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Rolle von NaCl in CTAB - DNA-Komplex in der DNA-Extraktion

Rolle von NaCl in CTAB - DNA-Komplex in der DNA-Extraktion


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Ich habe eine Frage zur Rolle von NaCl im DNA-Extraktionsprozess. Bei NaCl-Konzentrationen unter 0,5 M können CTAB- und DNA-Moleküle also Komplexe bilden. In diesen Konzentrationen sind Proteine ​​und andere Kohlenwasserstoffe mit Ausnahme des DNA-CTAB-Komplexes noch in Wasser löslich. Wenn wir die Konzentration von NaCl erhöhen, wird der Komplex von CTAB-DNA auch in Wasser löslich. Korrigiert mich, wenn ich bis jetzt falsch liege.

Also ich verstehe etwas nicht. Warum verwenden wir NaCl?

Nehmen wir an, wir fügen kein NaCl hinzu. Wird das CTAB einen Komplex mit DNA bilden oder nicht? Wie ich gelesen habe, schafft CTAB ionische Bindungen mit DNA (Phosphatgruppen). In dieser Situation (ohne NaCl) muss CTAB also auch mit DNA Komplexe bilden können.

Warum haben wir NaCl verwendet? Nur um Proteine ​​und andere Kohlenwasserstoffe im Wasser löslich zu halten oder gibt es noch etwas, das NaCl bei dieser komplexen Kreation hilft?


CTAB bildet mit Nukleinsäuren unlösliche Komplexe und kann verwendet werden, um diese selektiv aus Lösungen auszufällen, siehe diese Referenz:

Wenn Sie NaCl in einer Konzentration zwischen 0,4 - 0,7 M hinzufügen, bleiben die Nukleinsäuren in Lösung, während Polysaccharide und andere Substanzen, die die DNA-Präparation stören können, dies nicht tun. Siehe dieses Papier: "Schnelle Isolierung von Pflanzen-DNA mit hohem Molekulargewicht."


Was ist der Zweck von Salz bei der DNA-Extraktion?

Während der Extraktion von Desoxyribonukleinsäure oder DNA werden typischerweise Salzverbindungen wie Natriumacetat und Ammoniumacetat zugegeben, um die Entfernung von DNA-assoziierten Proteinen zu unterstützen. Eine andere Art von Salzverbindung namens Natriumchlorid oder NaCl hilft bei der Verfestigung und Sichtbarmachung der DNA. Beim Mischen in einer Alkohollösung bildet die Natriumkomponente von NaCl eine Schutzbarriere um die negativ geladenen DNA-Phosphatenden, die es ihnen ermöglicht, sich näher zu bewegen, um aus der Lösung extrahiert zu werden.

DNA-Extraktion ist der Prozess der Gewinnung reiner DNA aus einer Probe, entweder aus lebenden oder nicht lebenden Zellen, wie sie in Viren vorkommen. Diese Technik wird häufig im medizinischen Bereich verwendet, wo die Früherkennung von Krankheiten und Störungen die Überlebensraten betroffener Personen signifikant erhöht.

Das Verfahren erfordert zunächst die Lyse von Zellen, die die zu extrahierende DNA enthalten. Die Zellen zerfallen, indem die Probe Ultraschallschwingungen ausgesetzt wird oder durch Bead-Beads. Die Probe wird mit Salz versetzt, das in einer Lösung von Phenol-Chloroform zentrifugiert wird. Die zugehörigen Proteinmoleküle werden dann herausgezogen. Die nach dem Entfernen der Proteine ​​verbleibende DNA wird mit einer Alkohollösung, typischerweise kaltem Isopropanol oder Ethanol, vermischt. Die Lösung wird zentrifugiert und DNA, die sich nicht in Alkohol löst, wird ausgefällt und extrahiert. Um die DNA-Ausbeute zu erhöhen, muss der gesamte Prozess in einer kalten Umgebung durchgeführt werden.


Was ist DNA-Präzipitation?

DNA-Präzipitation ist ein Prozess, bei dem die DNA mit Alkohol und Salz zu den sichtbaren Baumwollfäden gefällt oder aggregiert wird.

Die DNA-Präzipitation entfernt auch die Verunreinigungen aus der DNA.

“Die Fällung ist ein Prozess, bei dem die Reaktion zwischen gelöstem Stoff und Lösungsmittel ein unlösliches Aggregat erzeugt, das als Niederschlag bezeichnet wird, und der Prozess wird als Fällung bezeichnet.”

Die DNA ist hydrophiler Natur und löst sich in Wasser, aber nicht im Alkohol.

Das Wasser hat eine positive Teilladung und eine negative Teilladung. Die positive Ladung des Wassermoleküls wechselwirkt mit der negativen Ladung der DNA (dem PO3-) und löst diese auf. Allerdings ist die Wechselwirkung nicht so stark.

Das Bild zeigt die intermolekulare Wechselwirkung zwischen Wasser und DNA.

Das Salz und der Alkohol machen die DNA wasserhydrophober, sobald wir das Salz in die DNA geben, interagiert die negative Ladung der DNA mit der positiven Ladung des Salzes anstelle der positiven Ladung des Wassers.

Es kann sich an das Wasser binden, aber dank des Alkohols schützt der Alkohol mit der niedrigeren Dielektrizitätskonstante den Salz- und DNA-Komplex, indem er ihn gegen das Wasser abschirmt.

Die DNA ist wie ein Baumwollfaden sichtbar und aggregiert durch diese chemische Reaktion als Niederschlag.

Für eine tiefergehende Erklärung des Mechanismus der DNA-Präzipitation lesen Sie bitte unseren vorherigen Artikel: Rolle von Alkohol bei der DNA-Extraktion.

Darüber hinaus bleibt das Wasser anstelle der negativen Ladung der DNA in Wechselwirkung mit der negativen Ladung des Alkohols, was ebenfalls die Präzipitationseffizienz und die Gesamtausbeute des DNA-Präzipitats erhöht.

Der gesamte Fällungsmechanismus basiert auf der Polarität der Lösung und der Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels.


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Herausforderungen bei der DNA-Extraktion und nachgelagerten Anwendungen

Die Lebensmittelauthentifizierung erfordert DNA von hoher Qualität, da sie für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Analyse unerlässlich ist. Die geringe Qualität der DNA, die nach massiver Hitzebehandlung aus Lebensmittelprodukten extrahiert wurde, behindert den Authentifizierungsprozess (Demirhan, Ulca & Senyuva, 2012). Die Auswahl einer geeigneten Methode zur DNA-Extraktion berücksichtigt bestimmte Faktoren wie Zeit, Kosten und Toxizität der verwendeten Chemikalien (Chapela et al., 2007). Zum Beispiel erfordert eine konventionelle Methode zur Extraktion von DNA aus Tierarten im Allgemeinen die Zugabe von Phenol und Chloroform (Lopera-Barrero et al., 2008), die ein größeres Risiko einer DNA-Kontamination und Gesundheitsgefahren darstellen (Yue & Orban, 2001). Die Methode ist auch zeitaufwendig.

Um eine erfolgreiche PCR-Amplifikation zu gewährleisten, ist die Reinheit der extrahierten DNA von größerer Bedeutung als die Ausbeute an DNA (Särkinen, Staats, Richardson, Cowan, & Bakker, 2012). Pintoet al. ( 2007 ) hat das Vorhandensein von Inhibitoren oder Kontaminanten aus Lebensmitteln wie Polysacchariden und Huminsäure beschrieben, während Rijpens, Jannes, Asbroeck, Rossau und Herman ( 1996 ) darauf hinweisen, dass Protein in Milch die Löslichkeit pelletierter Zellen, aus denen DNA besteht, reduziert extrahiert. Wilson (1997) berichtete über Lipide und phenolische Verbindungen, die die DNA verunreinigen können. Darüber hinaus wurden einige chemische Bestandteile, die während der DNA-Extraktion verwendet werden, als PCR-Inhibitoren identifiziert. Beispielsweise kann der Chelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit Magnesium einen Komplex bilden, der schließlich die effektive Magnesiumkonzentration, die für die PCR erforderlich ist, beeinflusst. Infolgedessen ist eine erhöhte Magnesiumkonzentration erforderlich, um die Amplifikation zu unterstützen (Khosravinia & Ramesha, 2007).

Darüber hinaus verursachen Chemikalien wie Phenol die Denaturierung der Polymerase, während NaOH auch den DNA- und Polymerase-Abbau verursacht. Die Verwendung von Isopropanol und Ethanol im DNA-Präzipitationsschritt beeinflusst die Qualität der erhaltenen DNA (Bar, Kubista & Tichopad, 2012 Hedman & Rådström, 2013). Diese Inhibitoren werden nachgeschaltete Anwendungen behindern und stören oder sie können eine vollständige Hemmung der DNA-Polymerase-Aktivität in der PCR verursachen (Pinto et al., 2007). Alternativ können PCR-Inhibitoren durch die Spin-Säulen-Technik eliminiert werden, bei der DNA mit Hilfe von chaotropen Mitteln während der Extraktion an Silica-Membranen bindet (Pinto, Forte, Conversano & Tantillo, 2005).

Abgesehen von Inhibitoren können erhöhte Temperaturen und die Dauer der Wärmebehandlung die Größe von DNA-Fragmenten allmählich abbauen (Şakalar, Abasiyanik, Bektik & Tayyrov, 2012). Ebenso sollten mehrere Faktoren wie Primerspezifität, Amplikongröße und Genkopienzahl für eine erfolgreiche Amplifikation berücksichtigt werden (Jagadeesan & Salem, 2017). Daher ist die Einbeziehung einer endogenen Kontrolle in nachgeschaltete Anwendungen wichtig, da sie potenzielle Amplifikationsschwankungen aufgrund bestimmter Faktoren überprüfen kann. Zu diesen Faktoren, die das Ergebnis des Assays beeinflussen können, gehören die Variation der Menge und Qualität der aus den Proben extrahierten DNA und der DNA-Abbau (Soares, Amaral, Oliveira, & Mafra, 2013).


Materialen und Methoden

Sojabohnensamenquellen

In der vorliegenden Studie wurden fünf Arten von Sojabohnensaatgut verwendet, darunter Nicht-Biotech- und Biotech-Sorten. Die Nicht-Biotech-Sojabohnensaatmaterialien Zhoudou22, Zheng196 und Zhonghuang13 wurden von der Henan Academy of Agricultural Sciences gekauft. Zwei Arten von GV-Sojabohnensamen wurden von der Henan Sunshine Oils and Fats Group bezogen, die jährlich GV-Materialien aus Amerika importiert. Es wurde ein immunchromatographischer Teststreifentest durchgeführt, der 5-Enolpyruvyl-shikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) positiv für beide GV-Sojabohnensamen zeigte. Da die GV-Sojabohnenproben geografisch unterschiedlich waren, nannten wir sie Roundup Ready Soybean (RRS) 1 (RRS1) bzw. Roundup Ready Soybean2 (RRS2).

Protokolle zur Extraktion genomischer DNA

Alle Sojasamen wurden gemahlen und in flüssigem Stickstoff mit einer Mischmühle homogenisiert, gefolgt von Filtrieren durch ein 80-mesh-Sieb. Alle gemahlenen Proben wurden vor der DNA-Extraktion bei –20°C gelagert.

SDB-Methode 1

100 mg Zhoudou22 wurden abgewogen und in ein steriles 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Ein Milliliter SDS-Extraktionspuffer (20 g SDS/l, 150 mM NaCl, 100 mM Tris/HCl, 25 mM EDTA, pH 8,0) vorgewärmt auf 65 °C wurde zugegeben und gemischt, gefolgt von der Zugabe von 10 µl Proteinase K (10 mg/ ml). Dann wurde das Reaktionsröhrchen 1 h bei 65 °C unter Rühren alle 10 min inkubiert. Nach dem Zentrifugieren des Röhrchens für 10 min bei 12000×g, wurde der Überstand zweimal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (P:C:I, 25:24:1, v/v/v) (erste Extraktion) und Chloroform/Isoamylalkohol (C:I, 24:1) extrahiert. v/v) (zweite Extraktion). Dann wurde die obere wässrige Phase mit 0,1 Volumen Kaliumacetatlösung (3 M, pH 5,5) und dem doppelten Volumen Ethanollösung (95%, v/v, –20°C) (erste Fällung) versetzt, gefolgt von sanftem Invertieren und Vortexen für 10 min bei 15000×g DNA zu pelletieren. Nach zweimaligem Waschen des Pellets mit Ethanollösung (70%, v/v, –20°C) und Lufttrocknen für 5 min wurde das getrocknete Pellet mit 400 μl Tris/EDTA-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) gelöst. Dem Gemisch wurden 10 mg RNase zugesetzt und eine 30-minütige Inkubation bei 37ºC durchgeführt, um die verbleibende RNA zu eliminieren. Eine weitere Extraktion mit C:I (dritte Extraktion) wurde durchgeführt, um Protein aus der DNA-Lösung zu entfernen. Die Gewinnung der oberen Schicht in ein neues steriles Röhrchen mit 2,5 Vol. Ethanol (zweite Fällung) würde dazu beitragen, DNA leicht auszufällen. Nach dem Spinnen der Röhre bei 15000×g für 10 min und zweimaligem Waschen des DNA-Pellets wurde die getrocknete DNA in 200 &mgr;l sterilem, entionisiertem Wasser wieder aufgelöst.

CTAB-Methode

Der Vorgang bei diesem Verfahren war ähnlich dem in SDS-Verfahren 1 beschriebenen, mit Ausnahme des Lysepuffers und der organischen Reagenzien, die zur Ausfällung der DNA verwendet wurden. Diese Methode basierte auf CTAB-Extraktionspuffer (20 g CTAB/l, 1,4 M NaCl, 100 mM Tris/HCl, 20 mM EDTA, pH 8,0) und der oberen wässrigen Phase wurden 0,6 Vol Ethanollösung, die in SDS-Methode 1 verwendet wird.

DP305 und DNeasy Plant Mini-Kit-Methode

Bei zwei kommerziellen Kits, DP305 (TIANGEN, Peking, China) und DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland), wurde DNA aus Zhoudou22 nach Herstellerangaben extrahiert.

SDB-Methode 2

Das DNA-Extraktionsprotokoll wurde in SDS-Methode 1 mit Ausnahme der Lysepufferkomponenten beschrieben. Die Konzentrationen jeder Komponente im SDS-Extraktionspuffer sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Komponenten Zusammensetzung des SDS Lysepuffers (pH 8,0) .
Nummer . SDB (w/v) . NaCl (mM). Tris/HCl (mM). EDTA (mM) .
1 0.5% 250 100 25
2 2% 250 100 25
3 5% 250 100 25
4 2% 0 100 25
5 2% 150 100 25
6 2% 250 100 25
7 2% 500 100 25
8 2% 250 10 25
9 2% 250 50 25
10 2% 250 100 25
11 2% 250 200 25
12 2% 250 100 5
13 2% 250 100 25
14 2% 250 100 50
15 2% 250 100 100
Komponenten Zusammensetzung des SDS Lysepuffers (pH 8,0) .
Nummer . SDB (w/v) . NaCl (mM). Tris/HCl (mM). EDTA (mM) .
1 0.5% 250 100 25
2 2% 250 100 25
3 5% 250 100 25
4 2% 0 100 25
5 2% 150 100 25
6 2% 250 100 25
7 2% 500 100 25
8 2% 250 10 25
9 2% 250 50 25
10 2% 250 100 25
11 2% 250 200 25
12 2% 250 100 5
13 2% 250 100 25
14 2% 250 100 50
15 2% 250 100 100
Organische Reagenzien zur Extraktion und Präzipitation von DNA.
Verfahren . Erste Extraktion. Dritte Extraktion. Erster Niederschlag. Zweiter Niederschlag.
EIN P: C: Ich C: Ich Ethanol Ethanol
B C: Ich C: Ich Ethanol Ethanol
C P: C: Ich / Ethanol Ethanol
D P: C: Ich C: Ich KAc + 95 % Ethanol Ethanol
E P: C: Ich C: Ich Isopropanol Ethanol
F C: Ich C: Ich Ethanol Isopropanol
g C: Ich C: Ich Isopropanol Isopropanol
h C: Ich C: Ich Isopropanol Ethanol
Organische Reagenzien zur Extraktion und Präzipitation von DNA.
Verfahren . Erste Extraktion. Dritte Extraktion. Erster Niederschlag. Zweiter Niederschlag.
EIN P: C: Ich C: Ich Ethanol Ethanol
B C: Ich C: Ich Ethanol Ethanol
C P: C: Ich / Ethanol Ethanol
D P: C: Ich C: Ich KAc + 95 % Ethanol Ethanol
E P: C: Ich C: Ich Isopropanol Ethanol
F C: Ich C: Ich Ethanol Isopropanol
g C: Ich C: Ich Isopropanol Isopropanol
h C: Ich C: Ich Isopropanol Ethanol

SDB-Methode 3

Das DNA-Extraktionsprotokoll wurde in SDS-Methode 1 beschrieben, mit Ausnahme der Sorten mit organischen Lösungsmitteln. Die Verwendung organischer Lösungsmittel ist in Tabelle 2 gezeigt. Das Zugabevolumen an Isopropanol betrug 0,6 Vol. Überstand.

SDS-Methode 4

Es war die optimierte DNA-Extraktionsmethode. Sein Protokoll wurde in SDS Methode 1 mit Ausnahme einiger Modifikationen gezeigt: SDS Lysepuffer (2% SDS (w/v), 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0), erstes Extraktionsreagenz (C: I ), drittes Extraktionsreagenz (C: I), erstes Fällungsreagenz (Isopropanol), zweites Fällungsreagenz (Ethanol).


Reagenzien zur DNA-Isolierung und -Aufreinigung

Wir haben vor kurzem ein Experiment zur Isolierung und Reinigung von DNA aus Bakterienzellen gemacht und so sehr ich es auch versuche, ich verstehe wirklich nicht, was als Ergebnis von welchem ​​Reagenz passiert ist? Ich habe online und in mehreren Texten nachgesehen, aber fast jede Quelle gibt eine andere Antwort.

Was wir verwendet haben (in der Reihenfolge der Verwendung):
TE-Puffer
SDB
Proteinase K
NaCl
CTAB/NaCl-Lösung
Chloroform/Isoamylalkohol 24:1
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1
Isopropanol
Ethanol

SDS lysiert Zellen
Proteinase K inaktiviert Nukleasen
NaCl neutralisiert Ladungen auf DNA
Phenol/Chloroform/Isoamyl trennt sich in Phasen und entfernt 'Gunk'
Isopropanol präzipitiert DNA
Ethanol entfernt Salz

Über den Rest bin ich so verwirrt.

Dies ist eines von vielen verschiedenen Protokollen zur Isolierung genomischer DNA, obwohl Sie uns bezüglich des genauen Protokolls ein wenig Rätselraten lassen! Dieser Verfahrenstyp wird gelegentlich auch für die Verwendung in Plasmid-DNA-Minipreps modifiziert. SDS, ein anionisches Tensid (oft in vielen Reinigungsprodukten wie Haarshampoo enthalten), lysiert die Bakterien. Bei alkalischer Lyse wird Plasmid-DNA-Minipreps SDS oft in Verbindung mit NaOH (z. B. 0,2 N) nach einem Lysozym-Enzymverdau verwendet, und dann wird normalerweise kein Proteinase-K-Schritt durchgeführt. PK wird häufiger bei der Isolierung genomischer DNA (ohne alkalische Lyse) oder sogar nach einem Restriktionsenzymverdau verwendet. Proteinase K wird also Nukleasen (z. B. DNasen/RNasen) insbesondere in Gegenwart von SDS inaktivieren, aber es ist eine Breitspektrum-Protease, die auch Proteine ​​verdaut, um eine vollständige Lyse der Zellen sicherzustellen.

CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) ist ein kationisches Tensid, das die Zellen weiter solubilisiert. Im Allgemeinen ist DNA in NaCl „glücklich“ – die Na+-Ionen neutralisieren die negativ geladenen Phosphate auf der DNA und erleichtern das Zusammenkommen von DNA-Molekülen (die Moleküle sind weniger hydrophil). Eine hohe Konzentration an NaCl ist erforderlich, sonst können sich CTAB-Nukleinsäure-Präzipitate bilden - was Sie hier versuchen, ist den gesamten mit CTAB komplexierten Müll (bakterielle Zellwandtrümmer, denaturierte Proteine, Polysaccharide) zu entfernen und die bakterielle DNA in Lösung zu lassen. Die Chloroform/IAA-Extraktion (mit Mikrofugen) hinterlässt diese Komplexe in einer weißlichen Grenzfläche (Chloroform unten, DNA oben IAA hilft, die Grenzfläche zu stabilisieren). Die DNA wird mit Phenol/Chloroform/IAA „gereinigt“, um verbleibende Komplexe zu entfernen, und wird mit Isopropanol aus dem Überstand präzipitiert (große, chromosomale DNA lässt sich mit diesem unpolaren Alkohol auch ohne Zusatz von zusätzlichem Salz leicht präzipitieren oder bei niedrigen Temperaturen). Das Pellet wird mit EtOH (normalerweise aber nicht immer 70-75%) gewaschen, um verbleibendes Isopropanol und restliche Salze zu entfernen.


Abstrakt

Verschiedene Arten von Zimt sind reich an Polysacchariden und sekundären Metaboliten, die den Prozess der DNA-Extraktion behindern. Qualitativ hochwertige DNA ist die Voraussetzung für jede molekularbiologische Studie. In diesem Artikel berichten wir über eine modifizierte Methode zur qualitativ hochwertigen und quantitativen DNA-Extraktion aus lyophilisierten und nicht lyophilisierten Blattproben. Das berichtete Protokoll unterscheidet sich vom CTAB-Verfahren durch die Zugabe einer höheren Salzkonzentration und Aktivkohle, um die Polysaccharide und Polyphenole zu entfernen. Der breite Nutzen des modifizierten Protokolls wurde durch DNA-Extraktion aus verschiedenen Holzarten und 4 Zimt Spezies. Daher wurde dieses Protokoll auch in verschiedenen Pflanzenarten validiert, die einen hohen Gehalt an Polyphenolen und Polysacchariden enthalten. Die extrahierte DNA zeigte eine perfekte Amplifikation, wenn sie RAPD, Restriktionsverdau und Amplifikation mit DNA-Barcoding-Primern unterzogen wurde. Das DNA-Extraktionsprotokoll ist reproduzierbar und kann für jede molekularbiologische Untersuchung der Pflanzen angewendet werden.


Rohextraktion von DNA

Ziel: Um das Verfahren der DNA-Extraktion mit Haushaltsmaterialien zu verstehen.

Einführung: Wie identifiziert der Tatortermittler den Tatverdächtigen? Wie erkennt der Fischer eine Viruserkrankung, die einen Ausbruch in seinen Teichen verursacht? Wie sagt dein Blut den Leuten, wer deine Eltern sind? Wie entdeckt der Wissenschaftler das Trockenresistenz-Gen in Pflanzen? Diese Antworten können in der Feldforschung der DNA-Technologie gefunden werden.

  1. Extraktion, um die DNA von der Zelle zu trennen. Diese Stufe verwendet normalerweise SDS/CTAB/Triton-X als aktives Detergens und gesättigtes NaCl
  2. Reinigung, um extrahierte DNA von jeglichen Verunreinigungen, Zelltrümmern, Proteinen und RNA zu trennen. Wissenschaftler verwenden hierfür Phenol:Chloroform:Isoamylethanol (PCIA) und
  3. Präzipitation, um die DNA auszufällen, um dünne, transparente oder weiße Stränge zu bilden. In diesem Stadium kann eiskaltes 96%iges Ethanol verwendet werden.
  1. 0,5 Gramm Probe im Sterilmörser zerkleinern und mit der Pufferlösung homogenisieren,
  2. Das Homogenat mit Filterpapier filtrieren und in die sterile Zentrifuge geben.
  3. Mischen Sie das Filtrat mit 5 ml SDS 20% und 5 ml 5 M NaCl mit einem Vortexer.
  4. Zentrifugieren Sie die Suspension, um zelluläre Komponenten von Zelltrümmern zu trennen.
  5. Entfernen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen.

Geben Sie eiskaltes 96%iges Ethanol vorsichtig durch die Seite des Röhrchens in das neue Röhrchen. Auf der Suspensionsoberfläche erscheinen weiße Stränge, wenn Sie die DNA-Extraktion richtig durchführen.


Vergleich der Methoden zur Gesamt-DNA-Extraktion für mikrobiellen Boden in Gemeinschaftsform

Die DNA-Isolierung stellt den grundlegenden und wahrscheinlich wichtigsten Schritt in der Molekularbiologie für mikrobielle Stämme und noch mehr für mikrobielle Gemeinschaftsanalysen dar. Trotz der Entwicklung molekularer Protokolle für die Isolierung von DNA-Mikrobengemeinschaften gibt es immer noch viele Nachteile, die von der Probenzusammensetzung abhängig sind, und selbst die kommerziell erhältlichen genomischen Isolierungskits weisen erhebliche Einschränkungen bei der Gewinnung hoher genomischer DNA-Mengen, insbesondere aus Bodenproben, auf. Unsere Studie zielt darauf ab, ein DNA-Isolationsprotokoll für die gesamte mikrobielle Gemeinschaft aus verschmutzten Bodenproben zu vergleichen und zu optimieren, wobei die Menge und Reinheit der genomischen DNA pro g Boden im Vergleich zu den Zeitanforderungen für jedes Protokoll geschätzt wird, wobei berücksichtigt wird, dass unsere Bodenproben eine hoher Gehalt an Huminsäuren. Wir haben mehrere Protokolle für die Gesamt-DNA-Extraktion auf CTAB-Basis überprüft, darunter ein spezielles Kit für das Soil DNA Isolation Kit NorgenBiotek. Wir schätzten die für jedes Protokoll benötigte Zeit, die Menge der DNA pro Gramm verschmutzten Boden, den Protein- und RNA-Kontaminationsgrad durch spektrophotometrische Analyse, aber auch den Grad der PCR-Amplifikationshemmung. Die effizienteste Methode für unsere Bodenproben mit hohem Huminsäuregehalt, die sich für weitere molekulare Analysen eignet, war die von Sagova et al. (2008) basierendes Protokoll mit mehreren Anpassungen. Dieses Protokoll wird für die molekulare Analyse von mikrobiellen Gemeinschaftsprofilen aus Umweltproben, insbesondere aus verschmutzten Böden, wertvoll sein.


Schau das Video: Plant DNA extraction - CTAB Method (Dezember 2022).