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Warum wird ein Gen für ein fluoreszierendes Protein verwendet und nicht eines für ein Enzym, das ein fluoreszierendes Molekül produziert?

Warum wird ein Gen für ein fluoreszierendes Protein verwendet und nicht eines für ein Enzym, das ein fluoreszierendes Molekül produziert?


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Grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist ein kleines Protein, das in blauem Licht hellgrün fluoresziert. Es wurde zuerst aus der Qualle isoliert.

Das für GFP kodierende Gen kann in Bakterien exprimiert werden und wird daher oft als Marker verwendet, um die erfolgreiche Aufnahme eines Gens durch das Bakterium zu zeigen.

Was ist der Vorteil das Gen für GFP zu verwenden, um leicht nachweisbare Fluoreszenz zu erzeugen, anstatt ein Gen für ein Enzym zu verwenden, das eine fluoreszierende Substanz produziert?

Ps. Die ursprüngliche Frage, die ich bekam, war, dies zu erklären Nachteil, was bedeutet, dass GFP möglicherweise nicht sehr hell fluoresziert und daher schwer zu erkennen ist.

Danke für deine Hilfe.


GFP hat viele Vorteile:

  • Die Detektion der Fluoreszenz funktioniert direkt und erfordert keinen Lyseschritt oder die Aufnahme eines Reagenzes.
  • Fluoreszenz kann direkt mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop mit den Zellen nachgewiesen werden. Dies kann erfolgen, während sie auf Platten gezüchtet werden (funktioniert für Bakterien und eukaryontische Zellkulturen).
  • Sie können markierte Zellen mit einem Durchflusszytometer sortieren.
  • direktes Tagging von Proteinen und deren anschließende Lokalisierung auf der Zelle ist möglich.
  • GFP ist in den Zellen ziemlich stabil und nicht toxisch.

Mir sind keine Gene bekannt, die Proteine ​​kodieren, genauer gesagt Enzyme, die die Produktion einer fluoreszierenden Verbindung aus Zwischenprodukten katalysieren, die in einer durchschnittlichen Zelle vorhanden sind. Vermutlich bräuchte man einen ganzen Weg.

Daher vermute ich, dass sich die Frage nie wirklich gestellt hat.


IIRC, Pseudomonas fluorescens produziert ein Kohlenstoffgerüstmolekül um Eisenionen, das ein fluoreszierendes kleines Molekül produziert. Aber dafür müssten wahrscheinlich mehrere Enzyme exprimiert werden


Wissenschaftliche Grundlagen der Biotechnologie

Abstrakt

Die Fluoreszenzmikroskopie in ihren verschiedenen Formen ist zur vorherrschenden Methode in der biologischen Bildgebung geworden. Diese Dominanz ist zum großen Teil auf seine Einzelmolekül-Sensitivität und seine hervorragende Selektivität zurückzuführen, die chemisches, antikörper- oder genetisches Targeting von Markern auf interessierende Moleküle verwendet. Beugungsbegrenzte Auflösungsgrenzen von 200 nm axial und 500 nm lateral wurden in den 1870er Jahren für die optische Mikroskopie etabliert und bis vor kurzem fest gehalten. In den letzten zehn Jahren hat sich eine Vielzahl von Methoden herauskristallisiert, die das Potenzial haben, die Beugungsgrenzen der Auflösung um mindestens eine Größenordnung in den Bereich molekularer Dimensionen auch bei der Untersuchung lebender Zellstrukturen zu überschreiten. Dieser Artikel untersucht vier solcher Strategien auf dem sich schnell entwickelnden Gebiet der superauflösenden Mikroskopie: optische Nahfeld-Scanning-Mikroskopie, stimulierte Emission-Depletion-Mikroskopie, superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie und Photoaktivierungs-Lokalisationsmikroskopie und ihre relative, stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie.


Einheit 5 Fragen Genetik, DNA und andere Fluffs Flashcards Preview

Zellen enthalten Suppressorgene, die für Proteine ​​kodieren, die die Zellteilung und das Wachstum steuern. Beschreiben Sie, was unter einer Mutation zu verstehen ist, und erklären Sie, wie eine Mutation in Suppressorgenen zur Entwicklung eines malignen Tumors führen kann. (6)

Mutation des Suppressorgens – bis zu 4 Markierungen 1. Mutation ist eine Veränderung des DNA- / Sense-Strangs 2. Basensequenz verändert / z.B. 3. Suppressor-Gen produziert falsche Anweisungen / hat einen anderen Code 4. (Daher) andere Aminosäuresequenz 5. Andere Proteinstruktur / nicht funktionierendes Protein Bösartiger Tumor – bis zu 2 Markierungen 6. Zellteilung durch Mitose 7. Tumorzellen Wachstum abnormal / kontinuierlich / unkontrolliert / schnell 8. Tumorzellen breiten sich aus / dringen in andere Gewebe ein / bilden Sekundärtumoren / Metastasen 9. Über Blut / Lymphsystem

Erklären Sie, warum eine Mutation, die die Deletion einer Base beinhaltet, einen größeren Effekt haben kann als eine Mutation, bei der eine Base durch eine andere ersetzt wird

Deletion verursacht Frameshift / verändert Basensequenz (ab Mutationspunkt) verändert viele Aminosäuren / Aminosäuresequenz (ab diesem Punkt) Substitution verändert ein Codon / Triplett verändert eine Aminosäure / Code degeneriert / gleiche Aminosäure codiert für

Ein Gen wird aus mRNA (unter Verwendung von reverser Transkriptase) und nicht aus DNA gewonnen. Schlagen Sie vor, warum.

Idee, dass mRNA in großen Mengen in Zellen vorhanden ist, die das Protein herstellen /mRNA wurde bearbeitet / enthält keine Introns / mRNA-Codes für ein einzelnes Protein Schwierigkeiten, ein Gen unter allen Genen im Zellkern zu finden / große Mengen an mRNA, die für Insulin kodiert, werden in insulinproduzierenden Zellen vorhanden sein / Idee, dass mRNA "editiert" wird

enthält Gene/Nukleotide/DNA-Abschnitte/künstliche DNA von zwei Arten/2 Arten von Organismen

Beschreiben Sie eine Möglichkeit, wie sich die Struktur der DNA eines Gens durch eine Mutation verändern kann?

Addition / Deletion / Substitution eines Nukleotids / einer Base Substitutionen: Fehlsinn (Codon geändert, sodass für neue Aminosäure kodiert), Nonsense (Codon zu Stoppcodon geändert), still (Änderung der 3. Base eines Codons und immer noch Ergebnisse) in der gleichen Aminosäure durch degenerierten genetischen Code) Addition/Deletion: Frameshift wird verursacht, verändert die Basensequenz ab der Mutation und kann viele Aminosäuren verändern

(kurze) Länge der DNA einzelsträngig (Referenz zu RNA ablehnen) mit spezifischer Basensequenz/komplementäre Basensequenz zeigt an, wo die Replikation das Annealing beginnt/stoppt

Erklären Sie, wie die Verwendung einer Gensonde es ermöglichen könnte, das Vorhandensein eines mutierten Allels des Mukoviszidose-Gens nachzuweisen.

Sonde bindet (an mutiertes Allel) bindet an einen DNA-Strang als Ergebnis der Radioaktivität der komplementären Basenpaarung, die auf Film/Röntgenaufnahme/durch Autoradiographie nachgewiesen wurde (wenn mutiertes Allel vorhanden ist)

Zur Markierung von Anfang und/oder Enden des DNA-Teils, der benötigt wird / zur Anlagerung von Enzymen oder Nukleotiden / Initiator / Stränge getrennt hält An / komplementär zum Anfang des Gens / Ende des Fragments Replikation der Basensequenz von hier

DNA-Stück Einzelsträngig Komplementär zu/bindet an bekannte Basensequenz/Gen

Beschreiben Sie, wie die Struktur der DNA es ihr ermöglicht, ihre Funktion auszuführen

Zucker-Phosphat-Rückgrat verleiht Kraft Coiling verleiht kompakte Form Basenabfolge ermöglicht die Speicherung von Informationen Langes Molekül / Coiling speichert große Informationsmengen Komplementäre Basenpaarung ermöglicht die Replikation / Transkription von Informationen Doppelhelix schützt schwache Wasserstoffbrückenbindungen / Doppelhelix macht Moleküle stabil Viele Wasserstoffbrücken sorgen zusammen für Stabilität des Moleküls Verhindert Codeverfälschung Wasserstoffbrücken ermöglichen die Aufspaltung von Ketten für die Replikation / Transkription ODER das Molekül lässt sich für die Replikation / Transkription leicht entpacken.

Beschreiben Sie die molekulare Struktur der DNA und erklären Sie, wie eine DNA-Sequenz repliziert wird. (9)

Zusammensetzung eines Nukleotids, 4 Basen genannt Zucker-Phosphat „Rückgrat“ zwei (Polynukleotid) Stränge spezifische Basenpaarung Beispiel z.B. A–T / C–G-Wasserstoffbrücken „Entwickeln“ / „Entpacken“ semikonservative Replikation DNA-Polymerase neue komplementäre Stränge bilden / identisches DNA-Molekül produziert DNA in selbstreplizierende Plasmide eingefügt

1 Gen) Keine H-Brücken Keine Basenpaare

Erklären Sie die Bedeutung von Markergenen

Ermöglicht die Trennung transformierter Bakterien von nicht transformierten Weitere Details z.B. transformierte Bakterien überleben, wenn ein Antibiotikum auf das Medium aufgetragen wird

Erklären Sie, wie die Exposition gegenüber einem mutagenen Agens dazu führen kann, dass ein inaktives Enzym von einer Zelle produziert wird.

Änderung der Sequenz von Nukleotiden/Basen/Addition/Deletion/Substitution geänderte Reihenfolge der Aminosäuren/anderes Protein/andere Tertiärstruktur inaktives Enzym, wenn die Form des aktiven Zentrums geändert wird/Enzym-Substrat-Komplex bildet sich nicht

Eine Genmutation darf die Struktur des kodierten Proteins nicht verändern. Erkläre warum.

Degenerierter Code / klare Beschreibung (Neues Triplett) Codes für dieselbe Aminosäure

Erklären Sie, wie modifizierte Plasmide gentechnisch hergestellt werden und wie die Verwendung von Markern den Nachweis von Bakterien ermöglicht, die diese Plasmide enthalten.

das gewünschte Gen/DNA aus einem anderen Organismus isolieren/mRNA aus einer Zelle/einem Organismus unter Verwendung von Restriktionsendonuklease/Restriktionsenzym/reverser Transkriptase isolieren, um DNA zu erhalten klebrige Enden produzieren Ligase verwenden, um das gewünschte Gen mit dem Plasmid zu verbinden auch ein Markergen einschließen Beispiel für einen Marker, z. Antibiotikaresistenz Plasmid zu Bakterien zum Wachsen hinzufügen (Kolonien) (Replikat) auf Medium plattieren, auf dem das Markergen exprimiert wird Bakterien/Kolonien nicht abgetötet haben Antibiotikaresistenzgen und (wahrscheinlich) das gewünschte Gen Bakterien/Kolonien, die das Markergen exprimieren, haben das gewünschte Gen sowie

Erklären Sie, wie Elektrophorese funktioniert

Trennt DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe. DNA-Proben werden in in einem Aragose-Gel geschnittene Vertiefungen gegeben, die mit einer gepufferten Ionenlösung bedeckt sind. Strom wird durch das Gel geleitet und die negativ geladene DNA bewegt sich zur positiven Elektrode. DNA-Fragmente diffundieren durch die Poren im Gel, und die größeren Stücke haben einen größeren Bewegungswiderstand als kleinere Stücke und legen daher eine kürzere Strecke zurück

Was sind Restriktionsenzyme?

Dies sind Enzyme, die DNA an bestimmten Stellen schneiden, Erkennungssequenzen (palindromische Sequenzen) GAATTC, CTTAAG Einige Restriktionsenzyme schneiden gerade über beide Ketten und bilden stumpfe Enden. Die meisten Enzyme machen einen versetzten Schnitt in den beiden Strängen und bilden klebrige Enden. Die Produkte werden Restriktionsfragmente genannt

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann verwendet werden, um große Mengen an DNA herzustellen. Beschreiben Sie, wie die PCR durchgeführt wird. (6)

1. DNA auf 90 bis 95 °C erhitzt 2. Stränge trennen 3. Abgekühlt / auf eine Temperatur unter 70 °C 4. Primer binden 5. Nukleotide binden 6. Durch komplementäre Basenpaarung 7. Temperatur 70 - 75 °C 8. DNA-Polymerase verbindet Nukleotide miteinander 9. Zyklus wiederholt

• Medikamente und Medikamente können sicher in großen Mengen aus Mikroben statt aus geschlachteten Tieren hergestellt werden. Diese Medikamente kommen dem Menschen zugute und können auch Tierleid ersparen. • Die landwirtschaftliche Produktivität kann verbessert werden, während weniger Pestizide oder Düngemittel verwendet werden, was der Umwelt zugute kommt. GV-Pflanzen können auf zuvor ungeeigneten Böden oder in zuvor ungeeigneten Klimazonen wachsen. • GV-Pflanzen können die Ernährung und Gesundheit von Millionen von Menschen verbessern, indem sie die Nährwertqualität ihrer Grundnahrungsmittel verbessern.

Manchmal treten Fehler beim Kopieren einer Basensequenz auf. Erklären Sie, warum einige Fehler weniger schwerwiegende Folgen haben als andere.

Änderungen in der Basensequenz wirken sich nicht unbedingt auf die Aminosäure aus, für die kodiert wird/die meisten Aminosäuren haben mehr als einen Code Diese Codes unterscheiden sich nur in der dritten Base, sodass Änderungen in der dritten Base wahrscheinlich keine Änderung der Aminosäuresequenz/Proteinänderungen in . verursachen erste/zweite Base führt zu einer falschen Aminosäure in der Sequenz/Bildung des falschen Proteins/Beispiel einer Mutation, die diese Art von Veränderung verursacht Veränderung der vorhandenen Aminosäure hat möglicherweise keinen Einfluss auf die Funktion des Proteins/einige Aminosäuren, die in der Tertiärstruktur wichtiger sind als andere

DNA-Abschnitt entwickelt / entrollt DNA trennt, h-Bindungen brechen RNA-Nukleotide komplementäre Basenpaarung ausrichten / Beispiel für Paarung U ersetzt T mRNA-Polymerase (verbindet Nukleotide) mRNA wird modifiziert, Introns werden entfernt

Transformation ist der Prozess, bei dem versucht wird, das rekombinante Plasmid in die Bakterien einzuführen. Erklären Sie, wie Sie Bakterien identifizieren können, die das Plasmid enthalten

Replica-Plating Verwendung von Agarplatten mit Ampicillin/kein Tetracyclin und Agarplatten mit Tetracyclin in Bakterien mit humaner DNA Tetracyclin-Gen nicht mehr funktionsfähig/nicht resistent gegen Tetracyclin Bakterien mit humaner DNA wachsen auf Platte mit Ampicillin/kein Tetracyclin, werden aber durch Tetracyclin-Bakterien mit . abgetötet keine zusätzliche DNA im Plasmid nicht abgetötet,

Beschreiben und erklären Sie, wie die Genexpression kontrolliert wird (Prätranskription)


Der leuchtende Durchbruch von Biotech

Diese Mäuse leuchten, weil Wissenschaftler ein Gen, das in bestimmten biolumineszenten Quallen gefunden wurde, in ihre DNA eingefügt haben. Dieses Gen ist ein Rezept für ein Protein, das grün leuchtet, wenn es von blauem oder ultraviolettem Licht getroffen wird. Das Protein ist im ganzen Körper vorhanden. Dadurch strahlen ihre Haut, Augen und Organe ein unheimliches Licht aus. Nur ihr Fell glüht nicht.

Teru Wakayama Teru Wakayama

bei Advanced Cell Technology in Worcester, Massachusetts, machen diese Mäuse darauf aufmerksam, wie leistungsfähig die Gentechnik geworden ist. Sie unterstreichen auch die Bedeutung des grün fluoreszierenden Proteins, kurz GFP. Das leuchtende Protein ist heute ein weit verbreiteter biologischer Highlighter, der Wissenschaftlern hilft, Gene schneller zu finden und zu untersuchen. Aber nur wenige haben es bemerkt, wenn

Osamu Shimomura Osamu Shimomura

, damals Wissenschaftler in Princeton, entdeckte GFP vor 40 Jahren.

Osamu Shimomura Osamu Shimomura

entdeckte erstmals 1962 grün fluoreszierendes Protein (GFP). Zunächst war es nur eine Fußnote in einer wissenschaftlichen Arbeit über eine kleine, biolumineszierende Qualle namens Aequoria Victoria. Das Studium des Leuchtens dieser Qualle wurde Shimomuras Lebenswerk.

Ab 1967 pilgerte Shimomura 20 Jahre lang im Sommer nach Friday Harbor im Bundesstaat Washington. Mit seiner Frau, seinem Sohn und seiner Tochter sammelt er täglich mehr als 3.000 Quallen. Über mehrere Monate könnten das bis zu 50.000 Quallen mit einem Gesamtgewicht von zweieinhalb Tonnen sein.

Aus dieser riesigen Menge Quallen könnten vielleicht ein paar hundert Milligramm der leuchtenden Proteine ​​für Studienzwecke gereinigt werden. Eine einzelne Qualle braucht nicht viel lichtemittierendes Protein, um ihren linsenförmigen Körper zum Leuchten zu bringen.

Die durchschnittliche Aequoria Victoria ist drei bis vier Zoll breit und wie ein Regenschirm geformt, mit 100 lichterzeugenden Organen in der Größe von Mohnsamen, die an ihrem äußeren Rand angeordnet sind. In jedem Organ erzeugen zwei chemische Reaktionen das grüne Leuchten.

Ein Protein namens Aequorin erzeugt das Licht durch eine Reaktion, an der Calciumionen beteiligt sind. Aber dieses Licht ist blau. Grün fluoreszierendes Protein absorbiert dieses Blau und gibt es als grünes Leuchten wieder ab. Aequorin erhielt jahrelang die meiste Aufmerksamkeit. Sieben Jahre nachdem GFP erstmals identifiziert wurde, "entdeckte" ein Team von Harvard-Forschern es, ohne zuvor davon gehört zu haben.

Aequorin erwies sich als nützlich, insbesondere als Werkzeug zur Untersuchung von Nerven, die die Calciumionen verwenden, mit denen es reagiert. GFP würde schließlich zu einem wichtigen Werkzeug werden, mit dem Molekularbiologen Gene markieren, die sie untersuchen möchten. Aber zuerst musste das Gen gefunden werden, das das GFP-Protein erzeugt. Das würde Jahrzehnte dauern.

William Ward William Ward

Douglas Prasher Douglas Prasher

auf einer Quallenjagd-Expedition in den 1980er Jahren. Ward, Professor an der Rutgers University, hatte ein Jahrzehnt damit verbracht, einer der weltweiten Experten für das grün fluoreszierende Protein zu werden, das in der Qualle Aequoria gefunden wird. Prasher wollte das Gen finden, das GFP herstellt.

Prasher, ein Forscher am Woods Hole Oceanographic Institute, kannte Aequoria bereits gut. Er klonte das andere leuchtende Protein der Qualle, Aequorin, während er seine Abschlussarbeit an der University of Georgia machte. Aber das Klonen des GFP-Gens würde sich als schwierig erweisen, zu finanzieren und abzuschließen.

Nachdem er sich um Fördermittel bemüht hatte, erhielt Prasher ein dreijähriges Stipendium der American Cancer Society. Er verbrachte alle drei Jahre damit, eine genetische Sequenz zu finden, die dem Protein entsprach – eine Aufgabe, die heute schnell erledigt werden konnte. Als er 1992 fertig war, hatte er nicht mehr genug Geld, um das Gen in Bakterien einzubringen – ein notwendiger Test, um sicher zu sein, dass er die richtige DNA-Sequenz hatte.

Martin Chalfie Martin Chalfie

an der Columbia University und

an der University of California in San Diego versuchte das Protein schließlich in anderen Organismen mit Prashers Sequenzen. Chalfie wird allgemein die Popularisierung des Proteins zugeschrieben. Prasher erhielt keine Anstellung beim WHOI und wechselte in ein völlig anderes Feld.

Heute ist er Populationsgenetiker beim Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten in Wood's Hole, Massachusetts.

In den frühen 1990er Jahren benannte ein Columbia-Professor

Martin Chalfie Martin Chalfie

hörte, dass ein anderer Forscher, Douglas Prasher, versuchte, das Gen für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) zu lokalisieren, das in Quallen gefunden wurde. Aufgeregt rief Chalfie Prasher an und bat um eine Kopie des Gens.

Doch als Prasher das Gen nach jahrelanger Forschung endlich fand, war Chalfie im Sabbatical an der University of Utah. "Damals war er noch nie am Telefon", sagt Prasher. "Er hatte eine Freundin da draußen."

Prasher machte weiter und veröffentlichte seine Beschreibung des GFP-Gens. Chalfie fand diese wissenschaftliche Arbeit während der Arbeit mit einem Doktoranden heraus, und die beiden Forscher nahmen schließlich Kontakt auf. Prasher schickte Chalfie eine Kopie des sequenzierten Gens.

Viele bezweifelten, dass das GFP-Gen das leuchtende Protein selbst produzieren würde. Aber als Chalfie es in Bakterien steckte und sie mit blauem Licht beleuchtete, leuchteten sie. Chalfies Veröffentlichung von 1994 über das Gen machte es als genetischen Marker bekannt. Wissenschaftler könnten GFP mit einem anderen Gen verknüpfen, wenn dieses DNA-Stück in einer Zelle vorhanden wäre, würde es leuchten.

Was Chalfies Freundin angeht, eine bekannte Fruchtfliegenforscherin namens Tulle Hazelrigg: Die beiden heirateten und beide sind Professoren an der Columbia. Hazelrigg leistete ihren eigenen großen Beitrag zur GFP-Forschung: Sie war eine der ersten, die GFP an andere Proteine ​​anbrachte und es Wissenschaftlern ermöglichte, zu beobachten, wohin sich einzelne Proteine ​​​​innerhalb einer Zelle bewegen.

Martin Chalfies Kreation von Bakterien, die mit grün fluoreszierendem Protein leuchteten, ließ die Molekularbiologie in neuer Farbe explodieren. Wissenschaftler könnten das GFP-Gen an andere Gene anhängen. Anstatt komplizierte Tests durchzuführen, um zu sehen, ob es ihnen gelungen war, ein Gen in einen Organismus einzufügen, konnten Wissenschaftler einfach ein blaues Licht anstrahlen und nach dem Leuchten Ausschau halten.

"Es ist wie eine Rechtschreibprüfung, die Wörter unterstreicht, wenn Sie einen Fehler gemacht haben", sagt Rutgers-Professor Bill Ward, der schockiert war, dass Chalfies Bakterien überhaupt leuchteten. "Der Rest von uns wusste, dass es nicht funktionieren würde", sagt Ward.

Andere biolumineszierende Proteine ​​leuchten nur, wenn bestimmte Enzyme vorhanden sind. Aber GFP ist eine Betonwand eines Moleküls – es krümmt sich um sich selbst, so dass kein Platz für ein Enzym zum Binden ist. "Es ist wie die Füße von jemandem in Gangsterfilmen aus Jersey, wo man konkrete Überschuhe bekommt", sagt GFP-Forscher Roger Tsien.

Eine weitere Überraschung: Viele Gene produzieren halbgare Proteine, die mit anderen Proteinen anderer Gene interagieren müssen, um zu funktionieren. Dies gilt jedoch nicht für GFP - es braucht überhaupt keine Hilfe.

Das grün fluoreszierende Protein wurde ursprünglich verwendet, um herauszufinden, ob überhaupt Gene vorhanden sind. Dann

Tüll Hazelrigg Tüll Hazelrigg

, Professor an der Columbia University, modifizierte Gene in Fruchtfliegen so, dass die von ihnen hergestellten Proteine ​​mit GFP angeklebt sind. Das Ergebnis ist, als würde man Ihrem Hund eine Taschenlampe an den Kopf binden. Selbst bei völliger Dunkelheit können Sie sehen, wo er ist.

Mit solchen Fusionsproteinen kann ein Wissenschaftler genau verfolgen, wohin sich ein Protein in einer Zelle oder im Körper eines Tieres bewegt. In diesem Fall untersuchte Hazelrigg ein Protein, das an der Produktion von Spermien und Eizellen beteiligt ist. Die hellen Flecken dieser männlichen Larve sind die Hoden der Fliege. Der Rest der Larven ist grün, da das GFP aufgrund der Biolumineszenz im Darm hauptsächlich in den Fortpflanzungsorganen exprimiert wird.

Die Schaffung transgener Tiere, die das GFP-Gen enthalten, ist immer wichtiger geworden. Bei Mäusen hat GFP beispielsweise die Forschung an adulten Stammzellen ermöglicht. Stammzellen, die einer Maus entnommen und in eine andere eingesetzt werden, sind an ihrem grünen Leuchten zu erkennen.

Wissenschaftler, die grün fluoreszierendes Protein in Zellen einbauen wollen, sind nicht mehr auf Grün beschränkt. Das Protein gibt es jetzt in gelben und blauen Sorten. Im Allgemeinen ist das im Labor beobachtete GFP nicht dasselbe wie bei Quallen.

, ein Professor an der University of California in San Diego, mutierte und veränderte das GFP-Gen auf andere Weise, um verschiedene Farben zu erzeugen. Er hat es auch geschafft, es heller zu machen. Das in der Aequoria-Qualle gefundene GFP erzeugt einen Teil seines Lichts, wenn es von ultraviolettem Licht getroffen wird, einiges, wenn es von verschiedenen Blautönen getroffen wird. Tsiens Version des Proteins erzeugt sein gesamtes Licht, wenn es von einer einzigen Farbe getroffen wird.

GFP ist ein wertvolles Werkzeug, und Tsiens Bastelei hat es noch wertvoller gemacht. Das geistige Eigentum, das alle GFP-Arbeiten umgibt, ist schlammig, aber Tsiens Patente waren stark genug, um als eine der Grundlagen für eine Biotechnologie namens Aurora Biosciences zu dienen. Aurora wurde kürzlich von Vertex Pharmaceuticals für fast 600 Millionen US-Dollar in Aktien gekauft.


Fluoresceinisothiocyanat (FITC)

Fluoresceinisothiocyanat ist einer der beliebtesten organischen Fluoreszenzfarbstoffe/-sonden, die in der Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz verwendet werden. Es zeichnet sich durch eine maximale/Spitzen-Absorption von 495 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm mit Fluorescein-zu-Fluorescein-Wechselwirkungen aus, die bei Konzentration zu Energieübertragung und Selbstlöschung führen.

Das Markieren von Molekülen mit dem Farbstoff kann für folgende Zwecke verwendet werden:

  • Nachweis von Proteinen nach elektrophoretischen Trennungen
  • Mikrosequenzierungsanalyse von Proteinen und Peptiden
  • Molekülanalyse mittels Kapillarzonenelektrophorese
  • Molekülverfolgung und -erkennung in Biointeraktionen
  • Antigennachweis in Zellen und Gewebeschnitt
  • Apoptose-Nachweis durch Markierung von DNA-Fragmenten

Fluoresceinisothiocyanat ist nicht nur aufgrund seiner Löslichkeit in Wasser einfach für die Konjugatherstellung zu verwenden, sondern ist auch hell fluoreszierend (aufgrund der großen Extinktionskoeffizienten und hohen Quantenausbeuten nach der Konjugation), was es zum Farbstoff der Wahl für viele Prozesse macht.

* In der Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie wird der Farbstoff mit verschiedenen Antikörpern (primäre oder sekundäre Antikörper) konjugiert, um Zustände wie die IL-17-Immunschwäche und die Rolle von CD63 bei der Nierenfunktion usw. zu untersuchen und zu untersuchen.

* Als Derivat von Fluorescein enthält Fluoresceinisothiocyanat eine reaktive Isothiocyanatgruppe, die zu seiner reaktiven Natur gegenüber den Anime- und Sulfhydrylgruppen beiträgt, die typischerweise in Biomolekülen vorkommen.


Talk-Übersicht

Die Bildgebung lebender Zellen wurde durch die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) revolutioniert. Roger Tsien spricht über fluoreszierende Proteine ​​und behandelt die Geschichte von GFP, wie es sich faltet und fluoresziert, wie es mutiert wurde, um zusätzliche Farben (Blau, Cyan, Gelb) zu erzeugen. Es umfasst auch neuartige photoschaltbare und photoaktivierbare fluoreszierende Proteine, deren Farbe durch Licht verändert werden kann, sowie neue infrarotfluoreszierende Proteine.

Fragen

  1. Von welchem ​​Organismus wurden rot fluoreszierende Proteine ​​gewonnen?
  2. Welche der folgenden Aussagen trifft auf die Bildung des GFP-Fluorophors zu?
    1. Bei der Reaktion entsteht Wasserstoffperoxid
    2. Die Chemie zur Herstellung des GFP-Fluorophors erfolgt wenige Sekunden nach der Proteinfaltung
    3. Das Fluorophor bildet sich in anaeroben Umgebungen
    4. Das Glycincarbonyl ist entscheidend für die Cyclisierungsreaktion
    1. Machen Sie die Proteinfalte besser
    2. Verschieben Sie das Emissionsspektrum
    3. Verschieben Sie das Anregungsspektrum
    4. Produzieren eine schnellere Reifung des Fluorophors
    1. Dendra photoaktiviert mit blauem Licht und verschiebt seine Emission von Blau zu Grün
    2. Die einzigartige Eigenschaft von Dronpa besteht darin, dass seine Fluoreszenz verschwindet, aber durch rotes Licht photoaktiviert werden kann
    3. Blau fluoreszierendes Protein wäre eine gute Wahl für die Bildgebung des tiefen Gewebes
    4. Infrarot fluoreszierende Proteine ​​benötigen den Cofaktor Biliverdin

    Antworten


    Wie steuern Gene die Produktion von Proteinen?

    Die meisten Gene enthalten die Informationen, die benötigt werden, um funktionelle Moleküle, die Proteine ​​genannt werden, herzustellen. (Einige Gene produzieren regulatorische Moleküle, die der Zelle beim Zusammenbau von Proteinen helfen.) Der Weg vom Gen zum Protein ist komplex und wird innerhalb jeder Zelle streng kontrolliert. Es besteht aus zwei Hauptschritten: Transkription und Übersetzung. Transkription und Translation werden zusammen als Genexpression bezeichnet.

    Während des Transkriptionsprozesses wird die in der DNA eines Gens gespeicherte Information an ein ähnliches Molekül namens RNA (Ribonukleinsäure) im Zellkern weitergegeben. Sowohl RNA als auch DNA bestehen aus einer Kette von Bausteinen, die als Nukleotide bezeichnet werden, aber sie haben leicht unterschiedliche chemische Eigenschaften. Der RNA-Typ, der die Informationen zur Herstellung eines Proteins enthält, wird als Boten-RNA (mRNA) bezeichnet, weil er die Informationen oder Botschaften von der DNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma transportiert.

    Die Translation, der zweite Schritt, um von einem Gen zu einem Protein zu gelangen, findet im Zytoplasma statt. Die mRNA interagiert mit einem speziellen Komplex namens Ribosom, der die Sequenz der mRNA-Nukleotide "liest". Jede Sequenz aus drei Nukleotiden, Codon genannt, kodiert normalerweise für eine bestimmte Aminosäure. (Aminosäuren sind die Bausteine ​​von Proteinen.) Eine Art von RNA namens Transfer-RNA (tRNA) baut das Protein um eine Aminosäure nach der anderen zusammen. Der Proteinaufbau wird fortgesetzt, bis das Ribosom auf ein „Stopp“-Codon trifft (eine Sequenz aus drei Nukleotiden, die nicht für eine Aminosäure kodiert).

    Der Informationsfluss von DNA über RNA bis hin zu Proteinen ist eines der Grundprinzipien der Molekularbiologie. Es ist so wichtig, dass es manchmal das „zentrale Dogma“ genannt wird.

    Durch die Prozesse der Transkription und Translation werden Informationen von Genen verwendet, um Proteine ​​herzustellen.


    3 wichtige Beispiele für transgene Tiere | Genetik

    Die folgenden Punkte heben die drei wichtigen Beispiele für transgene Tiere hervor. Die Beispiele sind: 1. Cloning Dolly 2. Transgene Mäuse 3. Reporter-System.

    Beispiel # 1. Dolly klonen:

    Im Februar 1996 berichteten Ian Wilmut und Mitarbeiter vom Roslin Institute und PPL Therapeutics, beide in Edinburgh, Schottland, im Nature Journal, dass sie erfolgreich ein Schaf aus einer Zelle aus dem Euter eines sechsjährigen Mutterschafes geklont hatten.

    Das geklonte Lamm wurde Dolly genannt. In der Vergangenheit wurden genetisch identische tierische Embi70s nur mit Amphibienzellen erzeugt, und solche aus adulten Kernen hatten nie das Erwachsenenalter erreicht. Klonen, bei denen die Kerne aus fötalen Zellen oder Zellen aus Zelllinien stammten, waren bereits bei Säugetieren erfolgreich. Das Wort Klon bedeutet, eine genetisch identische Kopie zu erstellen.

    Um ein Tier zu klonen, muss man mit einem Ei beginnen, der einzigen Zelle, von der bekannt ist, dass sie die Entwicklung einleitet und unterstützt. Um ein Individuum zu klonen, ist es notwendig, ein Ei ohne Kern zu bekommen und dann einen Kern bekannter Herkunft darin zu verpflanzen.

    In den 1950er Jahren wurden Techniken zur Kerntransplantation bei Fröschen und Kröten ausgearbeitet. Den schottischen Wissenschaftlern gelang es, Schafeier zu gewinnen, sie zu entkernen (ihre Kerne zu entfernen) und dann in Spenderkerne zu übertragen, indem sie die Spenderzellen und die entkernten Eier mit einem elektrischen Impuls verschmolzen.

    Der elektrische Impuls leitete auch die Entwicklung des Eies ein. Obwohl nur eine der neunundzwanzig eingeleiteten Schwangerschaften erfolgreich war, schien das Lamm, das geboren wurde, in jeder Hinsicht normal zu sein, da es Nachkommen gezeugt hatte.

    Andere hatten diese Art von Experimenten mit vielen Tierarten versucht, einschließlich Mäusen. Sie waren aus zahlreichen Gründen nicht erfolgreich. Die wahrscheinlichste Erklärung für den jüngsten Erfolg ist laut Wissenschaftlern, dass die Spenderzellen mehrere Tage in einer Nicht-Wachstumsphase gehalten wurden, was sie möglicherweise mit der Eizelle synchronisiert hat.

    Somit befanden sich Kern und Eizelle im gleichen Stadium des Zellzyklus und waren somit kompatibel. Weitere Reorganisation, die in den Spenderchromosomen stattfinden musste, sind nicht genau bekannt, aber eines ist klar: Der Zellkern einer erwachsenen Zelle des Schafes verfügt über das gesamte genetische Material, das für ein normales Wachstum und eine normale Entwicklung der Eizelle erforderlich ist. Die Arbeit wurde seitdem mit Ziegen, Rindern und Mäusen wiederholt.

    Der Erfolg dieser Arbeit hat verschiedene Konsequenzen:

    1. Das Klonen von Säugetieren könnte zu einem Routineverfahren werden. Dies würde es uns ermöglichen, die Entwicklung von Säugetieren zu untersuchen und genetisch identische Individuen zu replizieren, insbesondere transgene Tiere, die ein besonderes wertvolles Genom haben würden.

    2. Wir können diese Techniken auch verwenden, um das Altern zu untersuchen, da ein “alter” Kern die Entwicklung eines neuen Organismus einleitet.

    3. Von Interesse ist auch die Wechselwirkung eines bestimmten Genoms mit einem bestimmten Zytoplasma, da das Zytoplasma nicht nur das Material enthält, das für die frühe Entwicklung benötigt wird, sondern auch Zellorganellen, einschließlich Mitochondrien, die ihr eigenes genetisches Material haben.

    Beispiel # 2. Transgene Mäuse:

    Tierische Zellen können, wie die Protoplasten von Pflanzenzellen, mit sehr geringer Effizienz (in Gegenwart von Calciumphosphat) fremde Chromosomen oder DNA direkt aus der Umgebung aufnehmen. Die direkte Injektion der DNA verbessert die Effizienz erheblich.

    Beispielsweise werden transgene Mäuse heute routinemäßig präpariert, indem DNA entweder in Eizellen oder ein- oder zweizellige Embryonen von weiblichen Mäusen nach entsprechender hormoneller Behandlung injiziert wird.

    Nach Injektion von etwa 2 Pikolitern (2 × 10 –12 Liter) klonierter DNA werden die Zellen in die Gebärmutter empfänglicher weiblicher Wirte reimplantiert. Bei etwa 15% dieser Injektionen baut sich die fremde DNA in den Embryo ein.

    Transgene Tiere werden verwendet, um die Expression und Kontrolle fremder eukaryontischer Gene zu untersuchen. 1988 wurde eine transgene Maus, die anfällig für Krebs ist, als erstes gentechnisch verändertes Tier patentiert. Somit stellt die Maus ein ausgezeichnetes Modell zur Untersuchung von Krebs bereit. (Es entstand eine Kontroverse darüber, ob manipulierte höhere Organismen patentierbar sein sollten, was sie derzeit sind).

    Mäuse wurden bereits erfolgreich mit einem Ratten-Wachstumshormon-Gen transfiziert, und es wurden transgene Schafe produziert, die das Gen für einen menschlichen Gerinnungsfaktor exprimieren. Der jüngste Streit um rekombinante DNA entstand beim Klonen von Schafen im Jahr 1997.

    Die Transfektion kann auch durch Retroviren (RNA-Viren, die das Gen für reverse Transkriptase enthalten) vermittelt werden. Zum Beispiel wurde ein retroviraler Vektor einer Ritrodierung unterzogen und menschliche weiße Blutkörperchen repariert, denen das Enzym Adenosindeaminase fehlt.

    Ein Retrovirus, das für eine Form von Leukämie bei Nagetieren verantwortlich ist, die Moloney Murine Leukämieviren, wurden so konstruiert, dass alle Virusgene entfernt und durch einen antibiotischen Marker (Neomycin-Resistenz) und das menschliche Adenosindeaminase-Gen ersetzt wurden.

    Das Virus bindet an die Zelloberfläche und wird in die Zelle aufgenommen, seine RNA wird durch reverse Transkription in DNA umgewandelt und die DNA wird in eines der Zellen, Chromosomen, eingebaut. Es ist dem stark modifizierten Virus nicht möglich, die Zellen anzugreifen und zu schädigen.

    Beispiel # 3. Meldesystem:

    Zwei Reportersysteme werden verwendet, um anzuzeigen, dass ein Transfektionsexperiment erfolgreich war. Pflanzen können mit den Ti-Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens transfiziert werden. Wenn eine Pflanze mit A. tumefaciens infiziert wird, das das Ti-Plasmid enthält, wird ein Kronengallentumor induziert, indem die T-DNA-Region übertragen wird.

    Die mit der T-DNA transfizierten Zellen werden sowohl zum Wachstum als auch zur Produktion von Opinen induziert, von denen sich die Bakterien ernähren. Viele neuere Forschungen haben sich darauf konzentriert, Ti-Plasmide so zu verändern, dass sie andere Gene enthalten, die während der Infektion ebenfalls auf die Wirtspflanzen übertragen werden, wodurch transgene Pflanzen entstehen. Eine Reihe von Experimenten war besonders reizvoll.

    Tabakpflanzen wurden mit Ti-Plasmiden transinfiziert, die das Luciferase-Gen von Glühwürmchen enthalten. The product of this gene catalyzes the ATP- dependent oxidation of luciferin, which emits light. When a transfected plant is watered with luciferin, it glows like a firefly. The value of these experiments is not the production of glowing plants but rather the use of the glow to “report” the action of specific genes.

    In further experiments, the promoters and enhancers of certain genes were attached to the luciferase gene. As a result, luciferase would only be produced when these promoters were activated thus, the glowing areas of the plant show where the transfected gene is active.

    One of the more recent reported systems developed uses a gene from jellyfish that produces green fluorescent protein. The value of this system is that it “reports” when ultra-violet light falls on it, rather than it requiring an addition, as in the luciferase system (see Tamarin, 2002).


    Lecture 17: Genomes and DNA Sequencing

    Professor Martin talks about DNA sequencing and why it is helpful to know the DNA sequence, followed by linkage mapping and then the different methods of sequencing DNA.

    Lehrer: Adam Martin

    Lecture 1: Welcome Introdu.

    Lecture 2: Chemical Bonding.

    Lecture 3: Structures of Am.

    Lecture 4: Enzymes and Meta.

    Lecture 5: Carbohydrates an.

    Lecture 9: Chromatin Remode.

    Lecture 11:Cells, The Simpl.

    Lecture 16: Recombinant DNA.

    Lecture 17: Genomes and DNA.

    Lecture 18: SNPs and Human .

    Lecture 19: Cell Traffickin.

    Lecture 20: Cell Signaling .

    Lecture 21: Cell Signaling .

    Lecture 22: Neurons, Action.

    Lecture 23: Cell Cycle and .

    Lecture 24: Stem Cells, Apo.

    Lecture 27: Visualizing Lif.

    Lecture 28: Visualizing Lif.

    Lecture 29: Cell Imaging Te.

    Lecture 32: Infectious Dise.

    Lecture 33: Bacteria and An.

    Lecture 34: Viruses and Ant.

    Lecture 35: Reproductive Cl.

    PROFESSOR: And today I'm going to talk about DNA sequencing. And I want to start by just sort of illustrating an example of how knowing the DNA sequence can be helpful. So you remember in the last lecture, we talked about how one might identify a gene through functional complementation. And this process involved making a DNA library that had different fragments of DNA cloned into different plasmids and then involved finding the needle in the haystack where you find the gene that can rescue a defect in a mutant that you have.

    So if this line that I'm drawing here is genomic DNA, and it could be genomic DNA from, let's say, a prototroph for LEU2, the leucine gene. So this is from a prototroph.

    Then you could cut up the DNA with EcoRI. And if there is not a restriction site in this LEU2 gene, you get a fragment that contains the LEU2 gene. And then you could clone this into some type of plasmid that replicates in the organism that you're introducing it and propagating it in.

    And so that would allow you to then test whether or not this piece of DNA that you have compliments a LEU2 auxotroph, OK?

    Now one thing I want to point out is that because these EcoR1 sites, these sticky ends, would recognize this EcoR1 one end or this EcoR1 end, you can imagine that this gene-- if the gene reads this way to this way-- it could insert this way into the plasmid. Or it could insert in the opposite direction. So it could be inverted. So this would have some sort of origin of replication and some type of selectable marker.

    But if you have the same restriction site it can insert one way or the opposite way. That's just one thing I wanted to point out.

    Now let's say rather than leucine, you're interested in cycling dependent kinase, and you had a mutant end CDK and you had this sequence of your yeast CDK gene. Well, rather than having to dig through a whole library of pieces of DNA for the CDK gene, basically you're sort of fishing for that needle in the haystack. If you knew the sequence of the human genome, you'd be able to identify similar genes by sequence homology.

    And you could then take a more direct approach, where you take-- let's say you have a piece of human DNA now, double stranded DNA, and it has the CDK gene. You could take human DNA with this CDK gene. And you have unique sequence around the CDK gene, which would allow you to denature this DNA. And if you denature the DNA, you'd get two single strands of DNA. And you could then design primers that recognize unique sequences flanking the CDK gene.

    So you could imagine you'd have a primer here and a primer here. And then you could use PCR to amplify specifically CDK gene from, it could be the genome or from some library. And then you get this fragment here, which includes CDK. So knowing the sequence of the genome would allow you to more rapidly go from maybe a gene that you've identified as being important in one organism, and find the human equivalent that might be doing something similar in humans. So this step here is basically PCR.

    And let's say the CDK gene had restriction sites. Let's see, we'll say restriction site K and A here. Then if you have these restriction sites in your fragment of DNA, you can then digest or cut that piece of DNA with these restriction endonucleases. And then you'd get a fragment of CDK that has K and A sticky ends. We'll pretend that both of these have sticky ends.

    And now you have unique sticky ends between K and A. And you might have a vector that also has these two sites. And you could digest this vector with these two enzymes. And that would allow you to insert the specific gene in this plasmid.

    And if you have two unique sites, because K only recognizes K here and A only recognizes A, then it will ligate in. But you can do it with a specific orientation because you have two different restriction sites. So I hope you all see how it's with one restriction site versus two.

    Gut. Now let's say you want to do something more complicated than this. Let's say rather than just identifying the gene that's involved in cell division, you want to engineer a new gene, in order to determine where this particular protein, CDK, localizes in the cell. So we have CDK, which could be from yeast or human, it doesn't matter. And you want to engineer a new protein, basically, that you can see.

    So remember Professor Imperiali introduced green fluorescent protein earlier in the year. And this green fluorescent protein is from a gene from jellyfish. So now we could, using what I've told you, reconstruct or engineer a gene that has DNA from three different organisms, in order to make a CDK variant that we are able to see in the cell.

    So remember, a green fluorescent protein is like a beacon, if it's attached to a protein. If you shine blue light on it, it emits green light. And so you can use a fluorescent microscope in order to see it.

    In this case, let's say there's also another restriction site here, R. And let's say you have a fragment of GFP that has two restriction sites, A and R. You could then cut this fragment and this fragment with these restriction enzymes A and R. And you could insert GFP at the C terminus of the CDK gene. So you could go and have a gene that has CDK GFP inserted inside a bacterial vector.

    Now which one of these junction sites do you think would be most sensitive in doing this type of experiment? So there are three junction sites. There's this one, this one, and this one. Which is the one you're probably going to put the most thought into when you're doing this experiment?

    ADAM MARTIN: The A site. Miles is exactly right. This one is going to be important. And why did you choose that site?

    AUDIENCE: Of the three sites, two are half insert, half originals [INAUDIBLE]. But at A, both sides of it are inserts. So [INAUDIBLE] carefully.

    ADAM MARTIN: And if you're trying to make a fusion protein, what's going to be an important quality of this? Malik, DID you have a point?

    AUDIENCE: Well, they try to [INAUDIBLE] we'd have to make sure that the [INAUDIBLE].

    ADAM MARTIN: Excellent job. So Malik just pointed out two really important things. To make this a fusion protein, you have two different open reading frames. These two open reading frames have to be in frame with each other.

    So this junction here has to be in frame where GFP is in frame with CDK, meaning that you're reading the same triplet codons for GFP, there in the same frame as CDK. Also, you want to make sure there's no stop codon here. Because if you had a stop codon here, you're just going to make a CDK protein. And then it's going to stop and then you won't have it fused to GFP.

    And you guys will work through more of these in the homework. So you'll be able to get a sense of it.

    So now for the remainder of this lecture and also for Monday's lecture, I want to go through a problem with you. Basically, if you have a given disease that's heritable, how might you go from knowing that disease is heritable to finding out what gene is responsible for that given disease? And this is going to involve thinking about different levels of resolution, in terms of maps.

    So the highest resolution map you can have for a genome is the sequence. You can have the full nucleotide sequence of a genome. And that's the highest possible resolution because you have single nucleotide resolution as to what every single base pair is. But that's like knowing like your apartment number and your street number and basically knowing everything. But starting out, you might want to know what continent it's on, or what country is it in.

    And so you first have to narrow down the possible locations for a given disease gene. And that will, at first, involve establishing what chromosome and what region of a chromosome a given disease allele is linked to. And that involves making essentially a linkage map, where you establish where a disease gene is located based on its linkage to known markers that are present in the genome.

    Now this is going to require that you remember back two weeks ago, to when we talked about linkage and recombination. And you'll recall that we were looking at the linkage between genes and flies and genes and yeast. One difference between that type of linkage mapping and human linkage mapping is we don't have really clear traits that are defined by single genes. You can't just take hair color and map the hair color gene to link it to a disease gene. Because hair color is determined by many, many different genes.

    So in fruit flies, you can take white eyes and see if it's connected with yellow body color because both of those are determined by single genes. So we need something other than just having phenotypic traits that we can track. We need what are known as molecular markers to be able to perform linkage mapping.

    And so what we need in these molecular markers-- well, if we just think about if we wanted to determine the linkage between the A and B genes. And if you did this cross, would you be able to determine linkage?

    Georgia, you made a motion that was correct. Tell me. Why did you shake your head no?

    AUDIENCE: They'd all be heterozygous.

    ADAM MARTIN: Yeah they'd all be heterozygous. Because this individual has the same allele on both chromosomes, you're not going to be able to differentiate one chromosome from the other. And so the point I want to make is that in order to see linkage, what you need is variation.

    So we need to have variation. And another term for genetic variation is polymorphism. So we need polymorphism, or genetic variation, between these molecular markers.

    We also need genetic variation in the disease. But we have that. We have individuals that are affected by a disease and individuals that are not affected by a disease. So we have variation in alleles there. But in order to map it with a molecular marker, to map linkage to a molecular marker, you also need variation here. So the problem with this cross is here you need to have heterozygote. There needs to be variation in this individual, where both of these alleles are heterozygous.

    So now I want to talk about some of these molecular markers that we can use, and how they vary between individuals and between chromosomes. Now this is going to be maybe the lowest resolution map. But I'm talking about this linkage map here. And you can see highlighted that the bottom here are various types of polymorphisms that we can use to link a given disease allele to a specific chromosome and a specific place on chromosome.

    So I'll start with the first one, which is a simple sequence repeat. It goes by many names. But I will stick with what's on the slide.

    So a simple sequence repeat is also known as a microsatellite. So you might see that term floating around, if you're reading about this. And what a simple sequence repeat is, as the name implies, it's a simple sequence. It could be a dinucleotide, like CA. And it's just a dinucleotide that's repeated over and over again.

    So on a chromosome, you might have a unique sequence, which I'll just draw as a line. , And then you could have a CA dinucleotide that's repeated some number of times, N. And then that's followed by another unique sequence. And that's what's present in it.

    So that would be one strand. And then in the opposite strand, you'd have a unique sequence, the complement of CA, which is GT, and then, again, unique sequence. And so there's variation in the number of repeats of the CA. And so there's polymorphism. So we can use this to establish linkage between this marker and a phenotype, like a disease phenotype.

    So how might you detect the number of repeats that are present here? Anyone have an idea of a tool that we've discussed that could be used here? So one hint that I gave you is that the sequence here is unique and the sequence here is unique. So is there a way we can leverage that unique sequence to determine whether there's a difference in the number of repeats?

    What's a technique we discussed that involves some component of the technique recognizing a unique sequence? Yeah, Natalie?

    ADAM MARTIN: Well, CRISPR Cas9 is a possibility. Jeremy, did you have an idea?

    ADAM MARTIN: PCR-- so it's true. You could get it to recognize that. But then you have to detect it, somehow. So what's more commonly used is PCR. Those are both good ideas. But using PCR, you could design a primer here and a primer here. And you could amplify this repeat sequence. And the number of repeats would determine the size of your PCR fragment.

    So if you did PCR, then you'd get a PCR fragment that has the primers on each end, but then has this certain size based on the number of repeats. So in that case, we need some sort of tool that enables us to determine the size of a particular DNA fragment. And so I'm going to just introduce to you one such tool, which is gel electrophoresis.

    And gel electrophoresis involves taking DNA that you've generated, by either PCR or by cutting up DNA with a restriction enzyme, and loading it in a gel that has agarose. Maybe it's composed of agarose. It could be composed of polyacrylamide. And then because DNA is negatively charged, the backbone, if you run a current through it, such as the positive electrode is at the bottom, then the DNA is going to snake through this gel.

    Now we'll do a quick demonstration, if you two could come up. I need one volunteer. Ori, find 10 of your friends and bring them down. Gut. That's probably good. Ja.

    All right, Hannah, why don't you-- you guys have to link up, OK? Stay over here. We'll start at this end. This is the negative electrode over here. The positive electrode is going to be down there. And Jackie is going to be our single nucleotide. You guys link like-- yeah. You don't have to do-si-do, or anything like that.

    Gut. Now what I want you guys to do is I want you to slalom through these cones like it's all agarose gel. So that you're going towards the other side. And I'm going to turn on the current now. So go. All right, stop.

    Gut. See how the shorter DNA fragment is able to more easily navigate through the cones and get farther. So it was somewhat rigged. Ich kenne. But I just needed some way to make sure you always remember that the shorter nucleotide, or the shorter fragment, is going to migrate faster.

    You guys can go back up. Thank you for your participation. Let's give them round of applause.

    Gut. So what you just saw is that the longer DNA fragments, they're going to be more inhibited by moving through the gel. And so they're going to move slower and thus, not move as far in the gel. Whereas, the small fragments are going to move much faster because they're able to maneuver their way through this gel much more quickly. So there's going to be an inverse proportionality between the size of the DNA chain and its rate of movement. You're always going to see the shorter DNA fragment moving faster.

    So what one of these gels actually looks like is shown here. So this is a DNA gel that's agarose. And DNA has been run in these different samples. And what you're seeing is this gel is subsequently stained with a dye, like ethidium bromide, which allows you to visualize the individual DNA fragments. And so a band on this gel indicates a whole bunch of DNA fragments that are all roughly the same length. So essentially, you can measure DNA length using this technique.

    What's over here at the end of the gel, this is probably some sort of DNA ladder, where you have DNA fragments of known length that you can use to calibrate the length of these bands over here. So this is how you measure DNA length. And we're going to use it over and over again, as we talk about DNA and sequencing.

    So now, let's think about how this is going to help us establish linkage between a particular marker in the genome and a genetic disease. So if we think about these microsatellite repeats, I told you they're polymorphic. They exhibit a lot of variation in size. And so here's an example showing you a female who has two intermediate sized microsatellites. And if you look at this-- if you did PCR and measured the size of these, you get two different bands because there are two different alleles of different length here.

    So you can see this individual has two intermediate length repeats. And this person has had children with an individual that has a short and a long microsatellite. And you can see that on the gel, here.

    Now this female is affected by some disease. And these two individuals have children. And you can see that a number of those children are affected by the disease. So what mode of inheritance does this look like? If you had your choice between autosomal recessive, autosomal dominant, sex linked dominant, and sex linked recessive, what mode of inheritance is this looking like? Oh, Carmen.

    AUDIENCE: Autosomal recessive.

    ADAM MARTIN: Autosomal recessive? Why do you go with recessive? Yeah, go ahead.

    AUDIENCE: Because there is a male that's affected. But not both of the parents are affected. So it seems like the father is heterozygous and the mother is homozygous recessive.

    ADAM MARTIN: That's possible. That's exactly the logic I want to see. Is there another possibility? Yeah, Jeremy.

    AUDIENCE: Autosomal dominant.

    ADAM MARTIN: It could also be autosomal dominant. So you're right. Du hast recht. If this was not a rare disease, then that male could care be a carrier and could be passing it on to half the children. So that's good. You'd essentially need more information to differentiate between autosomal recessive and autosomal dominant.

    For the purposes of this, we're going to go with autosomal dominant. And what you see is that you want to look at the affected individuals and see if the disease phenotype is linked, or connected, with one of these microsatellite alleles. So if we look at-- we basically PCR DNA from all these individuals. And if you look at who is affected, each one of the individuals has this M double prime band. And none of the unaffected individuals has it.

    So obviously, it would be better to have more pedigrees and more data to really establish significance between this linkage. But this is just a simple example, showing what you could possibly see if you have one of these molecular markers linked to a particular disease allele. So that kind of establishes the principle.

    Now let's think about what are some other molecular markers that are possible? So another type of marker, and this is one that's the most common one, if I go here. So here, you see here's is a linkage map, here. And you see most of these bands are green. And the green markers, here, are what are known as Single Nucleotide Polymorphisms, or SNPs.

    So single nucleotide polymorphisms-- and this is abbreviated SNP. And what a single nucleotide polymorphism is, is it's a variation of a nucleotide at a single position in the genome. So it's just a one base pair difference at a position. So there's variation of single nucleotide at a given position, at a position in the genome. And because that's a pretty general definition, there are tons of these in the genome.

    Now one thing to think about is you could have a mutation in an individual that creates a SNP. So you could have a de novo formation of a SNP. But if you have a SNP and it gets incorporated to the gametes of an individual, then that variant is going to be passed on to the next generation. So this is something that could occur de novo. But it is also heritable. And if it's heritable, then you can follow it and use it to determine if a given variant is linked to a given phenotype, like a disease.

    So to identify a single nucleotide polymorphism, it's helpful to be able to sequence the DNA. And I'll talk about how we could do that in just a minute. But before I go on, I just want to point out a subclass of SNPs that can be visualized without sequencing. And these are called restriction fragment length polymorphisms.

    So restriction fragment-- so it's going to involve some type of restriction enzyme digest length polymorphism. It's a long word. But it's abbreviated RFLP. And what this is, is it's a variation of a single nucleotide. But this is a subclass of SNP. Because this is when the variation occurs in a restriction site for a restriction enzyme.

    So if you remember your good friend EcoR1, EcoR1 recognizes the nucleotide sequence GAATTC. And EcoR1 only cleaves DNA sequence that has GAATTC. So if there was a single nucleotide variation in the sequence, such that it's now GATTTC, or something like that, that destroys the EcoR1 site. And so EcoR1 will no longer be able to recognize this site in the genome and cut it.

    So you could imagine that if you had one individual in the genome having three EcoR1 sites, if you digest this region, you'd get two fragments. But if you destroyed the one in the middle, then if you digested this piece of DNA, then you'd only get one fragment. And that's something. Because it results in different sizes of fragments, that's something you can see just by doing DNA electrophoresis. And maybe you would use some method to detect this specific region, so that you're not looking at all the DNA in the genome, but you're establishing linkage to this specific area.

    You could use PCR. You can have PCR primers here and here. And you could then cut with EcoR1. In one case, you'd get two fragments. In this case, you'd get two fragments. In this case, if you amplified this region of the genome and cut with EcoR1, you'd only get one fragment. So you'd be able to differentiate between those possibilities.

    AUDIENCE: When you use PCR, are there [INAUDIBLE]?

    AUDIENCE: Are there [INAUDIBLE]?

    ADAM MARTIN: Oh. You're saying what causes it to stop? That's a great question, Malik. Ja.

    So initially, it's not going to stop. That's absolutely right. But because every step, each time you replicate, it's then primed with another primer. So you'd replicate something like this that's too long. But then the reverse primer would replicate like this. And it would stop.

    So if you go back to my slide from last lecture, look through that and see if it makes sense how it's ending. Because if you do this 30 times, you really will enrich for a fragment that stops and ends at the two primers, or begins and ends at the two primers, I should say. Gute Frage. Dankeschön.

    Gut. Now, let's talk about DNA sequencing. Because as I showed you, obviously, these SNPs, because there are so many of them, are probably the most useful of these markers to narrow in on where your disease gene is. And to detect a SNP, we need to be able to sequence DNA.

    So I'm going to start with an older method for DNA sequencing, which conceptually, is very similar to how we do DNA sequencing today. And so it will illustrate my point. And then at the end, I'll talk about more modern techniques to sequencing.

    So the technique I'm going to introduce to you is called Sanger sequencing. And that's because it was identified by an individual named Fred Sanger. And I'm going to just take a very simple DNA sequence, in order to illustrate how Sanger sequencing works.

    So let's take a sequence that's really simple. This is very, very simple, and then more sequence here. So let's say we want to determine the nucleotide that's at every position of this DNA fragment. So one way we could maybe conceptually think about doing this, is to try to let DNA polymerase tell us where given nucleotides are. And if we're going to use DNA polymerase, what are we going to need, in order to facilitate this process? Yes, Rachel.

    ADAM MARTIN: You're going to need nucleotides, definitely. So we're going to need nucleotides. Was sonst? To start, what are you going to need? Miles?

    ADAM MARTIN: You're going to need a primer, exactly. Gut gemacht. So you need a primer. So here's a primer.

    And now, we're going to try to get DNA polymerase to tell us whenever there is a given nucleotide in this DNA sequence. And so think with me. Let's say we were able to get DNA polymerase to stop whenever there was a certain nucleotide.

    So if we go through just a couple nucleotides, let's say, at first, we want DNA polymerase to stop whenever there's an A. So let's say there was a possibility it would stop at this A. If it's stopped at this A, you'd generate a fragment of this length. But if it read on through that A, there's another possibility that it would stop at this A.

    So we're kind of looking at when these are stopping. And the final possibility is it goes on and stops at this A. So if this DNA polymerase stopped only at As, you'd get fragments that are these three discrete lengths.

    Now let's consider another possibility. So pink here is stop at A. And in blue, I'm going to draw what would happen if it stopped at T. So they all start from the same place. If it stopped at T, it would just stop one nucleotide beyond this A in this simple sequence. So in blue here, this is stop at T.

    But if it's just a possibility, it stops. And some of the polymerases could go beyond this T and go to the next T and stop here. And again, this would be one nucleotide length longer than this pink one, here. And the final one would-- I'll just draw it down here-- would get out to this last T, here.

    So what you see is if we could get DNA polymerase to stop at these discrete positions, we'd get a different sized fragments, whether it was stopping at one nucleotide versus the other nucleotide. You all see how this is resulting in different fragment lengths. Yes, Andrew.

    AUDIENCE: How would you create a pattern [INAUDIBLE]?

    ADAM MARTIN: There are companies now. You can basically take nucleotides and synthesize these primers chemically, not using DNA polymerase.

    AUDIENCE: I'm saying how would you know what primer to use, if you don't know the sequence?

    ADAM MARTIN: Oh, in this case, you'd have to start with some sequence that you know. So in most sequencing technologies, you kind of make a DNA library, where you know the sequence of the vector. And then you'd use the vector sequence as a primer to sequence into the unknown sequence. Tolle Frage. Gut gemacht.

    Gut. So what we need now then is some sort of tool or ability to stop DNA polymerase when there's a certain nucleotide base. And to do that, we can use this type of molecule, here, which is known as a dideoxynucleotide. Remember, for DNA polymerase to elongate a chain, it requires that the last base have a three prime hydroxyl.

    And so what this dideoxynucleoside triphosphate is, is it's a nucleoside triphosphate that lacks a three prime hydroxyl. Here, I'll highlight that.

    So you see this guy? You see it bolt the highlight H? There's a hydrogen there on the three prime carbon, rather than the normal hydroxyl group. So if this base gets incorporated into a elongating chain, DNA polymerase is not going to be able to move on.

    So this method where you can add a certain dideoxynucleoside triphosphate to stop chain elongation is known as a chain termination method. So you're getting chain termination. And you're getting this chain termination with a specific dideoxynucleoside triphosphate. So these dideoxynucleotide triphosphates, if they get incorporated into the DNA, are going to halt the synthesis of that DNA strand.

    So if we take our example, here, this might be a reaction that has dideoxythymidine triphosphate. So if we had dideoxythymidine triphosphate in this sample and it's elongating, then when the polymerase reaches this point, there's a possibility that it will incorporate the dideoxynucleoside triphosphate. And if this is a dideoxynucleoside triphosphate, then there won't be a three prime hydroxyl.

    And DNA polymerase will just be like, oh, I can't go on! Because it's not going to have a three prime hydroxyl. So it's not going to be able to continue with the next nucleotide. So this is known as chain termination.

    So let me take you through an example, here. Gut. So here's an example that you have a slide of. And again, there's a template strand, which is the top strand. And this method requires that you have a primer. And what's often done is you label the primer.

    So the first step is you have to denature your DNA. So you have to go from double stranded DNA to a single stranded DNA. And then you mix the double stranded DNA with first, this labeled primer, such that the primer can then yield to the single stranded DNA. You need DNA polymerase, as I've mentioned. And as, I believe, Rachel mentioned before, you need the building blocks of DNA. So you need the four dideoxynucleoside triphosphates.

    So you always have the four dideoxynucleotide triphosphates. But what's special here is you're going to spike several reactions with one of the dideoxynucleoside triphosphates. So you spike the reaction with a tiny amount of one of your dideoxynucleoside triphosphates.

    So let's say you have a reaction, here. And this this one here has dideoxyadenosine triphosphate. Then polymerase will along get this strand until there's a thymidine on the template. And then there's a possibility that it will incorporate this dideoxy NTP. And if it does, then you get chain termination. And you get a fragment of this length.

    But the other possibility, because there is still the deoxy form of the NTP present, it's possible that it incorporates a deoxyadenosine triphosphate there. And keeps going, and then incorporates a dideoxy ATP later on, where you have another T. And so the polymerase will essentially randomly stop at these different thymidine residues, depending on whether or not a dideoxynucleoside triphosphate is incorporated. And that means for a given reaction, one in which you have dideoxy ATP, you get a certain pattern of bands that represent the length of fragments, where you have, in this case, a thymidine base.

    And then you do this for all four bases, where you have four reactions, each with a different base that's dideoxy. So when you're adding these, you're going to do four reactions, one with dideoxy ATP spiked in, one with dideoxy TTP, one with dideoxy CTP, and the last with dideoxy GTP. And because these nucleotides are present in different positions along the sequence, you're going to get distinct banding pattern for each of these reactions. But using that banding pattern, you can then read off the sequence of DNA that's present on the template strand.

    So this is how sequencing was done for many, many years. These days, it's been made cheaper and faster. And now what's often used is next generation sequencing. And one the pain in the ass about sequencing before is you'd use a lot of radioactivity. Your primer would be radioactive, so that you could detect these bands. Right now, everything's done using fluorescence, which makes it much nicer, I think.

    And so in next generation sequencing, your template DNA is attached to a solid substrate, such that it's immobilized on some type of substrate. And then you add each of the four nucleoside triphosphates. In this case, they're labeled with a dye, such that each one is a different color. But the dye also functions to prevent elongation, such that, again, it's this chain termination. When you incorporate one of these, the polymerase just can't run along the DNA. It incorporates one and then stops.

    So if you get your first nucleotide incorporated, it will incorporate one of these four. And it will be fluorescent at a certain wavelength, which you can see using a device or microscope. And then what you then do is chemically modify this base, such that you remove the dye and allow it to extend one more base pair. And so you go one nucleotide at a time. And you read out the pattern of fluorescence that appears. And that gives you the sequence of DNA on this molecule that's stuck to your substrate.

    And you can do this in parallel. You can have tons, many different strands of DNA. And you can be reading out the sequence of each one of these strands in parallel.

    Groß. Any questions about DNA sequencing? OK. Sehr gut. I will see you on Monday. Have a great weekend.


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