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Gibt es einen Unterschied zwischen Luria Broth und Lysogeny Broth?

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Gibt es einen Unterschied zwischen Luria Bertani und Luria Broth? Oder sind beide das Gleiche? Muss LB-Medium nach der Herstellung autoklaviert werden?


Obwohl beide Namen weit verbreitet sind, sind beide falsch. In der Originalarbeit von 1951 untersuchte Bertani die Lysogenese in E coli, daher nannte er seine Medien zu diesem Zweck "Lysogeny Broth" oder kurz LB. In den folgenden Jahrzehnten wurde dieser Name in "Luria Bertani" oder "Luria Broth" umgewandelt, was falsch ist. Weitere Informationen finden Sie in den Referenzen 1 und 2.

Zur zweiten Frage: Es ist unbedingt erforderlich, die Medien nach der Aufbereitung zu autoklavieren, um die Kontamination und das Wachstum von Mikroorganismen, die in unserer Umgebung vorhanden sind, zu vermeiden. Nur die Sterilität der Medien stellt sicher, dass wir mit definierten Mikroorganismen arbeiten können.

Verweise:

  1. Studien zur Lysogenese I.
  2. Die Grenzen von LB Medium

Wofür wird LB-Medium verwendet?

Klicken Sie hier, um die vollständige Antwort zu lesen. Warum verwenden wir in diesem Zusammenhang LB-Agar?

Luria-Brühe (PFUND) ist ein nährstoffreiches Medium im Allgemeinen Gebraucht Bakterien im Labor zu kultivieren. Das Hinzufügen von agar zu PFUND führt zur Bildung eines Gels, das Bakterien kann wachsen weiter, wie sie sind unfähig die zu verdauen agar aber kann Nahrung aus dem sammeln PFUND innerhalb.

Zweitens, woraus besteht LB-Agar? PFUND Brühe, auch bekannt als PFUND Medium, Lysogeny-Bouillon, Luria-Bouillon oder Luria-Bertani-Medium, ist ein üblicherweise verwendetes nährstoffreiches Medium zum Kultivieren von Bakterien. Erstmals 1951 von Giuseppe Bertani beschrieben, besteht ein 1-Liter-Medium aus 10 Gramm Trypton, 5 Gramm Hefeextrakt und 10 Gramm Natriumchlorid.

Was ist in dieser Hinsicht der Unterschied zwischen LB-Agar und LB-Brühe?

Agar ist ein komplexes gallertartiges Kohlenhydrat und wird dem LB-Brühe, um ein Gel zu bilden, auf dem Bakterien als mikrobielle Kultur wachsen können. PFUND ist ein reichhaltiges Medium mit Pepton, Hefeextrakt, NaCl und agar (für festes Medium).


LB Medien

LB ist das am häufigsten verwendete Medium zur Züchtung von rekombinanten Escherichia coli (E coli). LB media wurde von Giuseppe Bertani aufgrund seiner Forschungen zur Lysogenese als „Lysogenie-Brühe“ bezeichnet. LB wird häufig fälschlicherweise als Luria-Bertani-Medien, Luria Broth oder Lennox Broth bezeichnet. LB-Medien werden auch verwendet, um eine Vielzahl anderer fakultativer Organismen zu kultivieren.

Komponenten von LB Media

Ein Grund, warum LB häufig verwendet wird, ist die einfache Herstellung mit nur wenigen Zutaten, Trypton, Hefeextrakt und Natriumchlorid (NaCl). Trypton, eine Mischung von Peptiden, die durch die Verdauung von Casein mit dem Pankreasenzym Trypsin erzeugt wird, liefert Stickstoff und Kohlenstoff. Hefeextrakt liefert Vitamine (einschließlich B-Vitamine) und einige Spurenelemente. NaCl liefert Natriumionen für den Transport und das osmotische Gleichgewicht. E coli abgeleitet vom K-12-Stamm, einem der am häufigsten verwendeten Elternstämme von E coli die heute in der Molekularbiologie verwendet werden, haben einen Mangel an B-Vitamin-Produktion.

Historischer Hintergrund von LB

LB ist ein nährstoffreiches Medium, das seit den 1950er Jahren zur Kultivierung von Enterobacteriaceae und für Bakteriophagen-Plaque-Assays verwendet wird. LB ermöglicht bei vielen Arten ein schnelles Wachstum mit guten Wachstumserträgen. 1951 entwickelte Giuseppe Bertani LB, um die Plaquebildung bei a . zu optimieren Shigella Indikatorstamm von Enterobacteriaceae. Heutzutage ist LB-Medium das gebräuchlichste Medium für das Wachstum rekombinanter Stämme von E coli. Es gibt drei gängige Formulierungen von LB: LB Miller, LB Lennox und LB Luria. Alle werden manchmal als LB bezeichnet, obwohl die LB Miller-Formulierung die übliche oder Standardformulierung von LB ist. Die alternativen Formulierungen von LB variieren in der NaCl-Konzentration (Tabelle 1).

Tabelle 1. Formulierungen von LB.

Zutaten % Lurie (g/l) Lennox (g/l) Müller (g/l)
Trypton 1.0% 10 10 10
Hefeextrakt 0.5% 5 5 5
Natriumchlorid (NaCl) 0,05, 0,5 oder 1,0% 0.5 5 10

Die Verwirrung um den Namen LB ist angesichts der Geschichte von Bertani, Luria und Lennox verständlich. Giuseppe Bertani war Mitglied des Luria-Labors an der Indiana University, als er LB-Medien formulierte. Ed Lennox war auch Mitglied des Luria-Labors und arbeitete mit Bertani an einigen der frühen Lysogenie-Experimente unter Verwendung von Shigella. Salvador Luria veröffentlichte 1955 eine Arbeit, in der er die ursprüngliche Formulierung von Bertani kopierte und LB aufgrund seiner wissenschaftlichen Statur manchmal fälschlicherweise Luria zugeschrieben wird und daher auch fälschlicherweise als Luria Broth bezeichnet werden kann. Die ursprüngliche Bertani-Formulierung bestand aus 1,0 % Bacto-Trypton (10,0 g/l), 0,5 % Hefeextrakt (5,0 g/l), 1,0 % NaCl (10,0 g/l), 0,1 % Glucose (1,0 g/l) pH auf 7,0 eingestellt mit 1 N NaOH. Glucose wurde nach dem Autoklavieren zugegeben. Im Laufe der Zeit ist die Zugabe von Glucose bei allen LB-Formulierungen weggefallen. Der Name Miller kommt von der Formulierung im Buch Experimente in der Molekularbiologie von Jeffery Miller, veröffentlicht 1972, das keine Glukose enthält. Die ursprüngliche und gebräuchlichste Formulierung von LB, Miller, enthält 1,0% NaCl. 1955 untersuchte Ed Lennox die Mechanismen der DNA-Synthese unter Verwendung von Stämmen von E coli empfindlich auf osmotischen Stress entwickelten eine Formulierung von LB, die die Hälfte des Salzes der ursprünglichen Formulierung enthielt, d. h. 0,5% NaCl. Diese Formulierung wird als LB Lennox bezeichnet. Heute wird LB Lennox für den Anbau von E coli bei Verwendung von salzempfindlichen Antibiotika wie Blasticidin, Puromycin und Zeocin. Eine dritte Formulierung von LB, die die geringste Salzmenge enthält, wird als LB Luria bezeichnet. Diese Formulierung enthält 0,05% NaCl. LB Luria wird verwendet, um Meeresorganismen zu isolieren, wie z Vibrio cholerae.

Wachstumsmechanismen bei LB

LB-Medien wurden ursprünglich für das Wachstum von Bakterien bei geringer Dichte entwickelt. Es wird geschätzt, dass das exponentielle Wachstum, eine Phase des stationären Wachstums, endet, wenn die OD600 (optische Dichte bei 600 nm) liegt zwischen 0,6 und 1,0. Es ist bekannt, dass das Wachstum von E coli bei LB hört normalerweise auf, wenn die OD600 erreicht unter normalen Wachstumsbedingungen etwa 2,0, entsprechend etwa 0,6 mg E coli (Trockengewicht) pro ml. Im Jahr 2007 führten D’Ari und Kollegen eine umfassende Studie zu den Wachstumsmerkmalen bei LB durch, wobei sie sich insbesondere der Physiologie von E coli K-12, einer der heute am häufigsten verwendeten Stämme in der Molekularbiologie. Sie zeigten, dass im LB Miller gewachsene K-12-Zellen mit einer endgültigen OD600 von 0,6 – 1,0 befinden sich nicht immer im gleichen physiologischen Zustand. D’Ari und Mitarbeiter bestätigten frühere Beobachtungen des diauxischen Wachstums (Wachstum in zwei Phasen) bei LB und stellten fest, dass das exponentielle Wachstum bei . stoppte

OD600 0,3, viel früher als allgemein angenommen. Es ist bekannt, dass E coli ist bekannt, dass sie ein schlechtes Wachstum aufweisen, wenn der pH-Wert 9,0 überschreitet, und es ist nicht ungewöhnlich, dass sich LB-Medien auf einen pH-Wert nahe 9,0 ändern. Als D’Ari und Mitarbeiter jedoch den pH-Wert von LB anpassten, hatte dies keinen Einfluss auf die Wachstumskurve, während bei Zugabe von Glukose zum Medium die Kulturen auf OD . wachsen konnten600 6.49. Dies deutet darauf hin, dass das Wachstum von E coli in LB ist kohlenstoffbegrenzt. Wie bereits erwähnt, enthielt die ursprüngliche Formulierung von LB von Bertani 0,1% Glucose. Diese Forschung zeigt, dass LB zwar ein gutes Medium für routinemäßiges Wachstum ist, es jedoch nicht für physiologische Studien verwendet werden sollte, bei denen Reproduzierbarkeit und ein längerer Zeitraum exponentiellen Wachstums erforderlich sind.

LB und Auswahl

Es gibt eine Reihe von Zusatzstoffen, die dem LB-Medium zur Identifizierung oder Selektion einer Population von Organismen zugesetzt werden können. Antibiotika werden häufig dem LB-Medium zugesetzt, um auf Zellen zu selektieren, die so konstruiert wurden, dass sie gegen ein oder mehrere Antibiotika resistent sind. X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) oder Bluo-Gal (halogeniertes Indolyl-β-galactosid) können dem LB-Medium für ein blau-weißes Screening zur Insertion der Sequenz in hinzugefügt werden eine multiple Klonierungsstelle (MCS) in einem Plasmid, das das α-Fragment des β-Galactosidase-Gens enthält. Um die Expression von Genen zu induzieren, die durch den lac-Promotor kontrolliert werden, wird dem Medium das nicht metabolisierbare Lactose-Analogon IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) zugesetzt. In Bakterien, in denen keine Sequenz in das Plasmid eingefügt ist, sind MCS-Kolonien blau, da die X-Gal oder Bluo-Gal durch β-Galactosidase gespalten wird, um 5-Brom-4-chlor-indoxyl zu bilden. Bei Plasmiden mit Insertion gibt es keine funktionelle β-Galactosidase und die Kolonien bleiben weiß.


Lysogenie Mitte des 20. Jahrhunderts: P1, P2 und andere experimentelle Systeme

Die meisten von uns, die forschen, haben ein bevorzugtes Material, eine Reihe altbewährter Techniken, eine ständige Liste ungelöster Probleme, Sichtweisen oder Vorgehensweisen, die wir weitgehend mit Kollegen im selben Labor und anderen teilen das gleiche Fachgebiet, seien es Freunde, ehemalige Mitarbeiter oder Konkurrenten. All dies und mehr umfasst das Konzept des 𠇎xperimentalsystems”, wie es von Hans-Jörg Rheinberger (76, 77), einem Wissenschaftshistoriker, eingeführt und verwendet wird. Sein eher flexibles und metaphernreiches Konzept lässt sich leicht an die gegenwärtige Erzählung anpassen, die eher von einer persönlichen Sicht als von einer kritischen historischen Auseinandersetzung ausgeht. Eine sorgfältige Einschränkung von Material, Techniken und Nomenklatur ermöglicht konstruktivere Interaktionen zwischen verschiedenen Labors und verschiedenen Generationen von Wissenschaftlern auf demselben Gebiet. Natürlich wird dieser Prozess, wenn er exzessiv durchgeführt wird, Entwicklungen in neuen Gebieten ersticken und einige Entdeckungen aufschieben. Max Delbr࿌k, der in den frühen vierziger Jahren energisch das Studium der Bakteriophagen als Königsweg zu den Geheimnissen der Replikation und Rekombination befürwortet hatte, äußerte sich ganz offen für die Notwendigkeit, dass Arbeiter auf diesem Weg ein gemeinsames Material verwenden (die T-Phagen in Escherichia coli B) und genau standardisierte Techniken (1). Natürlich sind die T-Phagen im Allgemeinen virulente Parasiten von Bakterien, die keine Gefangenen sind, und konnten uns daher nicht über die eher schattenhaften Interaktionen zwischen “schwächeren” Bakteriophagen und ihren bakteriellen Wirten informieren: über Lysogenese, wo Infektion auf Vererbung trifft.

Der Begriff lysogene —generating lysis— wurde schon sehr früh nach der Entdeckung der Bakteriophagen verwendet und zunächst in grob beschreibender, unkritischer Weise verwendet. Auf der anderen Seite wurden bereits 1922 Bakterienkulturen isoliert, die spontan (dh ohne offensichtliche Infektion von außen) Bakteriophagen produzierten, aber gut wuchsen, ohne dass ein grober Hinweis auf Lyse vorhanden war. Es wurden verschiedene Interpretationen hin und her diskutiert Jahren, ziemlich heftig in der frankophonen medizinischen Forschungsgemeinschaft. Obwohl die Entwicklung des Konzepts gut zusammengefasst ist (68), verdient es einen ernsthaften Blick aus wissenschaftsgeschichtlicher und wissenschaftsphilosophischer Sicht. Der Geschmack der Debatten wird von einem der Teilnehmer, Paul Flu, vermittelt (42 siehe auch Referenz 84). Eugène Wollman (90, 91) vom Institut Pasteur war einer der wenigen, die damals die genetischen Implikationen von Konzepten der Lysogenese erkannten. Die Genetik war damals in den lateinischen Ländern Europas eher unterentwickelt, die Immunologie war der Star des Tages in der Medizin. Außerdem konzentrierte sich die Debatte nur selten auf eine Art von Experiment mit klar definiertem und allgemein verfügbarem Material. In den frühen dreißiger Jahren wurde eine Definition der Lysogenie gefunden (26), die noch immer gültig ist, offensichtlich ohne moderne molekulare Implikationen. Anlage, ein deutsches Wort, das in der Embryologie verwendet wird, wurde von Burnet und McKie (27) auf das angewendet, was wir heute als Prophagen bezeichnen. Das Konzept der Anlage oder Prophagen basierte auf der Tatsache, dass es niemandem gelungen war, mit einer Vielzahl von Methoden das Vorhandensein infektiöser Phagenpartikel im Inneren eines lysogenen Bakteriums nachzuweisen. Der Zweite Weltkrieg unterbrach viele dieser Arbeiten. Die Wollmans starben und die Grippe überlebte nur knapp in den Konzentrationslagern der Nazis. Burnet nahm mehr medizinisch orientierte Arbeit auf.

Auf Lysogenese stieß ich Anfang 1949, als ich in Cold Spring Harbor als wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor von Milislav Demerec arbeitete. Ich untersuchte spontane und induzierte Mutationen in einem Streptomycin-abhängigen E coli B-Stamm. Ich hatte noch nie mit Bakterien gearbeitet. Einmal verwundert über eine Kolonie, die sektoral angeknabbert aussah, zeigte ich sie Evelyn Witkin und dem verstorbenen Gus Doermann, die zu meinem Glück ihre Labore direkt neben meinem Zimmer hatten. Sie schlugen die offensichtliche Erklärung vor, Phagenkontamination, aber einer von ihnen fügte hinzu: 𠇎s gibt auch etwas namens Lysogenie…” (das englische Wort war damals tatsächlich Lysogenese oder Lysogenität.) Ich hatte noch nie zuvor von Lysogenie gehört (obwohl ich die Arbeiten von Paul Buchner [25] über Endosymbiosen kennengelernt hatte) und begann in der Bibliothek nach weiteren Informationen zu suchen.

Ungefähr zur gleichen Zeit, mir unbekannt, ereigneten sich zwei wichtige Ereignisse. In Madison, Esther und Joshua Lederberg, im Zuge ihrer Arbeit am K-12-Stamm von E coli, dann die einzigen Bakterien�gesehen von Pneumokokken�kannt für den Austausch von genetischem Material, isolierte eine Mutante, die bei Kontakt mit dem Elternstamm unerwartet lysierte. Sie kamen zu dem Schluss, dass der ursprüngliche K-12-Stamm für einen zuvor unvermuteten Phagen, den sie Lambda nannten, lysogen war, und dachten, es könnte sich um so etwas wie den Kappa-Faktor von Tracy Sonneborn handeln Paramezium. Dies wurde kurz in der ersten Ausgabe (Januar 1950) von Witkins informellem Microbial Genetics Bulletin mitgeteilt, die tatsächliche Veröffentlichung erfolgte viel später (58). In Paris ging André Lwoff, ein bekannter Protozoologe und Bakterienphysiologe, der Frage nach, wie Phagenpartikel von lysogenen Bakterien produziert werden. Das Problem wurde mutig angegangen durch direkte Mikromanipulation einzelner oder kleiner Mengen lysogener Bakterien, der übergroßen Bacillus megaterium, in einem Tröpfchen Brühe unter dem Mikroskop kultiviert. In Intervallen wurde die die Bakterien umgebende Flüssigkeit entfernt, durch frische Brühe ersetzt und dann auf das Vorhandensein von Bakteriophagen getestet. Gleichzeitig wurde die Anzahl der Bakterien im Tröpfchen aufgezeichnet und das Tröpfchen auf möglicherweise lysierende Bakterien untersucht. Ein starkes Ergebnis war, dass, wenn das Tröpfchen Phagen enthielt, diese in großer Zahl vorhanden waren, wie man es von der plötzlichen Lyse eines oder mehrerer Bakterien erwarten könnte. Umgekehrt konnte gezeigt werden, dass die Bakterien mehrmals wachsen und sich teilen können, ohne Phagen zu produzieren. Die Korrelation der Phagenproduktion mit der Zelllyse konnte jedoch nicht sofort nachgewiesen werden. Dies wurde später durch die Feststellung geklärt, dass B. Megaterium Zellen hatten die Eigenschaft, spontan und unproduktiv zu lysieren, wobei ein sichtbarer Zellgeist zurückblieb, während die mit der Phagenproduktion verbundene Lyse extrem schnell war und keine mikroskopisch sichtbaren Spuren der Bakterienkörper hinterließ (69, 70).

Im Herbst 1949 wechselte ich zu Salvador Luria an die Indiana University in Bloomington. Als wir Arbeitspläne machten, schlug ich vor, Lysogenese zu studieren. Luria war darüber nicht allzu glücklich, da er andere Probleme im Zusammenhang mit der Entwicklung des virulenten Phagen T2 (an dem ich allerdings mehrere Monate gearbeitet habe) im Auge hatte. Vielleicht—Ich vermute,𠅎r hatte Lysogenie in seinem Antrag auf Forschungsförderung nicht erwähnt. . . . Trotzdem war er sehr kooperativ und versprach, zu versuchen, einige Stämme zu bekommen, die ich verwenden könnte, um Lysogenese zu studieren. Tatsächlich erhielten wir im Januar 1950 von Lederbergs Indikatorstämme, die mit K-12 verwendet werden konnten, und auch den klassischen Lisbonne-Stamm, einen lysogenen E coli Stamm isoliert in den frühen zwanziger Jahren von M. Lisbonne und L. Carrère, zusammen mit seinen Shigella Indikator. Ich begann sofort mit der Arbeit an beiden Stämmen, untersuchte ihre kulturellen Eigenschaften und versuchte, Wachstum und Plaquebildung zu optimieren. Der offensichtliche Vorteil von K-12 und Lambda bestand darin, dass man das Studium der Phagen mit dem der bakteriellen Rekombination kombinieren konnte, wie es die Lederbergs tatsächlich auch begonnen hatten. Die Alternative erforderte die Verwendung von Shigella, offiziell ein Krankheitserreger, der strengere Sicherheitsvorkehrungen im Labor erfordern würde als die Verwendung von E coli. Unglücklicherweise traf Luria ein paar Wochen später Joshua Lederberg bei einem Treffen und verstand, dass er und Esther viel lieber gewesen wären, wenn ich nicht an Lambda gearbeitet hätte. Ich war damals ziemlich unzufrieden, obwohl ich erkannte, dass die Bitte der Lederbergs in ihrem Recht war, da ihre Entdeckung von Lambda noch nicht in der freien Literatur veröffentlicht worden war. Luria, Jim Watson (damals im letzten Jahr seines Studiums in Bloomington) und ich teilten uns ein kleines Labor, aus dem eine Ecke für Lurias Schreibtisch herausgeschnitten worden war. An einem späten Nachmittag diskutierten wir ernsthaft, wie angesichts der Bitte der Lederbergs vorzugehen sei. Ich erinnere mich, dass Jim mit lauter Stimme erklärte, dass er nicht in einem Labor sein möchte, in dem man routinemäßig die vermutlich pathogenen Shigella. Trotzdem überzeugte mich Luria, Lambda zumindest zeitweise in Ruhe zu lassen, und ich nahm die Herausforderung an, etwas vorsichtiger im Umgang zu sein Shigella. Rückblickend scheint mir diese kleine Episode jedoch nie das richtige �ling for the organism” (43) in Bezug auf Lambda zu entwickeln.

Verwendung des Lisbonne-Stamms (in Kürze als Li symbolisiert) und Shigella, machte ich mich daran, im Wesentlichen das gleiche Problem wie Lwoff zu untersuchen. Da ich während meiner Diplomarbeit (4) unter den Strapazen der Mikromanipulation litt, kam mir die Idee, seinen Ansatz zu verwenden, nie in den Sinn. Außerdem Phagenproduktion in lysogenen B. Megaterium ist im Vergleich zu anderen lysogenen Stämmen (einige Prozent freie Phagen) ungewöhnlich hoch (z. B. ein freies Phagenpartikel auf zwei Bakterien), so dass der direkte mikroskopische Ansatz bei den meisten Stämmen kaum erfolgreich wäre. Ich habe mich zuerst isoliert von Shigella eine Streptomycin-resistente Mutante (später bekannt als Sch/s oder Sh-16) und zeigte, dass der vom Li-Lysogen produzierte Phagen von Streptomycin nicht beeinflusst wurde. Als nächstes führte ich ein sogenanntes “modified single Burst”-Experiment durch, bei dem exponentiell wachsende lysogene Bakterien (gewaschen, um alle freien Phagen zu eliminieren) auf eine Reihe von Röhrchen verteilt wurden, und nach weiterer Inkubation wurde der gesamte Inhalt jedes Röhrchens mit dem Streptomycin-resistenten Indikator und einem Tropfen Streptomycin ausplattiert. Diese Technik bewertet nur die freien Phagen, die zum Zeitpunkt des Plattierens vorhanden sind, und nicht die Phagen, die die lysogenen Bakterien in Abwesenheit von Streptomycin auf den Platten produzieren würden. Würden die Phagen während des Lysogenwachstums kontinuierlich produziert, hätten die Platten zufällig verteilte Plaques. Wenn lysogene Kulturen Phagen in 𠇋ursts produzieren würden,”, wie wenn eine Phagen-sensitive Zelle durch einen virulenten Phagen infiziert wird, würden die meisten Platten keine Plaques und einige wenige eine große Anzahl von Plaques aufweisen, d. alle Phagen-Nachkommen eines Bakteriums. Nachdem die Parameter angepasst waren, funktionierte das Experiment wunderbar (5). Es bestätigte, dass die Phagenproduktion durch ein Lysogen diskontinuierlich war, was seltene, große Phagenausbrüche beinhaltete. Ein Arbeitstag ermöglichte es somit, die Häufigkeit der spontanen Phagenproduktion selbst auf sehr niedrigem Niveau (ein Burst pro 45.000 Zellgenerationen für Stamm Li) und die durchschnittliche Burst-Größe zu messen: mehr, als man in Monaten der Mikromanipulation erreichen könnte. Aber es gab eine Überraschung: Während die Phagen, die aus Kulturen des Stamms Li gewonnen wurden, bekanntermaßen ziemlich heterogen in der Plaquegröße waren, sahen die Plaques in meinem Experiment in verschiedenen Ausbrüchen unterschiedlich aus. Weitere Untersuchungen zeigten, dass der Stamm Li tatsächlich drei immunologisch unterschiedliche Phagentypen produzierte, die ich P1, P2 und P3 nannte, die alle drei unabhängig voneinander in der Lage waren, Lysogenie im Shigella und dass sie in der Regel unabhängig voneinander in homogenen Stößen erzeugt wurden (5). Ich arbeitete weiter mit den Phagen des Stammes Li, wobei ich besonderes Augenmerk auf P2 legte, in dem es relativ einfach war, verschiedene Mutanten vom Plaque-Typ zu erkennen.

In der Zwischenzeit hatten Lwoff und mehrere Mitarbeiter am Pasteur nach Bedingungen gesucht, die die 𠇎ntscheidung” einer lysogenen Zelle beeinflussen könnten, vom normalen Wachstum zur selbstmörderischen Produktion eines Phagenschubs zu wechseln. Nach dem Scheitern verschiedener chemischer Behandlungen erzielten sie einen dramatischen Erfolg: Die Exposition gegenüber einer sehr geringen Dosis UV-Licht verursachte fast alle Bakterien in ihrem lysogenen B. Megaterium Kulturen zu lysieren und einen Phagenstoß zu produzieren (71). Die Entdeckung der UV-Induktion, wie das neue Phänomen genannt wurde, hat der Lysogenie viel Aufmerksamkeit geschenkt. Selbst Delbr࿌k, der nur wenige Jahre zuvor Zweifel geäußert hatte (39), vertrat die Lysogenese hauptsächlich, sollte man hinzufügen, durch die Begeisterung seines Kollegen Jean Weigle, Professor für Physik an der Universität Genf, der gerade dann vorzeitig in den Ruhestand getreten und sich der Phagenforschung verschrieben (83). Bald stellte sich heraus, dass auch ein Phagen in Pseudomonas (51) und Lambda in E coli K-12 (89) könnte durch UV-Licht induziert werden. Auf der anderen Seite meine Versuche, die Stämme Li oder . zu induzieren Sch(P2) (d. h., Shigella Isolate, die für P2) lysogen gemacht wurden, waren völlig negativ. Dies war enttäuschend, war aber auch der erste Hinweis darauf, dass es grundlegende biologische Unterschiede zwischen lysogenen Systemen geben könnte.

Mehrere interessante Fragen zur Lysogenese waren offen. Würde es in einem etablierten lysogenen Bakterium eine Prophagenkopie oder viele Kopien geben? Wenn nur einer, wie würde er sich bei der Zellteilung regelmäßig trennen? Und was war der Modus Operandi der Immunität gegen Superinfektionen? War die Immunität auf ein diffundierbares, prophagenspezifisches Produkt zurückzuführen (“immunitätssubstanz”, “repressor”), das die Entwicklung eines superinfizierenden Phagen blockieren würde, oder war sie das Ergebnis einer notwendigen Interaktion mit einer speziellen Bakterienstelle? ? Vorläufige Bakterienkreuzungen von Esther Lederberg, die in ihrem Bericht aus dem Jahr 1950 erwähnt wurden, hatten auf eine, wenn auch komplexe, Verbindung zwischen Lambda-Lysogenie und bestimmten genetischen Markern in K-12 hingewiesen. Die Möglichkeit der chromosomalen Kontrolle einer Population zytoplasmatischer Elemente (wie im Fall von Kappa in Paramezium) wurde nicht ausgeschlossen. Ich habe Mutationen vom P2-Plaque-Typ als Marker bei der Superinfektion von Sch(P2) lysogene Zellen, die versuchen, dem Schicksal des superinfizierenden Phagen zu folgen. Letzteres, wie sich herausstellte, wurde vom Immunsystem des Lysogens nicht abgebaut oder abgestoßen, es wurde nur in seiner Replikation blockiert (als “Superinfektionspräprophage”) und zufällig auf die Tochterzellen verteilt, während das Lysogen weiter wuchs und sich teilte . Wenn eine Zelle, die es trug, lysierte, würde der superinfizierende Phagen im Wesentlichen gleichberechtigt mit dem Prophagen an dem Burst teilnehmen. In seltenen Fällen wurde der residente Prophagen (oder einige seiner Gene) durch den superinfizierenden Typ ersetzt. Noch seltener würde sich ein stabiler doppelt lysogener Stamm etablieren. Eine P2-Mutante (der klare Plaque-Typ “weak virulent”), die die Fähigkeit zur Lysogenisierung verloren hatte, konnte im blockierten Zustand für mehrere Zellgenerationen getragen werden und sich selten sogar wie ein zweiter Prophagen verhalten, dh von allen vererbt werden Nachkommenzellen, solange der ursprüngliche Prophagen (trübe Plaque-Typ) vorhanden war, verhielt er sich wie von einer Mutante mit einer rezessiven Mutation, die die Immunität beeinflusst, erwartet. Diese Ergebnisse (6, 7, 8, 9, 10), obwohl sie für komplexere Interpretationen offen sind, unterstützten sowohl die Idee von einem oder ausnahmsweise zwei Prophagen pro Bakterienzelle (genauer gesagt pro Nukleoid) als auch das Konzept eines spezifischen Prophagenprodukt, das mit superinfizierenden Phagen interagiert. Inzwischen eine neue Sorte von E coli, später genannt C (16), auf der Bühne erschienen, indirekt das Ergebnis einer Entdeckung von Cavalli und Heslot (35). Stamm C war empfindlich gegenüber Lambda und gegenüber allen Phagen des Stamms Li, ergab anständige Plaques mit P2 und kreuzte außerdem (35) mit K-12-Stämmen. Allmählich wechselte ich von Shigella Stamm C für die meisten Arbeiten mit P2, und dann konnten Bakterienkreuzungen durchgeführt werden, um die chromosomale Position von Prophagen zu bestimmen (10, 14). Während ich hier die Arbeit mit P2 hervorhebe, werden die meisten Leser wissen, dass während dieser Zeit (1951 bis 1957) schnelle Fortschritte im Verständnis der Genetik von K-12 und Lambda gemacht wurden, wie dann von zwei seiner Hauptmitwirkenden überprüft (53) . Es wurde ziemlich klar, dass der Lambda-Prophage selbst tatsächlich an einer bestimmten Stelle, die zunächst als die einzig mögliche verankert war, auf dem Bakterienchromosom verankert war. Eine detaillierte Kopplungsanalyse (28) und die damals neuen Vorstellungen von Chromosomenzirkularität führten zu Allan Campbells Vorschlag seines bekannten Integrationsmodells.

Außerhalb der Lysogenese trugen P1 und P2 auch allgemein zum frühen Fortschritt in der bakteriellen Genetik bei. (Mit P3 wurde nur wenig getan.) Ein Beispiel ist die Entdeckung der “host-kontrollierten Variation”, die jetzt häufiger als „inschränkung und Modifikation bezeichnet wird.” Ich habe es in P2 bemerkt (mit Stamm B als einschränkendem Wirt , Shigella als Standardhost) und wusste nicht, was ich davon halten sollte. Jean Weigle, mit dem ich oft korrespondierte, bemerkte es in Lambda (mit Stamm C als permissiven Wirt, K-12 als Standard-Wirt). In Kenntnis meiner Ergebnisse erkannte er sofort die Ähnlichkeiten der beiden Befunde. Kurz zuvor hatte ein kleiner Laborunfall, wie Luria (66) berichtete, zur Entdeckung eines weiteren, wenn auch komplexeren Falles von wirtskontrollierter Variation geführt (67). Obwohl zu diesem Zeitpunkt keine zufriedenstellende mechanistische Erklärung in Sicht war, wurden Jean und ich durch die Parallelität zwischen unseren beiden völlig unabhängigen “Systemen” ermutigt und beschlossen, unsere Ergebnisse gemeinsam zu veröffentlichen (16). Es kommt selten vor, dass ein neues Phänomen, das in zwei verschiedenen Systemen, in verschiedenen Labors beobachtet wurde, in derselben Arbeit vergleichend beschrieben wird. Dies verstärkte die Beweise und deutete auf die Allgemeingültigkeit des Phänomens hin, während es gleichzeitig einen Punkt für die Zusammenarbeit gegenüber dem Wettbewerb in Wissenschaft und menschlichen Angelegenheiten erzielte. (Ein ähnlicher Fall, einige Jahre später, war der einer Veröffentlichung von René Thomas und Elizabeth Bertani [87], die über parallele Experimente mit Lambda und mit P2 berichteten, um die Wirkungsweise des Immunitätsrepressors genauer zu definieren.) P2 in E coli B führte zu einem weiteren unerwarteten Befund: dem Vorhandensein eines defekten Prophagen (mit P2 verwandt, aber mit einer anderen Immunitätsspezifität) in diesem traditionellsten Phagenwirtsstamm (37). Defekte Prophagen sind heute ein fast täglicher Befund bei Genomanalysen von Bakterien.

P1 gab auch einige Überraschungen. Seine Etablierung der Lysogenese in Shigella wurde fast absolut temperaturgesteuert (17): sehr hohe Häufigkeiten der Lysogenisierung und keine sofortige Phagenproduktion, wenn die infizierten Bakterien nach der Infektion bei 20ଌ gehalten wurden, 100 % Lyse mit Phagenproduktion bei 40ଌ. Diese Eigenschaft ging anscheinend verloren, da P1 durch mindestens zwei Mutationsschritte �ptiert wurde,”, k und C (60, 88), um auf K-12 effizienter zu wachsen, und niemand hat sich wieder der Untersuchung des ursprünglichen Wildtyps in Shigella. Der Grund für diese Vernachlässigung ist natürlich die Tatsache, dass P1 als transduktionsfähig befunden wurde und fast ausschließlich in K-12-Derivaten verwendet wurde. Transduktion, entdeckt 1951 von Zinder und Lederberg in Salmonellen (94) und mit dem Phagen P22 korreliert, erlaubte eine genetische Analyse von eng verbundenen Mutationen, aber keine grobe Kartierung. Auf der anderen Seite war die Feinstrukturkartierung mit noch nicht praktikabel E coli K-12. Die Entdeckung dieser Fähigkeit von P1 ist Ed Lennox zu verdanken, einem Physiker, der sich damals auf Biologie umstellte, der eines Morgens Anfang 1954 unser Labor betrat und verkündete: “Joe, lass uns versuchen, ob deine Phagen transduzieren können!& #x0201d Ich hatte bis dahin einige auxotrophe Mutanten von Stamm C, die verwendet werden konnten, um die Idee zu testen. Wir führten das Experiment am nächsten Tag durch und es stellte sich heraus, dass P1 (aber nicht P2) tatsächlich ein sehr effizienter Wandler war. Ich habe noch die Kopie eines Briefes an Jean Weigle vom 16. April, in dem ich übereifrig schrieb: “Wir verbrachten eine Woche voller Aufregung (d. h. Ed Lennox und ich). Mein Phagen P1 kann transduzieren. Auf Shiga gezüchtetes P1 kann den Arginin-Charakter in . umwandeln coli C, ein Galactose-Marker auch in coli C und ein Streptomycin-Marker in coli B. Genug?𠉮s wird möglich sein, Transduktion und genetische Rekombination im gleichen Organismus zu untersuchen, den Temperatureffekt auf die Lysogenisierung zu vergleichen und vielleicht auf die Transduktion bei der Transduktion von Prophagen P2 durch Phagen P1 usw berichtete auf dem Oak Ridge-Treffen im selben Frühjahr über genetische Rekombination (59), gefolgt von der sehr umfassenden Veröffentlichung von Lennox (60). Sowohl Lennox (60) als auch Jacob (52) zeigten die Kotransduzierbarkeit von Lambda-Prophage mit bakteriellen Markern. Später wurden P2-Prophagen an drei verschiedenen Stellen cotransduziert und mittels P1 orientiert (31).

Während ältere Genetiker infizierten und kreuzten, traten die Methoden der heutigen Molekularbiologie auf den Plan, gefolgt von Elektronenmikroskopie und Ultrazentrifugation. Die Begeisterung für Lambda als experimentelles System machte Lambda über einige Jahrzehnte zum Paradigma der Lysogenese (47, 48, 75, 82). Es ist mittlerweile bis auf die molekulare Ebene so gut bekannt, dass es sinnvoll in silico modelliert wird (2). P1 zog aufgrund seines ungewöhnlichen Chromosomenverhaltens auch zahlreiche Anhänger an, zunächst als Werkzeug bei der Transduktion und später als eigenständiges Instrument (93). Einige, darunter auch ich, arbeiteten weiter an P2, wenn auch manchmal mit einem Gefühl der Isolation und der Sorge, dass die Unterschiede zu Lambda vielleicht nicht wichtig genug waren, um den Aufwand zu rechtfertigen. Dies stellte sich, glaube ich, als nicht der Fall heraus (12).

Partikel von P2 und Lambda unterscheiden sich strukturell. Im Gegensatz zu Lambda folgt die P2-DNA-Replikation während ihres Fortpflanzungszyklus einem typischen Rolling-Circle-Modell (54, 64, 73, 79). Dies wurde durch zwei bemerkenswerte Befunde nahegelegt, die strengen Anforderungen der P2-DNA-Replikation für die Rep-Funktion der Wirtszelle (32) und für a cis-wirkendes Phagenprotein (62), wie es bei den sehr unterschiedlichen, virulenten Phagen der Fall ist, φX174. Die Einkapselung erfolgt direkt aus monomeren Kreisen (74). Auf dem Bakterienchromosom existieren mehrere P2-spezifische Bindungsstellen, die sich von Lambda unterscheiden (3, 14, 33, 55). Die genetische Rekombination bei P2-Mischinfektionen tritt äußerst selten auf (11, 15): Die genetische Karte von P2 (13, 61) musste mit Hilfe von UV-Bestrahlung gewonnen werden, um die Rekombination zu stimulieren. Der P2-Regelkreis, Lyse versus Lysogenie, ist einfacher (78) als der von Lambda. Der P2-Prophagen-Integrationsmechanismus ist zwar eine typische ortsspezifische Rekombination, weist jedoch besondere Merkmale auf (20, 30, 46), die teilweise dafür verantwortlich sind, die Ablösung des Prophagen bei Derepression zu blockieren. Bei P2 ist hingegen kein Fall einer spezialisierten Transduktion bekannt, dessen komplementäres Ereignis �uktion eines bakteriellen Markers—wurde beschrieben (56). Ein großer Schub für P2-Studien war die Entdeckung des bemerkenswerten Satellitenphagen P4 und seiner komplexen Interaktionen (“transaktivierung”) mit P2- und P2-ähnlichen Phagen im Jahr 1966 durch Erich Six (81) (22, 29, 36, 65). . Eine Reihe von sehr faszinierenden Beobachtungen, die P2 eigen sind, bleiben unvollständig verstanden und verdienen weitere Untersuchungen: bemerkenswerte metabolische Effekte auf die Häufigkeit der Lysogenisierung (18, 19) Zellsensibilisierung gegenüber einem kleinen molekularen Produkt (21) die komplexen Wechselwirkungen zwischen P2-nicht-essentiellen Genen alt, die Wirtszelle und einen koinfizierenden Phagen Lambda (24, 44, 63, 72, 80) und andere. Based on the results of screens of coliforms in Paris and Los Angeles (23, 53) and the Dhillons' extensive work in Hong Kong (40), it became clear that—to the extent that modern notions of segmental evolution (57) allow it— P2 and lambda are representative of two main groups of temperate phages for such bacteria. Within the P2-like group, phage 186 was studied in great genetic and molecular detail by Barry Egan and his students (41, 92) phage 299 was studied to a lesser extent by E. I. Golub (45). More recently, other phages obviously related to P2 have been encountered in several other species besides E coli and as defective prophages in DNA sequencing studies (34).

The above recollections seem to indicate that at about the middle of the last century, starting before the formulation of the DNA structure and independently of the introduction and diffusion of “molecular” methods of analysis, there was a confluence of the rigorous approach of phage work with more traditional bacteriological perspectives, energized by the new remarkable findings about gene transfer. Studies of lysogeny were rather central in this process of broadening interest with respect to problems and materials. As a result, several new 𠇎xperimental systems” à la Rheinberger were developed in the fifties and sixties, lambda being the most successful. One is tempted to generalize these observations and suggest that it is the way of scientific progress to alternate between periods of broad and somewhat haphazard exploration and periods of highly focused in-depth analysis of particular problems or materials. On the one hand, as Francis Crick once wrote (38), �w molecular biologists would care to be caught studying the colour of butterflies' wings… .” The tendency in molecular biology (as it was, mutatis mutandis, in classical genetics) is for one to analyze the experimental material to the lowest possible structural level and thus invest heavily in one's system. On the other hand, the naturalist looks open mindedly for what may happen to be there and how it might be related to what has already been seen: in a way, he scouts for new experimental systems.

A comment may be made concerning induction: not lambda's, that of philosophers. It is hard to see how our intelligent species would have ever evolved without trusting induction, yet there are everyday examples of the risks of excessive reliance upon inductive predictions. Nach dem B. megaterium phage, a phage in Pseudomonas, and lambda in K-12 were found to be inducible by UV light, it was hard to believe that P2 was not. How do you prove a negative? Similarly, after seeing that both lambda and P2 prophages were present in single copies, physically integrated in the bacterial chromosome at specific sites, it was very surprising when P1 was found to be present as one unattached copy and yet be regularly transmitted to the bacterial progeny without losses (50) or Mu to be capable of inserting itself anywhere in the chromosome (85, 86). Perhaps most surprising, after the early efforts had convinced everyone that lysogens produce phage through the lysis of individual cells, was the discovery that filamentous phages are indeed continuously secreted by growing cells, without lysis (49).

Postscript. My first paper on lysogeny (5), describing the modified single-burst experiment and the isolation of P1, P2, and P3, also contained the formula of the LB medium which I had concocted in order to optimize Shigella growth and plaque formation. Its use has since become very popular. The acronym has been variously interpreted, perhaps flatteringly, but incorrectly, as Luria broth, Lennox broth, or Luria-Bertani medium. For the historical record, the abbreviation LB was intended to stand for “lysogeny broth.”


PDusk and pDawn

The pDusk and pDawn plasmids are engineered DNA systems that allow someone to control gene expression using light. Both pDusk and pDawn make R e d Fluorescent Protein (RFP), wh ich makes the colonies reddish in color. The difference is that pDawn turns on the RFP gene when exposed to light, while pDusk will only make RFP when kept in the dark . The pDawn system allows you to control the expression of RFP in the light. This kit teaches you many basic molecular biology techniques, while also giving you the ability to perform cool experiments using light to control gene expression.

The pDusk and pDawn systems are activated by blue light but since most white light contains blue light any sort of ambient light should work.

  • 1 hour Make plates (set aside more time if it's your first time making plates)
  • streak out bacteria onto an LB Agar plate (takes

Day of experiment overview

    Mix bacteria t ogether with the plasmids, and transformation mix (takes

Incubate and wait for growth

1 hour, but leave more time if it&rsquos your first time)

Step by step walk-through of making plates with photos at: https://goo.gl/7yzpA1

Agar plates provide a solid media nutrient source for bacteri a to grow on. The standard media that is used is LB (Luria Broth, Lysogeny Broth, or Luria Bertani Broth). This contains a carbon source, a nitrogen source, and salt (many strains of bacteria like salt!).

The top of the plate is the larger part.

  1. Find the tube labelled &ldquoLB Agar M edia &rdquo dump its contents into the 250mL glass bottle. (You will need to make plates out of each kind of media . Rinse bottle between media. )
  1. Using the 50mL conical tube labelled &ldquo Tube for Measuring &rdquo, measure and add 150mL of water to the glass bottle.
  1. Making agar is like making jello-- heat the agar to dissolve it, then it will solidify when it cools. Heat the bottle in the microwave for 30 seconds at a time, being careful not to let the bottle boil over. DO NOT SCREW THE LID DOWN TIGHT! (just place it on top and give it a slight turn).
  1. The media is completely dissolved when the liquid looks yel low . This should take about 2 -3 minutes total of microwaving. Take the bottle out , (caution contents hot), and let it cool until you are able to touch it without much discomfort. This will take 20-30 minutes.
  1. While the bottle remains somewhat warm, pour the plates. One at a time, remove the lid of 7 plates and pour just enough of the LB agar from the bottle to cover the bottom half of the plate. Put the lid back on.

Making Competent Bacterial Cells for Transformation

&lsquoCompetent&rsquo means the bacterial cells are able to intake foreign DNA. The cells&rsquo walls normally prevent things from entering , but mixing the bacteria with chemicals and salts that change the cells&rsquo walls, allow the cells take up DNA from the environment. This process is called a &lsquotransformation&rsquo. We put all the components into synthetic DNA to trick the bacteria into thinking that our DNA is its own DNA , so they make the RFP.

The bacterial transformation mix contains:

10% Polyethylene Glycol(PEG) 8000

PEG 8000 is thought to play several different roles in transformation, though nobody really knows for certain. Since both DNA and cell walls are negatively charged, they reject each other. PEG 8000 is thought to function by shielding the charge of the DNA, thereby making it easier to permeate the cell wall. PEG 8000 is also thought to help transport the DNA into the cell, as well as make the cell membrane itself more porous.

5% Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

DMSO is sometimes used to treat ailments in humans. In a transformation it is thought to permeabilize the cell wall. Also, sometimes DNA folds into complex structures that make it more difficult to pass through the cell wall. DMSO also might help to break these DNA structures down.

25mM Calcium Chloride(CaCl 2 )

Similarly to PEG 8000, CaCl 2 is thought to shield and neutralize the negative charge of DNA, thereby making it more likely to enter into the cell.

    Take one of the tubes of dried E. coli BL21, add water to the top and shake till it is all dissolved. Next, using your pipette put 100uL of the bacteria solution onto a new LB plate you made and using an inoculation loop gently spread or &ldquostreak&rdquo the bacteria. Let the plate grow overnight

  1. Use a syringe to transfer 0. 1 mL of Transformation mix to a microcentrifuge tube with pDawn . Make sure you mix the transformation mix with the tiny droplet of pDawn DNA in the microcentrifuge tube. Repeat with with pDusk DNA using another syringe. (Syringes can be washed with soap and water for reuse!!)
  1. Using an inoculation loop, gently scrape an area of the size of a pencil eraser of bacteria off of your fresh plate and mix it into the transformation p Dawn mix. Mix until any big clumps have disappeared. Twirling the inoculation loop can work, but avoid making bubbles. Repeat with pDusk using a clean inoculation loop.
  1. Make a warm water bath for the next step. The water should be 42ºC (108ºF) water. You can approximate this temperature by using water that is warm, but comfortable enough such that you can still keep you hand in it.
  1. Add 1.5 mL of room temperature water (or fill to the top) to one of the LB media microcentrifuge tubes and shake to dissolve the LB.
  1. Using a clean syringe , add 0.5 mL of LB media to your competent cell mixture containing your DNA.
  1. Incubate the tube at 37 º C (99 º F) for 2 hour or 4 hours at room temperature. This step allows to bacteria to recover and replicate the DNA and perform the engineering process. Take an LB/ Kan plate out of the fridge and bring them to room temperature
  1. Pour half of the LB/competent cell mix to your LB/Kan plates and gently spread the bacteria around the plate with an inoculation loop. L et dry for 10 minutes before putting the lid back on.
  1. Flip the plate upside down to prevent condensation from forming and dripping onto your bacteria.
  1. Incubate the plate at room temperature for 24-48 hours. Keep pDusk in a dark place or wrap the plate with tin foil.
  1. If your transformation was successful, you should have a plate that looks like the one below. If you kept it in the dark the pDusk plate should look a little red. If you kept it in the light the pDawn plate should look red. If not, give it another shot, Science doesn&rsquot always work on the first try. Also, feel free to contact us at [email protected] and we will help you troubleshoot.

Now that you have colonies growing, you can do a couple of tests to see how pDusk and pDawn behave differently in light and in dark conditions.


Inhalt

The most common growth media for microorganisms are nutrient broths (liquid nutrient medium) or lysogeny broth medium. Liquid media are often mixed with agar and poured via a sterile media dispenser into Petri dishes to solidify. These agar plates provide a solid medium on which microbes may be cultured. They remain solid, as very few bacteria are able to decompose agar (the exception being some species in the genera: Cytophaga, Flavobacterium, Bazillus, Pseudomonas, und Alcaligenes). Bacteria grown in liquid cultures often form colloidal suspensions. [4] [5]

The difference between growth media used for cell culture and those used for microbiological culture is that cells derived from whole organisms and grown in culture often cannot grow without the addition of, for instance, hormones or growth factors which usually occur in vivo. [6] In the case of animal cells, this difficulty is often addressed by the addition of blood serum or a synthetic serum replacement to the medium. In the case of microorganisms, no such limitations exist, as they are often unicellular organisms. One other major difference is that animal cells in culture are often grown on a flat surface to which they attach, and the medium is provided in a liquid form, which covers the cells. In contrast, bacteria such as Escherichia coli may be grown on solid or in liquid media.

An important distinction between growth media types is that of defined versus undefined media. [1] A defined medium will have known quantities of all ingredients. For microorganisms, they consist of providing trace elements and vitamins required by the microbe and especially defined carbon and nitrogen sources. Glucose or glycerol are often used as carbon sources, and ammonium salts or nitrates as inorganic nitrogen sources. An undefined medium has some complex ingredients, such as yeast extract or casein hydrolysate, which consist of a mixture of many chemical species in unknown proportions. Undefined media are sometimes chosen based on price and sometimes by necessity – some microorganisms have never been cultured on defined media.

A good example of a growth medium is the wort used to make beer. The wort contains all the nutrients required for yeast growth, and under anaerobic conditions, alcohol is produced. When the fermentation process is complete, the combination of medium and dormant microbes, now beer, is ready for consumption. The main types are

  • cultural media
  • minimal media
  • selective media
  • differential media
  • transport media
  • indicator media

Culture media Edit

Culture media contain all the elements that most bacteria need for growth and are not selective, so they are used for the general cultivation and maintenance of bacteria kept in laboratory culture collections.

An undefined medium (also known as a basal or complex medium) contains:

  • a carbon source such as glucose
  • Wasser
  • various salts
  • a source of amino acids and nitrogen (e.g. beef, yeast extract)

This is an undefined medium because the amino-acid source contains a variety of compounds the exact composition is unknown.

A defined medium (also known as chemically defined medium or synthetic medium) is a medium in which

Examples of nutrient media:

Minimal media Edit

A defined medium that has just enough ingredients to support growth is called a "minimal medium". The number of ingredients that must be added to a minimal medium varies enormously depending on which microorganism is being grown. [7] Minimal media are those that contain the minimum nutrients possible for colony growth, generally without the presence of amino acids, and are often used by microbiologists and geneticists to grow "wild-type" microorganisms. Minimal media can also be used to select for or against recombinants or exconjugants.

Minimal medium typically contains:

  • a carbon source, which may be a sugar such as glucose, or a less energy-rich source such as succinate
  • various salts, which may vary among bacteria species and growing conditions these generally provide essential elements such as magnesium, nitrogen, phosphorus, and sulfur to allow the bacteria to synthesize protein and nucleic acids
  • Wasser

Supplementary minimal media are minimal media that also contains a single selected agent, usually an amino acid or a sugar. This supplementation allows for the culturing of specific lines of auxotrophic recombinants.


Examples of lysogeny broth in the following topics:

Culture Media

  • The most common growth media nutrient broths (liquid nutrient medium) or LB medium (LysogenyBroth) are liquid.

Plasmids and Lysogeny

  • Both plasmids and lysogeny are used by bacteria and viruses to ensure transfer of genes and nucleic acids for viral reproduction.
  • Lysogeny is the process by which a bacteriophageintegrates its nucleic acids into a host bacterium's genome.
  • Lysogeny is utilized by viruses to ensure the maintenance of viral nucleic acids within the genome of the bacterium host.
  • Lysogeny is one of two major methods of viral reproduction utilized by viruses.
  • An example of a virus which can promote the transformation of bacterium from a nontoxic to toxic strain via lysogeny is the CTXφ virus.

Temperate Bacteriophages: Lambda and P1

  • With phage the term virulent is often used as an antonym to temperate, but more strictly a virulent phage is one that has lost its ability to display lysogeny through mutation, rather than a phage lineage with no genetic potential to ever display lysogeny (which more properly would be described as an obligately lytic phage).
  • In lysogeny, P1 can exist within a bacterial cell as a circular DNA, in that it exists by replicating as if it were a plasmid and does not cause cell death.
  • Während lysogeny, new phage particles are not produced.
  • A unique feature of phage P1 is that during lysogeny its genome is not incorporated into the bacterial chromosome, as is commonly observed during lysogeny of other bacteriophage.
  • This virus is temperate and may reside within the genome of its host through lysogeny.

History of Microbiology: Hooke, van Leeuwenhoek, and Cohn

  • Lazzaro Spallanzani (1729–1799) found that boiling broth would sterilise it and kill any microorganisms in it.
  • He also found that new microorganisms could settle only in a broth wenn die broth was exposed to the air.
  • By boiling the broth beforehand, Pasteur ensured that no microorganisms survived within the broths at the beginning of his experiment.
  • Nothing grew in the broths in the course of Pasteur's experiment.
  • This meant that the living organisms that grew in such broths came from outside, as spores on dust, rather than spontaneously generated within the broth.

Pasteur and Spontaneous Generation

  • In summary, Pasteur boiled a meat broth in a flask that had a long neck that curved downward, like a goose.
  • The idea was that the bend in the neck prevented falling particles from reaching the broth, while still allowing the free flow of air.
  • When the flask was turned so that particles could fall down the bends, the broth quickly became clouded .
  • In detail, Pasteur exposed boiled broths to air in vessels that contained a filter to prevent all particles from passing through to the growth medium, and even in vessels with no filter at all, with air being admitted via a long tortuous tube that would not allow dust particles to pass.
  • Nothing grew in the broths unless the flasks were broken open, showing that the living organisms that grew in such broths came from outside, as spores on dust, rather than spontaneously generated within the broth.

The Lytic and Lysogenic Cycles of Bacteriophages

  • Those phages able to undergo lysogeny are known as temperate phages.
  • Even though there are similarities between lysogeny and latency, the term lysogenic cycle is usually reserved to describe bacteriophages.

Pure Culture

  • Another method of bacterial culture is liquid culture, in which the desired bacteria are suspended in liquid broth, a nutrient medium.
  • The experimenter would inoculate liquid broth with bacteria and let it grow overnight (they may use a shaker for uniform growth).

Tissue Culture of Animal Viruses

  • Viruses cannot be grown in standard microbiological broths or on agar plates, instead they have be to cultured inside suitable host cells.

Complex and Synthetic Media

  • Luria Broth as shown here is made with yeast extract, as yeast extract is not completely chemically defined Luria Broth is therefore an undefined media.By Lilly_M [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC-BY-SA-3.0-2.5-2.0-1.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons

Minimal Inhibitory Concentration (MIC)

  • MICs can be determined on plates of solid growth medium (called agar, shown in the "Kirby-Bauer Disk Susceptibility Test" atom) or broth dilution methods (in liquid growth media, shown in ) after a pure culture is isolated.
  • For example, to identify the MIC via broth dilution, identical doses of bacteria are cultured in wells of liquid media containing progressively lower concentrations of the drug.
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VWR Life Science Premixed LB Broth

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Is there a difference between Luria Broth and Lysogeny Broth? - Biologie

Rich media used for routine culture of E. coli and other bacteria at high cell densities.

1L 5L Komponente
10 g 50 g Tryptone
5 g 25 g Yeast Extract
10 g 50 g NaCl

Add dH2O to final volume. Autoclave. If mixing up large batches and aliquoting, be sure to add exact volumes to final media bottles so that they will be ready for addition of antibiotic to known concentrations.

This recipe is from Miller JH. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics. CSHL Press. Handbook Unit 25.5.

Note: Be aware that (1) there are several other formulations that may be called LB but vary the amount of NaCl. Using the wrong one can cause large changes in growth. (2) LB was originally supposed to stand for "Lysogeny Broth" and you may also see it called "Luria Broth" (more about this).

Expected results: E coli strains grow to 5×10 9 cells/ml final density in LB.

Variant: 0.1×LB is made with 1 g Tryptone, 0.5 g Yeast Extract, and 10 g NaCl per liter. (It is 0.1× in the nutrients, but nicht the salt!)


Is there a difference between Luria Broth and Lysogeny Broth? - Biologie

When it comes to growing bacterial colonies, LB-agar steps up to the plate &ndash but first you have to get it into a gel state (a situation to which its friend agarose can surely relate!) &ldquo-ose&rdquo is an ending that&rsquos usually used to indicate something&rsquos a sugar &ndash and agarose ist a sugar &ndash but so is agar! So what&rsquos the difference? They&rsquore related, but they differ by more than just a few letters and those differences make them useful for making gel matrices for different tasks &ndash agarose gels for separating DNA fragments by size and agar gel plates for growing bacteria)

A gar is a fish-like thing and AGAR (aka agar-agar (seriously!)) is a Mischung of 2 sugars &ndash agaropectin & the one we&rsquore more familiar with, Agarose. So you get agarose by purifying agar. And to understand why you&rsquod go through that trouble sometimes, but not other times, it helps to know a bit more about what these sugars are.

Agarose ist ein Polysaccharid (&ldquopoly&rdquo means many & saccharide&rsquos sugar, so a polysaccharide is a long chain of repeating sugar subunits joined together). It&rsquos an example of a polymer. Polymersare long chains of repeating subunits. Different polymers have subunits of different types (e.g. nucleotide subunits link up to give you the polymers we call DNA or RNA amino acids join to form proteins and monosaccharide sugars chain-ify to give make complex carbs (like agarose!))

Sugars have lots of hydroxyl (-OH) groups (which water happily sticks to, helping you form a Gel &ndash an &ldquoinfinitely&rdquo interconnected (like 7° of Kevin bacon) polymer mesh containing water. (more to come)). Individual sugar units (monosaccharides) often adopt ring structures (as is the case in agarose) in which the -OH groups stick out like legs. Sugars can have the same &ldquolinkage&rdquo but have the linked groups sticking out in different ways & we use &ldquoL&rdquo and &ldquoD&rdquo to refer to which direction in space the legs point. More on such stereochemistry here: bit.ly/2Q8Dnax

Monosaccharides can use their -OH&rsquos to link together. Linking 2 gives you a disaccharide . Add a few more and you get oligosaccharides (oligo means few). Link lots and you get a polysaccharide (poly meaning many).

And speaking of many, the multiple -OHs mean there are multiple potential linkage sites (which we specify by which number &ldquoaddresses&rdquo on the sugar rings are joined). You can get &ldquobranching,&rdquo but in agarose, you have linear chains (of about 400 subunits). (Although branches can be introduced using &ldquocrosslinkers&rdquo to strengthen agarose so that it can do things like make size exclusion chromatography (&ldquogel filtration&rdquo) resin which can withstand the high pressures generated in FPLC (Fast performance liquid chromatography).

In agarose, the repeating subunit is a sugar duo (disaccharide) of galactose (D-galactose to be precise) linked to a modified galactose monosaccharide, 3,6-anhydro-L-galactose. We call this duo AGAROBIOSE (Linking a galactose to a glucose gives you lactose, a disaccharide you might be more familiar with).

In galactose, the rings have 6 sides with 4 -OH legs, 5 -H legs, & 1 methylhydroxyl (-CH₂OH) leg. We often don&rsquot draw the &ldquo-H&rdquo legs because they hide the more interesting legs that are capable of reacting. In agarose&rsquos modified galactose, 2 of the -OH groups have linked up & kicked out a hydrogen (&ldquoanhydro&rdquo) so that the methyl hydroxyl arm is bridged to an -OH arm forming a &ldquobridge&rdquo over the ring.

About 2/3 of agar is agarose but, agar also contains AGAROPECTIN. It&rsquos really similar (it has alternating D & L galactoses) BUT many of those galactoses have modifications. There are several different modifications including adding sulfate(s), pyruvic acid, or methyl groups, or sneaking in one of those linked-leg versions like&rsquos in agarose.

Unlike the consistent repeating nature of AGAROSE, it&rsquos only the alternating D- & L- galactose &ldquoskeleton&rdquo that&rsquos consistent in agaropectin. Its modifications are scattered throughout the chain (for instance,

every 10th is attached to a sulfate through an -O-sulfate linkage, but that&rsquos just on average, and it&rsquos not likely they&rsquore precisely, evenly, distributed). And, while the chains tend to be shorter than the agarose chains, their length is also variable, so, agaropectin&rsquos really quite a mix & you never know quite what you&rsquore gonna get!

Why use one over the other?

DNA has a lot of negatively-charged phosphate groups (phosphorus surrounded by 4 oxygens). This will serve the basis for them moving through the gel towards the positive end. So we need the gel to be neutral.

Agar has a lot of sulphate groups (sulfur surrounded by oxygens). These are also negatively-charged, so they can interfere with how the DNA moves through the gel. So it would make a bad matrix for electrophoresis.

BUT agarose is neutral, making a good matrix for electrophoresis.

BUT agarose is also more expensive because it has to be purified. So if you don&rsquot need to worry about the physical charge issue, might as well use something that has a lower *monetary* charge! Because agar requires less processing, its cheaper & perfect for use as a matrix to hold bacteria food!.

In agar plates, it&rsquos not the agar itself that&rsquos providing nutrients. That&rsquos one of the great things about agar &ndash *most* bacteria can&rsquot eat it. Instead, the agar just provides &ldquoscaffolding&rdquo to house the nutrients the bacteria need. And often those nutrients are provided through a liquid bacterial food &ldquogrowth media&rdquo called LB, which, no matter what your textbooks might say, (originally at least) stands for Lysogeny Broth. Sometimes initials for Luria, Lennox, or Luria & Bertani get credit for the name, but it really stands for LYSOGENY BROTH and its recipe was first published (by Giuseppe Bertani) in 1951. He was using it when studying lysogeny (a process where a bacteria-infecting virus called a bacteriophage (&ldquophage&rdquo) inserts its own DNA into a bacteria&rsquos DNA & bides its time until conditions are right for entering the lytic phage where it cuts itself out, makes lots of copies and bursts open the cell) http://bit.ly/2HLuB1S

The point of LB is basically to give the bacteria what they need to grow, divide, and do what we want (like make copies of DNA we put in them and/or make copies of proteins using instructions from DNA we put in them). And to do it cheaply.

Note: For the protein-making and large-scale DNA-making, we grow bacteria in straight-up LB liquid &ndash &ldquoin suspension&rdquo with shaking &ndash but when we need to isolate specific groups of bacteria that are all derived from the same &ldquoparent cell&rdquo and thus genetically-identical, we embed that LB into a gel so that different genetically-distinct &ldquocolonies&rdquo don&rsquot intermingle, but instead grow as gloopy dots. If you want to learn more about various media for the suspension stuff check out this post http://bit.ly/bacterialmedia but today I&rsquom going to focus on the gel-trapped form.

We don&rsquot give the bacteria 5-star cuisine. Instead, we want to spend as little money as possible while still giving them the nutrients they need. At a minimum, we need to give them a source of energy, something they can break down (catabolize) to make ATP &ndash such things can be sugars, proteins, fats. In addition to breaking things down, they need to be able to make things like proteins and DNA (do the anabolic part of metabolism). This requires nutrients that provide the elements needed like carbon and nitrogen, which thankfully you can get with a simple recipe that&rsquos sufficient for lots of bacteria.

There are 3 main components (though 2 of those components themselves have a lot of components.

  • TRYPTONE -> this is a mix of peptides formed by the digesting a protein called casein with pancreatic enzyme -> this provides amino acids the bacteria can use to make new proteins
  • YEAST EXTRACT -> this &ldquoautolysate&rdquo of yeast is basically just whatever happened to be in yeast (organic compounds including vitamins, trace elements, etc.) &ndash and if it was good enough for the yeast&hellip
  • SODIUM CHLORIDE (NaCl)(table salt) -> allows for osmotic balance, transport, etc.

A few of the major LB formulations are the &ldquoMiller,&rdquo &ldquoLennox,&rdquo & &ldquoLuria&rdquo versions & they differ in the amount of salt they have. Miller & Bertani drown the bacteria in NaCl (10g/L) whereas Lennox just uses 5g/L and Luria just 0.5g/L -> such low salt recipes are good if you&rsquore using a salt-sensitive antibiotic. in the original paper, Bertani also added glucose, but most later recipes leave it out.

And speaking of leaving things out, we need to make sure we &ldquoleave out&rdquo bacteria we don&rsquot want, which we can do by &ldquoselecting for&rdquo the bacteria we tun want using selection media, which contain things like antibiotics etc. that suppress the growth of things you don&rsquot want to grow. For example, when we put genes into bacteria, we normally do it in the form of circular pieces of DNA called plasmids. We design those plasmids to also have an antibiotic resistance gene, so we can spike the food with that antibiotic and it can still grow, but other stuff can&rsquot http://bit.ly/2tcW4ky

There&rsquos also differential media &ndash this allows for &ldquoscreening&rdquo as opposed to &ldquoselection&rdquo &ndash you don&rsquot keep things from growing, but you change how they appear &ndash for example, we use X-gal for blue-white screening http://bit.ly/2MxNPs2

After I put a plasmid with my gene into bacteria and get colonies, I pick a few of those colonies and put them in liquid LB (with antibiotic) to grow overnight to make lots of copies of the plasmid, then I can purify out those copies and send them for sequencing to check for typos before l enter the &ldquoexpression prep&rdquo part.

Regardless of what media you use, you need it to be sterile. So you autoclave it (stick it in a really hot, high pressure dishwasher) -> make sure the bottles aren&rsquot sealed tight or they&rsquoll explode (thankfully I haven&rsquot made this mistake) &ndash and don&rsquot re-tighten the lids until the bottles have cooled of or the lids will get stuck (I *have* made this one). Another mistake not to make -> don&rsquot add antibiotics before autoclaving, or you&rsquoll inactivate them. We usually don&rsquot add it until right before we&rsquore ready to use it.

In undergrad, I made all my own media, but here, we use so much of it, we have a &ldquomedia-maker&rdquo lab technician who&rsquos amazing and makes & sterilizes our bacterial growth media. You know something&rsquos been through an autoclave if the lines on its autoclave tape are black &ndash the tape is temperature-sensitive so it color-changes when it gets really hot. I really want to design a line of joke and/or trivia messaged autoclave tape &ndash so if the whole teaching thing doesn&rsquot work out, I guess I have a back up!


Schau das Video: Bacteriopage Lytic Cycle (Januar 2023).