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9.5: In-situ-Hybridisierung - Biologie

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5.5 In-situ-Hybridisierung

Vor Ort Hybridisierung (ISH) ist eine Art der Hybridisierung, bei der ein markierter komplementärer DNA-, RNA- oder modifizierter Nukleinsäurestrang (d. h. Sonde) verwendet wird, um eine spezifische DNA- oder RNA-Sequenz in einem Gewebeabschnitt oder -abschnitt zu lokalisieren (vor Ort) oder wenn das Gewebe klein genug ist (z.B. Pflanzensamen, Drosophila Embryonen), im gesamten Gewebe (whole mount ISH), in Zellen und in zirkulierenden Tumorzellen (CTCs). Dies unterscheidet sich von der Immunhistochemie, die normalerweise Proteine ​​in Gewebeschnitten lokalisiert.

In-situ-Hybridisierung wird verwendet, um die Position spezifischer Nukleinsäuresequenzen auf Chromosomen oder in Geweben aufzudecken, ein entscheidender Schritt zum Verständnis der Organisation, Regulation und Funktion von Genen. Zu den wichtigsten Techniken, die derzeit verwendet werden, gehören: vor Ort Hybridisierung an mRNA mit Oligonukleotid- und RNA-Sonden (sowohl radioaktiv als auch haptenmarkiert), Analyse mit Licht- und Elektronenmikroskop, Ganzkörper vor Ort Hybridisierung, Doppeldetektion von RNAs und RNA plus Protein und fluoreszierend vor Ort Hybridisierung zum Nachweis chromosomaler Sequenzen. DNA-ISH kann verwendet werden, um die Struktur von Chromosomen zu bestimmen. Fluoreszierende DNA-ISH (FISH) kann beispielsweise in der medizinischen Diagnostik zur Beurteilung der chromosomalen Integrität eingesetzt werden. RNA-ISH (RNA vor Ort Hybridisierung) wird zur Messung und Lokalisierung von RNAs (mRNAs, lncRNAs und miRNAs) in Gewebeschnitten, Zellen, Gesamtaufbauten und zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) verwendet. Vor Ort Hybridisierung wurde von Mary-Lou Pardue und Joseph G. Gall erfunden.

Abbildung 5.28 In-situ-Hybridisierung von Wildtyp Drosophila Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien für die RNA aus einem Gen namens Buckliger.

Bild von Nina


Für die Hybridisierungshistochemie werden Probenzellen und -gewebe normalerweise behandelt, um die Zieltranskripte an Ort und Stelle zu fixieren und den Zugang der Sonde zu verbessern. Wie oben erwähnt, ist die Sonde entweder eine markierte komplementäre DNA oder, jetzt am häufigsten, eine komplementäre RNA (Ribosonde). Die Sonde hybridisiert bei erhöhter Temperatur an die Zielsequenz, und dann wird die überschüssige Sonde weggewaschen (nach vorheriger Hydrolyse mit RNase im Fall von nicht hybridisierter überschüssiger RNA-Sonde). Lösungsparameter wie Temperatur, Salz- und/oder Detergenskonzentration können manipuliert werden, um alle nicht identischen Wechselwirkungen zu entfernen (d. h. nur exakte Sequenzübereinstimmungen bleiben gebunden). Dann wird die Sonde, die entweder mit radio-, fluoreszenz- oder antigen-markierten Basen (z. B. Digoxigenin) markiert wurde, im Gewebe lokalisiert und quantifiziert, indem entweder Autoradiographie, Fluoreszenzmikroskopie bzw. Immunhistochemie verwendet wird. ISH kann auch zwei oder mehr Sonden verwenden, die mit Radioaktivität oder den anderen nicht-radioaktiven Markern markiert sind, um gleichzeitig zwei oder mehr Transkripte nachzuweisen.

Eine alternative Technologie, Branched DNA Assay, kann für RNA (mRNA, lncRNA und miRNA) verwendet werden. vor Ort Hybridisierungsassays mit Einzelmolekül-Sensitivität ohne Verwendung von Radioaktivität. Dieser Ansatz (z. B. ViewRNA-Assays) kann verwendet werden, um bis zu vier Ziele in einem Assay zu visualisieren, und verwendet ein patentiertes Sondendesign und eine bDNA-Signalverstärkung, um empfindliche und spezifische Signale zu erzeugen. Proben (Zellen, Gewebe und CTCs) werden fixiert und dann behandelt, um die Zugänglichkeit des RNA-Ziels zu ermöglichen (RNA-Demaskierung). Zielspezifische Sonden hybridisieren an jede Ziel-RNA. Die nachfolgende Signalamplifikation basiert auf der spezifischen Hybridisierung benachbarter Sonden (einzelne Oligonukleotide [Oligos], die Seite an Seite an RNA-Targets binden). Eine typische zielspezifische Sonde enthält 40 Oligonukleotide, was zu 20 Oligopaaren führt, die Seite an Seite an das Ziel zum Nachweis von mRNA und lncRNA binden, und 2 Oligos oder ein einzelnes Paar zum Nachweis von miRNA. Die Signalverstärkung wird über eine Reihe von sequentiellen Hybridisierungsschritten erreicht. Ein Vorverstärkermolekül hybridisiert an jedes Oligopaar auf der zielspezifischen RNA, dann hybridisieren mehrere Verstärkermoleküle an jeden Vorverstärker. Als nächstes hybridisieren multiple Markersonden-Oligonukleotide (konjugiert an alkalische Phosphatase oder direkt an Fluorophore) an jedes Verstärkermolekül. Eine vollständig aufgebaute Signalverstärkungsstruktur „Baum“ hat 400 Bindungsstellen für die Markierungssonden. Wenn alle zielspezifischen Sonden an das Ziel-mRNA-Transkript binden, tritt eine 8000-fache Signalverstärkung für dieses eine Transkript auf. Separate, aber kompatible Signalverstärkungssysteme ermöglichen die Multiplex-Assays. Das Signal kann mit einem Fluoreszenz- oder Hellfeldmikroskop sichtbar gemacht werden.


Die Verwendung von Ganz-Mount vor Ort Hybridisierung zur Veranschaulichung der Genexpressionsregulation

Beatriz Llamusí und Verónica Muñoz-Soriano trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.

Abteilung für Genetik, Fakultät für Biologie, Universitat de València, Valencia, Spanien

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INCLIVA Gesundheitsforschungsinstitut, Valencia, Spanien

Anschrift für Korrespondenz an: Department of Genetics, Faculty of Biology, Universitat de València, València, Spanien. E-Mail: [email protected] Nach weiteren Artikeln dieses Autors suchen

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Joseph Gall

Joseph Gall ist Professor an der Carnegie Institution for Science und führend auf dem Gebiet der Zellbiologie. Er hat einen Großteil seiner Karriere damit verbracht, den Kern und seinen Inhalt zu studieren, und hat zahlreiche bedeutende Beiträge zu unserem Verständnis der Chromosomenstruktur und -funktion geleistet. Gall, ein angesehener Mikroskopiker, ist einer der … Weiterlesen


9.5: In-situ-Hybridisierung - Biologie

In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Art von Hybridisierung die einen markierten komplementären DNA- oder RNA-Strang (d. h. Sonde) verwendet, um eine spezifische DNA- oder RNA-Sequenz zu lokalisieren in ein Teil oder ein Gewebeabschnitt (vor Ort) oder, wenn die.
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FISCH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) ist ein Zytogenetikum. MeSH Fluoreszenz+ in+ Standort+ Hybridisierung. Informationen zu Fiber FISH von der Olympus Corporation.
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In situ Hybridisierung. Ab-Färbung. TUNEL-Färbung. Knorpelfärbung. Schneiden von Embryonen. für ganze Montierung in situ Hybridisierung funktioniert perfekt für .
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Verwenden von in situ Hybridisierung, ist es möglich, die Genexpression zu lokalisieren. Der erste Schritt von in situ Hybridisierung ist die Auswahl eines Sondentyps. .
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Lösungen für in situ Hybridisierung . Vorbereitung von In Standort Hybridisierung Puffer: . Nach in situ Hybridisierung abgeschlossen ist, Deckgläser mit 0,05 M spülen.
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IN SITU HYBRIDISIERUNG VON EINSTRÄNGIGEN RNA-SONDEN MIT ARABIDOPSIS-BLUMENGEWEBE. Meyerowitz (1987) In situ Hybridisierung zu RNA in Pflanzengewebe. Anlage .
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In situ Hybridisierung ist eine leistungsstarke Technik, die sehr informativ sein kann. . Beim Aufführen in situ Hybridisierung zum ersten Mal ist es oft wünschenswert.
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Mehrfarbige Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) kann in seiner einfachsten Form . In situ Hybridisierung Kits und fluoreszenzmarkierte Sonden sind im Handel erhältlich.
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RPA/RNAi/In Standort Hybridisierung Forschungskern . IN SITU HYBRIDISIERUNG ist ein bildgebendes Verfahren zur Visualisierung der mRNA-Expression in Geweben und Zellen. .
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In situ Hybridisierung - Methode. Tabelle der Methoden. aktualisiert - 18. Januar 2003. SOX3 . es ist möglich durchzuführen in situ Hybridisierung bei gebleichten Embryonen erscheint es .
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Factsheet zur Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), herausgegeben vom National Human Genome Research Institute. . in situ Hybridisierung (FISCH) .
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Liste der immunhistochemischen Ressourcen im Internet. Beinhaltet einen Blick auf Immunenzymtechniken, Immunfluoreszenz und in situ Hybridisierungen.
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In situ Hybridisierung Zusammenfassung mit 7 Seiten Enzyklopädieeinträgen, Aufsätzen, Zusammenfassungen, Forschungsinformationen und mehr. . Artikel über In situ Hybridisierung. .
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Verfahren für In Standort Hybridisierung zu Chromosomen, Zellen und Gewebeschnitten . In situ Hybridisierung zu menschlichen Metaphase-Chromosomen unter Verwendung von DIG-, Biotin- oder .
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. Praktische Alternative für Fluoreszenz in Standort Hybridisierung um HER-2/neu zu erkennen. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) gilt derzeit als Gold.
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In-situ-Hybridisierung

In-situ-Hybridisierung
Lokalisieren eines Gens durch Hinzufügen spezifischer radioaktiver Sonden für das Gen und Detektieren des Ortes der Radioaktivität auf dem Chromosom nach der Hybridisierung
Quelle: Jenkins, John B. 1990. Humangenetik, 2. Auflage. New York: Harper & Row.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Verfahren zur Visualisierung eines genetischen Markers auf einem Chromosom unter Verwendung einer fluoreszenzmarkierten Polynukleotidsonde, die während der Mitose (Metaphase) an ein Gen auf einem Chromosom hybridisiert und diesen anzeigt. (siehe auch Interphase-Kernkartierung) .

In-situ-Hybridisierung
In-situ-Hybridisierung ist eine Labortechnik, bei der eine einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenz, die als Sonde bezeichnet wird, komplementäre Basenpaare mit DNA oder RNA bilden kann, die in einer Gewebe- oder Chromosomenprobe vorhanden ist.

In-situ-Hybridisierung
Eine Technik zur Genkartierung, die die Hybridisierung einer markierten Probe eines klonierten Gens an ein großes DNA-Molekül (normalerweise ein Chromosom) häufig innerhalb einer Zelle beinhaltet.

in situ-Hybridisierung Verwendung einer DNA- oder RNA-Sonde zum Nachweis komplementärer DNA-Sequenzen kultivierter eukaryontischer Zellen oder bakterieller Klone.

In-situ-Hybridisierung Eine Technik zur Kartierung klonierter DNA-Sequenzen durch direkte Hybridisierung an Metaphase-Chromosomen und Analyse durch Mikroskopie (siehe Kapitel 10).
Siehe In-situ-Hybridisierung im MGI-Glossar.

In-situ-Hybridisierung Diese Technik wurde entwickelt, um spezifische RNA nachzuweisen, die in histologischen Proben vorhanden ist. Das Gewebe wird mit besonderer Sorgfalt präpariert, um RNA nicht abzubauen. Die Zellen werden auf einem Objektträger fixiert, mit der Sonde hybridisieren gelassen und dann gewaschen und mit einer photographischen Emulsion überschichtet.

in-situ-Hybridisierung – Nachweis der Lage von Nukleinsäuresequenzen in einer Zelle oder einem Organismus.
Induktorgen – Gen, das für das Repressorprotein des lac-Operons kodiert, wenn Lactose das Repressorprotein bindet, wird das lac-Operon induziert.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) bezieht sich auf die Verwendung einer fluoreszenzmarkierten Sonde, um an zytogenetische Zellpräparationen zu hybridisieren.
Neben Standardpräparaten kann FISH auch durchgeführt werden bei: .

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH) wird verwendet, um DNA-Sequenzen auf Chromosomen zu lokalisieren und zu identifizieren und Chromosomendefekte zu erkennen. Sie kann verwendet werden, um Bakterienpathogene im menschlichen Darm wie Enterococcusspp zu untersuchen und zu lokalisieren .

In-situ-Hybridisierung
Verwendung einer DNA- oder RNA-Sonde zum Nachweis der Anwesenheit der komplementären DNA-Sequenz in klonierten Bakterien- oder kultivierten eukaryontischen Zellen. (ORNL)
In vitro
Studien, die außerhalb eines lebenden Organismus wie in einem Labor durchgeführt werden. (ORNL)
In vivo
Untersuchungen an lebenden Organismen. (ORNL) .

FISH – fluoreszierende in situ-Hybridisierung: eine Technik zur eindeutigen Identifizierung ganzer Chromosomen oder Teile von Chromosomen unter Verwendung von fluoreszierender markierter DNA. 5'-Ende – das Ende eines Polynukleotids mit einer freien (oder phosphorylierten oder verkappten) 5'-Hydroxylgruppe, die Transkription/Translation beginnt an diesem Ende.

(Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung): Eine der moderneren Methoden in der Zytogenetik, die fluoreszenzmarkierte chromosomspezifische DNA, Sonden zum Nachweis von Translokationen, Inversionen, Deletionen, Amplifikationen und anderen strukturellen oder numerischen Chromosomenanomalien verwendet.

In-situ-Hybridisierung: erkennt das Vorhandensein eines Transkripts
MS2-Tagging: Durch den Einbau von RNA-Stammschleifen wie MS2 in ein Gen werden diese in neu synthetisierte RNA eingebaut.

Eine davon wird "in situ-Hybridisierung" genannt. Eine Sache, die ich damals gerne gewusst hätte, als ich die Antennapedia-Mutante in Fruchtfliegen untersuchte, ist, wo bestimmte Gene im Körper exprimiert werden. Mit der In-situ-Hybridisierung können Sie untersuchen, wo unterschiedliche Gene im Körper verwendet werden.

Die Nick-Translation ist die am häufigsten verwendete Methode zum Markieren von Sonden für die in-situ-Hybridisierung. Es leitet seinen Namen von den einzelsträngigen Nicks ab, die aus der mit DNAse behandelten DNA resultieren, und der Nick hat je nach Prozessivität der Polymerase eine gewisse Distanz "übersetzt".
Abgerufen von "".

Bei dieser neueren Technik werden mehrere verschiedene Sonden, die für ein Chromosomenpaar spezifisch sind und unterschiedliche Mengen eines Satzes von Fluoreszenzfarbstoffen tragen, an die Chromosomen in einer Technik hybridisiert, die als Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) bekannt ist.

Wenn die Merkmale einer Person stark auf das Williams-Syndrom hindeuten, kann ein Arzt einen Test anordnen, der eine Methode namens FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) verwendet. Wenn sich ein Arzt bei der Diagnose weniger sicher ist, kann er einen Test anordnen, der neben Chromosom 7 auch andere Chromosomen untersucht.

Verwendete Zellen und Gewebe und Identifizierungstechniken: Bandenbildungsmethoden, hochauflösende Bandenbildung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Mikrodeletion
Chromosomenanomalien: Autosomen und Geschlechtschromosomen
P 188-202, 314, 334-5, 400-5
T Ch 9, 10 .

Durch Koppeln der klonierten DNA an Fluoreszenzfarbstoffe und Hybridisieren der fluoreszenzmarkierten DNA direkt an Chromosomenpräparate oder ganze Zellen ermöglicht die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) eine schnelle, effiziente und zuverlässige Identifizierung ganzer Chromosomen oder Chromosomenfragmente.


Vor Ort Hybridisierungstechniken für in Paraffin eingebettete adulte Korallenproben

Das Ziel dieses Protokolls ist es, vor Ort Hybridisierung an erwachsenen Korallenproben, die in Paraffin eingebettet und auf Glasobjektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode, die verwendet wird, um die räumliche Expression einer RNA-Antisense-Sonde in in Paraffin eingebetteten Geweben zu visualisieren.

Abstrakt

Korallen sind wichtige wirbellose Meerestiere, die sowohl für die allgemeine Gesundheit der Ozeane als auch für die menschliche Gesundheit von entscheidender Bedeutung sind. Durch menschliche Einflüsse wie steigende Meerestemperaturen und Ozeanversauerung sind Korallen jedoch zunehmend bedroht. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, haben sich Fortschritte in der Zell- und Molekularbiologie als entscheidend für die Diagnose der Gesundheit von Korallen erwiesen. Die Modifikation einiger der in der Humanmedizin häufig verwendeten Techniken könnte die Fähigkeit der Forscher, Korallen zu behandeln und zu retten, erheblich verbessern. Um dies zu beheben, wurde ein Protokoll für vor Ort Hybridisierung, die hauptsächlich in der Humanmedizin und der evolutionären Entwicklungsbiologie verwendet wird, wurde für den Einsatz bei erwachsenen Korallen unter Stress angepasst.

Der Zweck dieser Methode besteht darin, die räumliche Expression einer RNA-Sonde in adultem Korallengewebe zu visualisieren, die in Paraffin eingebettet und auf Glasobjektträger geschnitten wurde. Dieses Verfahren konzentriert sich auf die Entfernung des Paraffins und die Rehydratisierung der Probe, die Vorbehandlung der Probe, um die Permeabilität der Probe sicherzustellen, die Inkubation vor der Hybridisierung, die Hybridisierung der RNA-Sonde und die Visualisierung der RNA-Sonde. Dies ist eine leistungsstarke Methode, wenn Nicht-Modell-Organismen verwendet werden, um herauszufinden, wo bestimmte Gene exprimiert werden, und das Protokoll kann leicht für andere Nicht-Modell-Organismen angepasst werden. Das Verfahren ist jedoch insofern eingeschränkt, als es hauptsächlich qualitativ ist, da die Expressionsintensität abhängig von der während des Visualisierungsschritts verwendeten Zeit und der Konzentration der Sonde variieren kann. Darüber hinaus ist Geduld gefragt, da dieses Protokoll je nach verwendeter Sonde bis zu 5 Tage (und in vielen Fällen auch länger) dauern kann. Schließlich ist eine unspezifische Hintergrundfärbung üblich, aber diese Einschränkung kann überwunden werden.

Einführung

Korallen sind wichtige Bausteine ​​für Ökosysteme und wichtig für die Biodiversität der Ozeane und die menschliche Gesundheit 1 , 2 , 3 . Sie sind durch den Klimawandel und andere anthropogene Stressoren bedroht, und viele Korallenarten gelten als vom Aussterben bedroht. Daher besteht ein erheblicher Bedarf an zellulären und molekularen Werkzeugen, um Korallen unter Stress zu diagnostizieren. Außerdem ist wenig darüber bekannt, wo Gene im adulten Korallengewebe exprimiert werden, und daher wenig über die Funktionen dieser Gene. Um dieses Problem zu beheben, haben wir die vor Ort Hybridisierungsprotokoll (ISH), das häufig in der Humanmedizin und der evolutionären Entwicklungsbiologie verwendet wird, zur Verwendung bei in Paraffin eingebetteten Gewebeproben ausgewachsener Korallen. Diese Technik ist am wirksamsten, wenn sie bei erwachsenen Korallen angewendet wird, die einem stressigen Ereignis wie Hitzestress ausgesetzt waren. Diese Technik kann jedoch auf eine Vielzahl von Geweben und Lebensstadien von Korallen angewendet werden und ist nicht nur auf hitzegestresste Korallen beschränkt 4 , 6 , 7 . Außerdem kann diese Technik bei Geweben oder Zellen eines beliebigen Metazoen verwendet werden, solange cDNA-Sequenzinformationen verfügbar sind.

Der Zweck dieser Methode besteht darin, RNA-Sonden in adultem Korallengewebe sichtbar zu machen, das konserviert und in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurde. Diese Methode ist ein leistungsstarkes diagnostisches Werkzeug, das die Visualisierung von Nukleinsäuren im erwachsenen Korallengewebe ermöglicht. Ursprünglich wurde diese Methode für die medizinische Diagnostik entwickelt und hat sich seitdem in Bereichen wie der Entwicklungsbiologie und der evolutionären Entwicklungsbiologie zu einem beliebten Werkzeug entwickelt 8 , 9 , 10 . ISH ist auch eine kritische Methode, insbesondere in Nicht-Modellsystemen, wenn genomische und transkriptomische Sequenzdaten verfügbar sind, aber räumliche Genexpressionsmuster unbekannt sind. Für diagnostische Arbeiten in Nicht-Modellsystemen ist diese Technik leistungsstark, da sie anzeigen kann, welche Zellen und Gewebe ein interessierendes Gen exprimieren, und zu gezielteren therapeutischen Ansätzen führen kann 8, 9, 10, 11, 12 . Schließlich ist diese Technik qualitativ und leistungsfähiger, wenn sie mit quantitativen Genexpressionsdaten gepaart wird 11 .

Der in diesem Beitrag skizzierte Ansatz wird für Forscher interessant sein, die bereits eine Digoxigenin (DIG)-markierte RNA-Sonde (sowohl die Sense- als auch die Antisense-Sonde) entwickelt haben und nun einsatzbereit sind vor Ort Hybridisierung der Sonden an eine Probe. Um dieses Verfahren durchzuführen, werden für jede getestete Sonde zwei serielle Schnitte eines Paraffinkorallengewebes benötigt. Ein Abschnitt wird für die Sense-Sonde und der andere für die Antisense-Sonde verwendet. Die Sense-Sonde wird eine Kontrolle sein, um unspezifische Bindung anzuzeigen. Wenn in der Sense-Sonde eine Färbung beobachtet wird, ist die Antisense-Sonde nicht spezifisch für die interessierende RNA. Sonden können für jedes exprimierte Gen konstruiert werden. In diesem Protokoll werden mehrere Beispiele verwendet, die zuvor bei Hitzestress in Korallen exprimiert wurden: FBJ-Maus-Osteosarkom-Virus-Onkogen-Homolog B (Fos-B), Aktivatorprotein (AP1) und Tumornekrosefaktor-Rezeptor 41 (TNFR 41) 11. ISH unter Verwendung von DIG-markierten RNA-Sonden wird gegenüber der Verwendung radioaktiver Sonden bevorzugt, da ihre Handhabung viel sicherer ist 10 . Darüber hinaus ist diese Technik hochsensibel und kann an einer Vielzahl von Geweben und Embryonen über hitzegestresste erwachsene Korallen hinaus durchgeführt werden 13, 14, 15, 16 .

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Protokoll

Achtung: Führen Sie die folgenden Schritte unter einer Abzugshaube durch.

  1. Entparaffinieren Sie die dünn geschnittenen, in Paraffin eingebetteten Objektträger mit 100 % Xylol unter der Haube in Coplin-Glasgläsern für 10 min. Verwenden Sie keine Coplin-Gläser aus Kunststoff, da Xylol Kunststoff schmilzt. Sterilisieren Sie die Coplin-Gläser vor der Verwendung in einem Autoklaven.
  2. Bereiten Sie vier sterile Coplin-Gläser mit folgendem Inhalt vor: 100 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol und 60 % Ethanol. Verdünnen Sie das Ethanol mit RNase-freiem Wasser.
    1. Übertragen Sie die Objektträger in das sterile Coplin-Glas mit 100 % Ethanol und weichen Sie sie 10 min ein. Leeren Sie nach 10 Minuten das Coplin-Glas und ersetzen Sie es durch neues 100 % Ethanol. Weichen Sie die Objektträger erneut für 10 Minuten ein.
    2. Übertragen Sie die Objektträger in das sterile Coplin-Glas mit 80 % Ethanol für 1 Minute.
    3. Übertragen Sie die Objektträger in das sterile Coplin-Glas mit 70 % Ethanol für 1 Minute.
    4. Übertragen Sie die Objektträger in das sterile Coplin-Glas mit 60 % Ethanol für 1 Minute.

    2. Vorbehandlung von Objektträgern zur Vorbereitung der RNA-Sondenhybridisierung

    1. Führen Sie die folgenden Waschgänge bei Raumtemperatur durch, sofern nicht anders angegeben. Führen Sie Waschvorgänge bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei langsamer Geschwindigkeit durch. Verwenden Sie zum Waschen der Objektträger sterile Objektträger-Poster mit Platz für bis zu fünf Objektträger.
    2. Übertragen Sie die Objektträger auf einen sterilen Objektträger-Mailer mit 18 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). 5 min bei Raumtemperatur waschen.
    3. Gießen Sie 1x PBS ab und behandeln Sie das Gewebe auf den Objektträgern sofort mit Proteinase K, um eine Sondendurchdringung des Gewebes zu ermöglichen. Geben Sie etwa 18 ml Proteinase K-Lösung in den Objektträger-Mailer (siehe Tabelle 1 für die Konzentration der Arbeitslösung). 15 min bei 37 °C inkubieren. Nicht schütteln.
      1. Bereiten Sie während der Inkubation der Objektträger den Prähybridisierungspuffer (Prehybe Buffer) vor. Legen Sie den Prehybe Buffer für 10 min in ein kochendes Wasserbad, dann kühlen Sie ihn für 5 min auf einem Eisbad ab. Ein Rezept für Prehybe Buffer finden Sie unter Tabelle 1.
      2. Stoppen Sie die Verdauung der Proteinase-K-Reaktion, indem Sie die Proteinase-K-Lösung ausgießen, und fügen Sie sofort 18 ml 0,2% Glycin-PBS-Lösung zum Slide-Mailer hinzu. Lassen Sie den Slide Mailer 5 min bei Raumtemperatur stehen.
      3. Gießen Sie die 0,2% Glycin-PBS-Lösung aus und fügen Sie jedem Objektträger-Mailer 18 ml 2x Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) hinzu. Waschen Sie die Objektträger in der 2x SSC für 10 min bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 100-150 U/min.

      3. Prähybridisierung von Objektträgern zur Vorbereitung der RNA-Sondenhybridisierung

      1. Während die Objektträger mit 2x SSC gewaschen werden, besorgen Sie sich einen neuen sterilen Objektträger-Poster und geben Sie ungefähr 18 ml Prehybe-Puffer in den Objektträger-Poster. Legen Sie den Slide Mailer in den Hybridisierungsofen bei Hybridisierungstemperatur.
        HINWEIS: Die Hybridisierungstemperatur hängt von der verwendeten Sonde ab, liegt jedoch normalerweise im Bereich von 50-60 °C.
      2. Sobald die 2x SSC-Wäsche abgeschlossen ist, gießen Sie die 2x SSC aus und legen Sie die Objektträger in den Slide Mailer in den Prehybe Buffer im Hybridisierungsofen für 1 h.

      4. Hybridisierung der RNA-Sonde

      1. Während die Objektträger mit dem Prehybe Buffer im Hybridisierungsofen inkubieren, bereiten Sie die Hybridisierungssondenlösung vor.
        1. Jede Sonde in Hybridisierungspuffer verdünnen (0,5 µL Sonde mit 24,5 µL Hybridisierungspuffer).
          HINWEIS: Das Rezept für Hybridisierungspuffer finden Sie in Tabelle 1. Ein Beispiel für Sondenvorbereitung und Konzentrationen finden Sie in Traylor-Knowles et al. 11 .
        2. Legen Sie die verdünnte Sonde 12 Minuten lang auf einen 86-90 °C-Heizblock und kühlen Sie sie dann 1 Minute lang auf Eis.
        1. Legen Sie die Proben in die Objektträger-Feuchtigkeitskammer mit 4x SSC + 50% Formamid-Lösung im Boden der Kammer.
        2. Nachdem allen Objektträgern Sonden hinzugefügt wurden, stellen Sie die Objektträger-Feuchtigkeitskammer für mindestens 24 Stunden bei einer Hybridisierungstemperatur von 50-60 °C in den Hybridisierungsofen. Die Inkubationszeit kann je nach Konzentration der Sonde variieren, sollte jedoch mindestens 24 Stunden betragen.
        1. Entfernen Sie die Deckgläser von jedem der Objektträger und achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu verschieben. In eine 1000 µL-Pipette 1000 µL 2x SSC-Lösung geben und den Objektträger vorsichtig abwaschen.
        2. Legen Sie den Objektträger in einen sterilen Objektträger-Mailer mit 18 ml 2x SSC-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Gießen Sie die Lösung aus und ersetzen Sie sie durch 18 ml frisches 2x SSC. Wiederholen Sie die Inkubation erneut für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
        3. Gießen Sie die 2x SSC-Lösung aus. 18 ml 1x SSC-Lösung zugeben und 5 min bei Raumtemperatur waschen. Gießen Sie die 1x SSC-Lösung aus und ersetzen Sie sie durch 18 ml frische 1x SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
        4. Gießen Sie das 1x SSC aus. Fügen Sie 18 ml 0,5x SSC hinzu und waschen Sie 10 Minuten lang bei 42 °C ohne Schütteln. Gießen Sie das 0,5x SSC aus und ersetzen Sie es durch 18 ml frisches 0,5x SSC. Nochmals 10 min bei 42 °C waschen, ohne zu schütteln.

        5. Visualisierung der RNA-Sonde

        HINWEIS: Zur Visualisierung der Sonde wird während des Entwicklungsprozesses BM lila verwendet. Vor diesem Schritt sind jedoch mehrere Waschgänge erforderlich, um die Proben für die Färbung vorzubereiten.

        1. Waschen Sie die Objektträger mit 18 ml alkalischer Phosphatase-Puffer (AP-Puffer) ohne MgCl2 für 1min. Gießen Sie den AP-Puffer ohne MgCl . aus2, und fügen Sie 18 ml 1x Boehringer-Mannheim-Blockierungspuffer, verdünnt mit Maleinsäurepuffer, hinzu. Inkubieren Sie mindestens 1 h bei Raumtemperatur in einem Objektträger-Mailer unter leichtem Schütteln.
          HINWEIS: Der Boehringer-Mannheim-Blockierungspuffer und der verwendete Maleinsäurepuffer wurden vorgefertigt und im DIG Wash and Block Buffer Set (im Handel erhältlich) gekauft.
          1. Alternativ kann eine Inkubation über Nacht bei 4 °C durchgeführt werden. Eine längere Blockierungszeit verringert das Auftreten einer unspezifischen Bindung.

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          Repräsentative Ergebnisse

          Nach Abschluss dieses Protokolls wird die Identifizierung von Zellen und Geweben erreicht, die die interessierende RNA-Sonde exprimieren. Die repräsentativen Ergebnisse für dieses Protokoll sind für AP-1, FosB und TNFR41. Diese Ergebnisse, die zuvor von Traylor-Knowles veröffentlicht wurden et al. 11 zeigen die räumliche Expression von RNA-Sonden auf erwachsenen Korallen, die Hitzestress ausgesetzt waren. Zwei Beispiele für verschiedene Färbearten werden in . vorgestellt Abbildung 1. Abbildung 1A ist ein Beispiel für diffuse Gewebefärbung. Der Farbstoff findet sich im gesamten Gewebe, nicht nur in bestimmten Zellen. Hier findet sich die Expression von Antisense-AP-1 in der gesamten Epidermis und der oralen Gastrodermis 11 (Abbildung 1A). Die Färbung ist diffus und nicht auf einen bestimmten Zelltyp getrennt. Bei dieser Art der Färbung ist es besonders wichtig, gleichzeitig eine Sense-Kontrolle durchzuführen, da einige der Ergebnisse auf unspezifische Färbungen zurückzuführen sein können.

          Die zweite Art der Färbung ist zellspezifisch, bei der die Färbung nur in bestimmten Zelltypen zu finden ist. Beide FosB (Abbildung 1B) und TNFR41 (Abbildung 1C) zeigen diese Art der Färbung. Beide Sonden wurden an Gewebeproben ausgewachsener Korallen verwendet, die einem Hitzestress ausgesetzt waren 11 . Im Antisense-Panel wird eine violette Färbung beobachtet. TNFR41 wurde in verschiedenen Arten von Nesselzellen exprimiert, einer Familie von Zelltypen, die nur bei Nesseltieren vorkommt (Abbildung 1). Insbesondere färbte es Nematozyten, die die mikrobasischen Mastigophor-Organellen (Nematozysten) produzieren, und Spirozyten, die Spirozysten produzieren, die sich alle in der Epidermis von Korallengewebe befinden. Nematozyten werden auch in anderen Gewebeschichten der Koralle gefunden, wie z. B. der Calicodermis, jedoch konnten aufgrund der an dieser speziellen Probe durchgeführten Schnitte keine Informationen gesammelt werden. FosB färbte auch Nesselzellen und war sowohl für Spirozyten als auch für Nematozyten spezifisch. Für beide dieser Sonden zeigte die Sense-Kontrolle keine Färbung, was darauf hinweist, dass die Färbung für die Antisense-Sonde tatsächlich spezifisch war. Dies sind nur zwei Arten von repräsentativen Ergebnissen (diffuse Gewebefärbung und zellspezifische Färbung) der Färbetechniken, die mit verschiedenen Sondentypen vorhanden sein können. Aufgrund dieser Variabilität ist es wichtig, eine Sense-Kontrolle zu verwenden, um unspezifische Färbungen zu bestimmen.


          Abbildung 1: Repräsentatives Ergebnis von ISH, das bestimmte Zellen färbte. (A) Im ersten Panel zeigt die Sense-Kontrolle für die AP-1-Sonde, dass innerhalb des Objektträgers wenig Färbung vorhanden ist. Im zweiten Feld zeigt die Antisense-Sonde für AP-1, dass die Färbung mit dieser Sonde im gesamten Gewebe diffus ist. Die Färbung ist spezifisch für die orale Gastrodermis und Epidermis. Bei dieser Art der Färbung ist es wichtig, eine Sense-Kontrolle durchzuführen, um sicherzustellen, dass die beobachtete Färbung spezifisch ist. (B) Eine Sense-Kontrolle für die FosB-Sonde im ersten Panel zeigt wenig vorhandene Färbung. Im zweiten Panel zeigt die Antisense-Sonde für FosB eine für Spirozyten und Nematozyten spezifische Färbung mit diffuser Färbung in der gesamten Epidermis und oralen Gastrodermis. (C) Im ersten Panel zeigt die Sense-Kontrolle für die TNFR 41-Sonde, dass auf dem Objektträger wenig Färbung vorhanden ist. Im zweiten Feld zeigt die Antisense-Sonde für TNFR 41 eine spezifische Färbung innerhalb der Spirozyten, Nematozyten und mikroblastischen Mastigophoren. Abkürzungen: Spirozyten (SP), Symbiodium (SY), Nematozyten (NE), mikrobasische Mastigophoren (MM), Symbionten-enthaltende gastrodermale Zelle (SU). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung wiedergegeben 11 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

          Notiz: Alle Verdünnungen sollten mit sterilem, RNase-freiem Wasser in autoklaviertem Glas erfolgen.
          Prehybe-Puffer (50 ml) HINZUFÜGEN
          Formamid 25 ml
          20X SSC (pH 4,5) 12,5 ml
          20 mg/ml Heparin 0,1 ml
          50X Denhardts 5 ml
          20% Tween-20 0,5 ml
          20% SDB 0,5 ml
          10 mg/ml Lachssperma-DNA (vor der Zugabe denaturieren) 2 ml
          RNase-freies Wasser 4,4 ml
          Notiz: Die Lösung kann in einem 50-ml-Einwegröhrchen hergestellt werden. Lachssperma sollte durch 5 Minuten langes Kochen auf einem Hitzeblock denaturiert werden, bevor es der Lösung hinzugefügt wird.
          Hybridisierungspuffer (47 ml) HINZUFÜGEN
          Formamid 25 ml
          20X SSC (pH 4,5) 12,5 ml
          20 mg/ml Heparin 0,1 ml
          50X Denhardts 5 ml
          20% Tween-20 0,5 ml
          20% SDB 0,5 ml
          10 mg/ml Lachssperma-DNA (vor der Zugabe denaturieren) 2 ml
          RNase-freies Wasser 1 ml
          Notiz: Die Lösung kann in einem 50-ml-Einwegröhrchen hergestellt werden. Lachssperma sollte durch 5 Minuten langes Kochen auf einem Hitzeblock denaturiert werden, bevor es der Lösung hinzugefügt wird.
          10X PBS (1,0 L) HINZUFÜGEN
          18,6 mM NaH2Bestellung4 2,56 g
          84,1 mM Na2HPO4 11,94 g
          1.750 mM NaCl 102,2 g
          Anmerkungen: Mischen Sie Phosphate in etwa 800 ml Wasser für ein Volumen von 1,0 l. Überprüfen Sie den pH-Wert. Es sollte 7,4 ± 0,4 sein. Ansonsten pH mit NaOH oder HCl auf 7,4 einstellen. NaCl und restliches Wasser hinzufügen. Nachdem der pH-Wert eingestellt ist, wird autoklaviert.
          20X SSC (1,0 L) HINZUFÜGEN
          3 M NaCl 175,3 g
          0,3 M Na-Citrat 88,2 g
          Anmerkungen: Mischen Sie etwa 800 ml RNase-freies Wasser ein, um ein Volumen von 1,0 l zu erreichen. pH auf 4,5 einstellen und autoklavieren.
          Puffer mit alkalischer Phosphatase (AP) ohne MgCl2 (50ml) HINZUFÜGEN
          1 M NaCl 5,0 ml
          1 M Tris, pH 9,5 5,0 ml
          20% Tween-20 1,25 ml
          RNase-freies Wasser 38,75 ml
          Anmerkungen: Vor Gebrauch in einem 50-ml-Röhrchen vorbereiten.
          Alkalischer Phosphatase (AP)-Puffer (100 ml) HINZUFÜGEN
          1 M NaCl 10,0 ml
          1 M MgCl2 5 ml
          1 M Tris, pH 9,5 10 ml
          20% Tween-20 2,5 ml
          RNase-freies Wasser 72,5 ml
          Anmerkungen: Vor Gebrauch in einem 50-ml-Röhrchen vorbereiten. Die Lösung trübt sich nach einigen Stunden ein und funktioniert nicht mehr für die enzymatische Reaktion.
          AP-Substratlösung HINZUFÜGEN
          AP-Puffer 25 ml
          NBT 82,5 µl
          BCIP 82,5 µl
          Anmerkungen: Dies kann anstelle von BM Purple verwendet werden. Vor Gebrauch in einem 50-ml-Röhrchen vorbereiten. Halten Sie diese Lösung im Dunkeln, indem Sie das Röhrchen mit Folie abdecken und bei schwachem Licht vorbereiten.
          Proteinase-K-Stammlösung (10 mg/ml) HINZUFÜGEN
          Proteinase K 10 mg
          RNase-freies Wasser 10 ml
          Anmerkungen: Aliquotieren und bei -20 °C °C lagern.
          Proteinase K Arbeitslösung HINZUFÜGEN
          Proteinase K-Stammlösung 90 ul
          1X PBS 18 ml
          Anmerkungen: Für beste Ergebnisse kurz vor der Verwendung herstellen.
          0,2% Glycin-PBS-Lösung HINZUFÜGEN
          10X PBS 45 ml
          RNase-freies Wasser 405 ml
          Glycin 1 g
          Anmerkungen: In einem autoklavierten Glasbehälter vorbereiten. Bei Raumtemperatur auf einer Rührplatte mischen, bis das Glycin vollständig gelöst ist.
          Boehringer-Mannheim Blocking Buffer (30 ml) (Bestandteil des DIG Wash and Block Buffer Set) HINZUFÜGEN
          10x Blockierungslösung 3 ml
          1x Maleinsäurepuffer 27 ml
          Anmerkungen: Für beste Ergebnisse kurz vor der Verwendung herstellen. Stammblockierungslösung und Maleinsäurepuffer wurden aus dem “DIG Wash and Block -Buffer Set" verwendet.
          4X SSC󈠂% Formamid (30 ml) HINZUFÜGEN
          20X SSC 6 ml
          50% Formamid 24 ml
          Anmerkungen: Vor Gebrauch in einem 50-ml-Röhrchen vorbereiten. Unter Laborhaube vorbereiten.
          Glycerin-Eindeckmittel HINZUFÜGEN
          50 mM Tris, pH 8,4 80 µL
          Glycerin 20 µL

          Tabelle 1: Stammlösungen für die Durchführung vor Ort Hybridisierung. Die Tabelle ist eine Liste der verschiedenen Stammlösungen, die für dieses Protokoll benötigt werden. Total amounts are estimated for performance of approximately 2 slide mailers. It is advised to adjust total amounts based on the amount of slides that are being processed.

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          Diskussion

          The method described in this protocol has been modified from previous work in medical and evolutionary developmental research 8 , 9 , 10 , 12 , 17 . This protocol focuses on the nuances of an vor Ort hybridization with a DIG-labeled RNA anti-sense probe on adult corals, which have been preserved and embedded in paraffin. This method can be easily transferred to samples of organisms beyond corals that have also been paraffin-embedded. Lastly, this method can be performed during different life stages of corals (z.B., larva) or within cell cultures, but the exact protocol may differ since those types of samples are not always paraffin-embedded 5 , 6 .

          There are several critical steps in this protocol, including the proteinase K treatment, hybridization of the probe, and color development of the probe. During the proteinase K treatment, timing is very important. If the treatment is longer than suggested, tissues can become degraded and damaged. Additionally, the stopping of the proteinase K reaction should be performed at the full time point specified. It is also critical to keep the sample at a constant hybridization temperature, as lowering of the temperature can cause non-specific binding of the probe and complicate results. When washing off the probe, it is important to take each slide out of the hybridization oven one at a time, rather than all at once, to ensure that the slides do not hybridize with the probe at a low temperature. Also, thorough washing of the slides after the probe hybridization will help prevent non-specific binding. Lastly, color development of the probe is one of the most critical yet subjective steps of this process. The color development can be easily overdone or stopped too soon. This step requires patience and vigilance to ensure that over-staining of the slides does not occur.

          Troubleshooting this protocol can be a daunting process due to the number of steps involved. If the protocol yields negative results, then it is best to start by examining the probe to make sure that it is the anti-sense (and not the sense) probe. Additionally, if the solutions are old, it is worth remaking or replacing them so they are fresh when performing this protocol. Modifications, such as the lengths of hybridization and blocking, can be implemented to increase the chances of probe hybridization or reducing amounts of background and non-specific staining. Due to the high number of steps in this protocol, it may be easy to lose track therefore, it is important to stay organized and track which parts of the protocol have been completed. Additionally, it is critical to ensure that no steps are skipped, and that time is not cut down during the incubations and washes. A good rule of thumb is to allow for longer rather than shorter washes to ensure that all slides are cleaned thoroughly.

          The biggest limitation of this method is that the results are not quantifiable. This is a qualitative method that, in concert with other methods such as histology, transcriptomics, and proteomics, is very informative. Due to variations in hybridization times as well as the subjective times during visualization, quantifying the intensity of the staining is not easily accomplished. It is tempting to say that a probe is more highly expressed if it shows greater intensity, but due to the variations in this protocol (such as the amount of time allowed for color development), gene expression amounts cannot be determined.

          This technique is not a new method in biology however, it is one not performed very often on adult corals. The use of this method on adult corals is very powerful because it anchors gene expression data to a tissue or a cell type 11 . Transcriptomics and genomics have become popular and powerful tools in coral biology however, these methods are generally done on homogenates of the whole animal. This makes it challenging to identify which parts of the coral are expressing the genes of interest, and thus more challenging to understand the actual mechanisms. Through the use of ISH along with gene expression data, a more holistic approach to where and to what extent genes are expressed can be achieved. This will greatly help in the understanding of the mechanisms responsible for different stress response pathways in adult corals.


          In situ hybridization technology-Shanghai Medicilon

          In situ hybridization (insituhybridization) uses a specific labeled nucleic acid of known base sequence as a probe to specifically detect the nucleic acid in tissues and cells in accordance with the principle of complementary base pairing in situ to form a hybrid, which is then labeled with The corresponding monitoring system of the substance can locate the nucleic acid in the cell in situ by immunohistochemistry. In situ hybridization can be divided into intracellular and tissue section in situ hybridization according to the test substance according to the probes and nucleic acid detection, it can be divided into DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA hybridization. According to different labeling methods, it can be divided into radioactive probes and non-radioactive probes.
          The basic methods include: fixation, sectioning, hybridization, color development and other main steps.

          (1) The material is fixed with the specimen

          1. Material extraction: The material used for in situ hybridization should be as fresh as possible. In order to prevent the degradation of RNA, the material should be taken quickly, and the material should be fixed or frozen as soon as possible after the material is taken.
          2. The tissues or cells that are fixed for in situ hybridization must be fixed. The purpose of fixation is to ① maintain the original structure of the cell morphology ② maximize the preservation of the level of DNA or RNA in the cell ③ make the probe easy to enter the cell or tissue .
          3. Fixatives: Common fixatives include 10% formaldehyde, 4% paraformaldehyde, glacial acetic acid-alcohol mixed solution, Bouin’s fixative, etc. These fixatives have different advantages and disadvantages, so the best fixative should be selected according to the specific experimental object.
          4. Fixing method After taking tissue samples, quickly put them into fixative solution for 2 to 4 hours. The size of the sampled tissue is 1cm×1cm×0.5cm, which should not be too large. If necessary, the animal tissue can be perfused and fixed, and then the tissue is taken into 20% sucrose according to the requirements, overnight at 4 ℃, and the next day can be frozen and sliced.

          (2) Preparation of sections and cell specimens

          1. Slide processing Because in situ hybridization is generally performed on slides, slides must be kept clean and free of any nuclease contamination. Generally, the glass slide can be soaked in washing powder overnight, rinsed with running water, soaked in acid for 4-8 hours, then rinsed with running water, and washed with double distilled water 2 to 3 times. Bake in 160℃ oven for 2~4h. It can also be sterilized by autoclaving at 15 pounds for 20 minutes to eliminate the nuclease on the slide.
          2. Tissue sectioning and pretreatment
            (1) Frozen section: fresh tissue can also be placed in liquid nitrogen for rapid quenching after taking the material. After freezing section, 4% paraformaldehyde is fixed for 5 to 10 minutes, and can also be stored at -70°C until use. Before hybridization, the slices were quickly returned to room temperature and dried, washed three times with 0.1mol PBS, washed with 2×SSC for 10 minutes, and added with pre-hybridization solution and incubated at room temperature for 1 hour.
            (2) Paraffin section: After the tissue is fixed, conventional paraffin embedded sections can be stored for a long time and can be used for in situ hybridization at any time. Before hybridization, slices were dewaxed 2 times with xylene for 10min each time ②washed with pure alcohol 2 times with 5min each time ③air dried for 5min ④ gradient alcohol rewashed 95%, 80%, 70% for 1min each ⑤0. Wash 3 times with 1 mol PBS for 5 minutes each time ⑥ 2×SSC for 10 minutes ⑦ add prehybridization solution dropwise and incubate for 1 hour at room temperature in a wet box.
            (3) Cultured cells: add 200 μl of a cell suspension with a concentration of 1×105/m1 to each slide, and air-dry for 1 to 2 minutes to prepare a cell smear, or directly use a cultured cell cover slip. The above cell pieces were fixed with alcohol or paraformaldehyde for 5 minutes, and the remaining steps were the same as frozen sections.

          (3) Reagent preparation
          Gloves are required during the preparation of the solution. The liquid preparation uses ultra-clean water. The bottles used are baked at 160 ℃ for 4 hours. The main purpose is to remove RNase.

            DEPC water Add DEPC to ultrapure water at a concentration of 1‰, mix thoroughly and let stand overnight, autoclave for 15

          (4) Hybridization and color development

          1. Hybridization Add the labeled probe to the pre-hybridization solution to become the hybridization solution (probe concentration is 1μg/m1). After the section is briefly immersed in 2×SSC, the hybridization solution is added dropwise and incubated in the built-in wet box at 37℃ or 42℃ overnight. Then, it was immersed in 2×SSC at room temperature for 1 h, l×SSC at room temperature for 1 h, 0.5×SSC at 37°C for 30 min, and 0.5×SSC at room temperature for 30 min. Be careful not to dry the sections when adding the hybridization solution.
          2. Color development The following steps are carried out at room temperature.
            (1) Buffer I was washed for 1 min.
            (2) Incubate the sections with buffer I containing 2% normal sheep serum and 0.3% TritonX-100 for 30 min.
            (3) Dilute goat anti-Dig antibody with buffer I containing 1% normal sheep serum and 0.3% TronX-100.
            (4) Drop the antibody dilution onto the slices, cover with parafilm, and incubate at 4°C in a wet box overnight.
            (5) Wash with buffer I for 10 minutes.
            (6) Buffer II was washed for 10 minutes.
            (7) Add color developing solution, cover with parafilm, incubate at room temperature for 2 to 20 hours in the dark, and examine at any time. When the color development is satisfactory, add buffer III to stop the color development.
            The coloring solution is prepared immediately before use, and its formula is: ① NBT 45μl ② X-Phospllate solution 35μl ③ Levamisole 2.4mg ④ Buffer II is added to 10ml.
            (8) Conventional dehydration, transparency and sealing.
            Results: The positive hybridization signal was purple-blue particles.

          (5) In situ hybridization control test
          As with the immunohistochemical staining control, in order to prove the accuracy of the in situ hybridization experiment operation and the specificity of the experimental results, a series of control experiments need to be set up. For the setting and significance of various control experiments, please refer to the in situ hybridization monograph. Only a few commonly used control experiments are introduced below.


          Sensitive whole mount vor Ort localization of small RNAs in plants

          Small RNAs, such as microRNAs (miRNAs), regulate gene expression and play important roles in many plant processes. Although our knowledge of their biogenesis and mode of action has significantly progressed, we still have comparatively little information about their biological functions. In particular, knowledge about their spatio-temporal expression patterns rely on either indirect detection by use of reporter constructs or labor-intensive direct detection by vor Ort hybridization on sectioned material. None of the current approaches allows a systematic investigation of small RNA expression patterns. Here, we present a sensitive method for vor Ort detection of miRNAs and siRNAs in intact plant tissues that utilizes both double-labeled probes and a specific cross-linker. We determined the expression patterns of several small RNAs in diverse plant tissues.

          Dateiname Beschreibung
          tpj13270-sup-0001-FigS1.pdfPDF document, 1 MB Abbildung S1. miRNA detection in embryos with and without clearing.
          tpj13270-sup-0002-MethodS1.pdfPDF document, 172.4 KB Method S1. Detailed protocol for whole mount vor Ort hybridization of small RNAs.
          tpj13270-sup-0003-Legends.docxWord document, 13.8 KB

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          Abschluss

          GeneCount provides reliable DNA copy numbers, both when based on the tumor cell fractions determined by flow cytometry and those estimated by the method. Accurate data are also achieved in translocated chromosomal regions, as demonstrated for the t(1418) translocation involving BCL2. Our method is the only one to provide genome-wide information of absolute DNA copy numbers. Moreover, the method represents a significant improvement compared to existing methods in the study of gene dosages and intratumor copy number heterogeneities. The robustness of GeneCount implies that the method can be utilized widely in the genomic exploration of both hematopoietic and solid tumors, addressing DNA copy number aspects in a reliable manner, regardless of possible translocations. This may lead to improved assays for disease classification and outcome prediction and aid the identification of efficient targets for new cancer therapies.


          Anmerkungen

          Always run a Sense probe in parallel with the Antisense probe to ensure specificity of the reaction (at least the first time for any tissue/probe set).
          All Day 1 and Day 2 procedures should (ideally) be performed in RNase-free conditions.
          Unlike many NBT/BCIP reagents, this color product is stable through the ethanol/xylene dehydration and mounting procedure. However, it may fade after several months of storage and may exhibit some crystaline precipitation that is not desired.