifiziert nach [50].

    Belastung trx2 wurde durch sequentielles Löschen der beiden Kopien des TRX2 Gen im Stamm T73ura3. Der Aufschluss erfolgte durch homologe Rekombination an beiden Enden des TRX2 offener Leserahmen einer Integrationskassette mit a kanR Markergen flankiert von loxP Websites. Die Exzision des Markers ist durch die Expression von Cre-Rekombinase induzierbar, die in denselben Stamm eingeführt wurde [51], um wiederholte Unterbrechungen zu ermöglichen. Integration der Kassette am TRX2 Locus und weitere Exzision der kanR Marker wurden durch PCR-Analyse bestätigt. Das Fehlen von TRX2 Genprodukt wurde durch Northern- und Western-Blot-Analysen bestätigt. Die Uracil-Prototrophie wurde durch die Einführung eines 1,1-kb .- Hind III lineares Fragment, das die URA3 Gen.

    Vorkulturen für industrielle Biomasse-Vermehrungsexperimente wurden in YPD-Flüssigmedium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose) hergestellt und bei 30°C unter Schütteln (250 U/min) für 12 h inkubiert.

    Melassemedium (verdünnt auf 60 g Saccharose L -1 für die Batch-Phase oder 100 g Saccharose L -1 für die Fed-Batch-Phase) wurde mit 7,5 g L -1 (NH4)2SO4, 3,5 g L -1 KH2Bestellung4, 0,75 g L -1 MgSO47H2O, 10 ml L –1 Vitaminlösung und 1 ml L –1 Antischaummittel 204 (Sigma, St. Louis, MO). Melasse und Minerallösungen wurden getrennt autoklaviert. Die 50 mg L -1 D-Biotin, 1 g L -1 Calciumpantothenat und 1 g L -1 Thiaminhydrochlorid enthaltende Vitaminlösung wurde vor der Verwendung im Melassemedium filtersterilisiert (0,2 &mgr;m Porengröße).

    Das Flüssigmedium YPGF (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 10 % Glucose, 10 % Fructose) wurde verwendet, um frische Hefe und aktive Trockenhefe zu beimpfen, die unter industriellen Bedingungen hergestellt wurden, um den Mostzuckergehalt und die Weinfermentationsbedingungen zu simulieren. YPGF-Medium wurde auch mit dem Carbonylierungsinduktor Glyoxal (GO) bei 5 mM für 1 h ergänzt, um Proteincarbonylierungsschäden zu induzieren [32].

    Industrielle Produktionsbedingungen

    In einem BIOFLO III-Bioreaktor (NBS, New Jersey) wurden Versuche zur Biomassevermehrung mit zwei Wachstumsstadien, Batch und Fed-Batch, konzipiert und die technischen Parameter (Agitation, pH und Feedrate) wie zuvor beschrieben festgelegt [1, 3, 29]. Über Nacht wurden YPD-Vorkulturen bei 30°C unter Schütteln (250 U/min) inkubiert (Zeit 0 h). Der Bioreaktor, der 2 l sterilisiertes Melassemedium bei pH 4,5 enthielt, wurde dann auf eine anfängliche OD . beimpft600 nm von 0,05. In der Batch-Phase verbrauchten die Zellen die gesamte im Medium vorhandene Saccharose unter Verwendung eines fermentativen Stoffwechsels. Wenn die Saccharose erschöpft war (12-15 h), stellten die Zellen ihren Stoffwechsel auf Atmung um, was den Verbrauch des produzierten Ethanols bis etwa 40 h des Prozesses ermöglichte. Wenn das Ethanol erschöpft war, begann die Fed-Batch-Phase, indem der Reaktor bis etwa 80 h kontinuierlich mit Melassemedium mit der gewünschten Flussrate beschickt wurde, wodurch ein fermentativer Metabolismus vermieden wurde, um die höchste Biomasseausbeute zu erzielen. Für den T73, T . wurden drei unabhängige Produktionsversuche durchgeführtTRX2 und trx2 Stämme.

    Trocknung und Rehydration von Biomasse

    Am Ende der Fed-Batch-Fermentation wurde die Biomasse durch Zentrifugation von den fermentierten Medien abgetrennt und mehreren Waschschritten mit destilliertem Wasser unterzogen. Konzentrierte Biomasse (500 mg) wurde in Petrischalen gesammelt. Hefebiomasse wurde unter Luftstrom in einem Konvektionsofen bei 30°C bis zu einer relativen Luftfeuchtigkeit von ca. 8 % (ca. 24 h) mit geöffneten Petrischalen entwässert [3]. Dehydratisierte Biomasse wurde in Plastiktüten gesammelt und unter Vakuumbedingungen bei Raumtemperatur während einer Woche gelagert. Die Rehydratisierung erfolgte in destilliertem Wasser bei 37 °C während 10 min unter statischen Bedingungen und 10 min unter Schütteln bei 130 U/min [52].

    Proteinextraktion und zweidimensionale Gelelektrophorese

    Zellproben (25 mg) wurden nach 0 h, 15 h und 80 h Wachstum für die Proteinextraktion gesammelt. Die Zellen wurden in 150 μl Extraktionspuffer (8 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCl pH 8,0), einer Mischung von Protease-Inhibitoren (200 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 20 μM TPcK, 200 μM Pepstatin A) und 0,2 g Glas resuspendiert Perlen. Die Zellen wurden in Fast Prep (MP Bio) bei 5,0 m/s 45 Sekunden lang dreimal aufgebrochen. Nach 10 min Zentrifugation bei 12000 Upm wurde der Überstand beschallt und erneut 10 min bei 12000 Upm zentrifugiert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Nanodrop ND-1000 UV/Vis-Spektrophotometer bestimmt. Von 50-80 ug Protein wurden in 340 ul Rehydrationspuffer (8 M Harnstoff, 4% CHAPS (w/v), 50 mM DTT und 0,5% Ampholyte (v/v) pH 3-10 (Amersham)) verdünnt. Die isoelektrische Fokussierung (50-100 µg Protein) wurde in immobilisierten pH-Gradientenstreifen (3-11 NL Amersham) durchgeführt. Nach der ersten Dimension wurden die Streifen 20 min lang mit 5 ml einer Lösung inkubiert, die 10 mM 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) in 10 % Trifluoressigsäure (TFA) enthielt. Diese Verbindung reagiert mit Carbonylgruppen in Proteinen. Um diese Reaktion zu stoppen, wurde der Streifen in eine 5 ml Lösung überführt, die 0,4 M Tris, 6 M Harnstoff, 2 % SDS und 20 % Glycerin enthielt. Die SDS-PAGE der zweiten Dimension wurde auf 18 × 18 cm 11% Polyacrylamidgelen durchgeführt.

    Vier Streifen wurden parallel gefahren, jeweils zwei Streifen für den Wildtyp und zwei Streifen für den jeweiligen Mutantenstamm. Die Gele wurden entweder zur Western-Blot-Analyse auf PVDF-Membranen übertragen oder mit Silber belastet und in einem GS800-Densitometer (Bio-Rad) gescannt. In beiden Fällen wurden die erhaltenen Bilder mit der PDQuest-Software (Bio-Rad) analysiert. Die Gele wurden mit dem PlusOne Silberfärbekit von General Electric Healthcare silbergefärbt. PVDF-Membranen wurden silbergefärbt, um die Proteinbelastung zu kontrollieren, wie an anderer Stelle beschrieben [53].

    Western-Blot-Analyse und Quantifizierung des Carbonylgehalts

    Rohextrakte wurden in 10 % SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und aus eindimensionalen Gelen auf die PVDF-Membran übertragen. Ein polyklonaler Anti-Adh1p-Antikörper wurde von Acris (R1049) erworben, der in der Lage ist, Monomer-, Dimer- und Tetramerformen von Adh1p unter SDS/PAGE-Bedingungen nachzuweisen, wie auf der Website http://www.acris-antibodies.com/antibodies . beschrieben /r1049.htm und auf 1:1000 verdünnt. Die Western-Blots aus zweidimensionalen Gelen wurden wie im vorherigen Abschnitt beschrieben hergestellt. Eine 1:5000 Verdünnung des Antikörpers gegen DNP (Dako) wurde verwendet. In beiden Fällen wurde ein Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper zum Nachweis verwendet. Bilder wurden in einem ChemiDoc XRS-System (Bio-Rad) aufgenommen und mit der Software Quantity One (Bio-Rad) analysiert.

    Der Carbonylgehalt wurde unter Verwendung der PDQuest-Software (Bio-Rad) quantifiziert. Die Carbonylierungsgrade für jedes Protein werden berechnet, indem die Carbonylintensität von westlichem 2-D-Anti-DNP (Cich) nach Proteinintensität (Pich) aus 2D-silbergefärbten Gelen.

    Proteinidentifizierung durch tryptischen Verdau und MALDI-TOF

    Proteinflecken wurden aus Gelen ausgeschnitten und vor Ort Verdau mit Trypsin auf einer ZipPlate (Millipore). Gelstücke wurden mit 25 mM Ammoniumbicarbonat gewaschen und mit Acetonitril dehydratisiert, gefolgt von (i) Reduktion von Cysteinen mit 10 mM DTT, (ii) Alkylierung von freien Cysteinen mit 55 mM Iodacetamid und (iii) vor Ort Verdau mit 170 ng Trypsin über Nacht bei 30°C. Peptidextraktionen und Waschungen wurden auf einer ZipPlate gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Tryptische Peptide wurden in 5 ml 0,1% TFA, 50% Acetonitril gewonnen und in Gegenwart von a-Ciano-4-hydroxycynaminsäure auf eine MALDI-Platte getüpfelt. Spektren wurden in einem im Reflektormodus arbeitenden voyager DE PRO MALDI-TOF-Gerät von Applied Biosystems erhalten. Es wurden Spektren mit höheren Auflösungen als 8000 erhalten. Die externe Kalibrierung wurde mit Kalibriermischungen von Applied Biosystems durchgeführt. Die aufgenommenen Spektren wurden von Data Explorer (Version 4.0) verarbeitet. Proteine ​​wurden durch Peptid-Mass-Fingerprinting-Suche in der Swiss-Prot-Datenbank unter Verwendung von MASCOT identifiziert. Eine Proteinbedeckung für jeden Fleck in der MASCOT-Analyse von bis zu 50 Prozent wurde als signifikant angesehen. Alternativ wurden Proteine ​​durch Gel-Matching mit . identifiziert S. cerevisiae zweidimensionale Gelelektrophoresekarten verfügbar in den folgenden Datenbanken: YPD (Yeast Proteome Database http://www.proteome.com) YMP (Yeast Mitochondrial Proteome http://www.biochem.oulu.fi/proteomics/ymp.html) und 2-DE S. cerevisiae (IPG6-12) http://www.weihenstephan.de/proteomik/. Die Analyse der funktionellen Gruppen wurde mit den Online-Anwendungen GOstat und GO term Finder (SGD-Datenbank) mit einer Fehlentdeckungsrate von 5 % durchgeführt. Die dargestellten Daten entsprechen dem Durchschnitt von drei biologischen Replikaten.

    ADH-Immunpräzipitation

    Zellen in IP-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 % Glycerin, 0,1 % Nonidet-P40) plus 1X Protease-Inhibitoren (Roche) und PMSF 0,4 mM wurden mit 0,5 g Glas gebrochen Beads in einem Fast Prep (MP Bio) bei 5,0 m/s für 45 s, 3 mal. Lysate wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 14.000 U/min geklärt und zu 20 &mgr;l Protein A/G PLUS-Agarose-Kügelchen (Santa Cruz Biotechnology, INC) mit gebundenem polyklonalen Anti-ADH-Antikörper (Acris-Antikörper) gegeben. Nach einem 4-stündigen Bindungsschritt bei 4 °C wurden die Kügelchen dreimal mit IP-Puffer plus 0,5 % TritonX-100 und 0,5 mM NaCl gewaschen und in Carbonylderivatisierungspuffer (25 mM Imidazol, 2 mM EDTA, pH 7,0, 6 % SDS .) resuspendiert , 1X Protease-Inhibitor) und 3 min gekocht. Probenproteine ​​wurden mit DNPH derivatisiert und in einem 9% Acrylamidgel (BioRad Laboratories) aufgetrennt und mit Anti-DNP-Antikörper bei 1/3500 und Anti-Kaninchen (1/5000) inkubiert.

    Enzymaktivitäten

    Dehydratisierte Zellen wurden in YPGF inokuliert (10 7 Zellen/ml) und bei 30°C und 65 UpM für 5 h inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden Proben entnommen und Zellextrakte wurden unter Verwendung von Glasperlen hergestellt und wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben untersucht: Alkoholdehydrogenase [54], Enolase [55], Pyruvatdecarboxylase [56] und Katalase [57].


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Bemerkungen:

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