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Gibt es eine Alternative zum x-gal white/blue-Screening zur Überwachung der Beta-Galactosidase-Aktivität von Pseudomonas aeruginosa auf Agarplatten?

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Ich möchte einen Bildschirm anzeigen pseudomonas aeruginosa Mutantenbibliothek, die a . trägt lacZ Transkriptionsfusion für dysregulierende Mutationen. Ich habe es auf xgal-Platten versucht, aber die Anhäufung der blauen Farbe macht das Screening schwierig. Ich habe gesehen, dass Leute Macconkey- oder Endo-Agar-Medien für das Zwei-Hybrid-Beta-Gal-Screening verwenden E coli zum Beispiel. Ich frage mich, ob es etwas wäre, es auch mit Pseudomonas zu versuchen (die nur die lacZ gen, also keine Permease etc… ) und ob es hier schon mal jemand probiert hat ? Oder ob andere Beta-Gal-Substrate für diese Anwendung verwendet werden könnten? danke Julian


Ich denke, Ihr Problem wird noch schlimmer, wenn Sie MacConkey- oder Endo-Platten verwenden. Sie können auf diesen Platten Unterschiede zwischen verschiedenen Bakterienarten / Expression bestimmter Enzyme sehen, aber die Färbung / Entfärbung basiert auf löslichen Verbindungen, die leicht diffundieren.

Hydrolyse von xgal erzeugt eine unlöslich Produkt, das mehr oder weniger in Ihrer Kolonie bleibt. Natürlich ist es nicht perfekt und nach einiger Zeit hat man einen komplett blauen Teller, aber das würde mit einer löslichen Verbindung viel schneller passieren.

Versuchen Sie, Ihre Bedingungen so anzupassen, dass Sie sich die Platte ansehen können, bevor sie vollständig blau ist. Dinge, die Sie versuchen könnten: Schauen Sie früher nach, plattieren Sie sie etwas verdünnter, damit die Kolonien weiter auseinander liegen, verwenden Sie weniger Xgal, damit Ihre endgültige Färbung weniger intensiv ist, suchen Sie nach Papieren, die Xgal zum Screening verwenden, und stehlen Sie ihre Tricks.


Aseptische Labortechniken: Beschichtungsmethoden

Mikroorganismen sind auf allen unbelebten Oberflächen vorhanden und bilden im Labor allgegenwärtige Quellen für mögliche Kontaminationen. Der experimentelle Erfolg hängt von der Fähigkeit eines Wissenschaftlers ab, Arbeitsflächen und -geräte zu sterilisieren sowie den Kontakt von sterilen Instrumenten und Lösungen mit nicht sterilen Oberflächen zu verhindern. Hier stellen wir die Schritte für verschiedene Plattierungsmethoden vor, die routinemäßig im Labor verwendet werden, um Mikroorganismen wie Bakterien und Phagen zu isolieren, zu vermehren oder zu zählen. Alle fünf Methoden beinhalten aseptische Techniken oder Verfahren, die die Sterilität des experimentellen Materials erhalten. Die beschriebenen Verfahren umfassen (1) Streak-Plating-Bakterienkulturen zum Isolieren einzelner Kolonien, (2) Pour-Plating und (3) Spread-Plating zum Auszählen lebensfähiger Bakterienkolonien, (4) Weichagar-Overlays zum Isolieren von Phagen und Auszählen von Plaques und ( 5) Replica-Plating, um Zellen in einem identischen räumlichen Muster von einer Platte auf eine andere zu übertragen. Diese Verfahren können am Labortisch durchgeführt werden, sofern es sich um nicht pathogene Stämme von Mikroorganismen handelt (Biosafety Level 1, BSL-1). Wenn mit BSL-2-Organismen gearbeitet wird, müssen diese Manipulationen in einer Biosicherheitswerkbank erfolgen. Konsultieren Sie die aktuellste Ausgabe der Biosicherheit in mikrobiologischen und biomedizinischen Labors (BMBL) sowie Produktsicherheitsdokumente (MSDS) für infektiöse Stoffe zur Bestimmung der Biohazard-Einstufung sowie der Sicherheitsvorkehrungen und Eindämmungseinrichtungen, die für den betreffenden Mikroorganismus erforderlich sind. Bakterienstämme und Phagenbestände können von Forschern, Unternehmen und Sammlungen von bestimmten Organisationen wie dem Amerikanische Art Kultur Sammlung (ATCC). Es wird empfohlen, beim Erlernen der verschiedenen Plattierungsmethoden nicht-pathogene Stämme zu verwenden. Durch Befolgen der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sollten die Schüler in der Lage sein: ● Plattierungsverfahren ohne Kontamination des Mediums durchzuführen. ● Isolieren Sie einzelne Bakterienkolonien durch die Streak-Plating-Methode. ● Verwenden Sie Gießplattierungs- und Spread-Plating-Methoden, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen. ● Führen Sie Weichagarüberlagerungen durch, wenn Sie mit Phagen arbeiten. ● Übertragen Sie Bakterienzellen von einer Platte auf eine andere mit dem Replika-Plating-Verfahren. ● Wählen Sie bei einer experimentellen Aufgabe die geeignete Beschichtungsmethode.


Einführung

Die Burkholderia cepacia Komplex (Bcc) umfasst genetisch eng verwandte Bakterien, die derzeit in 17 gültig benannte Arten verteilt sind (Vandamme und Dawyndt 2011 ). Bcc-Arten tragen große Multireplikon-Genome, die ihnen ein bemerkenswertes Potenzial verleihen, sich an verschiedene ökologische Nischen anzupassen. In der Tat, seit der ersten ökologischen Beschreibung von B. cepacia als Zwiebelpathogen wurden Bcc-Stämme aus Böden, Gewässern, Rhizosphären, immungeschwächten Patienten und Industrieprodukten isoliert (Burkholder 1950 Mahenthiralingam et al. 2005 Vial et al. 2011 ). Zwei Hauptgründe, die den Menschen besorgniserregend sind, sind, dass Bcc-Spezies ein effizientes Pflanzenwachstum fördern können, Rhizobakterien (PGPR), aber auch eine erhebliche Bedrohung für das Leben von immungeschwächten Personen darstellen, wie z. B. von Mukoviszidose (CF) (Govan et al . 2000). Enorme Fortschritte bei Identifizierungstechniken und Taxonomie haben gezeigt, dass Bcc-Mitglieder weit verbreitet, aber heterogen nach Nischen verteilt sind, wobei einige Arten ein besonders hohes Virulenzpotenzial gegenüber CF-Patienten aufweisen, während andere als effiziente PGPR fungieren (Mahenthiralingam et al. 2008). Dennoch wurden fast alle Bcc-Arten sowohl aus Umwelt- als auch aus klinischen Quellen isoliert, was darauf hindeutet, dass die Anpassung an eine bestimmte Nische nicht streng an die Zugehörigkeit zu einer bestimmten Art gebunden ist (Mahenthiralingam et al. 2008 Vial et al. 2011 ). Da die Umwelt anscheinend ein Reservoir für lebensbedrohliche Bakterien ist, wird die kommerzielle Verwendung von Bcc-Stämmen daher nicht empfohlen und tatsächlich unter ein Moratorium der US-Umweltschutzbehörde (EPA) gestellt (Chiarini et al. 2006).

Quorum Sensing (QS) ist ein bakterielles Zell-zu-Zell-Kommunikationssystem, das auf der Freisetzung von Signalmolekülen in der Mikroumgebung basiert, wenn die Bakterienpopulation wächst, die Konzentration der Moleküle steigt und eine Schwelle erreicht wird, die die Regulierung von Zielgenen auslöst (Williams 2007 .). ). Das erste QS-System wurde in . entdeckt Vibrio Fischeri und implizierte die LuxI-Synthase, die für die Produktion von an . verantwortlich ist n-Acylhomoserinlacton (AHL) als Signalmolekül, das seinen verwandten Transkriptionsregulator LuxR bindet (Engebrecht und Silverman 1984). Ähnliche QS-Systeme vom LuxRI-Typ, die auf AHL-Molekülen beruhen, wurden seitdem in den meisten gramnegativen Bakterien identifiziert. Bei Bcc-Spezies existiert ein LuxRI-Typ-System namens CepRI (Lewenza et al. 1999). CepRI verlässt sich auf n-Octanoylhomoserinlacton (C8-HSL) und n-Hexanoylhomoserinlacton (C6-HSL) als Signalmoleküle, wobei ersteres im Allgemeinen am häufigsten vorkommt (Lutter et al. 2001). Es wurde beschrieben, dass einige Phänotypen, wie die Produktion von Siderophoren, proteolytische Aktivitäten und die Bildung von Biofilmen, bei Bcc-Bakterien unter QS-Kontrolle gestellt werden (Eberl 2006). Da QS typischerweise an der Regulation von Virulenzfaktoren beteiligt ist, konzentrierten sich die meisten Studien hauptsächlich auf pathogene Bakterien (Sokol et al. 2007). QS könnte jedoch allgemeiner als Mittel angesehen werden, mit dem Bakterien ihre Mikroumgebung wahrnehmen und mit ihr interagieren (Williams 2007 Mellbye und Schuster 2011). Jüngste Studien mit nicht-pathogenen Burkholderia Stämme haben gezeigt, dass QS für bakterielle Beziehungen innerhalb der Rhizosphäre, für die Interaktion mit Pflanzen sowie in polymikrobiellen Gemeinschaften wichtig ist (Chan et al. 2011 Suarez-Moreno et al. 2012 ).

Der Bcc Burkholderia ambifaria Die Art wird meist aus Böden isoliert und ist besonders in der Rhizosphäre mehrerer Kulturpflanzen vorherrschend (Coenye et al. 2001 Coenye und Vandamme 2003 ). Der Typ Stamm B. ambifaria LMG19182 T (oder AMMD) wurde aus der gesunden Erbsenrhizosphäre isoliert und danach als Biokontrollmittel verwendet (Coenye et al. 2001 Chiarini et al. 2006). Diese Spezies wird selten von CF-Patienten isoliert, wo sie vorübergehende und nicht übertragbare Infektionen verursacht (Chiarini et al. 2006 Mahenthiralingam et al. 2008 ). Dennoch erwies sich der klinische Stamm AU0212 als klonal zu AMMD, was darauf hindeutet, dass die Umgebung ein Reservoir für klinische Stämme darstellt (Payne et al. 2005 ). Das QS-System von B. ambifaria wurde nicht im Detail untersucht. Es wurde dennoch in einige Studien aufgenommen, in denen Bcc-Mitglieder verglichen wurden, und zeigten, dass es auch ein CepRI-System besitzt, das auf C . beruht6-HSL und C8-HSL-Signalmoleküle (Lutter et al. 2001 Zhou et al. 2003). Proteolytische Aktivität, Biofilmbildung und Virulenz gegenüber Nematoden sind QS-kontrollierte Phänotypen, scheinen aber stammabhängig zu sein (Wopperer et al. 2006). Interessanterweise ist die Produktion von antimykotischen Molekülen auch bei dieser Bcc-Spezies QS-kontrolliert (Zhou et al. 2003 Schmidt et al. 2009 ). Wir haben eine phänotypische Studie und ein Ganzgenom-Transposon-Mutagenese-Screening durchgeführt, um QS-kontrollierte Gene und Funktionen eines klinischen B. ambifaria Stamm, über den wir zuvor berichtet haben (Vial et al. 2008, 2010). Diese Studie wird zum Verständnis der durch QS regulierten Funktionen bei einer schwach virulenten Bcc-Spezies mit großen biotechnologischen Eigenschaften beitragen.


Einführung

Die Aneignung und Verbreitung von Antibiotikaresistenzen bei pathogenen Bakterien stellt eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, insbesondere angesichts des Mangels an neuen Antibiotika in der Entwicklung [1]. Folglich besteht ein Bedarf an neuen antimikrobiellen Mitteln, die als Alternativen zu herkömmlichen Antibiotika eingesetzt werden können. Als potenzielle Alternativen werden antimikrobielle Peptide und Bakteriozine in Betracht gezogen [2, 3]. Bacteriocine sind ribosomal synthetisierte Peptide mit antimikrobieller Aktivität, die von vielen Bakterienarten produziert werden. In den meisten Fällen hemmen Bakteriocine das Wachstum eng verwandter Bakterien, obwohl einige ein breites Hemmspektrum gegen Lebensmittelverderb und pathogene Bakterien aufweisen [4]. Die überwiegende Mehrheit dieser Moleküle wird zunächst intrazellulär als größere inaktive Vorstufen synthetisiert, und viele von ihnen werden weiter verschiedenen enzymatischen Modifikationen wie Zyklisierung, Glykosylierung und Einführung von Lanthionin und Beta-Methyllanthionin unterzogen [5]. Bakteriocine lassen sich nach dem neuesten Klassifikationsschema in drei Hauptgruppen einteilen [2, 6]. Klasse I werden durch antimikrobielle Peptide repräsentiert, die enzymatisch modifiziert wurden Klasse II, die nicht modifizierte oder minimal modifizierte Peptide umfasst, die weiter in mehrere Untergruppen unterteilt sind Klasse III, die die großen, unmodifizierten hitzeempfindlichen antimikrobiellen Proteine ​​mit bakteriolytischen oder anderen Mechanismen enthalten Handlungs.

Bakterien der Gattung Bazillus und verwandte Gattungen produzieren viele Substanzen mit antimikrobieller Aktivität, darunter nicht-ribosomal synthetisierte Peptide und Lipopeptide [7–9], Polyketidverbindungen [10] und Bakteriocine. In der Tat, Bazillus Stämme produzieren Bakteriocine aus allen drei Klassen [11]. Vertreter der Klasse I sind Subtilin, Ericin A, Ericin S, Mersacidin, Paenibacillin, Sublancin 168 [11, 12], Haloduracin, Lichenicidin und Subtilosin A [13–15]. Bakteriocine der Klasse II gefunden in Bazillus Stämme umfassen Koagulin, produziert von Bacillus coagulans [16], Lichenocin 50.2, hergestellt von B. licheniformis VPS50.2 [17] und andere [18]. In Bazillus, Klasse III wird durch große Proteine ​​mit enzymatischer Aktivität repräsentiert, wie die Megacin-Familie der Bakteriocine, die von Stämmen von Bacillus megaterium [18–20].

Antagonistische Verbindungen, die von Bakterien der Gattung . produziert werden Brevibazillen wurden in den letzten Jahren ebenfalls untersucht [21] und Stämme von Brevibacillus laterosporus sind bekannte Hersteller von antibakteriellen und antimykotischen Wirkstoffen [22–24]. Sie gelten aufgrund ihrer biopestiziden Eigenschaften gegen Insekten und Nematoden als wichtiges Werkzeug zur biologischen Bekämpfung [25, 26]. Die kürzlich charakterisierte Br. Laterosporus OSY-I1 produziert Brevibacillin, ein 1583 Da antimikrobielles Lipopeptid mit einer linearen Struktur mit 13 Aminosäuren und einem C6 Fettsäure am N-Terminus [27]. Brevibacillin zeigt eine starke antimikrobielle Aktivität gegen einige pathogene und lebensmittelverderbliche grampositive Bakterien, insbesondere resistent gegen Methicillin Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes und Bacillus cereus. Der Wirkungsmechanismus dieses Moleküls beruht höchstwahrscheinlich auf seiner amphiphilen Natur und der Fähigkeit der kationischen Aminosäuren, mit den negativ geladenen Phospholipiden der Zellmembran zu interagieren, wodurch die Membran zerstört und depolarisiert wird [27]. Ein ähnlicher Mechanismus wurde im Fall von Paenibacterin beobachtet, einem antimikrobiellen Breitspektrum-Lipopeptid, das von Paenibacillus thiaminoolyticus [28]. Außerdem wurde festgestellt, dass das marine Bakterienisolat Brevibacillus laterosporus PNG-276 zeigte ein antibiotisches Breitbandspektrum (produziert Polyketide, die Basiliskamide A und B und nichtribosomale Peptide: Loloatine A-D und Bogorole A-E) gegen die Humanpathogene MRSA, VRE, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, und Escherichia coli [29].

Aus der Bakteriocin-Perspektive ist Laterosporulin ein Beispiel für ein Bakteriocin der Klasse IId, das vom Stamm GI-9 produziert wird, vorläufig identifiziert als Br. Laterosporus [30]. Laterosporulin ist sowohl gegen Gram-positive als auch gegen Gram-negative Bakterien aktiv und erwies sich als resistent gegen eine Reihe von proteolytischen Enzymen. Strukturstudien ergaben, dass das Peptid aus einem verdrillten β-Faltblatt besteht und drei Disulfidbrücken enthält [31]. Laterosporulin ist relativ reich an Cystein und polaren Aminosäuren, was für Bakteriocine im Allgemeinen untypisch ist, während seine Struktur Ähnlichkeiten mit Säugetier-Defensinen aufwies. In jüngerer Zeit wurde Laterosporulin 10, produziert vom Stamm Brevibazillen sp. SKDU10 wurde charakterisiert [32] und zeigt, obwohl es als ähnlich angesehen wird, nur 57,6% Identität mit Laterosporulin. Darüber hinaus hat dieses neuartige Bakteriocin ein anderes antimikrobielles Spektrum als Laterosporulin, da die Aktivität auf grampositive Bakterien beschränkt ist. Laterosporulin 10 hat sich aber auch als vielversprechendes neues Anti-Krebs-Molekül erwiesen, das eine zytotoxische Wirkung auf Krebszellen zeigt [33].

Eine Anzahl von Br. Laterosporus Stämme wurden sequenziert und ihre Genome in der Genbank hinterlegt. Dazu gehören LMG 15441 (unter der Zugangsnummer AFRV00000000, [34]), GI-9 (unter den Zugangsnummern CAGD01000001 bis CAGD01000061, [35]), B9 (unter den Zugangsnummern CP011074-CP011076, [36]), Lak 1210 (unter den Zugangsnummern) Nummer NDIP00000000, [37]), OSY-I1 (unter Zugangsnummer NOLX00000000, [38]), DSM25 (Zugangsnummer ARFS00000000), ZQ2, UBA5783, DSM25, PE36 (Zugangsnummer NZ_AXBT00000000.1) und Uniss_18.

Die aktuelle Studie konzentrierte sich auf die Isolierung neuer kultivierbarer Bakterien, die natürliche antimikrobielle Moleküle produzieren, die unabhängig von ihrer Taxonomie gegen multiresistente Krankheitserreger von Mensch, Tier und Pflanze wirksam sind. Dieser Ansatz führte zur Charakterisierung und Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von drei neuen isolierten Stämmen von Br. Laterosporus aus Silage, um ihr Potenzial als biologische Bekämpfungsmittel zu bestimmen.


Ergebnisse

Auswahl der AHL-abbauenden Bakterien

Die in dieser Arbeit untersuchten 450 Stämme wurden aus einer Fischbruterei in Salobre༚ (Granada, Spanien) isoliert und aufgrund ihrer unterschiedlichen Koloniemorphologie ausgewählt. Wir führten ein erstes Screening der AHL-Abbauaktivität der Isolate in 96-Well-Mikrotiterplatten in Gegenwart von kommerziellen AHLs mit unterschiedlich langen Fettsäureketten (C6-HSL und C10-HSL siehe Materialien und Methoden). Die im Medium verbliebenen AHLs wurden mit den Biosensor-Stämmen nachgewiesen C. violaceum CV026 (Ergänzende Abbildung S1), das in Gegenwart von AHLs mit kurzen und mittleren Fettsäureketten Violacein produziert und C. violaceum VIR07 (Ergänzende Abbildung S1), das in Gegenwart von C . ein Violacein-Pigment bildet10-HSL. Wir fanden, dass Überstände, die mit 112 Stämmen assoziiert waren, die beiden verwendeten Biosensorstämme nicht aktivierten, was bedeutet, dass sie sowohl C6-HSL und C10-HSL. Diese Experimente wurden dreifach durchgeführt und wir erhielten die gleichen Ergebnisse. Alle Experimente wurden bei pH 7 durchgeführt, um die Lactonolyse der AHLs (die bei basischem pH auftritt) und die Inaktivierung von Biosensoren zu verhindern, was zu falsch positiven Ergebnissen führte (Yates et al., 2002).

Als zweites Screening wurde dann ein Well-Diffusions-Agarplatten-Assay der oben genannten 112 ausgewählten Bakterien in Gegenwart von sieben kommerziellen AHLs (C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, 3-oxo-C12-HSL und 3-OH-C10-HSL). Das Ergebnis war die Auswahl von 12 Stämmen mit der Fähigkeit, eine Vielzahl von AHLs abzubauen. Wie gezeigt in Tabelle ​ Tabelle1 1 die 12 Stämme bauen mittel- und langkettige AHLs mehr oder weniger effizient ab, einschließlich unsubstituierter, Oxo- und Hydroxyl-substituierter AHLs. Trotzdem zeigt keiner von ihnen QQ-Aktivität gegen C4-HSL.

Tabelle 1

Quorum Quenching (QQ) Aktivität der ausgewählten marinen Bakterien und taxonomische Identifizierung.

BelastungC4-HSLC6-HSLC8-HSLC10-HSLC12-HSL3-oxo-C12-HSL3-OH-C10-HSLTaxonomische Identifizierung% Identität
PQQ-1-+++++++++-Pseudoalteromonas paragorgicola99.78%
PQQ-5-++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis99.7%
PQQ-8-+++++++++-Alteromonas stellipolaris99.59%
PQQ-18-+++++++++-Pseudoalteromonas carrageenovora99.7%
PQQ-20-++++++++++-Pseudoalteromonas atlántica99.44%
PQQ-31-++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis100%
PQQ-33-++++++++++-Alteromonas genovensis99.6%
PQQ-37-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-39-+++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis99.48%
PQQ-42-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-44-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-84-+++++++++-Pseudoalteromonas differenta99.7%

Charakterisierung der AHL-Abbauaktivität durch HPLC-MS

Wir haben die HPLC-MS-Analyse angewendet, um den Abbau von AHLs durch die ausgewählten AHL-abbauenden Stämme weiter zu bestätigen. Dazu haben wir uns für eine mittel- und eine langkettige AHL (C6-HSL und C10-HSL). Die Ergebnisse zeigten, dass die 12 ausgewählten Stämme die Konzentration beider AHL-Typen signifikant reduzieren konnten, obwohl diese Kapazität gegenüber C . höher war10-HSL (Daten nicht gezeigt). Basierend auf diesen Ergebnissen zusammen mit denen aus den Well-Diffusions-Agar-Platten-Assays (Tabelle ​ Tabelle1 1 ) wurde der Stamm PQQ-42 für nachfolgende Studien ausgewählt.Es degradierte alle getesteten AHLs und zeigte in allen Fällen eine Aktivität von nahezu 100 % (Abbildung ​ Abbildung1 1 ).

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie plus Massenspektrometrie-Analyse (HPLC-MS) Messungen von C6-HSL und C10-HSL in den zellfreien Kulturmedien der n-Acylhomoserinlactone (AHL)-abbauender Stamm PQQ-42 nach 24 h. Als Negativkontrolle wurde zellfreies MB-Medium verwendet. Die anfängliche AHL-Konzentration betrug 10 μM. Fehlerbalken repräsentieren eine Standardabweichung.

Taxonomische Identifizierung ausgewählter Stämme

Um die 12 AHL-abbauenden Bakterien zu identifizieren, haben wir deren 16S rRNA-Gensequenzen bestimmt. Die Sequenzen weisen hohe Homologien zu denen einiger Arten der Gattungen auf Alteromonas (fünf Stämme) und Pseudoalteromonas (sieben Stämme) (Tabelle ​ Tabelle1 1 ) im Vergleich zu 16S-rRNA-Referenzgensequenzen, die aus den GenBank- und EMBL-Datenbanken unter Verwendung der BLAST-Suche und des EzTaxon-e EzBioCloud-Programms erhalten wurden.

Stamm PQQ-42 baut AHL-Extrakte von pathogenen ab Vibrio spp.

Um festzustellen, ob der Stamm PQQ-42 verwendet werden könnte in vivo Um die QS-Systeme anderer Bakterien zu stören, haben wir zuerst ihre Fähigkeit untersucht, AHLs abzubauen, die von mit Aquakulturen assoziierten pathogenen . produziert werden Vibrio Stämme in vitro. Zu diesem Zweck haben wir die QQ-Aktivität des Stamms PQQ-42 gegen Rohextrakte der vier pathogenen Stämme untersucht V. anguillarum ATCC 19264 T , V. nigripulchritudo CIP 103195 T , V. metschnikovii NCTC 8483 T , und V. mediterranei VibC-Oc-097. Die verbleibenden Mengen an AHLs wurden durch Diffusions-Agar-Platten-Assays getestet (Abbildung ​ Abbildung2 2 ) und dann durch TLC analysiert, was die QQ-Aktivität bestätigte (Daten nicht gezeigt). Als Biosensor-Stämme haben wir verwendet A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) zum Nachweis mittel- und langkettiger AHLs und C. violaceum CV026, das in Gegenwart von kurz- und mittelkettigen AHLs aktiviert wird (Daten nicht gezeigt). Wir konnten nicht in allen getesteten AHL-Molekülen nachweisen Vibrio Rohextrakte.

Abbauende Aktivität des Stamms PQQ-42 von AHLs, die von pathogenen Vibrio spp. visualisiert auf einem Agarplatten-Assay mit dem Biosensor-Stamm Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4). Zellfreies MB-Medium hinzugefügt mit Vibrio mediterranei VibC-Oc-097 AHL-Extrakte (Kontrolle EIN). Kultur des Stamms PQQ-42 hinzugefügt mit V. mediterranei VibC-Oc-097 AHL-Extrakte (B). Zellfreies MB-Medium hinzugefügt mit V. metschnikovii NCTC 8483 T AHL-Extrakte (Kontrolle C). Kultur des Stamms PQQ-42 hinzugefügt mit V. metschnikovii NCTC 8483 T AHL-Extrakte (D). Maßstabsleiste, 1 cm.

Art und Ort der AHL-Degradationsaktivität in PQQ-42

Um festzustellen, ob die QQ-Aktivität auf ein Enzym vom Lactonase-Typ zurückzuführen ist, haben wir die Überstände der Kulturen des Stamms PQQ-42 nach Inkubation mit den verschiedenen getesteten AHLs (C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, 3-oxo-C12-HSL und 3-OH-C10-HSL). Diese Ansäuerung ermöglicht es dem Lactonring, sich selbst umzustrukturieren, falls er zuvor durch eine Lactonase geöffnet wurde. Die Wiederfindung der AHL-Konzentration nach Ansäuern der Kulturen war im Vergleich zur Negativkontrolle (MB mit der gleichen Menge an AHLs hinzugefügt und unter den gleichen Bedingungen angesäuert) unbedeutend Ergänzende Abbildung S2). Dies weist darauf hin, dass die Abbauaktivität des Stamms PQQ-42 auf die Aktivität eines Enzyms zurückzuführen sein kann, das sich von einer Lactonase unterscheidet.

Um den zellulären Ort des Enzyms zu bestimmen, wurden Überstand und CCE aus den Kulturen des Stamms PQQ-42 gewonnen und mit ihnen wurden AHL-Abbauassays in Gegenwart von C . durchgeführt6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, 3-oxo-C12-HSL und 3-OH-C10-HSL. Die Proteinkonzentration sowohl im Überstand als auch im CCE wurde zuvor auf 35 μg ml -1 eingestellt. QQ-Aktivität des ausgewählten Stamms wurde in allen Fällen im CCE gefunden, jedoch wurde keine Aktivität in den zellfreien Kulturmedien gefunden (Ergänzende Abbildung S3).

Stamm PQQ-42 baut AHLs ab und reduziert die Proteaseaktivität und Motilität von Vibrio Arten in Co-Kultur

Um Co-Kultur-Experimente durchzuführen, haben wir zunächst untersucht, ob der ausgewählte AHL-abbauende Stamm PQQ-42 das Wachstum der vier pathogenen Stämme stört V. anguillarum ATCC 19264 T , V. nigripulchritudo CIP 103195 T , V. metschnikovii NCTC 8483 T , und V. mediterranei VibC-Oc-097 durch ein Antagonismus-Experiment (siehe Materialien und Methoden). Unsere Ergebnisse zeigen, dass PQQ-42 keinen negativen Einfluss auf das Wachstum eines der Vibrio getestete Stämme (Daten nicht gezeigt). Daher wurde PQQ-42 in SFSWYE gezüchtet, um Co-Kulturexperimente mit jedem der vier pathogenen durchzuführen Vibrio Dehnungen in sechs verschiedenen Verhältnissen (siehe Materialien und Methoden). Nach 24 h Inkubation wurden die AHLs aus den Kokulturen extrahiert und mit dem Biosensor überprüft A. tumefaciens NTL4. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn 10 2 KBE ml -1 einer Übernachtkultur eines der Vibrio getestete Stämme wurden zu einer Übernachtkultur von 10 5 CFU ml –1 PQQ-42 gegeben. In jedem Cokultur-Experiment wurden keine AHLs nachgewiesen. Dieses Verhältnis wurde während der Co-Kulturexperimente beibehalten, wie durch Plattenzählungen in TCBS bestätigt wurde (wobei Vibrio produziert gelb gefärbte Kolonien) und MA (wobei Vibrio produziert glatte weiße Kolonien und PQQ-42 produziert konkave weiße Kolonien).

Die Co-Kulturen in diesem Verhältnis wurden auch verwendet, um die Wirkung des AHL-Abbaus auf die Virulenzfaktoren zu bewerten, die von den vier pathogenen Vibrio Stämme. Durch die Verwendung verschiedener Assays (siehe Materialien und Methoden) fanden wir, dass unterschiedliche Phänotypen der Vibrio Stämme waren unter unseren Testbedingungen betroffen (Tabelle ​ Tabelle2 2 ), wie Proteaseaktivität und Schwimmmotilität von V. mediterranei VibC-Oc-097 (Ergänzende Abbildung S4).

Tabelle 2

Phänotypen von Vibrio Stämme nach Co-Kultur mit dem AHL-abbauenden Stamm PQQ-42.

PhänotypVibrio mediterraneiVibrio mediterranei + PQQ-42Vibrio anguillarumVibrio anguillarum + PQQ-42Vibrio nigripulchtriutdoVibrio nigripulchritudo + PQQ-42Vibrio MetschnikoviiVibrio Metschnikovii + PQQ-42
AHLs++-++-++-++-
Beweglichkeit++++++++++++
Hämolyse+++++++++++++++
Protease+++++++--+++
Amylase--+++--+-
DNAse+++++++++++++
Chitinase+-++++++-
Lipase (Tween 20)+++++++++++++
Lipase (Tween 80)++++++++++++
Lipase (Tributyrin)--------
Siderophoren--------
Biofilm++++++++++++++++

Stamm PQQ-42 reduziert die Virulenz von Vibrio mediterranei auf der Koralle Oculina patagonica

In vivo Es wurden Assays an Kolonien der Skleraktinkorallen durchgeführt O. patagonica unter Verwendung des PQQ-42-Stammes. Korallen behandelt mit Stamm PQQ-42 und V. mediterranei VibC-Oc-097 zeigte weniger Gewebeschäden als diejenigen, die mit dem Vibrio allein belasten (Abbildung ​ Abbildung3A 3A ), wie sich in den Chlorophyll-a-Gehalten im Korallengewebe widerspiegelt (Abbildung ​ Abbildung3B 3B ). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass der Stamm PQQ-42 die Pathogenität von V. mediterranei VibC-Oc-097 auf der Koralle O. patagonica zeigt einen geringeren Grad an Gewebeschädigung (29,25 ± 14,63 %) in seiner Anwesenheit im Vergleich zu einer Infektion der Koralle mit V. mediterranei VibC-Oc-097 allein (77,53 ± 13,22%). Darüber hinaus waren die Chlorophyll-a-Werte in Kontrollkorallen und in Korallen, die mit dem Stamm PQQ-42 behandelt wurden, ähnlich (Abbildung ​ Abbildung3B 3B ), die gezeigt hat, dass dieses Bakterium keine Schäden an O. patagonica (Abbildung ​ Abbildung3A 3A ).

Oculina patagonica Korallenkolonien nach 10-tägiger Behandlung, die das unterschiedliche Ausmaß der Bleichung je nach hinzugefügtem Bakterium zeigen [1: Zellfreies MB-Medium (Kontrolle), 2: PQQ-42, 3: PQQ-42+V. mediterranei VibC-Oc-097, 4: V. mediterranei VibC-Oc-097]. Maßstabsleiste, 1 cm (EIN). Chlorophyllspiegel a (B) und Anzahl der Vibrationen (KBE g -1 C) im Gewebe von O. patagonica nach 5 und 10 Tagen Behandlung. Fehlerbalken repräsentieren eine Standardabweichung. Gruppen definiert durch post hoc SNK-Test nach ANOVA (P-Wert < 0,05) wurden durchgeführt und werden durch Zahlen angezeigt.

In Bezug auf die Anzahl der KBE von Vibrio im Wasser (Ergänzende Abbildung S5) und im Korallengewebe (Abbildung ​ Abbildung3C 3C ), können wir sehen, dass die Zugabe des Stamms PQQ-42 das Wachstum des pathogenen Stamms nicht beeinflusste.


Abstrakt

CsrA/RsmA-Homologe sind eine umfangreiche Familie von Ribonukleinsäure (RNA)-bindenden Proteinen, die als globale posttranskriptionelle Regulatoren fungieren und wichtige zelluläre Prozesse wie Sekundärmetabolismus, Motilität, Biofilmbildung und die Produktion und Sekretion von Virulenzfaktoren in verschiedenen Bakterienarten kontrollieren . Während die direkte Boten-RNA-Bindung durch CsrA/RsmA für einige Gene detailliert untersucht wurde, wird erwartet, dass es zahlreiche zusätzliche, noch unentdeckte direkte Ziele gibt, die ihre globale Regulation vermitteln. Um die Entdeckung dieser Targets zu unterstützen, schlagen wir einen sequenzbasierten Ansatz zur Vorhersage von Genen vor, die direkt von diesen Regulatoren reguliert werden. In dieser Arbeit entwickeln wir einen Computercode (CSRA_TARGET), der diesen Ansatz implementiert, der zu Vorhersagen für mehrere neue Targets in Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa. Die vorhergesagten Ziele in anderen Bakterien, insbesondere Salmonella enterica Serovar Typhimurium, Pectobacterium carotovorum und Legionella pneumophila, umfassen auch globale Regulatoren, die die Virulenz dieser Krankheitserreger kontrollieren und die komplizierten indirekten regulatorischen Rollen für CsrA/RsmA entwirren. Wir haben vier vorhergesagte RsmA-Ziele experimentell validiert in P. aeruginosa. Der in dieser Arbeit entwickelte sequenzbasierte Ansatz kann daher zu mehreren überprüfbaren Vorhersagen für direkte Ziele von CsrA-Homologen führen, wodurch die Bemühungen zur Aufklärung der globalen Regulation durch diese wichtige Proteinfamilie ergänzt und beschleunigt werden.


Funktionsscreening

Es ist die Fähigkeit, exprimierte Gene in einer metagenomischen Bibliothek nachzuweisen, zu isolieren und zu charakterisieren, die den Erfolg jeder funktionsbasierten metagenomischen Bewertung bestimmt. Eine breite Palette von Screening-Methoden kann verwendet werden (zusammengefasst in Abb. 1). Darunter werden drei allgemeine Erkennungsstrategien unterschieden (Simon und Daniel 2009):

Phänotypische Insert-Erkennung (PID), bei der die Expression eines bestimmten Merkmals verwendet wird, um positive Klone zu identifizieren

Modulated Detection (MD), eine Strategie, die auf der Produktion eines Genprodukts beruht, das für das Wachstum unter selektiven Bedingungen notwendig ist

Substratinduktion, eine Strategie, die auf der induzierten Expression klonierter Gene über ein spezifisches Substrat basiert

Obwohl zwischen diesen drei Erkennungsstrategien unterschieden wird, wäre eine Einteilung in separate Gruppen falsch. Häufig wird eine Kombination davon verwendet, um das Screening durchzuführen und zu optimieren. Beispielsweise kann der phänotypische Nachweis durch ein GFP-Reportergen mit einer substratinduzierten Expression des Insert-Gens kombiniert werden (Uchiyama et al. 2005).

PID ist der am häufigsten verwendete Ansatz für das funktionelle Screening von metagenomischen Bibliotheken. Der Screen basiert auf dem Nachweis spezifischer phänotypischer Merkmale. Die Intensität (der Grad) der Genexpression ist hier ein wichtiges Thema, da schwache Expressionssignale bei Hochdurchsatz-Screenings leicht übersehen werden können. Eine mögliche Hilfestellung bieten mikrofluidische Ansätze mit Nanoliter-Volumina. Diese können die Sensitivität des Assays erhöhen, da weniger Genprodukt benötigt wird, um einen nachweisbaren Phänotyp zu erhalten (Taupp et al. 2011).

Spezifische phänotypische Merkmale können auf verschiedene Weise nachgewiesen werden. Der erste Weg basiert auf der direkten Expression, beispielsweise durch den Nachweis von Pigmentierung oder Koloniemorphologie (Brady 2007), die beide direkt aus dem exprimierten inserierten Gen resultieren können (Craig et al. 2010 LeClir et al. 2007). Ein anderer Weg ist die (indirekte) Reaktion oder Wechselwirkung einer zugesetzten Substanz mit dem exprimierten Genprodukt oder einem Produkt, das eine Folge dieser Expression ist. Schließlich kann der Nachweis auf der Co-Expression eines Reportergens basieren, das mit dem Zielgen in der Bibliothek verknüpft ist. Basierend auf diesen drei Strategien hat sich eine große Methodenvielfalt entwickelt, von denen im Folgenden die bekanntesten diskutiert werden.

Direkterkennung

Die visuelle Erkennung ist eine phänotypische Screening-Methode, die relativ einfach und „low-tech“ ist. Allerdings ist es auch recht arbeitsintensiv. Dieses Screening-Verfahren funktioniert mit positiven Klonen, die ein Merkmal (als Ergebnis der Expression eines Bibliotheksgens) aufweisen, das direkt beobachtbar ist. Beispiele für solche beobachtbaren Merkmale sind Koloniepigmentierung, unregelmäßige Koloniemorphologie oder Halobildung auf Plattenüberlagerungen. Die Kopplung dieser Direktnachweismethode mit Hochdurchsatztechnologien, wie sie beispielsweise 384-Well-Platten, Kolonie-Picking-Roboter und Mikroplatten-Reader bieten, verkürzt nicht nur die Verarbeitungszeit, sondern erhöht auch die Zuverlässigkeit und Vergleichbarkeit von Screenings, die an verschiedenen Klonen durchgeführt wurden. Ein Nachteil dieser Methode ist ihre eher geringe Auflösung bzw. Empfindlichkeit. Wenn beispielsweise die Expression in einem bestimmten positiven Klon gering ist, ist ein phänotypisches Merkmal möglicherweise nicht ohne weiteres nachweisbar, was zu einer falschen Ablehnung von positiven Klonen unter dem Schwellenwert führt. Außerdem erlaubt das Verfahren nicht, dem Bildschirm eine Richtung zu geben. In einer aktuellen Studie (Craig et al. 2010) wurden Klone im Hochdurchsatz in mehreren Wirten basierend auf den drei oben genannten phänotypischen Merkmalen gescreent. Diese Merkmale wurden aufgrund der Tatsache ausgewählt, dass sie häufig mit der Produktion kleiner Moleküle in Verbindung gebracht werden (Craig et al. 2010). Dies veranschaulicht die Tatsache, dass diese Methoden eher für eine breit angelegte Exploration des Metagenoms auf pleiotrophe Merkmale geeignet sind als für die gezielte Suche nach einem bestimmten Stoffwechselweg oder Metaboliten.

Indikatormedium

Die Verwendung eines Indikatormediums stellt einen direkten Weg dar, um bestimmte kleine Moleküle, chemische Reaktionen oder metabolische, katabole oder antibiotische Fähigkeiten eines Klons nachzuweisen. Es ist eine beliebte Nachweismethode aufgrund seiner Eignung für Hochdurchsatzanwendungen sowie seiner Eignung für viele Experimente, von breiten Screenings verschiedener Genprodukte bis hin zur Isolierung sehr spezifischer metabolischer Fähigkeiten (De Vasconcellos et al. 2010 Fan et al. 2011 Morohoshi ua 2011 Tirawongsaroj ua 2008). Darüber hinaus ermöglicht die relative Sensitivität dieser Methode, z. B. pH-Änderungen bei moderaten Expressionsniveaus nachzuweisen, insbesondere in Kombination mit tropfenbasierten Mikrofluidiken, bei denen nachweisbare Konzentrationen aufgrund des geringen verwendeten Volumens leicht erreicht werden.

Ein schönes Beispiel für die Verwendung von Indikatormedium in Screenings ist die Isolierung neuer Metallo-Proteasen aus metagenomischen Bibliotheken unter Verwendung von mit Milch infundierten Platten. Der Screen basierte auf dem Nachweis proteolytischer Aktivität im E coli Klone, die die Fähigkeit verleihen, Milchproteine ​​zu hydrolysieren. Die Klone der Bibliothek wurden auf entrahmter Milch enthaltenden Agarplatten inkubiert und die proteolytische Aktivität wurde durch die Bildung von klaren Höfen auf den Platten nachgewiesen (Waschkowitz et al. 2009).

Die Verwendung von Indikatormedien ist vielversprechend, da die erfolgreiche Expression von Fremdgenen im Wirt leicht im Hochdurchsatz überwacht werden kann. Sich auf die erfolgreiche Expression fremder Gene zum Nachweis zu verlassen, könnte geringe Mengen an positiven Treffern ergeben, aber die Garantie geben, dass das Gen im Metagenom-Wirt funktionsfähig ist. Problematisch ist jedoch, dass die Zielenzyme nur intrazellulär im Metagenomwirt exprimiert werden und die Zellmembran für die im Medium vorhandenen Indikatorsubstanzen nicht unbedingt permeabel sein muss. Daher ist die Sekretion des Genprodukts für den Nachweis notwendig. Darüber hinaus können andere Probleme auftreten, wie z. B. enzymatischer Abbau oder intrazelluläre Produktakkumulation (Sørensen und Mortensen 2005), die zu Toxizität führen können. Erzwungene Zelllyse kann die Lösung halten, da sie die Indikatorsubstanz mit den intrazellulären Zielproteinen in Kontakt bringen kann (Bao et al. 2011). Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass die exprimierten Proteine ​​nicht durch die Lysemittel denaturiert werden, da ansonsten die Proteinaktivität sowie deren Wechselwirkung mit dem Indikatorsubstrat verloren gehen könnten. Darüber hinaus kann der mechanische Zellaufschluss zeit- und arbeitsintensiv sein. Eine Möglichkeit, dies zu vermeiden, ist die Verwendung eines autolytischen Vektors. Liet al. (2007) einen UV-induzierbaren autolytischen Vektor zur Verwendung in Hochdurchsatz-Screenings entwickelt. Ein SRRz Lyse-Genkassette wurde stromabwärts eines UV-induzierbaren Promotors in . eingefügt E coli. Die Effizienz der Zelllyse wurde durch die Expression von β-Galactosidase in getestet E coli vor der UV-Induktion. Nach UV-induzierter Lyse wurde die extrazelluläre (überstehende) β-Galactosidase-Aktivität mit der Gesamtmenge der intrazellulären (Pellet) und extrazellulären β-Galactosidase-Aktivität verglichen, um die Lyseeffizienz zu quantifizieren. Bei einer Temperatur von 30 °C wurde eine Lyseeffizienz von 60 % oder mehr beobachtet. Dies ist vergleichbar mit einer konventionellen Lysozym-Behandlung. Bei 37 °C war die Lysegeschwindigkeit jedoch weniger konstant. Somit könnte die Verwendung eines solchen autolytischen Vektors eine einfache Alternative zu bestehenden Lysetechniken darstellen (Li et al. 2007).

Zusätzlich zu dem auf Beta-Galactosidase basierenden Screen haben sich mehrere andere chromogene und fluorogene Reportertechniken als effizient bei der Identifizierung der Aktivitäten von Enzymen erwiesen, die durch das (die) inserierte(n) Gen(e) kodiert werden. LeCleir et al. (2007) zeigten somit die Anwesenheit von chitinolytischen Enzymen in einer Mündungs-Metagenom-Bibliothek durch Spaltung von fluorogenen Analoga von Chitin.

MD verlässt sich nicht auf den direkten Nachweis eines exprimierten Gens, sondern verwendet einen vorgefertigten Expressionsweg. Durch Modulieren der Expressionswirts- und/oder Vektorsysteme können Selektion und Nachweis inserierter Gene manipuliert werden, beispielsweise durch Coexpression von Reportergenen oder heterologe Komplementation. Dies führt zu spezifischeren Screenings und standardisierten nachweisbaren Signalen.

Reportergene

Die Verwendung von Reportergenen ist eine geeignete Methode für Hochdurchsatz-Screenings. Die lacZ Gen, das für Beta-Galactosidase kodiert (was zu einer Färbung der Kolonie beim Wachstum führt) X-Gal-haltiges Medium) wird häufig als Reportergen verwendet. In einem Experiment zum Screening auf metagenomische Klone, die Gene enthalten, die das Quorum Sensing (QS) stören, wurde dieses Reportergen verwendet. Das Screening wurde durch Messung des potentiellen Abbaus der QS-Signalmoleküle erreicht. Ein A. tumefaciens Stamm mit a traI-lacZ Genfusion wurde beim Screening verwendet. Durch die Veranlassung traI Gen mit dem QS-Signalmolekül Homoserinlacton 3-oxo-C 8 -HSL, lacZ ist aktiviert. Dies führt zu einer Beta-Galactosidase-Produktion, die blaue Kolonien ergibt. Wenn jedoch 3-oxo-C 8 -HSL wird vom Wirt abgebaut, lacZ die Induktion wird gehemmt und es erscheint keine blaue Farbe. Dies wäre ein Hinweis auf eine Quorum-Sensing-hemmende oder -abbauende Aktivität des Klons. Das Experiment ergab 438 positive Klone, die eine QS-Hemmung zeigten (Schipper et al. 2009).

Ein großer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass der Nachweis positiver Klone nicht auf der erfolgreichen Expression eines Genprodukts stromabwärts der Transkription beruht. Auch eine möglicherweise schwache Expression des inserierten Gens behindert den Nachweis nicht, wie dies bei anderen Nachweisverfahren der Fall sein könnte. Dies kann bei der Suche nach Genen, die im Wirt schwer exprimierbar sind, von großem Vorteil sein.

Heterologe Komplementation (HC)

Heterologe Komplementation (HC) beruht auf der Erforschung fremder Gene, um eine genetische Komplementation im Wirt zu erreichen, was zur Expression eines Genprodukts führt, das für das Wachstum unter selektiven Bedingungen entscheidend ist. Die Technik ermöglicht eine große Selektivität und dadurch kann ein Screen präzise auf die Suche nach bestimmten Genen ausgerichtet werden (Kellner et al. 2011 Simon et al. 2009). Ein Beispiel wird von Simon et al. (2009), die aus Gletschereis abgeleitete metagenomische Plasmid- und Fosmid-Bibliotheken auf DNA-Polymerase-kodierende Gene durchmusterten. Dies wurde durch die Verwendung eines E coli Stamm, der eine kälteempfindliche Mutation in der 5′–3′-Exonuklease-Domäne der DNA-Polymerase I trägt, die bei Temperaturen unter 20 °C tödlich ist. Durch Züchten der Klone auf antibiotikahaltigen Platten, die mit Vektorresistenz kompatibel sind, bei einer Temperatur von 18 °C können positive Klone identifiziert werden, die die letale Mutation komplementieren. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden 17 Plasmide und 1 Fosmid mit dem gewünschten Phänotyp aus der Klonbibliothek gewonnen. Die Sequenzanalyse von neun positiven Klonen zeigte, dass tatsächlich DNA-Polymerasegene aus der Bibliothek isoliert worden waren. Unter Berücksichtigung der Konservierung der DNA-Polymerase-Gene und des Homologiegrades zu bekannten DNA-Polymerase-Genen führte dieses Ergebnis zu dem Schluss, dass die Gene aus noch unerforschten Mikroorganismen gewonnen wurden (Simon et al. 2009).

Ein weiteres Beispiel für HC liefert eine Studie, in der versucht wurde, neue Lysin-Racemase-Gene aus einem Metagenom zu isolieren (Chen et al. 2009). Ein E coli Stamm, der eine Lysin-Auxotrophie-Mutation trägt, wurde verwendet, um in einer aus Gartenerde stammenden metagenomischen Bibliothek auf die oben genannten Gene zu screenen. Klone wurden auf d-Lysin-ergänztem Medium gezüchtet. Da nur erfolgreiche rekombinante Klone in der Lage wären, d-Lysin abzubauen, würden erfolglose Klone auf dem Medium verhungern. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde ein positiver Klon identifiziert und sequenziert. Um zu bestätigen, dass das inserierte Gen aus dem Metagenom und nicht aus verdauten DNA-Fragmenten während der Bibliothekskonstruktion stammt, wurden Primer basierend auf den nachgewiesenen lyr (Lysinracemase)-Gen entwickelt. Diese Primer amplifizierten dann erfolgreich die lyr Gen direkt aus der metagenomischen DNA durch PCR (Chen et al. 2009).

Induktion durch Substrat

Die Induktion der Genexpression durch das Substrat ist besonders praktisch für den Nachweis von katabolen Genen. Die Expression kataboler Gene wird oft durch Substrate und/oder Metaboliten katalytischer Enzyme induziert. Die regulatorischen Elemente dieser katabolen Gene liegen im Allgemeinen nahe bei den Genen selbst. Es wurde gezeigt, dass diese Elemente in Wirtsorganismen wie E coli.

Substratinduzierte Genexpression

Uchiyamaet al. (2005) entwickelten das sogenannte Substrat-induzierte Genexpressionssystem (SIGEX) zur Verwendung als Screening-Verfahren für bestimmte katabole Gene. Um dieses Verfahren Hochdurchsatz-kompatibel zu machen, wurde ein Operon-Trap-GFP-Expressionsvektor verwendet, was zu co-exprimiertem GFP bei substratinduzierter Expression eines beliebigen responsiven inserierten Gens führte. Diese GFP-Expression ermöglichte anschließend die Trennung positiver Klone durch Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung (FACS). In der Studie wurden metagenomische Gene aus dem Grundwasser gefunden, die durch Benzoat und Naphthalin induziert werden könnten. Dies ergab 58 Benzoat- und vier Naphthalin-positive Klone (Uchiyama et al. 2005). Durch Wechsel des Substrats kann der Umfang des Screens angepasst und verschiedene katabole Gene gezielt angesteuert werden. Möglicherweise lassen sich sogar unbekannte Genfunktionen aus dem verwendeten Induktionssubstrat ableiten. Die Induktion der Expression durch andere Effektoren als das verwendete Substrat kann jedoch zum Nachweis von falsch positiven Ergebnissen führen.

Metabolitenregulierte Expression

Die metabolitenregulierte Expression stellt eine ähnliche Technik wie die obige dar (Williamson et al. 2005). Es zielt darauf ab, biologisch aktive kleine Moleküle durch eine intrazelluläre luxI–luxR Biosensor-System. In diesem System wird die Genexpression durch Quorum Sensing induziert oder gehemmt. Nach Erreichen einer bestimmten Konzentration des Genprodukts erfolgt die Induktion der Expression eines Transkriptionsaktivators durch Bindung von luxR, die aktiviert luxI die anschließende Expression eines Reportergens erfolgt. Die erfolgreiche Expression des Reportergens ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening durch FACS. Ein Vorteil dieses Systems besteht darin, dass es nicht auf die Sekretion eines Genprodukts angewiesen ist, wie dies bei Screenings mit Indikatororganismen der Fall ist (eine übliche Technik zur Identifizierung von Antibiotika). Stattdessen sucht diese Technik intrazellulär nach exprimierten kleinen Molekülen (Williamson et al. 2005).


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ERGEBNISSE

Biologische Anreicherung von Phagen mit Hsp16.3-bindenden Peptidsequenzen durch Biopanning.

Nach der dritten Panning-Runde der Ph.D.-7-Bibliothek auf Hsp16.3 wurde festgestellt, dass von den acht zufällig ausgewählten Phagenklonen (Seq IDs 1 bis 8), die für die Peptid-kodierende Region sequenziert wurden, fünf waren identisch (Tabelle ​ (Tabelle1). 1 ). Seq ID 9 stellt eine Konsensussequenz dar, Lys-Met-His-Ala-Thr-Asn-His, die aus diesem Panning-Experiment hervorgeht. Im Fall der Ph.D.-12-Bibliothek waren die Ergebnisse auffallender. Von den 10 Klonen, die nach dem dritten Panning sequenziert wurden, waren 9 Klone (Seq IDs 11 bis 20) identisch, und die Konsensus-Peptidsequenz (Seq ID 21) war in diesem Fall Tyr-Pro-His-His-Phe-Lys-His- Arg-His-Ile-Pro-Ile. Beim Vergleich der beiden Konsensussequenzen (Seq IDs 9 und 21) wurde festgestellt, dass der dritte und siebte His-Rest in einer ausgerichteten Position existierten. Die Bindung von Phagenklonen, die Peptide (Seq.-IDs 9 und 21) präsentieren, an Hsp16.3 wurde weiter bestätigt, indem ein reverser Phagen-ELISA durchgeführt wurde (Abb. ​ (Abb.1)). Um synthetische Peptide abzuleiten, wurde der Gly-Gly-Gly-Ser-Spacer zu den Konsensussequenzen an den C-terminalen Enden hinzugefügt, um die wirksamen Bindungssequenzen mit den IDs 10 und 22 zu erhalten.

Reverser Phagen-ELISA zur Bestätigung der Bindung von Phagenklonen, die Peptidsequenzen, Seq ID 9 und 21, an Hsp16.3 zeigen. Die Phagenklone wurden amplifiziert, durch PEG-Präzipitation konzentriert und entweder mit Hsp16.3 oder unspezifischem Ziel-BSA umgesetzt, das auf die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgetragen wurde. Ungebundene Phagen wurden durch Waschen mit TBST (0,5% Tween 20) entfernt und gebundene Phagen wurden mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem monoklonalen Anti-M13-Antikörper (1:5.000) und ABTS-Substrat nachgewiesen. Die Farbentwicklung wurde spektrophotometrisch bei 405 nm überwacht. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Das Balkendiagramm zeigt die Bindungsaktivität von Phagenklonen mit Seq ID 9 (□) und Seq ID 21 (▪) an Hsp16.3 und BSA (Hintergrundbindung). Die Fehlerbalken repräsentieren die SE.

TABELLE 1.

Hsp16.3-bindende Peptidsequenzen, die nach dem Panning in der dritten Runde selektiert wurden

Verwendete Phagen-Display-BibliothekSequenz-ID einAminosäuresequenz B
Ph.D.-71GlyValKleberAsnValSerTrp
2LysGetroffenSeineAlaThrAsnSeine
3LysGetroffenSeineAlaThrAsnSeine
4LysGetroffenSeineAlaThrAsnSeine
5LeuProfiAlaLysAsnPheSeine
6PheProfiProfiLeuLysSerProfi
7LysGetroffenSeineAlaThrAsnSeine
8LysGetroffenSeineAlaThrAsnSeine
9*LysGetroffenSeineAlaThrAsnSeine
10†LysGetroffenSeineAlaThrAsnSeineGlyGlyGlySer
Ph.D.-1211TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
12TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
13TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
14TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
15TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
16AlaTyrLysProfiIleAlaSeinePheIleSerProfiAla
17TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
18TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
19TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
20TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
21*TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIle
22†TyrProfiSeineSeinePheLysSeineArgSeineIleProfiIleGlyGlyGlySer

Die verschiedenen Hsp16.3-bindenden Peptidsequenzen, die in der vorliegenden Studie erwähnt werden, das Verfahren zu ihrer Ableitung und der Test ihrer inhibitorischen Aktivitäten sind alle durch eine (anhängige) Patentanmeldung beim US-Patent- und Markenamt abgedeckt.

Bindungsaffinität der Peptidliganden für Hsp16.3.

Die Seq IDs 10 und 22, die im Folgenden als Peptide 10 und 22 bezeichnet werden, wurden chemisch synthetisiert und an den N-terminalen Enden mit FITC markiert.

Die fluoreszierten Peptide wurden verwendet, um die Bindung mit Hsp16.3 durch Fluoreszenzanisotropie zu messen. 2A und B zeigen die Titrationen der FITC-konjugierten Peptide 10 bzw. 22 (800 nM) mit steigenden Konzentrationen von Hsp16.3. Für jedes Peptid wurden drei unabhängige Titrationen durchgeführt, und die mittlere Anisotropie ± der SE wurde gegen die Proteinkonzentration aufgetragen. Die Anisotropie nahm als Funktion der Hsp16.3-Konzentration zu. Die Daten wurden an die Single-Site-Bindungsgleichung (Gleichung 2) angepasst und die Dissoziationskonstante wurde bestimmt. Die KD Die so erhaltenen Werte waren 54,2 ± 13,7 μM (P = 0,001) und 45,7 ± 18,0 μM (P = 0,023) für die Peptide 10 bzw. 22.

Bestimmung der Dissoziationskonstante und Stöchiometrie der Peptidbindung an Hsp16.3. Anisotropiezunahme von FITC-markiertem Peptid 10 (A) und Peptid 22 (B) als Funktion der Hsp16,3-Konzentration in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) mit 300 mM NaCl bei Raumtemperatur. Anisotropiewerte sind Mittelwerte ± der SE (angezeigt durch Fehlerbalken) von drei unabhängigen Experimenten. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen lagen bei 495 bzw. 519 nm. Im Fall von Peptid 10 wurde die Stöchiometrie (C) aus der dosisabhängigen Löschung der intrinsischen Tyrosinfluoreszenz von Hsp16.3 unter den gleichen Pufferbedingungen bestimmt. Die Linien wurden gezogen, um die Bindungsstöchiometrie zu bestimmen.

Die Tyrosin-Fluoreszenzlöschung des Hsp16.3-Proteins wurde auch verwendet, um die Bindung von Peptid 10 zu untersuchen. Da Peptid 10 keine Tyrosinreste aufweist, kann es als Löscher verwendet werden, aber eine ähnliche Übung konnte im Fall von Peptid 22 nicht durchgeführt werden, da Tyrosin bildet einen Teil der Sequenz. Abbildung ​ Abbildung2C 2C zeigt das Tyrosin-Fluoreszenz-Quenching-Profil von Hsp16.3 (15 μM) nach Bindung von Peptid 10. Der Abszissenwert des Schnittpunkts der asymptotischen Linie und des durch die Anfangslinie gezeichneten F/F0 Werte repräsentiert nPT + KD, wo n ist die Anzahl der Peptidbindungsstellen pro Untereinheit von Hsp16.3 und PT ist die Gesamtproteinkonzentration in Form von Monomer. Um festzustellen n, wurden die Löschexperimente bei zwei Konzentrationen von Hsp16.3 durchgeführt: 15 μM (Fig. ​ (Fig.2C) 2C) und 5 μM (Daten nicht gezeigt). Die Abszissenwerte wurden mit 20,0 (Abb. ​ (Abb.2C) 2C) bzw. 10,2 μM ermittelt. Daher haben wir KD + 15n = 20.0 und KD + 5n = 10.2. Durch Eliminieren KD aus diesen beiden Gleichungen ist der Wert von n wurde mit 0,98 bestimmt. Daraus kann geschlossen werden, dass es eine Bindungsstelle für Peptid 10 pro Untereinheit von Hsp16.3 gibt.

Spezifische Hemmung der Hsp16.3-Chaperon-Aktivität durch die Peptide.

Alkoholdehydrogenase (ADH) (5 μM) aggregiert beim Erhitzen auf 50ଌ (Abb. 3A, B, D und E). Diese Aggregation wird bis zu einem Ausmaß von ca. 85%, wenn ADH mit Hsp16.3 (Fig. 3A und D) bei einem Molverhältnis von ADH zu Hsp16.3 von 5:4 koinkubiert wird. Die Zugabe steigender Mengen von Peptid 10 führte zu einem fortschreitenden Verlust der Chaperon-Aktivität von Hsp16.3. Bei der höchsten Konzentration von 100 μM, dh bei einem �-fachen molaren Überschuss, wurde eine signifikante Hemmung (㹰%) der Chaperonaktivität beobachtet (Abb. ​ (Abb.3A). 3A ). In ähnlicher Weise betrug im Fall von Peptid 22 das Ausmaß der Hemmung bei 100 μM ca. 60 % (Abb. ​ (Abb.3D). 3D). Die Zugabe von Peptid allein hatte keine Wirkung auf die Aggregationsraten von ADH (Fig. 3A und D). Unter Verwendung des gleichen experimentellen Aufbaus wurde Hsp16.3 durch alphaB-Crystallin ersetzt und die hemmende Wirkung der Peptide auf dieses Protein, falls vorhanden, analysiert. Wie erwartet, wurde beim Mischen von ADH (5 μM) mit alphaB-Crystallin (2,5 μM) ein vollständiger Schutz gegen Aggregation beobachtet, aber dieser Schutz konnte nicht durch Zugabe von Peptid 10 oder Peptid 22 aufgehoben werden (Abb .3B bzw. E) in einer Konzentration von 100 μM, was effektiv einen �-fachen molaren Überschuss an Peptid gegenüber dem Zielprotein alphaB-Crystallin ergibt. Um eine quantitativere Interpretation zu erhalten, wurde die prozentuale restliche Chaperonaktivität (Mittelwert ± der SE aus drei unabhängigen Experimenten) gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Dies ergab eine Dosis-Wirkungs-Kurve (Fig. 3C und F), aus der IC50 Werte von 53,0 ± 8,47 μM (P = 0,0079) für Peptid 10 und von 57,1 ± 4,37 μM (P = 0,0058) für Peptid 22 wurden erhalten. Die Dosis-Wirkungs-Kurven für beide Peptide zeigen auch grafisch, dass im Zusammenhang mit alphaB-Crystallin fast kein Effekt auftrat.

Dosisabhängige Hemmung der Chaperon-Aktivität von Hsp16.3 durch die Peptide 10 und 22. Aggregationsassays wurden durch direktes Erhitzen von 5 &mgr; x003bcl in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), der 100 mM NaCl enthält. Die Extinktion wurde 1200 s lang bei 360 nm überwacht und alle 100-s-Intervalle abgelesen. ADH aggregiert beim Erhitzen (A, B, D und E ▴). Der Einbau von Hsp16.3 in einem Molverhältnis von 5:4 (A und D) oder von alphaB-Crystallin in einem Molverhältnis von 1:1 (B und E) führt zu einer Abnahme der Aggregationsaktivität (•). Dann wurden steigende Konzentrationen von Hsp16.3-bindendem Peptid 10 (A und B) und Peptid 22 (D und E) wie angegeben bei den folgenden Konzentrationen zugegeben: 25 μM (□), 50 μM (▪ ) und 100 μM (▵). Sterne repräsentieren die ADH-Aggregation in Gegenwart von Peptid 10 (A und B) und Peptid 22 (D und E). Der IC50 für Peptid 10 (C) und Peptid 22 (F) wurde aus der Auftragung der prozentualen restlichen Chaperonaktivität gegen die Peptidkonzentration berechnet. Jeder Bezugspunkt in den Feldern C und F ist ein Durchschnitt von drei unabhängig abgeleiteten Ergebnissen. Fehlerbalken zeigen die SE an.

Peptide beeinflussen die Stabilität von Hsp16.3-Substratkomplexen.

Es wurde bereits früher gezeigt, dass alpha-HSPs lösliche Komplexe mit aggregationsanfälligen Proteinen bilden, wenn sie zusammen auf 50ଌ erhitzt werden (14). Um den möglichen Wirkmechanismus der Peptidinhibitoren zu untersuchen, wurde deren Einfluss auf die Hsp16.3-Substratkomplexbildung am Modellsubstrat Malatdehydrogenase (MDH) untersucht. MDH wurde in einer Konzentration von 2 μM entnommen und auf 50ଌ erhitzt. Wie erwartet bildete es Aggregate und fiel aus. Bei der Analyse des Pellets und des Überstands durch SDS-PAGE wurde festgestellt, dass das gesamte Protein in der Pelletfraktion vorhanden war (Abb. ​ (Abb. 4A, 4A, Spur 2). Hsp16.3 (80 μM) wurde dann zu MDH in einem 40-fachen molaren Überschuss vor dem Erhitzen zugegeben, um eine Aggregation zu verhindern.Die Aufnahme dieser Menge ergab maximalen Schutz, und das meiste der MDH wurde im Überstand zurückbehalten (Abb. ​ (Abb.4A, 4A .). , Spur 3.) Um die Wirkung von Peptid 10 auf die Komplexbildung zu untersuchen, wurden steigende Dosen des Peptids zugegeben, um Hsp16.3 zu inaktivieren. Abbildung ​ Abbildung4B 4B zeigt eine progressive Verschiebung der MDH-Bande vom Überstand zur Pelletfraktion (Spuren durch schwarze Punkte markiert) bei Zugabe steigender Mengen von Peptid 10. Hsp16.3 blieb jedoch bis zu einer Konzentration von 3,2 mM von Peptid 10 (40-facher molarer Überschuss) löslich, obwohl bei einer höheren Konzentration (4,8 mM, dh ein 60-facher molarer Überschuss) wurde ebenfalls ausgefällt (Abb. ​ (Abb.4D). 4D). Zugabe von Peptid 22 führte zu ähnlichen Folgen (Abb. ​ (Abb.4C), 4C), aber in diesem Fall trat eine fast vollständige Ausfällung des Komplexes bei einer Peptidkonzentration von 1,2 mM (15-facher molarer Überschuss) im Vergleich zu 4,8 mM (60-facher molarer Überschuss) im Fall auf von Peptid 10. Ein weiterer bemerkenswerter Unterschied bestand darin, dass im Gegensatz zum vorherigen Fall die Fällung von Hsp16.3 und MDH parallel auftrat, wenn Peptid 22 als Inhibitor verwendet wurde (Abb. ​ (Abb. 4E). 4E). Da in beiden Fällen ein nachweisbarer Verlust der Löslichkeit von Hsp16.3 beobachtet wurde, wurde die Wirkung dieser Peptide auf die Löslichkeit von Hsp16.3 selbst bei den Peptidkonzentrationen untersucht, bei denen die Komplexe ausgefällt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass im Fall von Peptid 10 (Fig. ​ (Fig.4F), 4F) ca. 70 % des vorhandenen Chaperonproteins wurden bei einem 60-fachen molaren Überschuss (4,8 mM) unlöslich, während im Fall von Peptid 22 (Abb.​ (Abb.4G), 4G) fast 90 % davon verlorene Löslichkeit bei einem 15-fachen molaren Überschuss (1,2 mM).

Wirkung von Peptiden auf die Stabilität des Hsp16.3-MDH-Komplexes. (A) MDH (2 μM) entweder allein oder nach Mischen mit Hsp16.3 (80 μM) wurde 30 min auf 50ଌ erhitzt, gefolgt von Zentrifugation bei 15.000 × g. Die Überstände und Pellets wurden durch SDS-PAGE auf einem 15%-Gel analysiert. Mit schwarzen Punkten markierte Spuren repräsentieren in allen Fällen Pelletfraktionen. Der MDH-Hsp16.3-Komplex wurde dann in Gegenwart des inhibitorischen Peptids 10 bzw. Peptid 22 (B und C) gebildet.Die molaren Überschüsse der eingesetzten Peptide gegenüber Hsp16.3 sind unterhalb der Spuren angegeben. Die Banden wurden densitometrisch gescannt, und die Fraktion des Proteins (entweder Hsp16.3 oder MDH), die im Überstand erschien, wurde als prozentuale Löslichkeit gegen den molaren Überschuss von Peptid 10 bzw. Peptid 22 (D und E) aufgetragen. (F und G) Die Wirkung der Peptide 10 und 22 auf die Löslichkeit von Hsp16.3 wurde unter Verwendung des angegebenen molaren Überschusses getestet. (H) Die vergleichende Wirkung von Peptid 22 (mit schwarzen Punkten markierte Bahnen) auf alphaB-Crystallin wurde Seite an Seite mit der Hsp16.3-Kontrolle bestimmt. (I) In ähnlicher Weise wurde die Wirkung von Peptid 22 auf die Bildung eines löslichen Komplexes zwischen alphaB-Crystallin und MDH zusammen mit einer Hsp16.3-MDH-Kontrolle getestet. In den letzten beiden Experimenten wurde ein molarer Peptidüberschuss von 15 über entweder Hsp16.3 oder alphaB-Crystallin verwendet.

Obwohl die Ausfällung bei relativ hohen Peptidkonzentrationen beobachtet wurde, ist das Phänomen spezifisch, da es im Fall von BSA und DnaK nicht auftritt (Daten nicht gezeigt) und auch das verwandte Homologe alphaB-Crystallin beeinflusst (Abb. ​ ( Abb. 4H) 4H). Wenn also ein 15-facher molarer Überschuss (1,2 mM) von Peptid 22 zu Hsp16.3 (80 μM) hinzugefügt wurde, wurde erwartungsgemäß ein signifikanter Verlust an Löslichkeit beobachtet (Abb , Spur 4), aber bei Zugabe zu alphaB-Crystallin wurde keine Wirkung beobachtet (Fig. ​ (Fig.4H, 4H, Spur 8) Die Wirkung der Peptide auf den Komplex zwischen MDH und alphaB-Crystallin wurde ebenfalls untersucht (Abb. ​ (Abb.4I). 4I). Die für Peptid 22 präsentierten Ergebnisse zeigen, dass bei der Konzentration des Peptids, bei der der Hsp16.3-MDH-Komplex ausfällt (Abb. ​ (Abb .4I, 4I, Spur 4), es wurde keine Wirkung auf den alphaB-Crystallin-MDH-Komplex (Abb. ​ (Abb. 4I, 4I, Spur 8) beobachtet. Die Assays wurden mehrmals wiederholt und das Präzipitationsmuster wurde gefunden Diese Beobachtungen belegen weiter, dass die Peptidinhibitoren eine Zielspezifität aufweisen.

Die Ausfällung ist kein wesentliches Merkmal für die Hemmung.

Um zu untersuchen, ob der in den spektrophotometrischen Aggregationsassays beobachtete Verlust der Chaperon-Aktivität von Hsp16.3 auf die Präzipitation des Proteins zurückzuführen war, wurde zunächst ein Assay (Abb. ​ (Abb.5A) 5A) durchgeführt, im Wesentlichen wie in die vorherigen Abschnitte und dann, nachdem die Aggregation im Steady-State erreicht war, wurden die Proben zentrifugiert und die Pelletfraktionen wurden durch SDS-15% PAGE analysiert (Abb. ​ (Abb. 5C). 5C). Die Anwesenheit von Hsp16.3 (4 μM) verhindert die Aggregation zu einem Ausmaß von 60% (Abb. 5A und B). Die Zugabe von Peptid 10 oder Peptid 22 in einem 50-fachen molaren Überschuss (200 μM) stellte die Aggregation fast auf das ursprüngliche Niveau (ADH allein) wieder her. Hsp16.3 selbst zeigt keine Aggregation. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte, dass in Gegenwart von Hsp16.3 ein 55%iger Abfall der Intensität der ADH-Bande (Fig. 5C und D, Spur 3) entsprechend dem im spektrophotometrischen Assay beobachteten Abfall auftrat. In Gegenwart der Peptide kehrte die Intensität auf fast 100% zurück, was eine Hemmung der Hsp16.3-Aktivität anzeigt (Fig. 5C und D, Spuren 4 und 5 im Vergleich zu Spur 2). Die Intensitätsschwankungen traten nur bei den ADH-Banden auf, nicht jedoch bei Hsp16.3, dessen Intensität auf den Hintergrundwerten blieb (Abb. ​ (Abb.5D). 5D). Dies weist darauf hin, dass unter den Bedingungen des spektrophotometrischen Assays die Inaktivierung durch die Peptide keine Aggregation von Hsp16.3 beinhaltet. Das Ergebnis legt nahe, dass die Bindung der Peptide die Konformation von Hsp16.3 verändert, so dass es weniger löslich wird, aber der Löslichkeitsverlust zeigt sich tatsächlich, wenn die Konzentrationen der Peptide hoch sind, d. h. im millimolaren Bereich. Die Präzipitation ist daher nicht das Phänomen selbst, sondern ein Spiegelbild einer möglichen Konformationsänderung von Hsp16.3 als Folge der Peptidbindung.

Peptid-vermittelte Inaktivierung von Hsp16.3 unter Bedingungen, die für den spektrophotometrischen Assay der Chaperon-Aktivität verwendet wurden. (A) Die Chaperon-Aktivität wurde spektrophotometrisch gemessen, wie in Abb. ​ Abb.3 beschrieben. 3 . Die Aggregation von ADH (5 μM) ohne Chaperon wird durch die durch weiße Kreise markierte Kurve dargestellt, der Schutz durch Hsp16.3 (4 μM) durch schwarze Kreise und die Hemmung von Hsp16.3 durch die Peptide 10 und 22 (200 & #x003bcM) durch weiße bzw. schwarze Quadrate. Die Aggregation von Hsp16.3 allein wird durch weiße Dreiecke angezeigt. (B) Die in Panel A beobachteten Steady-State-Aggregationen (1.200 s) sind grafisch dargestellt. (C) Die aggregierten Proben wurden zentrifugiert und die Pelletfraktionen wurden durch SDS-PAGE auf einem 15% Gel analysiert. Spuren entsprechend den Aggregationskurven sind durch identische Symbole gekennzeichnet. Die verwendeten Kombinationen von Proteinen und Peptiden sind oben angegeben. Das Balkendiagramm (D) zeigt die Bandintensitäten der Komponenten ADH (□) und Hsp16.3 (▪) in jeder Spur.

Beweis für die Beteiligung von His-Resten an der Interaktion von Peptid mit Hsp16.3.

Um die Wechselwirkung zwischen Peptiden und Hsp16.3 weiter zu untersuchen, wurden NMR-Experimente durchgeführt. Abbildung ​ Abbildung6A 6A zeigt die überlagerten TOCSY-Spektren der NH-αH-Region von Peptid 10 (2 mM) in Abwesenheit von Hsp16.3 (rot) und in Gegenwart von Hsp16.3 (blau) bei einem substöchiometrischen Konzentration (0,1 mM). Unter diesen Ligandenüberschussbedingungen sind nur die Peptidpeaks sichtbar. Der schnelle Austausch zwischen den rezeptorgebundenen und freien Formen ermöglicht die Mittelung der beiden chemischen Verschiebungen unter zwei verschiedenen Bedingungen. Somit stellt die Änderung der chemischen Verschiebung im Vergleich zum freien Peptid chemische Verschiebungen dar, die sich im Rezeptor-gebundenen Zustand und möglichen Interaktionspunkten zwischen dem Peptid und dem Rezeptor unterscheiden. Abbildung ​ Abbildung 6B 6B stellt die chemischen Verschiebungsunterschiede der Amidprotonen der Peptid-10-Reste in Pufferlösungen in Gegenwart oder Abwesenheit von Hsp16.3 grafisch dar. Aus dem Balkendiagramm wird deutlich, dass sich nur wenige Reste verschieben und dass die chemische Verschiebung der meisten Reste unverändert bleibt. Die Resttypen wurden anhand der Spinkonnektivität und der chemischen Verschiebungsinformationen zugeordnet (Daten nicht gezeigt). Die Peaks für Met wurden in den TOCSY-Spektren nicht beobachtet, wahrscheinlich wegen der Verbreiterung der Peaks aufgrund des Konformationsaustauschs. Der Peak für Met konnte jedoch beobachtet werden, wenn die Spektren in Wasser bei 27°C abgeleitet wurden (Daten nicht gezeigt), was bestätigt, dass das Peptid Met enthielt. Der Vergleich der TOCSY-Spektren von Peptid 10, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Hsp16.3 erhalten wurden, zeigte signifikante Veränderungen der chemischen Verschiebung für beide His-Reste von Peptid 10 in Gegenwart von Hsp16.3. Bei Ala wurde ein geringer Effekt beobachtet, bei den anderen war der Effekt jedoch vernachlässigbar. Aus diesem Ergebnis geht hervor, dass die His-X-Y-Y-His-Region von Peptid 10 für die Wechselwirkung mit Hsp16.3 notwendig sein kann, wobei X für Ala oder eine analoge Aminosäure steht und Y für jede andere Aminosäure steht. Eine ähnliche Analyse mit Peptid 22 war nicht möglich, da der Peptid 22-Hsp16.3-Komplex in hoher Konzentration ausfällt, wie zuvor gezeigt wurde.

Änderungen der chemischen Verschiebung von Peptid-10-Resten aufgrund der Wechselwirkung mit Hsp16.3. (A) Überlagerung von 2D-TOCSY-Spektren im Fingerabdruckbereich (ausgewählt) von 2 mM Peptid 10 in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 250 mM NaCl in 90 % H2O und 10 % D2O bei 5ଌ in Abwesenheit (rot) oder in Gegenwart (blau) von 0,1 mM Hsp16.3-Protein. Aminosäuren werden unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes bezeichnet. (B) Grafische Darstellung der chemischen Verschiebungsunterschiede (Δ δ Hz) von Amidprotonen von Peptid-10-Resten in Pufferlösung in Gegenwart oder Abwesenheit von Hsp16.3, wie in der Legende zu Tafel A erwähnt.


Materialen und Methoden

Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen

Escherichia coli verwendete Stämme waren DH5α [52], C600 [53], MV10Nal R [54], JM109 [17], HB101 [55], Nissle1917 [56], AL1 (diese Studie, Rif R-Mutante von Maus E. coli Stamm von Alessandro Lazdins in Sydney isoliert). Verwendete Plasmide sind in der S2-Tabelle aufgeführt. Bakterien wurden aerob kultiviert, entweder in L-Brühe/L-Agar [33] oder M9 Minimal Medium [33] (ergänzt mit Aminosäuren bei 50 μg ml –1 ) bei 37 °C. Die endgültigen Antibiotikakonzentrationen waren: Ampicillin (Ap oder Amp), 100 µg ml -1 Kanamycin (Km oder Kan), 50 µg ml -1 Chloramphenicol (Cm oder Cam), 50 µg ml -1 Nalidixinsäure (Nal), 25 µg ml -1 Rifampicin (Rif) 100 µg ml -1 und Tetracyclin (Tc oder Tet), 25 µg ml -1 . Für das Blau/Weiß-Screening wurde L-Agar mit X-gal (20 &mgr;g ml –1 ) und IPTG (0,5 mM) ergänzt.

DNA-Analyse und -Manipulation

Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs T4-DNA-Ligase bezogen und Taq-DNA-Polymerase stammte von Invitrogen Velocity. Die PCR-Amplifikation von DNA wurde unter Verwendung der Primer (AltaBioscience, University of Birmingham, UK oder Sigma Aldrich) erreicht, die in der S3-Tabelle aufgeführt sind. Die Reaktionen wurden in einem SensoQuest Lab Cycler nach Standardverfahren zyklisiert [57]. PCR-Produkte wurden unter Verwendung des Illustra GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE TM Healthcare) gereinigt. Plasmid-DNA-Präparationen im kleinen Maßstab wurden unter Verwendung des AccuPrep Plasmid MiniPrep DNA Extraction Kit (Bioneer) durchgeführt, das an die alkalische Lysemethode von Birnboim und Doly angepasst war [58]. DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden vorbereitet und auf einem ABI 3730 DNA-Analysator (Functional Genomics Facility, University of Birmingham, Großbritannien) nach der Kettenabbruchmethode [59] durchgeführt.

Vergleich der Kopienzahl des Plasmids

Mindestens dreifache selektive Übernacht- (16 h) Kulturen von E. coli die Abfrage-Plasmide plus 2 kb pACYC194-Derivat pDS3 als internen Standard trugen, gezüchtet in LB unter Schütteln bei 200 U/min und 37ºC, wurden geerntet und dann Plasmid-DNA wie oben beschrieben extrahiert. Plasmid-DNA wurde mit einem Enzym verdaut, das nur einmal schneiden würde, um die DNA zu linearisieren und die Ethidiumbromid-Bindung einheitlich zu machen. Die Bandenintensitäten wurden mit der Software QuantityOne von Biorad bestimmt und gegen die pDS3-Bande normalisiert. Kolonien aus serieller Verdünnung der Kulturen wurden Replika-plattiert, um den %-Plasmidträger zu bestimmen.

Konjugative Übertragung

Nach dem Wachstum über Nacht wurden 100 µl Spender mit 1 ml E. coli MV10 Nal R-Empfänger und filtriert auf einem 0,45 &mgr;m sterilen Millipore-Filter. Filter wurden auf L-Agarplatten gelegt, die 6 Stunden bei 37ºC inkubiert wurden. Zellen aus dem Filter wurden jeweils in 1 ml 0,85% (w/v) steriler Kochsalzlösung resuspendiert und seriell verdünnt, bevor sie auf selektivem Agar ausgebreitet und bei 37 °C inkubiert wurden.

Rekombinations-Engineering (Rekombination) von konjugativen IncP-1-Plasmidgenomen

Für Insertionen, Deletionen oder Ersetzungen wurden Primer (S3-Tabelle) verwendet, um etwa 500 bp-Arme auf beiden Seiten des zu ändernden Punktes oder der zu ändernden Region mittels PCR zu amplifizieren. Die Arme wurden verbunden, indem die internen Primer komplementär gestaltet wurden und manchmal neue Restriktionsstellen einbauten, um eine Verbindung durch SOEing (Splicing by Overlap Extension) PCR zu ermöglichen [60]. Anfängliche PCR-Produkte wurden gereinigt, gemischt und dann für drei Zyklen verlängert, bevor die externen Primer für die verbleibenden Zyklen zugegeben wurden. Das Produkt wurde routinemäßig zwischen HindIII- und SalI-Stellen eines pACYC184-Derivats pMEL1 kloniert, das die sackB Gen (ermöglicht eine Gegenselektion mit Saccharose), das zwischen den XbaI- und HindIII-Stellen eingefügt ist. Um die antiF- und antiK-Kassetten in ein konjugatives Plasmid einzubauen, wurden die Homologiearme zuerst inseriert, um pMILL1 zu ergeben (S2-Tabelle) und dann wurden die Kassetten zwischen die Arme kloniert (unter Verwendung von in den inneren Primern entworfenen Restriktionsstellen), um pMILL2 bzw. pSLK1 zu ergeben (S2 Tisch).

Das Rekombinationsplasmid wurde in E. coli C600 trägt bereits das Zielplasmid, selektiert mit Cam und einem für das Zielplasmid geeigneten Antibiotikum (routinemäßig Tet). Anschließend wurde eine konjugative Übertragung auf MV10nal R durchgeführt, wobei beide Marker und Nal ausgewählt wurden – das von pMEL1 abgeleitete Plasmid sollte nicht übertragen werden, es sei denn, es rekombiniert mit dem konjugativen Plasmid. Einzelne Kolonien wurden durch Ausstreichen zu einzelnen Kolonien gereinigt und diese Platten wurden verwendet, um Flüssigkulturen anzuimpfen, die über Nacht ohne Cam gezüchtet wurden. Die Selektion der Auflösungsprodukte erfolgte dann entweder durch Verteilen auf L-Agar mit Saccharose (5% w/v) oder durch Isolieren von Plasmid-DNA und Schneiden mit XbaI, das in pMEL1, aber nicht in das IncP-1-Rückgrat schneidet, um die unerwünschten Plasmide zu linearisieren, so dass sie Bakterien nicht umwandeln.

Aushärtungseffizienz testen

Für den Transfer durch Konjugation werden über Nacht Flüssigkulturen von E. coli C600, die das zu testende pCURE-Plasmid trugen, oder eine geeignete Kontrolle wurden gewaschen, um selektive Antibiotika zu entfernen, dann 1:1 und 1:10 mit einem Stamm gemischt, der das Zielplasmid trägt, und eine Standardfilterpaarung bei 37 °C für durchgeführt 1 Std. Bakterien von der Membran wurden dann in 1 ml steriler Kochsalzlösung (0,85 % w/v) resuspendiert und vor dem Ausplattieren auf selektivem Agar seriell verdünnt, um die Gesamtzahl der Transkonjuganten und Transkonjuganten zu bestimmen, die noch das Zielplasmid tragen. Verschiebung von F’prolac wurde auf zwei Arten bestimmt: erstens durch Streuen auf M9-Medium, das entsprechend mit und ohne Prolin ergänzt wurde, um den prozentualen Verlust des Pro + -Phänotyps zu bestimmen, zweitens durch Wachstum auf L-Agar mit IPTG und X-gal, wenn der Zielstamm zusätzlich pUC18 trug (ausgewählt for with Amp), um aufgrund des Vorhandenseins des von pUC18 kodierten lacZ-Fragments einen Lac + Phänotyp zu ergeben, so dass der Verlust von F'prolac gab einen Lac-Phänotyp. Beim Einführen des Härtungsplasmids durch Transformation wurden die Zielbakterien durch Standard-CaCl&sub2; kompetent gemacht2 Behandlung und Transformation erfolgte mit gereinigter pCURE-DNA.

Der unselektierte Invasionsassay wurde durch wiederholtes Mischen auf Nylonmembranen durchgeführt, wie von Fox et al., [35] beschrieben. Spenderbakterien wurden mit dem Zielstamm gemischt, um ungefähr 10 6 Spender- und 10 9 Empfängerbakterien zu ergeben, bevor 100 &mgr;l auf einem Nitrozellulosefilter (25 mm Durchmesser, 0,45 &mgr;m Porengröße, EMD-Millipore, Darmstadt, Deutschland) auf einer L-Agarplatte verteilt wurden. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurden die Bakterien in 1 ml Kochsalzlösung resuspendiert, gründlich gemischt und seriell verdünnt, um sowohl den Transfer als auch die Härtung zu bestimmen. Die unverdünnte Suspension (100 µl) wurde auf einer frischen Nylonmembran auf einer L-Agarplatte ausgestrichen, um die nächste Paarungsperiode zu starten.

Manipulation von Mini-RK2-Plasmiden

Die Herstellung von pCT549-Derivaten war wegen der Insertion von EcoRI-BglII . umständlich oriV Fragmente oder BglII-PacI-Fragmente in dieses Plasmid erwies sich als schwierig. So fügen Sie EcoRI-BglII . ein oriV Fragmente ohne die antiF-Kassette die oriV Segment wurde durch PCR erzeugt, mit pGEM-T Easy verbunden und sequenziert. Das pGEMT-Derivat und pCT549 wurden dann mit BglII geschnitten und vor der Transformation in . ligiert E. coli C2110, das DNA-polI-defizient ist, erlaubt keine Replikation des pMB1-Replikons in pGEM-T, wodurch Kointegranten ausgewählt werden, die auch das PolI-unabhängige IncP-Replikon enthalten. Plasmid-DNA von Transformanten wurde auf die relative Orientierung der verbundenen Segmente überprüft und dasjenige ausgewählt, das mit EcoRI geschnitten und durch Ligation rezirkularisiert werden konnte, um das alte zu ersetzen oriV mit dem neuen.

So legen Sie die antiF-Kassette neben oriVwurden Primer entwickelt, um XbaI + EcoRI-Stellen stromabwärts von zu platzieren oriV und MfeI + PacI-Stellen stromaufwärts, wo BglII normalerweise ist. Nach dem Klonen des MfeI-XbaI oriV Fragment in pGEM-T Easy und Überprüfung der Sequenz wurde es mit dem mit EcoRI und XbaI geschnittenen pACYC184-Derivat pLAZ2 ligiert. In pLAZ2 definiert EcoRI ein Ende der antiF-Kassette und die XbaI-Stelle befindet sich auf derselben Seite, getrennt durch einen Homologiearm und die sackB Gen. Das andere Ende der antiF-Kassette in pLAZ2 wird durch eine BglII-Stelle definiert. Die MfeI/EcoRI-Enden können sich verbinden, regenerieren aber keine der beiden Stellen, so dass diese Konstruktion ein BglII-antiF-PacI-oriV-EcoRI-XbaI-Segment, und dieses wurde wie oben beschrieben in pCT549 eingefügt, wobei BglII-Schnitt, Ligation und Transformation in C2110 eingeschlossen waren. Die antiF-Kassette wurde in ähnlicher Weise in das Mini-RK2-Plasmid pRK2501 eingefügt, dem bereits . fehlte korB.

So entfernen Sie Teile des korA-incC-korB-korF-korG-kfrABC Region und Reste von trbB in der Nähe von trfAwurde eine inverse PCR an pCT549+antiF-Kassette mit Primern durchgeführt, die eine XbaI-Stelle enthielten, da XbaI das RK2-Rückgrat oder die antiF-Kassette nicht schneidet. Die Long-Range-PCR wurde mit Q5-High-Fidelity-Taq-Polymerase unter Verwendung des empfohlenen Primerdesigns und der empfohlenen Bedingungen zum Entfernen durchgeführt korF-trbB, korB-trbB und incC-trbB. Das Produkt wurde gereinigt, mit XbaI geschnitten, rezirkuliert und in DH5&agr; transformiert. Zu entfernen incC aber nicht korB das korB orf wurde verstärkt und es plus die ΔkorF-trbB Plasmid wurden nach dem Schneiden mit XbaI ligiert (Schnitte stromaufwärts von trbBp) und SphI, das einschneidet incC.

Mausexperimente

Alle Verfahren und Experimente zur Tierpflege wurden vom Animal Ethics Committee des Western Sydney Local Health District (Protokoll 4276.08.17) gemäß dem „Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes“ genehmigt und im Wesentlichen wie zuvor beschrieben [9]. Fünf Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Animal Resource Centre Perth, WA, Australien) wurden in Dreiergruppen in M1-Polypropylenkäfigen mit offenem Deckel (Able Scientific, Australien) in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Futter und Wasser gehalten ad libitum verfügbar (Biological Services Facility, Westmead Institute for Medical Research). Jede unterschiedliche Behandlung umfasste Gruppen von 3 Mäusen. Die Mäuse wurden vor den Experimenten akklimatisiert (d-6 bis d0), gefolgt von einem Einlauf (d1-d3) im Versuchsraum, um die Basislinie festzulegen. Die Mäuse wurden 6 Stunden lang gefastet, bevor sie Zugang zu Saccharosewasser erhielten, und dann stand normales Futter kontinuierlich zur Verfügung. Bakterienkulturen, die ein Plasmid trugen, wurden in Saccharosewasser (8%, w/v) auf eine OD600 von . resuspendiert

0,4±0,05 und an bestimmten Tagen an Mäuse verfüttert und/oder Antibiotika (10–50 mg L -1 ) je nach Bedarf. An den angegebenen Tagen wurde jede Maus zum Wiegen und Sammeln von frischem Kot kurzzeitig in eine separate Plastikbox überführt. Fäkalien (100 mg pro Maus) wurden in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert, Verdünnungen auf CHROMagar mit geeigneten Antibiotika ausplattiert und Kolonien nach Inkubation O/N bei 37 °C gezählt. Periodisch wurden 100 Kolonien auf weitere Platten gepickt, um genaue Anteile der Resistenz-Phänotypen zu bestimmen. PCR zum Nachweis des IncK-Plasmid-Replikons in Rif S E. coli wurde unter Verwendung der Primer AL_IncK_F und AL_IncK_R (S3-Tabelle) durchgeführt. Mäusekotlösungen (100 mg in 1 ml Kochsalzlösung) wurden 1:100-fach in Wasser verdünnt und 3 µl als Template in 50 µl Reaktion verwendet und E. coli PCT tragen::aph wurde als Positivkontrolle verwendet. Am Ende des Experiments wurde eine PCR durchgeführt, um zu bestimmen, ob irgendein pCT::aph Plasmid-DNA konnte nachgewiesen werden, wenn dies nicht durch direktes Ausplattieren offensichtlich war. Mäuse wurden durch eine Überdosis CO . eingeschläfert2 unmittelbar nach Abschluss der Versuche.

Die Mäusegruppen waren wie folgt. Gruppe 1 (Kontrollgruppe): erhielt normale Nahrung und Getränke plus Saccharosewasser, wenn andere Gruppen es erhielten, jedoch ohne Bakterien oder Antibiotika. Gruppe 2 (Antibiotika-Kontrollgruppe): erhielt normales Essen und Trinken plus Saccharosewasser mit Antibiotika, wenn die Gruppen 3 und 4 Antibiotika erhielten. Gruppe 3 (Kolonisationskontrollgruppe): erhalten E. coli AL1 (pCT::aph) in Saccharosewasser für die Tage 3–5 plus Kanamycin für die Tage 4–6, dann normale Nahrung und Wasser für den Rest des Experiments, Überwachung E. coli AL1(pCT::aph) im Stuhl bis Versuchsende. Gruppe 4 (Härtungsversuchsgruppe A): erhalten E. coli AL1(pCT::aph) in Saccharosewasser für 3 Tage plus Kan (3 Tage) als Gruppe 3, dann herausgefordert mit E. coli Nissle1917(pCURE-K-307) für die Tage 10–12 und Tet für die Tage 11–13 und überwachte Fäzes für verschiedene Sets von E. coli (endogener Kolonisator, heilende Stämme und Challenger). Gruppe 5 (Härtungsversuchsgruppe B): erhalten E. coli AL1 (pCT::aph) in Saccharosewasser für 3 Tage plus Kan (3 Tage), dann herausgefordert mit E. coli Nissle1917 (pCURE-K-307) für 3 Tage, aber keine Antibiotika und überwachte Fäzes wie oben. Gruppe 6 (Härtungsversuchsgruppe C): erhalten E. coli AL1 (pCT::aph) in Saccharosewasser für 3 Tage plus Kan (3 Tage), dann herausgefordert mit E. coli Nissle1917 (pCURE-K-307) täglich für 8 Tage (d10-17) und die Fäzes wie oben überwacht.