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Expression von Bakteriophagen in Säugerzellen

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Ist es möglich, Bakteriophagen in Säugerzellen durch Codon-Optimierung zu exprimieren? Gibt es relevante Literatur? vielen Dank im Voraus.


Expression von Bakteriophagen in Säugerzellen - Biologie

Swapnil Ganesh Sanmukh und Sérgio Luis Felisbino *
Labor für Extrazelluläre Matrixbiologie, Abteilung für Morphologie, Institut für Biowissenschaften Botucatu, Sao Paulo State University, Sao Paulo, Brasilien

* Korrespondierender Autor: Sérgio L Felisbino, Labor für Extrazelluläre Matrixbiologie, Abteilung für Morphologie, Institut für Biowissenschaften Botucatu, Sao Paulo State University, Sao Paulo, Brasilien

Veröffentlicht: 16. Mai 2017
Diesen Artikel zitieren als: Sanmukh SG, Felisbino SL. Bakteriophagen in der Krebsbiologie und -therapien. Clin Oncol. 2017 2: 1295.


FRANZÖSISCHE INFRASTRUKTUR FÜR INTEGRIERTE STRUKTURBIOLOGIE

- Verwendung des Vaccinia-Virus-Systems. Die Überexpression von Proteinen in Säugerzellen (Hamster-BHK21-Zellen) wird unter Verwendung eines abgeschwächten Vacciniavirus-Vektors (Modified Vaccinia Virus Ankara-MVA) erreicht, der anwendersicher ist und unter BSL1-Bedingungen gehandhabt werden kann. In einem ersten Schritt werden die interessierenden Gene stromabwärts eines Bakteriophagen-T7-Promotors kloniert, um die Machbarkeit zu überprüfen. Die Proteinexpression wird dann nach Plasmidtransfektion in BHK21-Zellen und Co-Infektion mit einem spezialisierten viralen Vektor untersucht, der für die Bakteriophage T7-RNA-Polymerase kodiert. Die IGBMC-Einrichtung führt diesen Machbarkeitsschritt mit jedem interessierenden Gen, das stromabwärts eines T7-Promotors kloniert ist, durch und erhält die Ergebnisse innerhalb weniger Tage.

Um eine hohe Proteinexpression zu erhalten, werden Gene, die im Machbarkeitstest gut abschneiden, in spezialisierte Plasmide kloniert, die ihren ortsgerichteten Transfer in das virale Genom stromabwärts des Bakteriophagen-T7-Promotors ermöglichen. Rekombinante Viren, die für interessierende Gene kodieren, werden in wenigen Wochen unter nicht-permissiven Bedingungen für die rekombinante Proteinexpression isoliert. Eine Expression auf hohem Niveau wird dann in Säugerzellen in Gegenwart eines Induktors (IPTG) erreicht. Bis zu 10 mg gereinigtes Protein können konsistent aus 5-Liter-Suspensionszellkulturen hergestellt werden. Eine allgemeine Übersicht über die verwendeten Verfahren kann in den folgenden Referenzen gefunden werden: Anal Biochem. 2012 426(2): 106-8 Anale Biochem. 2010 Sep 1 404(1): 103-5 Protein Expr Purif. 2007 56(2): 269-78. Neuere Verbesserungen, die die Arbeitsgeschwindigkeit und die Proteinproduktivität verbessern, sind unveröffentlicht.

Die Unterstützung umfasst Expressionstests im kleinen Maßstab mit Plasmiden, die von Benutzern bereitgestellt werden (benötigt den T7-Promotor). Einfache Genassemblierung mit dem „Biobrick“-System basierend auf kompatiblen Restriktionsschnittstellen (EcoRI, XbaI, SpeI, PstI) wie in (Ho-Shing et al., 2012) beschrieben mit einer Vielzahl von N-terminalen Tags in einem Gateway-Eintrittsvektor für die anschließende Konstruktion von rekombinanten Viren ist verfügbar. Die Teilnahme von Benutzern wird für Schulungen in der Isolierung viraler Expressionsvektoren und Proteinproduktionsläufe am IGBMC empfohlen. Den Benutzern werden spezielle Materialien und die neuesten verfügbaren Methoden zur Verfügung gestellt.


MATERIALEN UND METHODEN

Bakterienstämme und Plasmide

Die verwendeten Bakterienstämme waren Stable 2 (Life Technologies, Breda, Niederlande), INV㬟’ (Invitrogen, Groningen, Niederlande), MC1061 (Stratagene Europe, Amsterdam, Niederlande), KMBL 1164 [Δlac- proXIII, thi209, SupE + ] (16) und KMBL 1001 [SupE – ], abgeleitet von W1485 (22).

Das Plasmid pmMu876 wurde von pGP876 (23) durch Entfernen des genetischen Codes für MuA und MuB durch partielle abgeleitet ÖkoRI-Aufschluss und Rezirkularisierung.

Die Konstruktion der Plasmide pSC-NLS-MuA und pSC-NLS-MuB, die die Transposase MuA bzw. den Transpositionsstimulator MuB enthalten, wurde wie unten beschrieben durchgeführt. Um die Mu-A-kodierende Sequenz zu isolieren, wurde pGP876 mit den Restriktionsenzymen verdaut ÖkoWohnmobil und PmeI, ein Fragment von 2018 bp wurde isoliert und durch Klenow-Polymerase-Auffüllung der klebrigen Enden abgestumpft. Anschließend wurde dieses Fragment in den eukaryontischen Expressionsvektor pSuperCatch-NLS (24) ligiert, ein Derivat von pCatch-NLS, das mit BamHI und aufgefüllt mit Klenow-Polymerase. Das Konstrukt, das MuA unter der Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors (pCMV) enthielt, wurde pSC-NLS-MuA genannt (Abb.  1 A).

Konstrukte, die bei der Analyse der Mu-Transposition in Säugerzellen verwendet werden. (EIN) Plasmid pSC-NLS-MuA enthält die eukaryontische Expressionskassette, die für die Mu-Transposase MuA kodiert, fusioniert an ein Flag-Epitop und SV40 NLS. Die T7-RNA-Polymerase-Transkriptionsinitiationsstelle ermöglicht die prokaryontische Expression dieses Fusionsproteins. Das Plasmid pSC-NLS-MuB enthält die eukaryontische Expressionskassette, die den Transpositionsstimulator MuB codiert, ähnlich dem MuA-Konstrukt. (B) Die Donorplasmide sind durch das Vorhandensein eines miniMu-Transposons gekennzeichnet, abgegrenzt durch die L- und R-Anheftungsdomänen (L att und R att). Diese att-Domänen sind als Pfeile dargestellt, die auf die Lage der MuA-induzierten Nick-Stellen zeigen. Die Domäne L att umfasst auch die IAS-Region. Das miniMu-Transposon von pmMuHyg enthält einen Hyg R-Marker, der von einem TK-Promotor gesteuert wird. Das Donorkonstrukt pmMuHyg-GFP enthält das zuvor erwähnte miniMu-Transposon mit Hyg R-Marker und einen CMV-getriebenen GFP-Marker, der sich direkt außerhalb dieses Transposons befindet. Das miniMu-Transposon von pmMuNeo enthält einen Neo R-Marker, der vom SV40-Promotor für die eukaryotische Expression und vom Tn5-Promotor für die prokaryotische Expression gesteuert wird. Dieses Element umfasst auch einen von pBR322 abgeleiteten Replikationsursprung (pBR Ori). pCMV, Immediate Early Promotor von Cytomegalovirus pSV40, Promotor von Simian Virus 40 PolyA, Polyadenylierungsstelle ColE1, Replikationsursprung NLS, Kernlokalisationssignal Amp R , Ampicilin-Resistenzmarker T7 und Sp6, RNA-Polymerase Transkriptionsinitiationsstellen pTK, Thymidin -Kinase-Promotor Hyg R , Hygromycin-Resistenzmarker Cam R , Chloramphenicol-Resistenzmarker GFP, grünes Fluoreszenzprotein LTR, Long Terminal Repeat Tn5, Tn5 Neo-Promotor. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Plasmide in Supercoiled-Form verwendet.

Die kodierende Sequenz für MuB wurde durch Verdau von pGP876 mit . erhalten SspIch und DraIII. Ein Fragment von 1231 bp wurde isoliert und die DraDer III-abgeleitete 3′-Überhang wurde durch die Exonuklease 3′𡤥′ entfernt. Dieses Fragment mit glatten Enden wurde in die BamHI-verdautes und Klenow-Polymerase-abgestumpftes pSuperCatch-NLS. Das Konstrukt pSC-NLS-MuB (Abb. ​ (Abb. 1A) 1A) enthielt das MuB-Gen, das vom CMV-Promotor gesteuert wurde. DNA-Sequenzanalysen bestätigten die Integrität der modifizierten MuA- und MuB-Gene in den Plasmiden pSC-NLS-MuA und pSC-NLS-MuB.

Drei Donorkonstrukte, Plasmide mit einem miniMu-Transposon, wurden in der in vivo Transpositionsexperimente (Abb. ​ (Abb.1B). 1 B). Das erste Konstrukt, pmMuHyg, wurde durch Verdau des Plasmids pCep4 (Invitrogen) mit . konstruiert Nruich und teilweise mit SalI, Isolierung des 3,2-kb-Fragments und Klonierung in SmaIch und SalI-verdautes pmMu876. Das zweite Donorkonstrukt, pmMuHyg-GFP, ist mit dem ersten identisch, außer dass ein GFP-Marker außerhalb des miniMu-Transposons hinzugefügt wird. Zuerst wurde der GFP-Marker in pmMu876 kloniert. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid phGFP-S56T (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) mit MluIch und BamHI, das resultierende 2,3-kb-Fragment, das die vollständige GFP-Expressionskassette trägt, wurde isoliert und mit Mung Bean-Nuklease geglättet. Dieses Fragment wurde in pmMu876 kloniert, das mit . linearisiert worden war ClaI und mit Mung Bean Nuklease abgestumpft. Der Hygromycin-Resistenzmarker (Hyg R ) wurde anschließend auf die gleiche Weise wie für pmMuHyg beschrieben in das resultierende Konstrukt kloniert. Das letzte Donorkonstrukt, pmMuNeo, wurde wie folgt hergestellt. Plasmid pmMu876 wurde verdaut mit AatII und SalI und ein 5927-bp-Fragment wurde isoliert. Darin klonierten wir die 3707-bp AatII- und SalI-verdautes Fragment aus dem retroviralen Vektor pBAG (25).

Immunfluoreszenz

Der Nachweis der MuA- und MuB-Proteine, die beide an ein Flag-Epitop fusioniert sind, wurde mit einer 400-fachen Verdünnung (3% BSA in PBS) eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen das Flag-Epitop (m㬟lag M2 Kodak, New Haven) durchgeführt , CT). Als zweiter Antikörper wurde mit Fluorescein-Isothiocyanat markierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (GαMFitc Jackson Immunoresearch Laboratories, WestGrove, PA) verwendet. Nukleare DNA wurde mit 1 µg/ml 2,4-Diamino-2-phenylindol (DAPI), 2% 1,4 Diazabicyclo-ֲ,2,2]-octan und 0,1 M Tris–HCl pH . gefärbt 8,0 in Glycerin.

Proteinanalyse durch Western Blotting

Die Hybridproteinprodukte aus pSC-NLS-MuA und pSC-NLS-MuB wurden hergestellt in vitro mit dem TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System (Promega, Leiden, Niederlande) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Stabil transfizierte 911-Zellen lieferten die Hybridproteine ​​nach in vivo Ausdruck. Zelllysat wurde durch Abkratzen der Zellen in RIPA-Lysepuffer (25 mM Tris–HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,5% Doc, 2% NP-40, 0,2% SDS) erhalten. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Lysate durch Zentrifugation geklärt und die Proteinkonzentration des Überstands wurde durch den Bradford-Proteinassay gemessen.

Zelllysat und in-vitro Transkriptionstranslationsproben wurden auf einem 10% SDS–PAGE-Gel fraktioniert. Proteine ​​wurden auf Immobilon-P-Membranen (Millipore, Bedford, MA) übertragen und mit m㬟lag (Kodak) als erstem Antikörper inkubiert. Der zweite Antikörper war ein mit Meerrettich-Peroxidase markierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Brunschwig Chemie, Amsterdam, Niederlande). Die resultierenden Protein-Antikörper-Komplexe wurden durch verstärkte Chemilumineszenz sichtbar gemacht.

Ergänzung von MuA bin und MuB bin Phagen

Kulturen der Escherichia coli Stämme KMBL 1001 [Sup E – ] transformiert mit pSC-NLS-MuA, KMBL 1001 [Sup E – ] transformiert mit pSC-NLS-MuB und KMBL 1164 [Sup E + ] wurden auf eine OD verdünntλ650 = 0,1 (10 8 Zellen/ml). Bei dieser Konzentration wurden 1 ml Kulturproben mit dem Wildtyp-Bakteriophagen Mu, MuA . infiziert bin oder MuB bin bei Infektionsmultiplizitäten (m.o.i.) vom 2𠄳. Nach der Phagenzugabe wurden die Proben 20 min bei 37ଌ ohne Störung inkubiert. Dann wurden die Proben 1000-fach verdünnt (5 µl:5 ml) und bei 37ଌ gezüchtet. Nach 1 h Inkubation wurden 50 µl Chloroform zugegeben, die Proben wurden 10 min bei 800 . zentrifugiert g und der Phagen enthaltende Überstand wurde gesammelt.

Der Phagentiter des Überstands wurde an den Stämmen KMBL 1164 und KMBL 1001 bestimmt. Der Überstand wurde 10- oder 1000-fach verdünnt und 100 µl dieser Verdünnungen wurden zu einer 1-ml-Kultur von KMBL 1164 bzw. 1001 gegeben. Die Mischung wurde 20 min bei 37 °C ohne Störung inkubiert. Danach wurden 3 ml Top-Agar (1:1, Agar versus LB) zugegeben und sofort auf LB-Platten überführt. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden die Plaques gezählt und der Titer berechnet.

Zellkultur, Transfektion und Selektion

Die Ad5E1-transformierte humane embryonale Retina-Zelllinie 911 (26) und die Osteosarkom-Zelllinie U2OS wurden in Dulbecco’s modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Antibiotika und 3 g/l Glukose, gezüchtet in einem 5% CO2 Atmosphäre bei 37ଌ. Die Transfektion von 911-Zellen erfolgte nach der Calciumphosphat-Technik (27). U2OS-Zellen wurden mit Fugene (Boehringer Mannheim, Almere, Niederlande) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Ungefähr 48 h nach der Transfektion wurde die Selektion transfizierter Zellen durch Zugabe von 150 µg/ml Hygromycin (Boehringer Mannheim) oder 450 µg/ml G418 (Life Technologies) zum Medium gestartet. Eine Woche nach der Transfektion starben alle scheintransfizierten Zellen und es erschienen Hygromycin- oder G418-resistente Kolonien. Der Selektionsdruck wurde dann auf 50 µg/ml Hygromycin oder 200 µg/ml G418 reduziert. Einzelkolonien wurden gepickt, Zelllinien etabliert und chromosomale DNA isoliert.

Analyse chromosomaler DNA auf Transpositionsereignisse

Chromosomale DNA wurde aus G418-resistenten Kolonien isoliert, die nach Co-Transfektion von 911- oder U2OS-Zellen mit dem Donorkonstrukt pmMuNeo, pSC-NLS-MuA und mit oder ohne pSC-NLS-MuB erhalten wurden. Um auf Mu-katalysierte Integrationen zu überprüfen, wurde die DNA, die die att-Stellen flankiert, durch das folgende Verfahren analysiert. Für die Analyse der DNA, die die L att-Stelle flankiert, wurde 1 µg chromosomale DNA über Nacht mit 3 U von verdaut SpeI (Abb. ​ (Abb.1B). 1 B). Nach Hitzeinaktivierung des Restriktionsenzyms wurden die Proben auf 4 ng /µl verdünnt und die Fragmente zirkularisiert. Nach Inkubation über Nacht wurde die DNA präzipitiert und zur Elektroporation von . verwendet E coli Stamm stabil 2. Transformanten, die den Neomycin-Resistenzmarker (Neo R ) enthielten, wurden durch Wachstum auf Kanamycin-enthaltenden LB-Platten bei 30 °C selektiert. Die resultierenden Kolonien wurden durch Gegenselektion auf Ampicilin (Amp) auf Mu-bezogene Herkunft überprüft. Die Amp-sensitiven Kolonien wurden weiter analysiert durch SpeIch und HindIII-Restriktionsanalyse, PCR basierend auf Primern, die die Mu-induzierte Nick-Stelle umgeben, und schließlich Sequenzanalyse.

Dieselben Analysen wurden durchgeführt, um die DNA zu untersuchen, die die R att-Stelle flankiert, aber in diesem Fall BamHI wurde verwendet, um die chromosomale DNA zu verdauen.


Targeting von Bakteriophagen auf Oberflächenrezeptoren von Säugetierzellen für die Genabgabe

Filamentöse Bakteriophagen stellen eine der elegantesten Methoden der Natur dar, DNA zu verpacken und zu liefern. In dem Bemühen, neue Methoden für die Entdeckung von Liganden über die Phagen-Genabgabe zu entwickeln, haben wir filamentösen Bakteriophagen Säugerzelltropismus verliehen, indem wir basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF2), Transferrin oder epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) an ihre Hüllproteine ​​angehängt und den CMV-Promotor gemessen haben -getriebene Reportergenexpression in Zielzellen. In diesem System war FGF2 ein wirksameres Targeting-Mittel als Transferrin oder EGF. Der Nachweis von grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder β-Galactosidase (β-Gal)-Aktivität in Zellen erforderte FGF2-Targeting und war von der Phagenkonzentration abhängig. Die Spezifität des Targetings für hochaffine FGF-Rezeptoren wurde durch die Konkurrenz des anvisierten Phagen mit FGF2, durch das Versagen von FGF2-gerichteten Bakteriophagen bei der Transduktion hochaffiner FGF-Rezeptor-negativer Zellen und durch ihre Fähigkeit, diese Zellen bei stabilen Bedingungen zu transduzieren, gezeigt transfiziert mit FGFR1, einem hochaffinen FGF-Rezeptor. Eine langfristige Transgenexpression wurde durch Selektion von Kolonien auf G418-Resistenz etabliert, was darauf hindeutet, dass filamentöse Bakteriophagen mit dem geeigneten zielgerichteten Tropismus als Vehikel für die gezielte Genabgabe an Säugerzellen dienen können.


Inhalt

Die Cre-Lox-Rekombination ist eine spezielle Art der ortsspezifischen Rekombination, die von Dr. Brian Sauer entwickelt und von DuPont patentiert wurde, die sowohl in mitotischen als auch nicht mitotischen Zellen funktioniert und ursprünglich zur Aktivierung der Genexpression in Säugetierzelllinien verwendet wurde. [2] [3] [4] Anschließend zeigten Forscher im Labor von Dr. Jamey Marth, dass die Cre-Lox-Rekombination verwendet werden könnte, um loxP-flankierte chromosomale DNA-Sequenzen mit hoher Effizienz in sich entwickelnden T-Zellen transgener Tiere zu deletieren. Die Autoren schlugen vor, dass dieser Ansatz verwendet werden könnte, um die endogene Genfunktion in bestimmten Zelltypen zu definieren, Vorläufer in Studien zur Bestimmung des Zellschicksals unauslöschlich zu markieren, spezifische Chromosomenumlagerungen für die biologische und Krankheitsmodellierung zu induzieren und die Rolle früher genetischer Läsionen bei Krankheiten zu bestimmen ( und Phänotyp) Pflege. [5]

Kurz darauf berichteten Forscher im Labor von Prof. Klaus Rajewsky über die Produktion pluripotenter embryonaler Stammzellen, die ein gezieltes loxP-flankiertes (floxed) DNA-Polymerase-Gen tragen. [6] Durch die Kombination dieser Fortschritte in Zusammenarbeit haben die Labore von Drs. Marth und Rajewsky berichteten 1994, dass die Cre-lox-Rekombination für konditionelles Gen-Targeting verwendet werden könnte. [7] Sie beobachteten, dass 50% des DNA-Polymerase-Beta-Gens in T-Zellen basierend auf DNA-Blotting deletiert waren. Es war unklar, ob nur ein Allel in jeder T-Zelle oder 50% der T-Zellen eine 100%ige Deletion in beiden Allelen aufwiesen. Forscher haben 1995 vom Marth-Labor über eine effizientere bedingte Cre-Lox-Genmutagenese in den sich entwickelnden T-Zellen berichtet Untersuchung chimärer Gewebe. Von allen an Mäusen getesteten Zelltypen wurde gezeigt, dass sie eine transgene Cre-Rekombination durchlaufen.

Unabhängig davon hat Joe Z. Tsien Pionierarbeit bei der Verwendung des Cre-loxP-Systems für die zelltyp- und regionenspezifische Genmanipulation im erwachsenen Gehirn geleistet, wo Hunderte von unterschiedlichen Neuronentypen existieren können und fast alle Neuronen im erwachsenen Gehirn bekanntermaßen postoperativ sind -mitotisch. [9] Tsien und seine Kollegen zeigten, dass eine Cre-vermittelte Rekombination in den postmitotischen Pyramidenneuronen im Vorderhirn der erwachsenen Maus auftreten kann. [10]

Diese Entwicklungen haben zu einer weit verbreiteten Anwendung der bedingten Mutagenese in der biomedizinischen Forschung geführt, die viele Disziplinen umfasst und zu einer leistungsstarken Plattform zur Bestimmung der Genfunktion in bestimmten Zelltypen und zu bestimmten Entwicklungszeiten wird. Insbesondere die klare Demonstration seiner Nützlichkeit bei der präzisen Definition der komplexen Beziehung zwischen spezifischen Zellen/Schaltkreisen und Verhaltensweisen für die Hirnforschung [11] hat das NIH dazu bewogen, Anfang 2000 das NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre-driver Mausprojekte zu initiieren.[12] [13] Bis heute haben NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre-Projekte mehrere Hundert Cre-Treiber-Mauslinien erstellt, die derzeit von der weltweiten neurowissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet werden.

Die Cre-Lox-Rekombination beinhaltet das Targeting einer bestimmten DNA-Sequenz und deren Spleißen mit Hilfe eines Enzyms namens Cre-Rekombinase. Die Cre-Lox-Rekombination wird häufig verwendet, um die embryonale Letalität zu umgehen, die durch die systemische Inaktivierung vieler Gene verursacht wird. [14] [15] Seit Februar 2019 ist die Cre-Lox-Rekombination ein leistungsstarkes Werkzeug und wird in der transgenen Tiermodellierung verwendet, um Genotypen mit Phänotypen zu verknüpfen. [11] [16] [17]

Das Cre-lox-System wird als genetisches Werkzeug verwendet, um ortsspezifische Rekombinationsereignisse in genomischer DNA zu kontrollieren. Dieses System hat es Forschern ermöglicht, eine Vielzahl genetisch veränderter Organismen zu manipulieren, um die Genexpression zu kontrollieren, unerwünschte DNA-Sequenzen zu löschen und die Chromosomenarchitektur zu modifizieren.

Das Cre-Protein ist eine ortsspezifische DNA-Rekombinase, die die Rekombination von DNA zwischen spezifischen Stellen in einem DNA-Molekül katalysieren kann. Diese Seiten, bekannt als loxP Sequenzen, enthalten spezifische Bindungsstellen für Cre, die eine gerichtete Kernsequenz umgeben, wo eine Rekombination stattfinden kann.

Wenn Zellen mit loxP Stellen in ihrem Genom Cre exprimieren, kann ein Rekombinationsereignis zwischen den loxP Websites. Cre-Rekombinaseproteine ​​binden an die ersten und letzten 13 bp-Regionen einer lox-Stelle unter Bildung eines Dimers. Dieses Dimer bindet dann an ein Dimer an einer anderen lox-Stelle, um ein Tetramer zu bilden. Lox-Stellen sind gerichtet und die beiden durch das Tetramer verbundenen Stellen sind parallel ausgerichtet. Die doppelsträngige DNA wird an beiden geschnitten loxP Stellen durch das Cre-Protein. Die Stränge werden dann in einem schnellen und effizienten Prozess wieder mit DNA-Ligase verbunden. Das Ergebnis der Rekombination hängt von der Orientierung des loxP Websites. Für zwei lox-Stellen auf demselben Chromosomenarm, invertiert loxP Stellen eine Inversion der dazwischenliegenden DNA verursachen, während eine direkte Wiederholung von loxP Websites verursachen ein Löschereignis. Wenn loxP Stellen sich auf verschiedenen Chromosomen befinden, ist es möglich, dass Translokationsereignisse durch Cre-induzierte Rekombination katalysiert werden. Zwei Plasmide können unter Verwendung der varianten lox-Stellen 71 und 66 verbunden werden. [18]

Cre-Rekombinase Bearbeiten

Das Cre-Protein (kodiert durch den Locus, der ursprünglich als "Causes Rekombination" bezeichnet wurde, wobei in einigen Referenzen "Cyclization Recombinase" zu finden ist) [19] [20] besteht aus 4 Untereinheiten und zwei Domänen: Die größere Carboxyl-(C-terminale) Domäne und eine kleinere Amino-(N-terminale) Domäne. Das Gesamtprotein hat 343 Aminosäuren. Die C-Domäne ähnelt in ihrer Struktur der Domäne in der Integrase-Familie von Enzymen, die aus Lambda-Phagen isoliert wurden. Dies ist auch das katalytische Zentrum des Enzyms.

LoxP Website Bearbeiten

loxP (Locus von X-over P1) ist eine Stelle auf dem Bakteriophagen P1, die aus 34 bp besteht. Die Stelle umfasst eine asymmetrische 8 bp-Sequenz, die mit Ausnahme der mittleren zwei Basen variabel ist, zwischen zwei Sätzen von symmetrischen 13 bp-Sequenzen. Die genaue Sequenz ist unten angegeben. 'N' bezeichnet Basen, die variieren können, und Kleinbuchstaben bezeichnen Basen, die aus dem Wildtyp mutiert wurden. Die 13 bp-Sequenzen sind palindromisch, der 8 bp-Spacer jedoch nicht, wodurch der loxP-Sequenz eine bestimmte Richtung gegeben wird. Normalerweise kommen loxP-Sites paarweise zur genetischen Manipulation. Wenn die beiden loxP-Stellen in der gleichen Orientierung sind, wird die floxed-Sequenz (Sequenz flankiert von zwei loxP-Stellen) ausgeschnitten, wenn die beiden loxP-Stellen jedoch in der entgegengesetzten Orientierung sind, wird die floxed-Sequenz invertiert. Falls eine gefoxed Donorsequenz existiert, kann die Donorsequenz gegen die Originalsequenz ausgetauscht werden. Diese Technik wird als rekombinasevermittelter Kassettenaustausch bezeichnet und ist eine sehr bequeme und zeitsparende Methode zur genetischen Manipulation. Die Einschränkung besteht jedoch darin, dass die Rekombinationsreaktion rückwärts ablaufen kann, was den Kassettenaustausch ineffizient macht. Außerdem kann es zu einer Sequenzexzision kommen in trans anstelle einer in cis Kassettentausch-Event. Die loxP-Mutanten werden geschaffen, um diese Probleme zu vermeiden. [21]

13bp 8bp 13bp
ATAACTTCGTATA - NNNTANNN - TATACGAAGTTAT
Beispiel für alternative loxP-Sites [22]
Name 13bp Anerkennungsregion 8bp Spacer-Region 13bp Anerkennungsregion
Wildtyp ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT
lox 511 ATAACTTCGTATA ATGTATaC TATACGAAGTTAT
lox 5171 ATAACTTCGTATA ATGTgTaC TATACGAAGTTAT
lachs 2272 ATAACTTCGTATA AaGTATcC TATACGAAGTTAT
M2 ATAACTTCGTATA AgaaAcca TATACGAAGTTAT
M3 ATAACTTCGTATA taaTACCA TATACGAAGTTAT
M7 ATAACTTCGTATA AgaTAGAA TATACGAAGTTAT
M11 ATAACTTCGTATA cgaTAcca TATACGAAGTTAT
lox 71 TACCGTTCGTATA NNNTANNN TATACGAAGTTAT
lachs 66 ATAACTTCGTATA NNNTANNN TATACGAACGGTA

Während der genetischen Rekombination wird zwischen den beiden DNA-Strängen eine Holliday-Verbindung gebildet und ein Doppelstrangbruch in einem DNA-Molekül lässt ein 3’OH-Ende frei. Diese Reaktion wird durch die Endonukleaseaktivität eines Enzyms unterstützt. 5’-Phosphatenden sind normalerweise die Substrate für diese Reaktion, daher bleiben ausgedehnte 3’-Regionen erhalten. Diese 3’-OH-Gruppe ist sehr instabil, und der Strang, an dem sie vorhanden ist, muss ihr Komplement finden. Da die homologe Rekombination nach der DNA-Replikation stattfindet, stehen zwei DNA-Stränge zur Verfügung, und daher muss die 3'-OH-Gruppe mit ihrem Komplement paaren, und zwar mit einem intakten Strang am anderen Duplex. Nun ist ein Kreuzungspunkt aufgetreten, der als Holliday Intermediate bezeichnet wird.

Das 3’OH-Ende wird mit Hilfe der DNA-Polymerase verlängert (also Basen hinzugefügt). Die Paarung entgegengesetzter Stränge stellt das Crossing-over- oder Rekombinationsereignis dar, das allen lebenden Organismen gemeinsam ist, da das genetische Material auf einem Strang eines Duplexes mit einem Strang eines anderen Duplexes gepaart und durch DNA-Polymerase verlängert wurde . Eine weitere Spaltung von Holliday Intermediates führt zur Bildung von Hybrid-DNA.

Diese weitere Spaltung oder „Auflösung“ erfolgt durch eine spezielle Gruppe von Enzymen, die Resolvasen genannt werden. RuvC ist nur eine dieser Resolvasen, die in Bakterien und Hefe isoliert wurden.

Viele Jahre lang wurde angenommen, dass bei der Bildung des Holliday-Verbindungszwischenprodukts der Verzweigungspunkt der Verbindung (wo sich die Stränge überkreuzen) an der ersten Spaltungsstelle liegen würde. Die Migration des Verzweigungspunkts zur zweiten Spaltungsstelle würde dann irgendwie die zweite Hälfte des Weges auslösen. Dieses Modell lieferte eine bequeme Erklärung für das strikte Erfordernis der Homologie zwischen den Rekombinationsstellen, da die Verzweigungsmigration bei einer Fehlpaarung zum Stillstand kommen würde und den Austausch des zweiten Strangs nicht zulassen würde. In den letzten Jahren wurde diese Ansicht jedoch in Frage gestellt, und die meisten aktuellen Modelle für die Int-, Xer- und Flp-Rekombination beinhalten nur eine begrenzte Verzweigungswanderung (1–3 Basenpaare des Holliday-Intermediats), gekoppelt an ein Isomerisierungsereignis, das ist für das Umschalten der Strangspaltungsspezifität verantwortlich.

Die ortsspezifische Rekombination (SSR) umfasst spezifische Stellen für die katalysierende Wirkung spezieller Enzyme, die als Rekombinasen bezeichnet werden. Cre oder zyklische Rekombinase ist ein solches Enzym. Ortsspezifische Rekombination ist somit die enzymvermittelte Spaltung und Ligation von zwei definierten Desoxynukleotidsequenzen.

Sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Organismen wurden eine Reihe von konservierten ortsspezifischen Rekombinationssystemen beschrieben. Im Allgemeinen verwenden diese Systeme ein oder mehrere Proteine ​​und wirken auf einzigartige asymmetrische DNA-Sequenzen. Die Produkte des Rekombinationsereignisses hängen von der relativen Orientierung dieser asymmetrischen Sequenzen ab. Neben der Rekombinase sind viele andere Proteine ​​an der Regulierung der Reaktion beteiligt. Bei der ortsspezifischen DNA-Rekombination, die eine genetische Umordnung in Prozessen wie der viralen Integration und Exzision und der chromosomalen Segregation bewirkt, erkennen diese Rekombinase-Enzyme spezifische DNA-Sequenzen und katalysieren den reziproken Austausch von DNA-Strängen zwischen diesen Stellen.

Wirkmechanismus Bearbeiten

Die Initiierung der ortsspezifischen Rekombination beginnt mit der Bindung von Rekombinationsproteinen an ihre jeweiligen DNA-Ziele. Eine separate Rekombinase erkennt und bindet an jede von zwei Rekombinationsstellen auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen oder innerhalb desselben DNA-Strangs. An der bestimmten Stelle der DNA greift die Hydroxylgruppe des Tyrosins in der Rekombinase über einen direkten Umesterungsmechanismus eine Phosphatgruppe im DNA-Rückgrat an. Diese Reaktion verbindet das Rekombinase-Protein über eine Phospho-Tyrosin-Bindung mit der DNA. Dadurch bleibt die Energie der Phosphodiesterbindung erhalten, sodass die Reaktion ohne Beteiligung eines hochenergetischen Cofaktors umgekehrt werden kann.

Die Spaltung am anderen Strang verursacht auch eine Phospho-Tyrosin-Bindung zwischen DNA und dem Enzym. An beiden DNA-Duplexen lässt die Bindung der Phosphatgruppe an Tyrosinreste eine 3’-OH-Gruppe im DNA-Rückgrat frei. Tatsächlich ist der Enzym-DNA-Komplex eine Zwischenstufe, auf die die Ligation der 3'-OH-Gruppe eines DNA-Strangs mit der 5'-Phosphatgruppe des anderen DNA-Strangs folgt, die kovalent an den Tyrosinrest gebunden ist, der h., die kovalente Bindung zwischen dem 5'-Ende und dem Tyrosinrest ist gebrochen. Diese Reaktion synthetisiert die zuvor diskutierte Holliday-Verbindung.

Auf diese Weise werden gegenüberliegende DNA-Stränge miteinander verbunden. Anschließende Spaltung und Wiedervereinigung bewirken, dass DNA-Stränge ihre Segmente austauschen. Protein-Protein-Wechselwirkungen treiben und steuern den Strangaustausch. Die Energie wird nicht beeinträchtigt, da die Protein-DNA-Verknüpfung den Verlust der Phosphodiester-Bindung ausgleicht, der während der Spaltung aufgetreten ist.

Die ortsspezifische Rekombination ist auch ein wichtiger Prozess, den Viren wie Bakteriophagen anwenden, um ihr genetisches Material in den infizierten Wirt zu integrieren. Das Virus, genannt a prophage erreicht dies in einem solchen Zustand durch Integration und Exzision. Die Punkte, an denen die Integrations- und Exzisionsreaktionen stattfinden, werden als Attachment-(att)-Stellen bezeichnet. Eine attP-Stelle auf dem Phagen tauscht Segmente mit einer attB-Stelle auf der Bakterien-DNA aus. Diese sind also standortspezifisch und treten nur an den jeweiligen att-Sites auf. Die Enzymklasse der Integrase katalysiert diese besondere Reaktion.

Effizienz der Aktion Bearbeiten

Es wurde gezeigt, dass zwei Faktoren die Effizienz der Exzision von Cre bei dem Lachspaar beeinflussen. Erstens die Nukleotidsequenzidentität in der Spacer-Region der lox-Stelle. Gentechnisch hergestellte lox-Varianten, die sich in der Spacer-Region unterscheiden, neigen dazu, eine unterschiedliche, aber im Allgemeinen niedrigere Rekombinationseffizienz im Vergleich zu Wildtyp-loxP aufzuweisen, vermutlich durch Beeinflussung der Bildung und Auflösung des Rekombinationszwischenprodukts. [23]

Ein weiterer Faktor ist die Länge der DNA zwischen den Lox-Paaren. Eine Erhöhung der DNA-Länge führt zu einer verringerten Effizienz der Cre/lox-Rekombination, möglicherweise durch Regulierung der Reaktionsdynamik. [24] [25] [26] Die genetische Lokalisierung der floxed-Sequenz beeinflusst auch die Rekombinationseffizienz, wahrscheinlich durch Beeinflussung der Verfügbarkeit von DNA durch Cre-Rekombinase. [26] Die Wahl des Cre-Treibers ist ebenfalls wichtig, da eine geringe Expression der Cre-Rekombinase dazu neigt, zu einer nicht parallelen Rekombination zu führen. Nicht-parallele Rekombination ist besonders problematisch in einem Schicksalskartierungsszenario, bei dem ein Rekombinationsereignis dazu bestimmt ist, das untersuchte Gen zu manipulieren und das andere Rekombinationsereignis zur Aktivierung eines Reportergens (normalerweise kodierend für ein fluoreszierendes Protein) für die Zelllinienverfolgung notwendig ist. [26] Das Versäumnis, beide Rekombinationsereignisse gleichzeitig zu aktivieren, verfälscht die Interpretation der Ergebnisse der Zellschicksalskartierung.

Zeitsteuerung Bearbeiten

Die induzierbare Cre-Aktivierung wird durch die CreER-Variante (Östrogenrezeptor) erreicht, die erst nach Abgabe von Tamoxifen aktiviert wird. [27] Dies geschieht durch die Fusion einer mutierten Ligandenbindungsdomäne des Östrogenrezeptors mit der Cre-Rekombinase, wodurch Cre spezifisch durch Tamoxifen aktiviert wird. In Abwesenheit von Tamoxifen führt CreER zum Shuttle der mutierten Rekombinase in das Zytoplasma. Das Protein verbleibt an dieser Stelle in seinem inaktivierten Zustand, bis Tamoxifen verabreicht wird. Sobald Tamoxifen eingeführt wird, wird es zu 4-Hydroxytamoxifen metabolisiert, das dann an das ER bindet und zur Translokation des CreER in den Zellkern führt, wo es dann die lox-Stellen spalten kann. [28] Wichtig ist, dass manchmal fluoreszierende Reporter in Abwesenheit von Tamoxifen aktiviert werden können, da einige wenige Cre-Rekombinase-Moleküle in den Zellkern gelangen, was in Kombination mit sehr empfindlichen Reportern zu einer unbeabsichtigten Zellmarkierung führt. [29] CreER(T2) wurde entwickelt, um die Tamoxifen-unabhängige Rekombination zu minimieren und die Tamoxifen-Sensitivität zu maximieren.

Bedingte Zelllinienverfolgung Bearbeiten

Zellen ändern ihren Phänotyp als Reaktion auf zahlreiche Umweltreize und können die Expression von Genen verlieren, die normalerweise verwendet werden, um ihre Identität zu markieren, was es schwierig macht, den Beitrag bestimmter Zelltypen zu Krankheiten zu erforschen. Daher verwenden Forscher häufig transgene Mäuse, die durch Tamoxifen-Verabreichung induzierte CreER-t2-Rekombinase exprimieren, unter der Kontrolle eines Promotors eines Gens, das den spezifischen Zelltyp von Interesse markiert, mit einem Cre-abhängigen fluoreszierenden Protein-Reporter. Die Cre-Rekombinase ist an eine mutierte Form des Östrogenrezeptors fusioniert, der anstelle seines natürlichen Liganden 17β-Östradiol das synthetische Östrogen 4-Hydroxytamoxifen bindet. CreER(T2) befindet sich im Zytoplasma und kann nur nach Tamoxifen-Gabe in den Zellkern translozieren, was eine strenge zeitliche Kontrolle der Rekombination ermöglicht. Die fluoreszierende Reporterkassette enthält einen Promotor, um eine hohe Expression des fluoreszierenden Transgen-Reporters (z. B. einen CAG-Promotor) und eine loxP-flankierte Stoppkassette zu ermöglichen, wodurch sichergestellt wird, dass die Expression des Transgens Cre-Rekombinase-abhängig und die Reportersequenz ist. Bei der Cre-getriebenen Rekombination wird die Stoppkassette ausgeschnitten, was es Reportergenen ermöglicht, spezifisch in Zellen zu exprimieren, in denen die Cre-Expression durch den zellspezifischen Marker-Promotor gesteuert wird. Da die Entfernung der Stoppkassette dauerhaft ist, werden die Reportergene in allen Nachkommen exprimiert, die von den Ausgangszellen produziert werden, in denen das Cre einst aktiviert wurde. Eine solche bedingte Abstammungsverfolgung hat sich als äußerst nützlich erwiesen, um vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) und von VSMC abgeleitete Zellen effizient und spezifisch zu identifizieren, und wurde verwendet, um Wirkungen auf VSMC und von VSMC abgeleitete Zellen zu testen in vivo. [30] [31] [32] [33] [34] [35]

Der P1-Phagen ist ein gemäßigter Phage, der entweder einen lysogenen oder einen lytischen Zyklus verursacht, wenn er ein Bakterium infiziert. In seinem lytischen Zustand werden, sobald sein virales Genom in die Wirtszelle injiziert wurde, virale Proteine ​​produziert, Virionen zusammengesetzt und die Wirtszelle wird lysiert, um die Phagen freizusetzen, wodurch der Zyklus fortgesetzt wird. Im lysogenen Zyklus repliziert das Phagengenom mit dem Rest des Bakteriengenoms und wird bei jeder nachfolgenden Zellteilung auf Tochterzellen übertragen. Es kann durch ein späteres Ereignis wie UV-Strahlung oder Hunger in den lytischen Zyklus übergehen.

Phagen wie der Lambda-Phagen verwenden ihre ortsspezifischen Rekombinasen, um ihre DNA während der Lysogenese in das Wirtsgenom zu integrieren. Auf der anderen Seite existiert die P1-Phagen-DNA als ein Plasmid im Wirt. Das Cre-lox-System erfüllt im Phagen mehrere Funktionen: Es zirkuliert die Phagen-DNA zu einem Plasmid, trennt miteinander verbundene Plasmidringe, sodass sie gleichermaßen an beide Tochterbakterien weitergegeben werden, und kann helfen, die Kopienzahl durch alternative Replikationsmethoden aufrechtzuerhalten. [36]

Die P1-Phagen-DNA liegt, wenn sie vom Virion in den Wirt freigesetzt wird, in Form eines linearen doppelsträngigen DNA-Moleküls vor. Das Cre-Enzym zielt auf loxP-Stellen an den Enden dieses Moleküls ab und zyklisiert das Genom. Dies kann auch in Abwesenheit des Cre lox-Systems [37] mit Hilfe anderer bakterieller und viraler Proteine ​​erfolgen. Das P1-Plasmid ist relativ groß (~90 Kbp) und existiert daher in einer geringen Kopienzahl – normalerweise eine pro Zelle. Wenn die beiden Tochterplasmide miteinander verbunden werden, verliert eine der Tochterzellen des Wirts das Plasmid. Das Cre-lox-Rekombinationssystem verhindert diese Situationen, indem es die Ringe der DNA durch Ausführen von zwei Rekombinationsereignissen auflöst (verknüpfte Ringe – > einzelner fusionierter Ring – > zwei nicht verbundene Ringe). Es wird auch vorgeschlagen, dass die Rolling-Circle-Replikation gefolgt von der Rekombination es dem Plasmid ermöglicht, seine Kopienzahl zu erhöhen, wenn bestimmte Regulatoren (repA) limitierend sind. [36]

Mehrere Varianten von loxP, [38] insbesondere lox2272 und loxN, wurden von Forschern mit der Kombination verschiedener Cre-Wirkungen (vorübergehend oder konstitutiv) verwendet, um ein "Brainbow" -System zu schaffen, das die Mehrfärbung des Mäusegehirns mit vier fluoreszierenden Proteinen ermöglicht .

Ein anderer Bericht, der zwei lox-Variantenpaare verwendet, aber durch die Regulierung der DNA-Länge in einem Paar führt zu einer stochastischen Genaktivierung mit einem regulierten Grad an Sparse. [24]


Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen und eukaryotischen Zellen

Wie der Name schon sagt, ist Bakteriophage ein bakterienspezifisches Virus. Es infiziert und tötet den bakteriellen Wirt. Bakteriophagen haben seit dem alarmierenden Anstieg der Antibiotikaresistenz bei Mikroben in der westlichen Welt als alternative antimikrobielle Wirkstoffe Aufmerksamkeit erlangt. Obwohl sie im Allgemeinen als prokaryontische Viren gelten, weisen neuere Studien darauf hin, dass Bakteriophagen mit eukaryontischen Organismen, einschließlich des Menschen, interagieren können. In der aktuellen Übersicht werden diese Wechselwirkungen in zwei Kategorien unterteilt, d. h. indirekte und direkte Wechselwirkungen unter Beteiligung von Bakteriophagen, Bakterien und Eukaryoten. Wir diskutieren Bakteriophagen-assoziierte Erkrankungen, die Transzytose von Bakteriophagen, Bakteriophagen-Interaktionen mit Krebszellen, die Zusammenarbeit von Bakteriophagen und Eukaryoten gegen bakterielle Infektionen und den horizontalen Gentransfer zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten. Solche Wechselwirkungen sind entscheidend für das Verständnis und die Entwicklung von Bakteriophagen als therapeutische Wirkstoffe und pharmazeutische Abgabesysteme. Mit der Weiterentwicklung und Kombination von in silico, in vitro, und in vivo Ansätzen und klinischen Studien dienen Bakteriophagen definitiv als nützliches Repertoire für die Entwicklung biologischer zielgerichteter Medikamente, um in Zukunft viele komplexe Krankheiten zu behandeln.

1. Einleitung

Bakteriophagen (kurz Phagen) wurden 1915 vom britischen Mikrobiologen Frederick Twort und 1917 vom französisch-kanadischen Wissenschaftler Felix d’Herelle unabhängig als bakterienspezifische Viren entdeckt [1]. In den folgenden Jahren galten Bakteriophagen als vielversprechende Kandidaten für eine antimikrobielle Therapie, bis die Idee in der westlichen Welt durch die Einführung von Antibiotika aufgegeben wurde [2]. Antibiotika wurden Bakteriophagen vorgezogen, weil sie feste chemische Verbindungen sind und einfach herzustellen sind. Dennoch wurde die Bakteriophagenforschung in einigen Regionen der Welt, z. B. in Georgien, Polen und der Sowjetunion, während des Zweiten Weltkriegs bis heute fortgeführt [3, 4]. Mit den weltweit aufkommenden Fällen von antibiotikaresistenten Superbakterien haben Bakteriophagen wieder wissenschaftliche Aufmerksamkeit erlangt und werden derzeit als alternative antimikrobielle Therapie umfassend untersucht [5]. Die Bakteriophagenforschung hat sich stark erweitert und umfasst viele Aspekte der Bakteriophagenbiologie, von in vitro-Level-Experimente bis hin zu klinischen Studien.

Die jüngste klinische Studie zur Anwendung der Bakteriophagentherapie bei Verbrennungswunden, die durch Pseudomonas aeruginosa wurde in den Jahren 2015–2017 durchgeführt. Trotz der unzureichenden Wirksamkeit der Therapie im Vergleich zum Kontrollantibiotikum Sulfadiazin aufgrund einer geringen Menge verabreichter Bakteriophagen weckten die Ergebnisse das Interesse in der Wissenschaft [6].Im Februar 2019 hat die US-amerikanische Food and Drug Administration eine von der University of California, San Diego, der School of Medicine und der AmpliPhi Biosciences Corporation initiierte klinische Studie zur Bakteriophagentherapie bei Patienten mit ventrikulären Unterstützungssystemen genehmigt, die mit Staphylococcus aureus [7]. Die Bakteriophagentherapie wird intravenös verabreicht und ist die erste klinische Studie zur Bakteriophagenbehandlung in Nordamerika [7]. Diese beiden klinischen Studien und einige andere, die hier nicht erwähnt wurden, markieren neue Stadien in der Entwicklung von Bakteriophagen vom experimentellen Stadium bis hin zu einer regulären kommerziell erhältlichen Therapie zur Ausrottung hochresistenter Superbakterien.

Abgesehen von den typischen Wechselwirkungen mit Bakterien und ihrer Anwendung bei Infektionskrankheiten können Bakteriophagen auch auf viele unerwartete Weise mit Eukaryoten interagieren und diese beeinflussen [8]. In der aktuellen Überprüfung werden diese Interaktionen in zwei Kategorien unterteilt: indirekte und direkte Interaktionen. Während der ersteren beeinflusst ein Bakteriophage einen Eukaryonten, indem sie mit Eukaryonten verwandte Bakterien beeinflusst, während im letzteren Fall der Bakteriophage und der Eukaryonte in unmittelbarem Kontakt stehen. Wir stellen diese Wechselwirkungen im Folgenden vor und betonen ihren Einfluss auf die zukünftige Anwendung von Bakteriophagen im klinischen Umfeld.

2. Indirekte Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten

2.1. Bakteriophagen helfen, bakterielle Krankheitserreger von Eukaryoten abzutöten

Die Fähigkeit von Bakteriophagen, pathogene Bakterien von Eukaryoten abzutöten, unterstreicht das wiederbelebte Interesse an Bakteriophagen als alternative antimikrobielle Therapie. Die detaillierten Mechanismen, die von Bakteriophagen verwendet werden, um Eukaryoten zu unterstützen, variieren.

Barr et al. zeigten, dass Bakteriophagen, insbesondere T4-Bakteriophagen, als nicht vom Wirt abgeleitete Immunität gegen bakterielle Eindringlinge auf menschlichen Schleimhautoberflächen wirken [9]. Der T4-Phagen bindet schwach an ein Mucin-Glykoprotein, einen der wesentlichen Bausteine ​​des Schleims (der von der Epithelschleimhaut sezerniert wird), unter Verwendung einer Immunglobulin-ähnlichen Domäne des Hoc-Proteins. Die schwache Bindung bietet den Epithelzellen zusätzlichen Schutz, indem sie die Abtötung von T4-Phagen erleichtert und die Besiedlung durch bakterielle Krankheitserreger verhindert [9]. Die schwache Bindung maximiert auch die Fähigkeit des T4-Phagen, Bakterien abzutöten, indem es ihm ermöglicht wird, sich auf subdiffusive Weise über die Schleimhautoberflächen zu bewegen. Die subdiffusive Bewegung erhöht die Wahrscheinlichkeit von Bakteriophagen-Bakterium-Begegnungen, da sie dem Phagen eine gründliche Erkundung bestimmter Bereiche des Schleims ermöglicht [10].

Kaur et al. weisen auf die Fähigkeit einiger Bakteriophagen hin, intrazelluläre Pathogene abzutöten [11]. Intrazelluläre Krankheitserreger sind gefährlicher und schwerer auszurotten als extrazelluläre Krankheitserreger, da sie sich dem Immunsystem entziehen können, indem sie sich in der Wirtszelle verstecken. Eine frühe Studie zeigte, dass der lytische Bakteriophage MR-5 mit breitem Wirtsspektrum ein vielversprechender Kandidat für die Phagentherapie ist [11]. Der Bakteriophage tötet Methicillin-resistente S. aureus (MRSA), die von murinen BALB/c-Makrophagen phagozytiert wurden, wodurch die Bakterienzahl reduziert wird, so dass die Bakterien von Makrophagen leichter gehandhabt werden können. Darüber hinaus reduziert es auch die zytotoxische Wirkung von S. aureus gegen Makrophagen durch Abtöten der Bakterien. Daher unterstützt der MR-5-Phagen indirekt die Makrophagen bei der Eliminierung von MRSA und leistet damit insbesondere bei hoher Bakterienbelastung eine große Hilfe. Anstatt direkt in die Makrophagen einzudringen, verwendet der MR-5-Phagen S. aureus als Fahrt.

In einer ähnlichen Studie haben Zhang et al. fanden heraus, dass ein anderer lytischer Bakteriophage mit breitem Wirtsspektrum, vB_SauM_JS25, MRSA in bovinen Epithelzellen (MAC-T bovine mammar epithelial cells) abtöten kann [12]. Die Autoren berichteten, dass der vB_SauM_JS25-Phagen in den Kern der MAC-T-Zelle eindringen kann, obwohl der zugrunde liegende Mechanismus nicht bekannt ist. Nachfolgende Untersuchungen bestätigten, dass mehrere Bakteriophagen zwar in die eukaryontischen Zellen eindringen können, aber nicht ganz in die Zellkerne gelangen [13, 14]. Das Eindringen von Bakteriophagen in die eukaryontischen Zellen wird im Detail wie folgt diskutiert.

Das Auftreten von Wechselwirkungen zwischen Phagen, Bakterien und eukaryontischen Zellen wirft die Frage nach der Wirksamkeit der Phagentherapie auf. Eine weitere Studie untersuchte die Sicherheitsaspekte im Zusammenhang mit der Wirkung einer experimentellen Bakteriophagentherapie in vitro auf die intrazelluläre Abtötungsfähigkeit von Granulozyten und Monozyten [15]. Die Autoren fanden heraus, dass eine Therapie mit T2-, T4- und A3-Bakteriophagen die intrazelluläre Abtötungsfähigkeit der genannten Zellen nicht beeinflusst. Eine spätere Untersuchung am Menschen [16] kam zu ähnlichen Ergebnissen. Diese Bakteriophagentherapie, die als Cocktail aus mehreren lytischen Bakteriophagen verabreicht wird, beeinflusst nämlich nicht die Abtötungsfähigkeit von polymorphkernigen Neutrophilen und peripheren mononukleären Blutzellen während einer chronischen Infektion, die durch pathogene Escherichia coli, Enterococcus faecalis, P. aeruginosa, und S. aureus, unabhängig vom Verabreichungsweg und Infektionstyp. Darüber hinaus verbesserte die Bakteriophagentherapie die Abtötungsfähigkeit von mononuklearen Zellen des peripheren Blutes während nicht pathogener E coli B-Infektionen bei Patienten, die positiv auf die Therapie ansprachen. Basierend auf diesen Beobachtungen schlugen die Autoren vor, dass die Bakteriophagentherapie ausreichend sicher ist, um beim Menschen angewendet zu werden, insbesondere bei chronischen Infektionen.

Die Studien bestätigen, dass Bakteriophagen in einigen Systemen die antibakterielle Aktivität eukaryontischer Zellen unterstützen können. Bakteriophagen können jedoch auch indirekt mit Bakterien wechselwirken, um Eukaryoten zu schädigen, entweder durch (1) Unterbrechen einer wechselseitigen Beziehung zwischen Eukaryoten und Bakterien oder durch (2) Unterstützung von eukaryotischen bakteriellen Pathogenen, wie nachstehend ausführlich erörtert wird.

2.2. Bakteriophagen stören das gegenseitige mikrobielle Gleichgewicht im menschlichen Körper

Die gegenseitige Beziehung zwischen Mikroben und Menschen gilt als entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen und der Homöostase im menschlichen Körper. Der menschliche Wirt bietet Nahrung und Lebensraum, der zur Unterstützung des Bakterienwachstums notwendig ist. Die Mikrobiota produziert Metaboliten, die als Signalmoleküle für den Darm, das Gehirn, das Immun- und Hormonsystem und andere Funktionen des Wirts dienen [17]. Die Beziehung ist wichtig, da der menschliche Körper ein Refugium von fast 100 Billionen Mikroben ist, die eine Vielzahl von Arten repräsentieren, insbesondere im Verdauungstrakt. Das Vorhandensein von Bakteriophagen, die Bakterien, einschließlich nützlicher Bakterien, abtöten können, kann das Gleichgewicht in Richtung Dysbiose (Fehlanpassung der mikrobiellen Zusammensetzung) verschieben und so Krankheiten auslösen [18–21]. Bakteriophagen können also auch humanpathogen werden [22].

Bakteriophagen könnten dieser Hypothese zufolge die möglichen Initiatoren der Parkinson-Krankheit sein [23]. Die Parkinson-Krankheit ist gekennzeichnet durch die Anhäufung von falsch gefalteten α-Synuclein in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra aufgrund einer Erschöpfung des Neurotransmitters Dopamin. Gemäß dem vorgeschlagenen pathophysiologischen Weg der Parkinson-Krankheit ist die Fehlfaltung von α-Synuclein beginnt im enterischen Nervensystem und breitet sich allmählich in die Substantia nigra aus. Es wird angenommen, dass die Fehlfaltung das Ergebnis des Fehlens bestimmter Milchsäurebakterien ist. Lactokokken spp., im Darm, die für die Aufrechterhaltung des richtigen Dopaminspiegels im Darmnervensystem verantwortlich sind [24]. L-DOPA beeinflusst als Teil des Parkinson-Arzneimittelregimes die mikrobielle Population im Darm [25]. Die Analyse der Stuhlproben von L-DOPA-naiven Parkinson-Patienten zeigte Veränderungen der Mikrobiota [26] und der Phageota [23]. Die Darmpopulation von Lactokokken spp. ist zehnmal niedriger als bei Kontrollpersonen. Die Erschöpfung von Lactokokken spp. ist mit dem Überfluss an spezifischen lytischen Bakteriophagen verbunden, Lactokokken Bakteriophage 936 und Lactokokken Virus c2. Lactokokken Bakteriophagen sollen töten Lactokokken spp., wodurch die Entwicklung der Parkinson-Krankheit gefördert wird [23]. Schon seit Lactokokken Bakteriophagen werden häufig in Milch, Käse und Joghurt gefunden, der Verzehr von Milchprodukten kann zu ihrer hohen Häufigkeit im menschlichen Darm führen [27]. Zur Validierung solcher Annahmen sind zusätzliche Daten erforderlich, etwa durch die Bestimmung der durchschnittlichen Konzentration von Lactokokken Bakteriophage 936 und Lactokokken Virus c2 in Milchprodukten und Untersuchung des Zusammenhangs zwischen dem Verzehr von Milchprodukten, die diese Bakteriophagen enthalten, und der Häufigkeit von Parkinson-Symptomen.

2.3. Bakteriophagen können bakterielle Erreger von Eukaryoten unterstützen

Bakteriophagen können auf verschiedene Weise bei einer pathogenen bakteriellen Infektion helfen. Addyet al. untersuchten die Beteiligung von filamentösen Phagen φRSS1 während Ralstonia solanacearum Infektion von Tomatenpflanzen [28]. Zuerst, φRSS1 verbessert die R. solanacearum Virulenz durch Anlagerung und Ansammlung von Phagenpartikeln auf der Oberfläche der Bakterienzellmembran. Dies erhöht anschließend die Dichte der Bakterienkolonien und induziert eine frühe Expression des Gens für den Transkriptionsregulator PhcA, der für die Aktivierung vieler anderer Virulenzfaktoren verantwortlich ist. Dazu gehörte die Produktion großer Mengen an extrazellulärem Polysaccharid, das eine entscheidende Rolle bei der Erweiterung der Stammkolonisation in Tomaten spielt. Außerdem, φRSS1 verstärkt die Expression des PilA-Proteins (Pilus Typ IV), was die Zuckungsmotilität und die Anheftung von Bakterienkolonien an Pflanzenzellen weiter erhöht. R. solanacearum Stamm infiziert von φRSS1 verursacht bei Tomatenpflanzen schneller eine vollständige Welke (5 Tage nach der Inokulation) als ein nicht infizierter Stamm (8 Tage nach der Inokulation). Interessanterweise könnte dieses Phänomen in der Natur häufiger auftreten, da ähnliche Beobachtungen für den filamentösen Phagen Xf2 gemacht wurden, der die Virulenz von . erhöht Xanthomonas campestris pv. oryzae [29].

Bakteriophagen können auch bakterielle Krankheitserreger bei der Biofilmbildung unterstützen [30]. Biofilm ist eine Ansammlung von Bakterien in gut organisierten Polymeren. Die extrazelluläre Matrix schützt Bakterien und ermöglicht ihnen, sich an mehrere Oberflächen innerhalb des Wirts oder an nicht lebenden Objekten anzuheften. Es ist eines der Schlüsselmerkmale bakterieller Krankheitserreger, das ihr Überleben in einer rauen Umgebung ermöglicht, das Immunsystem des Wirts umgeht und chronische Infektionen fördert [31, 32]. Dementsprechend ist die Existenz des Prophagen SV1 im Streptokokken (NS.) Lungenentzündung Genom korreliert mit der bakteriellen Fähigkeit zur Biofilmbildung [33]. SV1-Prophage kann seinen Lebensmodus spontan von statisch lysogen zu aktiv lytisch ändern. Eine solche Veränderung reicht aus, um kleine Mengen von . zu lysieren St. Pneumonie Zellen in einer Kolonie, wodurch extrazelluläre DNA bereitgestellt wird, die als für die Biofilmbildung erforderliche Adhäsion dient [34]. Mit anderen Worten, einige St. Pneumonie Zellen werden durch SV1-vermittelte Lyse für den Biofilmaufbau getötet, um andere Zellen zu schützen. Obwohl St. Pneumonie bereits mit einem autolytischen Mechanismus in Form des lytischen Enzyms LytA [35] ausgestattet ist, erhöht die Anwesenheit eines anderen lytischen Stoffwechselwegs (SV1-vermittelt) dessen Fähigkeit zur Bildung eines Biofilms. St. Pneumonie Stamm mit SV1-Prophage konstruiert in kürzerer Zeit dickere und dichtere Biofilme als St. Pneumonie ohne SV1-Prophage [33].

Bakteriophagen könnten auch die Biofilmbildung anderer Bakterienarten unterstützen, wie z P. aeruginosa und E coli. Bei Mukoviszidose unterstützen die filamentösen Bakteriophagen Pf und Fd P. aeruginosa und E coli beim Aufbau hochgeordneter Biofilme mit stabilen Flüssigkristallstrukturen [36]. Die filamentösen Bakteriophagen werden kontinuierlich aus dem bakteriellen Wirt extrudiert, aber nicht lysiert und abgetötet. Die Form und negative Ladung dieser filamentösen Bakteriophagen scheint mit ihrer Fähigkeit zu korrelieren, mit Polymeren innerhalb der Biofilme zu assoziieren. Die resultierenden Biofilme schützen die Bakterien vor Aminoglykosid-Antibiotika und Austrocknung und fördern eine festere Anhaftung an Oberflächen als die von Biofilmen, die ohne Bakteriophagen gebildet werden [37]. Darüber hinaus wird die Assoziation durch eine Verarmungsanziehungskraft aufrechterhalten, die von der Ionenstärke, Polymergröße und Polymerkonzentration abhängt. In einem murinen Lungenentzündungsmodell wurden Biofilme, die durch den Bakteriophagen Pf-unterstützt gebildet wurden, P. aeruginosa lassen das Bakterium in der Lunge verbleiben, indem es die Phagozytose durch Makrophagen umgeht und Entzündungsreaktionen hemmt [38]. Diese Interaktion ist bemerkenswert, weil P. aeruginosa und E coli fungieren als Wirte für die Bakteriophagen Pf bzw. Fd. Viele Labor- und klinische Stämme von P. aeruginosa und E coli beherbergen die Prophagen Pf und Fd, die aktiviert werden, wenn die Bakterien Biofilme bilden [38].

In Studien von Bille et al. wurde berichtet, dass Prophagen eines filamentösen Bakteriophagen MDAφ (Meningococcal Disease-Associated) verbessert den körperlichen Kontakt zwischen Meningokokken Zellen während der Anlagerung und Besiedelung von Epithelzellen im menschlichen Nasopharynx, vor der Infektion und Durchdringung der Blut-Hirn-Schranke [39]. Das anfängliche Anheftungs- und Kolonisationsstadium wird durch einen Typ-IV-Pilus vermittelt, der die erste Schicht von . bildet N. meningitidis Zellen, die fest an die apikale Oberfläche von Epithelzellen binden. Kurz nach der Anheftung vermehren sich die Zellen und bilden eine weitere Bakterienschicht, um Kolonien zu bilden. Der Pilus Typ IV vermittelt jedoch nicht die Bildung dieser nächsten Schicht, da die Expression des Pilus nach Bildung der ersten Schicht unterdrückt wird [40]. Die Autoren fanden das N. meningitidis drückt und verwendet den MDAφ Prophagen als Ersatz für den Typ IV-Pilus. Mit anderen Worten, die Bakteriophagenpartikel werden wie der Pilus verwendet, um die nächste Bakterienschicht zu erzeugen, die an der ersten Schicht befestigt ist. Interessanterweise werden die Bakteriophagenpartikel sezerniert und direkt in die äußere Membran der Bakterien eingebettet, ohne sie zu lysieren oder abzutöten. Viele Bakteriophagenpartikel bilden riesige Bündel, die die Bakterien aggregieren und die Kolonien vor Scherstress und der Fließbewegung der Epithelzellzilien schützen. Die Deletion von Prophagen MDAφ von dem N. meningitidis Genom führt zu Aggregations- und Kolonisationsversagen [39].

Die integrale Beteiligung von filamentösen Bakteriophagen bei der Förderung einer bakteriellen Infektion gegen Eukaryoten zeigt das wechselseitige Verhalten von Bakterien und Bakteriophagen. Folglich werden diese Arten von Bakteriophagen zu neuen potentiellen Zielen für die Entwicklung von Medikamenten gegen pathogene Bakterien. Da eine lebenswichtige Verbindung zwischen filamentösen Bakteriophagen und resistenten Mikroben identifiziert wird, besteht vielleicht eine Chance, diese Superbakterien zu bekämpfen, nicht indem man sie direkt angreift, sondern ihre Verbündeten zerstört.

3. Direkte Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten

Viren (einschließlich Bakteriophagen) sind obligat intrazelluläre Krankheitserreger und werden im Allgemeinen anhand der jeweiligen Wirtsdomäne (Bakterien, Archaeen oder Eukaryoten) klassifiziert [41]. Diese Klassifizierung basiert auf der allgemeinen Annahme, dass kein Virus Vertreter von mehr als einem einzigen Lebensbereich direkt infizieren und mit diesen interagieren kann [42]. Obwohl Bakteriophagen jedoch keine anderen Lebensdomänen als Bakterien infizieren können, können sie dennoch direkt interagieren und Vertreter solcher anderer Domänen, insbesondere Eukaryoten, beeinflussen. Im Folgenden beschreiben wir einige Ergebnisse zur direkten Interaktion zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten.

3.1. Bakteriophagen können in einen eukaryotischen Wirt eindringen und sich verteilen

Ein wichtiger Faktor, der es Bakteriophagen ermöglicht, direkt zu interagieren und Eukaryoten zu beeinflussen, ist die Fähigkeit, die Zellmembran zu durchdringen und sich innerhalb eines eukaryotischen Wirts frei auszubreiten [43–45]. Studien mit einschichtigen Epithelzellen aus dem Darm (T84 und CaCo2), der Lunge (A549), der Leber (Huh7), des Gehirns (hBMec) und der Niere (MDCK) vom Menschen zeigten, dass die Bakteriophagenpenetration von Zellen auf Transzytose beruht, die die Endomembransysteme der eukaryontischen Zellen, insbesondere des Golgi-Apparats [14]. Die Transzytose beginnt, wenn ein Bakteriophagenpartikel von der Zellmembran verschlungen und in einem kleinen Vesikel in das Zytoplasma übertragen wird. Das Vesikel wandert dann in den Golgi-Apparat, bevor es auf der anderen Seite derselben Zelle entladen wird. Der Vorgang wird von den Nachbarzellen wiederholt und ermöglicht so den Bakteriophagen-Partikeln, Zellschichten zu durchqueren. Dieses Phänomen wurde bei mehreren Bakteriophagen wie T4-, T5-, T7-, SP01-, SPP1- und P22-Phagen beobachtet [14]. Detaillierte Beobachtungen zeigten, dass die Transzytose von Bakteriophagen hauptsächlich von apikal nach basolateral verläuft, mit einer geschätzten Rate von 0,325 × 10 –12 ml/(μm 2 h) und gilt als dosisabhängiger Prozess [14].

Ähnliche Beobachtungen wurden in einer anderen Studie mit gemacht E coli Bakteriophage PK1A2 und humane Neuroblastomzellen kSK-N-SH, die reichlich Polysialinsäure auf der Membranoberfläche exprimieren [13]. Der Bakteriophage PK1A2 kann an Polysialinsäure binden und dringt durch Endozytose in kSK-N-SH-Zellen ein. Die Bakteriophagen akkumulieren im späten Endosomenkompartiment nahe der perinukleären Region und verbleiben darin bis zum allmählichen Abbau durch die Zelle, ungefähr 48 h nach der Endocytose. Die Bindung zwischen PK1A2 und Polysialinsäure der kSK-N-SH-Zelle ist spezifisch, wahrscheinlich aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit mit dem Polysialinsäure-Lipopolysaccharid von E coli K1, der Hauptwirt des Bakteriophagen PK1A2. Die Bindung wird zur Initiierung der Endozytose benötigt und ist temperaturabhängig [13].

Das Eindringen von Bakteriophagen in die eukaryontische Zelle könnte die Beobachtung erklären, dass Bakteriophagen in vielen vielzelligen Eukaryonten vorkommen, auch in isolierten Regionen, z. B. im menschlichen Gehirn, das lange Zeit als steril galt [46]. Diese Beobachtung liefert wertvolle Informationen zu den pharmakokinetischen Aspekten der Bakteriophagenbehandlung, die im Zusammenhang mit der Verwendung von Bakteriophagen als alternative antimikrobielle Therapie von entscheidender Bedeutung ist [47]. Es betont auch die Möglichkeit der Verwendung von Bakteriophagen als Vektoren in Medikamenten- und Genabgabesystemen, einschließlich Therapien, die auf das Hirngewebe, den Magen-Darm-Trakt und die Lunge durch systemische oder lokale Abgabe abzielen [48–51]. Darüber hinaus liefert es auch eine vernünftige Erklärung des Mechanismus des direkten horizontalen Gentransfers (HGT) zwischen Phagen und Eukaryoten, der in einem späteren Abschnitt diskutiert wird.

3.2. Bakteriophagen können an Krebszellen binden und Metastasen hemmen

Bakteriophagen können mit Krebszellen interagieren und Metastasen hemmen, indem sie eine spezifische Protein-Protein-Konfiguration verwenden, an der GP24 des Bakteriophagen und Integrin beteiligt sind β3, HSP90-Rezeptor oder andere Proteine ​​der Krebszellen. Diese ungewöhnliche Interaktion wurde an Melanom- und Lungenkrebszellen im Mausmodell (B16- bzw. LLC-Zellen) und am Menschen (HS294T- bzw. A549-Zellen) untersucht [52, 53]. Die Autoren schlugen vor, dass in vitro und in vivo Die Metastasierung beider Krebsarten wird durch die Bindung der Bakteriophagen T4 und HAP1 (eine Unterlinie des Bakteriophagen T4) gehemmt. Die Hypothese ist, dass diese Hemmung durch die spezifischen Interaktionen zwischen GP24 und Integrin . vermittelt wird β3 (αIIβ3/αvβ3) auf Krebszellen. GP24 ist ein Kapsidprotein mit einem spezifischen Lys-Gly-Asp-Motiv (dem KGD-Motiv). Es bildet ein Pentamer an jeder Ecke des T4- und HAP1-Kopfes. Integrieren β3 ist ein Oberflächenprotein, das an verschiedenen Aspekten der Zellbiologie beteiligt ist, wie Gewebeintegrität, Zellmigration, Zellüberleben und Angiogenese [54].In Krebszellen ist Integrin β3 ist sehr häufig und wird als einer der möglichen Faktoren zur Förderung der Metastasierung angesehen [55, 56]. Es wird angenommen, dass das KGD-Motiv in GP24 an der Bindung zwischen GP24 und Integrin . beteiligt ist β3. Sowohl T4- als auch HAP1-Bakteriophagen können Integrin . binden β3 über GP24, aber die HAP1-Phagenbindung ist signifikant stärker als die des T4-Phagen [53]. Der genaue Mechanismus, der die Hemmung von Krebsmetastasen nach Bindung von GP24 und Integrin . auslöst β3 ist unbekannt. Wahrscheinlich reguliert die Bindung das Integrin herunter β3 Expression oder verhindert Integrin β3 Interaktion mit anderen Proteinen, die an einigen Signalwegen im Zusammenhang mit Krebsmetastasen beteiligt sind.

Detaillierte Untersuchungen ergaben, dass die stärkere Bindung des HAP1-Phagen mit einer Missense-Mutation in hoc Gen, das für das Hoc-Protein kodiert [57]. Das Hoc-Protein ist ein stark immunogenes äußeres Kapsidprotein des Kopfes von T4- und HAP1-Phagen. Es hat eine hantelähnliche Form, die ca. 6 nm von der Kapsidoberfläche absteht, einschließlich GP24 [58, 59]. Anstelle eines Hoc-Proteins voller Länge wie der T4-Phagen produziert der HAP1-Phagen ein verkürztes Hoc-Protein aufgrund einer Änderung des C496-Rests zu T, das anschließend das Gln166-Codon in ein Stop-Codon (UAA) ändert. Hoc-Trunkierung in HAP1-Phagen erhöht möglicherweise die Wahrscheinlichkeit der Bindung zwischen GP24 und Integrin β3, da es nicht vom Kopf absteht und einen direkten Kontakt zwischen diesen beiden Proteinen stört. Diese Vorstellung wird durch eine ähnliche Bindungskapazität von HAP1-Phagen und T2-Bakteriophagen, die kein Hoc-Protein, aber GP24- und KGD-Motiv besitzen, an Integrin . unterstützt β3 in Krebszellen [57].

Die Untersuchung des Verhaltens von T4- und HAP1-Phagen in Mäusen, die B16-Melanomzellen beherbergen, ergab eine weitere interessante Beobachtung. Es zeigte sich, dass trotz einer viel größeren Affinität zu Integrin β3 in den Krebszellen wird der HAP1-Phagen von Kupffer-Zellen in der Leber durch Phagozytose schneller entfernt als der T4-Phagen [53]. Es wurde vorgeschlagen, dass HAP1 anfälliger für Phagozytose ist, da die kurze Version des Hoc-Proteins die Kopfkapsidproteine ​​nicht verbirgt, die daher von Kupffer-Zellen leicht nachgewiesen werden können. Das Hoc-Wildtyp-Protein hat vier Domänen, von denen drei dem eukaryontischen Immunglobulin ähneln. Domäne 1 ähnelt Fc-Rezeptoren, Domäne 2 der dritten Immunglobulin-ähnlichen Domäne von Perlecan und Domäne 3 der V-Set-Familie der Immunglobulin-Superfamilie [60]. Daher hat sich das Hoc-Protein wahrscheinlich als eine Form der Anpassung von T4-Bakteriophagen entwickelt, um eine Erkennung durch das Immunsystem zu vermeiden, wodurch sie in Eukaryoten überleben können.

Eine andere Studie zeigte, dass die Bakteriophagen T4 und M13 die Expression des HSP90-Gens in menschlichen Prostatakrebszellen (PC3) unterdrücken können, die für die Förderung der Mitose, DNA-Reparatur und Verhinderung von Apoptose und Autophagie verantwortlich sind [61]. Die Suppression wird durch die Interaktion von T4- und M13-Phagen mit HSP90-Rezeptoren vermittelt und führt zu Apoptose und Autophagie von Krebszellen. Ähnlich wie GP24-Integrin β3 Bindung ist der genaue Mechanismus unbekannt, der die Herunterregulierung der Expression des HSP90-Gens nach der Bindung von T4- und M13-Phagen an HSP90-Rezeptoren fördert. Diese Ergebnisse heben jedoch die ungewöhnlichen Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten hervor und stellen auch einen neuen Ansatz dar, um die mögliche Verwendung von Bakteriophagen als Antikrebsmittel zu untersuchen.

Obwohl das Wissen über Wechselwirkungen zwischen β3 Integrin und HSP90-Rezeptor mit Bakteriophagen selten ist, spekulieren wir, dass die beiden Proteine ​​wahrscheinlich dem Bakteriophagen ermöglichen, mit Eukaryoten im Allgemeinen zu interagieren, nicht nur in Krebszellen. Diese Spekulation basiert auf den Informationen, die β3 Integrin- und HSP90-Rezeptoren werden in vielen Arten gefunden, auch wenn sie möglicherweise nicht so häufig vorhanden sind wie in Krebszellen. Mit anderen Worten, β3 Integrin- und HSP90-Rezeptoren werden von Bakteriophagen verwendet, um mit Eukaryoten zu interagieren und umgekehrt. Weiterhin initiiert diese Wechselwirkung wahrscheinlich die Transzytose von Bakteriophagen zu eukaryontischen Zellen über eine Rezeptor-vermittelte Endozytose, ähnlich der Polysialinsäure-vermittelten Endozytose von PK1A2-Bakteriophagen, wie zuvor diskutiert. Wenn dies tatsächlich der Fall ist, dann ist eine direkte Interaktion zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten häufiger als derzeit angenommen. Außerdem, β3 Integrin, HSP90-Rezeptor und Polysialinsäure sind höchstwahrscheinlich nicht die einzigen Arten von Mediatoren, die solche direkten Interaktionen vermitteln.

3.3. Menschliche Zellen unterstützen Bakteriophagen bei der Infektion des bakteriellen Wirts

Die Interaktion zwischen Bakteriophagen und menschlichen Zellen kann für die Bakteriophageninfektion von Bakterien entscheidend sein. phiCDHS1-Bakteriophage tötet das pathogene Bakterium Clostridium difficile schneller, wenn beide in eine Kultur von HT-29-Zellen der menschlichen Dickdarmkrebslinie gegeben werden [62]. Mit anderen Worten, HT-29-Zellen tragen anscheinend dazu bei, die Abtötungsfähigkeit von phiCDHS1-Bakteriophagen zu maximieren, um C. schwer. Dieses Phänomen ist mit der Anheftung von phiCDHS1-Phagen und C. schwer auf HT-29-Zellen, die phiCDHS1-Phagen und C. schwer Zellen in engem Kontakt, was dem Phagen mehr Möglichkeiten bietet, das Bakterium zu infizieren. Die Neigung zu dieser Anheftung ist hoch, da in der Studie etwa 70 % der phiCDHS1-Phagen an HT-29-Zellen angeheftet gefunden wurden [62]. Darüber hinaus ist die Anheftung spezifisch, da das Ersetzen von HT-29-Zellen durch HeLa-Zellen (menschliche Gebärmutterhalskrebslinie) zu keiner Anheftung und keiner Erhöhung der Abtötungsfähigkeit von phiCDHS1 oder anderer C .-Zellen führte. schwer Bakteriophagen (phiCDHM3 und phiCDHM6). Da die Anbringung die Ausrottung von C. schwierig im menschlichen Darm und erhöhen die Population von phiCDHS1-Phagen, kann sie als direkte gegenseitige Beziehung zwischen Bakteriophagen und Menschen klassifiziert werden. Leider sind der Vermittler der Bindung und der zugrunde liegende Mechanismus nicht klar verstanden.

Die Anheftung von phiCDHS1-Phagen an HT-29-Zellen unterstützt unsere frühere Spekulation, dass direkte Interaktionen zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten in der Natur häufiger vorkommen als derzeit angenommen. Obwohl der Bindungsmechanismus unbekannt ist, ist es möglich, dass er durch Moleküle mit ähnlichen Eigenschaften wie . vermittelt wird β3 Integrin, HSP90-Rezeptor und Polysialinsäure. In silico-Studien mit Homologie-/Vergleichsmodellierung, molekularem Docking, quantitativen Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-(QSAR)-Methoden und Konformationsanalysen von Bakteriophagen, Bakterien und menschlichen Proteomen können das/die Kandidatenprotein(e) identifizieren, die an solchen Interaktionen beteiligt sind.

3.4. Bakteriophagen beteiligen sich an der direkten HGT mit Eukaryoten

HGT wird als Übertragung von Genen von einem Organismus auf einen anderen, nicht verwandten Organismus definiert [63, 64]. Der Transfer kann zwischen Organismen derselben Spezies, unterschiedlichen Spezies und sogar Organismen, die unterschiedliche Domänen repräsentieren, erfolgen. HGT kommt hauptsächlich in Bakterien auf drei Wegen vor: Transduktion, Transformation und Konjugation. Das Wissen über HGT innerhalb der eukaryotischen Domänen ist begrenzt, aber viele Hinweise deuten darauf hin, dass es auch häufig in Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen könnte [65]. HGT kommt häufig zwischen Bakteriophagen und dem bakteriellen Wirt und auch zwischen Bakterien und Eukaryonten vor, insbesondere bei obligaten intrazellulären Bakterien und ihrem jeweiligen Eukaryonten-Wirt. Auf den ersten Blick gibt es keine direkte HGT zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten. Allerdings treten solche Wechselwirkungen auf, wie für den Bakteriophagen WO gezeigt wurde, der mehrere Arthropoden-Gene trägt [42, 66]. Bakteriophage WO infiziert auf natürliche Weise Wolbachia. Wolbachia, wiederum ist ein intrazelluläres Bakterium von Arthropoden. Durch Anstecken Wolbachia, Bakteriophage WO mit Arthropodenzellen in Kontakt stehen kann, was HGT zwischen ihnen ermöglichen würde. Gene, die vom Bakteriophagen WO beherbergt werden, werden zusammenfassend als eukaryotisches Assoziationsmodul bezeichnet. Das Modul umfasst Gene wie solche, die für die Latrotoxin-C-terminale Domäne, eukaryotische Furinspaltung, Ankyrin C-Terminus, Ankyrin und Tetratricopeptide, und NACHT (Neuronal Apoptosis inhibitory protein, MHC Class II Transcription Activator, Incompatibility Locus Protein from Podospora anserina HET-E, Telomerase-assoziiertes Protein TP1). Bakteriophage WO beherbergt all diese Gene, vermutlich um sich an Arthropodenkörper anzupassen und darin zu überleben und um effizient zu infizieren Wolbachia. Der Mechanismus, der HGT zwischen Bakteriophage WO und Arthropoden ermöglicht, ist nicht vollständig verstanden. Es wird angenommen, dass HGT auf drei verschiedenen Wegen involviert sein könnte: (1) direkter Gentransfer, wenn Bakteriophage WO in die Arthropodenzellen eindringt, (2) Transfer vermittelt durch Wolbachiaund (3) Übertragung vermittelt durch andere Arten von Viren, die auch die Arthropoden infizieren.

Im Gegensatz dazu tragen mehrere Eukaryoten Gene, die sich auf bestimmte Bakteriophagen beziehen. Nematode und Walderdbeere tragen ein orthologes Gen namens VP1, das ein Hauptkapsidprotein von kodiert φChp4, a Chlamydien Bakteriophagen aus der Familie der Microviridae [67]. Es ist möglich, dass ein Fragment eines oder mehrerer Bakteriophagengene in die Genome von Eukaryoten integriert wurde, entweder durch nichthomologe Rekombination oder durch Insertion während der DNA-Replikation.

Die Existenz eines nuklearen Lokalisierungssignals wurde im Terminal Protein (TP) mehrerer Bakteriophagen nachgewiesen, z. B. Φ29, Nf, PRD1, Bam35 und Cp-1 [68]. Das Kernlokalisierungssignal ist eine spezifische Sequenz, die eine Aufnahme und Abgabe von Proteinen in den eukaryontischen Kern ermöglicht. Daher sind diese TP-DNA-Moleküle ein nützliches Werkzeug, um Gene zu amplifizieren und anschließend effizient in den eukaryontischen Kern zu transportieren [69]. Unterdessen ist TP ein Protein, das von Bakteriophagen verwendet wird, um die DNA für die Replikation vorzubereiten. Dabei wird TP kovalent an das 5'-Ende des DNA-Produkts gebunden. Daher weist nach der TP-vermittelten DNA-Replikation das TP-gebundene Bakteriophagen-DNA-Produkt ein Kernlokalisierungssignal auf und kann in den Kern eindringen. Dies ist ein weiterer möglicher Mechanismus, der direktes HGT zwischen Bakteriophagen und Eukaryoten ermöglicht und es Eukaryoten auch ermöglicht, Bakteriophagen-Gene zu erhalten. Damit eine solche HGT auftritt, muss der Bakteriophage jedoch in eukaryontische Zellen eindringen, bevor er die TP-gebundene DNA freisetzt. Daher spielt die Bakteriophagenpenetration über die Transzytose eine entscheidende Rolle bei der Ermöglichung des Auftretens direkter HGT. Dieser Befund stützt eine neue Theorie über die Rolle von Bakteriophagen bei der Gestaltung der Diversität eukaryotischer Genome.

4. Fazit

Seit ihrer Entdeckung im frühen 20. Jahrhundert haben die Eigenschaften und Rollen von Bakteriophagen viele Grundlagen- und angewandte Forschungen ausgelöst. Im Laufe der Zeit erstreckten sich die Studien zu Bakteriophagen von Phagen-Bakterien-Interaktionen auf Interaktionen mit nichtbakteriellen Zellen, einschließlich Zellen von Eukaryoten. Diese Wechselwirkungen umfassen u.a. Bindung von Phagen mit spezifischen Rezeptoren auf eukaryontischen Zellen, Transzytose und horizontaler Gentransfer. Darüber hinaus wurde auch die potenzielle Rolle bakterieller Viren bei neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs untersucht. Angesichts der bemerkenswerten Vielfalt von Phagen und Eukaryoten sind weitere Studien erforderlich, um neue Interaktionsmechanismen zu identifizieren und auch zu erklären, welche Interaktionsmodi üblich und welche einzigartig sind. Bakteriophagen sind nicht nur außergewöhnliche Mikroben, sondern können auch als Forschungswerkzeuge und wertvolles Repertoire für biologische zielgerichtete Wirkstoffentwicklung und Wirkstoffabgabesysteme verwendet werden. Interaktionen von Bakterienviren mit eukaryontischen Zellen sind daher ein aktuelles und relevantes Forschungsthema.

Interessenskonflikte

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit bestehen.

Danksagung

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Klinische Pharmazie der Medizinischen Fakultät der Brawijaya University unterstützt.

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Copyright © 2020 Ramendra Dirgantara Putra und Diana Lyrawati. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.


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Schlüsselwörter: Phagentherapie, Epithelzellen, Entzündung, eukaryotische Zellen, Zytokine

Zitat: Górski A, Borysowski J und Mi⊝zybrodzki R (2021) Bakteriophagen-Interaktionen mit Epithelzellen: Therapeutische Implikationen. Vorderseite. Mikrobiol. 11:631161. doi: 10.3389/fmicb.2020.631161

Eingegangen: 19. November 2020 Angenommen: 22. Dezember 2020
Veröffentlicht: 18. Januar 2021.

Luís D. R. Melo, Universität Minho, Portugal

Gabriel Almeida, Universität Jyväskylä, Finnland
Anders S. Nilsson, Universität Stockholm, Schweden

Copyright © 2021 Górski, Borysowski und Mi⊝zybrodzki. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License (CC BY) verbreitet wird. Die Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung in anderen Foren ist unter Nennung der Urheber und Urheber sowie unter Angabe der Originalpublikation in dieser Zeitschrift im Einklang mit der anerkannten wissenschaftlichen Praxis gestattet. Es ist keine Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung gestattet, die nicht diesen Bedingungen entspricht.


Leitender Wissenschaftler für Säugetierzellexpression – Zell- und Molekularbiologie

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Dies ist eine aufregende Gelegenheit, sich einem Forschungs- und Entwicklungsteam von Wissenschaftlern anzuschließen, die über eine langjährige Erfahrung in der Bereitstellung innovativer Lösungen im Bereich der Bioverarbeitung verfügen. Menschen kommen zu Lonza wegen der Herausforderung und Kreativität, komplexe Probleme zu lösen und neue Ideen in den Life Sciences zu entwickeln. Im Gegenzug bieten wir die Zufriedenheit, die mit der Verbesserung des Lebens auf der ganzen Welt einhergeht. Die Zufriedenheit, die damit einhergeht, einen bedeutsamen Unterschied zu machen.


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Schlüsselwörter : Magnetresonanztomographie, MagA, modifizierte Ferritin-Untereinheiten, Relaxationsraten, Eisen, Krebszellen

Zitat:Sengupta A, Quiaoit K, Thompson RT, Prato FS, Gelman N und Goldhawk DE (2014) Biophysikalische Merkmale der MagA-Expression in Säugetierzellen: Auswirkungen auf den MRT-Kontrast. Vorderseite. Mikrobiol. 5:29. doi: 10.3389/fmicb.2014.00029

Eingegangen: 11. November 2013 Angenommen: 17. Januar 2014
Online veröffentlicht: 05. Februar 2014.

Kevin C. Chan, University of Pittsburgh, USA
Laimonas Kelbauskas, Arizona State University, USA

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