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4: Säurefeste und Endosporenfärbung - Biologie

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4: Säurefest und Endosporenfärbung

4: Säurefeste und Endosporenfärbung - Biologie

Mikrobiologische Färbungen werden verwendet, um Mikroorganismen zu erkennen und zu identifizieren, die sonst in klinischen Proben schwer zu finden wären. Einfache positiv oder negativ geladene Farbstoffe sorgen für eine schnelle Entdeckung. Die vorgemischten Lösungen färben künstlich ein, um Bewegung, Struktur und Eigenschaften von lebenden oder konservierten Exemplaren zu beobachten. Die Unterscheidung von Mikroorganismen nach Eigenschaften, Farbkombinationsverfahren wie die Gram-Färbung oder säurefeste Techniken erfordern mikrobiologische Färbungen.

Die folgenden Punkte heben die fünf wichtigsten Färbearten hervor. Die Typen sind: 1. Einfache Färbung 2. Differentielle Färbung 3. Gram-Färbung 4. Säurefeste Färbung 5. Endosporen-Färbung.

Färbetyp # 1. Einfache Färbung:

Die Färbung von Mikroorganismen durch Auftragen eines einzelnen Farbstoffs auf einen fixierten Ausstrich wird als einfache Färbung bezeichnet. Man bedeckt den fixierten Ausstrich für eine bestimmte Zeit mit Fleck, wonach diese Lösung mit Wasser abgewaschen und trocken getupft wird. Basische Farbstoffe wie Kristallviolett, Methylenblau und Carbolfuchsin werden häufig in der einfachen Färbung verwendet, um Größe, Form und Anordnung prokaryontischer Zellen zu bestimmen.

Färbetyp # 2. Differenzielle Färbung:

Diese Färbeverfahren werden verwendet, um Organismen basierend auf Färbeeigenschaften zu unterscheiden. Sie sind etwas aufwendiger als einfache Färbetechniken, bei denen die Zellen mehr als einem Farbstoff oder einer Färbung ausgesetzt werden können, beispielsweise die Verwendung der Gram-Färbung, die Bakterien in zwei Klassen einteilt – Gram-negativ und Gram-positiv.

Färbetyp # 3. Gram-Färbung:

Es ist eine der wichtigsten und am häufigsten verwendeten differentiellen Färbetechniken in der Mikrobiologie. Diese Technik wurde 1884 vom dänischen Arzt Christian Gram eingeführt. Im ersten Schritt wird der Ausstrich mit dem basischen Farbstoff Kristallviolett (Primärfärbung) angefärbt und anschließend mit Jodlösung als Beizmittel behandelt. Jod erhöht die Wechselwirkung zwischen Zelle und Farbstoff, so dass sich die Zelle stark anfärbt. Der Ausstrich wird als nächstes durch Waschen mit Ethanol oder Aceton entfärbt. Dieser Schritt erzeugt den differentiellen Aspekt von Gram-Färbungen. Gram-positive Bakterien behalten Kristallviolett und werden farblos. Schließlich wird der Ausstrich mit einem einfachen Grundfarbstoff, der sich in der Farbe von Kristallviolett unterscheidet, gegengefärbt. Safranin ist die häufigste Gegenfärbung, die gramnegative Bakterien rosa bis rot färbt und grampositive Bakterien dunkelviolett hinterlässt. Die Unterschiede in den Färbereaktionen auf die Gram-Färbung können mit chemischen und physikalischen Unterschieden der Zellwände zusammenhängen. Die Zellwand der Gram-negativen Bakterien ist dünn, komplex mehrschichtig aufgebaut und enthält neben Protein und Mucopeptid relativ hohe Lipidgehalte. Die höhere Menge an Lipid wird leicht durch Alkohol gelöst, was zu großen Poren in der Zellwand führt und somit das Austreten des Kristallviolett-Jod-(CV-I)-Komplexes erleichtert, was zu einer Entfärbung der Bakterienzelle führt. Die nehmen später Gegenflecken und erscheinen rot. Im Gegensatz dazu ist die Zellwand von Gram+Ve-Bakterien dick und chemisch einfach und besteht hauptsächlich aus Mucopeptiden. Wenn es mit Alkohol behandelt wird, führt es zu einer Dehydration und einem Verschluss der Zellwandporen, wodurch der Verlust des (CV-I)-Komplexes verhindert wird und die Zellen violett bleiben.

Färbetyp # 4. Säurefeste Färbung:

Es ist ein weiteres wichtiges differentielles Färbeverfahren. Es wird am häufigsten verwendet, um Mycobacterium spp. Diese Bakterien haben Zellwände mit hohem Lipidgehalt wie Mykolsäure – eine Gruppe von verzweigtkettigen Hydroxylipiden, die verhindern, dass Farbstoffe leicht an Zellen binden. Sie können mit der Ziehl-Nulsen-Methode gefärbt werden, bei der mithilfe von Hitze und Phenol basisches Fuchsin in die Zellen gelangt. Mycrobacterium spp. wurden mit basischem Fuchsin durchdrungen, lassen sich von angesäuertem Alkohol (saurer Alkohol) nicht leicht entfärben und gelten daher als säurefest. Nicht trockenfeste Bakterien werden durch Trockenalkohol entfärbt und werden daher durch Methylenblau-Gegenfärbung blau gefärbt.

Färbungstyp # 5. Endosporenfärbung:

Bei einigen Bakteriengattungen findet eine Sporenbildung statt, um ungünstigen Bedingungen standzuhalten. Alle Bakterien können keine Sporen bilden, nur wenige Bakteriengattungen einschließlich Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum produzieren sporulierende Strukturen in vegetativen Zellen, die als Endosporen bezeichnet werden. Morphologie und Lage der Endosporen variieren je nach Art und sind wertvoll für die Identifizierung Endosporen werden von den meisten Farbstoffen nicht gut gefärbt, aber wenn sie einmal gefärbt sind, widerstehen sie einer Entfärbung stark. Beim Schaffer-Fulton-Verfahren werden Endosporen zuerst durch Erhitzen von Bakterien mit Malachitgrün gefärbt, einem sehr starken Farbstoff, der Endosporen durchdringen kann. Nach der Malachitgrün-Behandlung wird der Rest der Zelle mit Wasser farbstofffrei gewaschen und mit Safranin gegengefärbt. Diese Technik ergibt eine grüne Endospor mit roten vegetativen Zellen.


Säurefeste Fleckenbakterien

Bei der säurefesten Färbung wird eine Reihe von Farbstoffen aufgetragen, die einige Bakterien rosa (säurefest) und andere violett (nicht säurefest) hinterlassen. Um zu verstehen, wie diese Färbung funktioniert, ist es wichtig, die Art der Bakterien zu kennen, die mit der säurefesten Färbung identifiziert wurden.

* Mykobakterien und Nocardia-Infektionskrankheit *

Viele Bakterien der Gattungen Mycobacterium und Nocardia sind medizinisch bedeutsame Erreger von Infektionskrankheiten wie Tuberkulose, Lepra und anderen Lungen- und Hautinfektionen. Es ist daher offensichtlich wichtig, Mitglieder dieser Gattungen genau identifizieren zu können.

* Zellwand von Mykobakterien und Nokardien *

Die Gram-Färbung ist eine differentielle Färbereaktion, die verwendet wird, um die meisten Bakterien entweder als Gram+ oder Gram- zu kategorisieren. Diese Unterscheidung ist auf Unterschiede in der Zellwandstruktur dieser beiden Bakterienkategorien zurückzuführen und hat Bedeutung in Bezug darauf, welche Antibiotika verwendet werden können, um Bakterien abzutöten oder zu kontrollieren.

Bakterien des allgemeinen Mycobacteriums und Nocardia haben ungewöhnliche Zellwände, die aufgrund des Vorhandenseins von Mykolsäure und großen Mengen an Fettsäuren, Wachsen und komplexen Lipiden wachsartig und nahezu undurchlässig sind. Diese Organismen sind sehr beständig gegen Desinfektionsmittel, Austrocknung und sind mit wasserbasierten Beizen wie Gram schwer zu färben.

Da die Zellwand gegen die meisten Verbindungen so resistent ist, benötigen säurefeste Organismen eine spezielle Färbetechnik mit Hitze, um die Färbung in die wachsartige Zellwand zu treiben.

* Hitzefixierung eines Bakterienabstrichs *

Vor dem Anfärben von Bakterien muss ein Bakterienausstrich auf einem Objektträger hitzefixiert werden. Ein Abstrich ist eine Bakterienprobe, die in einer kleinen Menge Wasser auf einem Objektträger suspendiert ist. Diese Probe wird dann unter Verwendung von Hitze getrocknet. Die Hitze tötet die Bakterien ab und bindet die Probe am Objektträger, so dass sie nicht so leicht weggespült wird.

* Säureschnelles Färbeverfahren *

Das Protokoll zum Färben von säurefesten Organismen ist wie folgt:

1. Legen Sie einen Streifen Löschpapier über den Objektträger.
2. Legen Sie den abgedeckten Objektträger über ein gesiebtes Wasserbad und tränken Sie dann das Löschpapier mit der Primärfärbung Ziehl’s carbol fuschion.
3. Lassen Sie den Objektträger 3 bis 5 Minuten über dem Wasserbad liegen und tragen Sie die Farbe erneut auf, wenn er auszutrocknen beginnt.
4. Löschpapier entfernen und Objektträger spülen, bis das Wasser klar ist.
5. Objektträger 10 bis 15 Sekunden mit Entfärber Acid Alcohol fluten und dann spülen.
6. Objektträger eine Minute lang mit Kristallviolett gegenfärben und dann spülen.
7. Tupfen Sie den Objektträger vorsichtig trocken. Es kann nun unter Ölimmersion (1000x TM) mit einem Hellfeld-Verbindungsmikroskop betrachtet werden.

Nach diesem Färbevorgang erscheinen die säurefesten Zellen rosa, da die Primärfärbung, Ziel’s carbol fuschion, mit der Hitze des Wasserbads in die wachsartige Zellwand der Bakterien getrieben wurde. Die nicht säurefesten Zellen (Bakterien, die keine wachsartige Zellwand haben) erscheinen violett, nachdem sie die Gegenfärbung, Kristallviolett, zurückbehalten haben, nachdem die Primärfärbung durch den Entfärber entfernt wurde.

Bauman, R. (2005)Mikrobiologie. Pearson Banjamin Cummings.
Park Talaro, K. (2008)Grundlagen in der Mikrobiologie. McGraw-Hill.


Figuren

Alle Bakterienproben sind als Biosafety Level 1 (BSL1) eingestuft und wurden wie folgt von ATCC bezogen: Streptococcus salivarius (ATCC BAA-1024), Escherichia coli (ATCC 25922), Bacillus subtilis (ATCC 825D-5), Mycobacterium phlei (ATCC BAA-486), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228D), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603D-5), Micrococcus luteus (ATCC 53598D), Acinetobacter lwolffi (Cal Poly-Probe), Enterococcus faecalis (ATCC 47077), Brevibacterium-Bettwäsche (Cal Poly-Probe), Serratia marcescens


Pre-Lab - Lab Unit 05 - Acid-Fast & Endospor Stain

  • Eingereicht von: Essayreader
  • Einreichungsdatum: 13.02.2009 16:51 Uhr
  • Kategorie: Soziale Themen
  • Wörter: 386
  • Seite 2
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Einreichung der Aufgaben: Pre-Lab - Lab Unit 05 - Acid-Fast & Endopore Stain und FTM Danay Perez(dperez7) PeopleLink-Optionen für diesen Benutzer anzeigen
Anweisungen:
Die Schüler müssen vor diesem Lab ein Prelab über das uLearn-Aufgabentool einreichen. Prelabs sind in der Regel am Montag vor der ersten Unterrichtsstunde einer bestimmten Laboreinheit (siehe Stundenplan) fällig. Das Prelab für Lab Unit 03 muss einen Einführungs- und einen Verfahrensabschnitt (Materialien und Methoden) enthalten.

Die Einführung in Lab Unit 05 muss in Essayform verfasst sein und Hintergrundinformationen zu den säurefesten Färbemitteln, Endosporenfärbemitteln und flüssigen Thioglykollat-Medien enthalten. Im Folgenden sind spezifische Themen aufgeführt:

* Säurefeste Flecken: Diese Färbung ist erforderlich, um das Vorhandensein von Mykolsäuren und die Wirkung von Mykolsäuren auf die Gram-Färbung zu bestimmen
* Endosporen: Was sind Endosporen und was bedeutet ein Bakterium mit Endosporen.
* FTM: Warum ist es wichtig, die Sauerstoffverwertungsanforderungen eines Organismus zu kennen und wie zeigt das Fluid Thioglycollate Medium die Sauerstoffverwertung.

Sie müssen sich für diese Informationen auf externe Quellen beziehen. Diese Einleitung muss zwischen 500 und 1000 Wörtern lang sein, richtig referenziert sein (verwenden Sie das Referenzschema in den Zeitschriften der American Society for Microbiology) und muss den Richtlinien für die Einreichung von Aufgaben in uLearn entsprechen (die Einreichung muss sowohl in der Einreichungsfenster und als .rtf-Dokument angehängt.

Der Abschnitt "Verfahren" ist in Ihren eigenen Worten zu verfassen und kann eine Kombination aus Aufsatzformat und Gliederung sein. Visuelle Umrisse, Konzeptkarten oder Cartoons sind ebenfalls akzeptabel. Die Schüler werden ermutigt, die Zeitdauer zu berücksichtigen, die für die Durchführung eines Verfahrens erforderlich ist. Bitte beachten Sie, dass das Kopieren von Material direkt aus dem Laborlehrbuch, auch mit geringfügigen Änderungen, als Plagiat gilt und zu einer Note von Null (0) für den Abschnitt Verfahren führt. Das Ziel.


Ich suche nach:

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Säureschnelle Färbung

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3 - 1 Benutzung des Mikroskops

Das Mikroskop, wie in Abbildung 3-1 dargestellt, ist eines der wichtigsten Instrumente des Mikrobiologen. Um die morphologischen und färbenden Eigenschaften von Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Schimmelpilzen, Algen und Protozoen zu untersuchen, müssen Sie ein Mikroskop richtig bedienen können.

Abbildung 3.1. Das Lichtmikroskop. Ein modernes Lichtmikroskop. Dies ist ein Beispiel, wie es in den Lehrlabors der University of Wisconsin-Madison verwendet wird. Die verschiedenen Teile des Mikroskops sind beschriftet. Bitte nehmen Sie sich die Zeit, sich mit ihren Namen vertraut zu machen.

Das in der Mikrobiologie verwendete Verbundmikroskop ist ein Präzisionsinstrument, dessen mechanische Teile wie der kalibrierte Kreuztisch und die Einstellknöpfe leicht beschädigt werden können und alle Linsen, insbesondere das Ölimmersionsobjektiv, empfindlich und teuer sind. Gehen Sie vorsichtig mit dem Instrument um und halten Sie es sauber.

Das Mikroskop ist im Grunde ein optisches System (zur Vergrößerung) und ein Beleuchtungssystem (um die Probe sichtbar zu machen). Um die Funktion der verschiedenen Teile des Mikroskops zu verstehen, verfolgen wir einen Lichtstrahl, der sich von der Lichtquelle über die Linsen bis zum Auge durch ein Mikroskop bewegt. Abbildung 3-8 zeichnet den Lichtweg durch die Teile des Mikroskops nach

Abbildung 3.8. Der Lichtweg durch ein Mikroskop. Moderne Mikroskope sind komplexe Präzisionsinstrumente. Licht, das von der Lichtquelle (1) ausgeht, wird durch den Kondensor (2) auf die Probe (3) fokussiert. Das Licht tritt dann in die Objektivlinse (4) ein und das Bild wird vergrößert. Das Licht durchläuft dann eine Reihe von Glasprismen und Spiegeln und gelangt schließlich in das Okular (5), wo es weiter vergrößert wird und schließlich das Auge erreicht.

Betrachten wir zunächst ein Hauptmerkmal aller Mikroskope, die Lichtquelle. Die richtige Beleuchtung ist für den effektiven Einsatz eines Mikroskops unerlässlich. Als Beleuchtungsquelle dient in der Regel eine Wolfram-Glühlampe. Wenn eine Auflichtbeleuchtung verwendet wird, liefert eine separate Lampe einen fokussierten Lichtstrahl, der von einem Spiegel durch die Kondensorlinsen nach oben reflektiert wird.

Das Licht von der Beleuchtungsquelle wird durch den Kondensor der Unterstufe geleitet. Der Kondensor dient zwei Zwecken: Er reguliert die Lichtmenge, die die Probe erreicht und bündelt das von der Lichtquelle kommende Licht. Mit zunehmender Vergrößerung der Objektivlinse wird mehr Licht benötigt. Die Irisblende (im Kondensor) reguliert die Lichtmenge, die das Präparat erreicht. Der Kondensor sammelt auch das breite Lichtbündel der Lichtquelle und fokussiert es auf den kleinen zu beobachtenden Bereich der Probe.

Das Licht gelangt dann durch das Dia nach oben und in das Objektiv, wo die erste Vergrößerung des Bildes stattfindet. Die Vergrößerung erhöht die scheinbare Größe eines Objekts. Im zusammengesetzten Lichtmikroskop vergrößern zwei Linsen, eine in der Nähe des Objekttisches, die als Objektivlinse bezeichnet wird, und eine andere im Okular, die Probe. Die Vergrößerungsstärke eines Objektivs ist in die Objektivfassung eingraviert. Mikroskope in den meisten mikrobiologischen Labors haben drei Objektivlinsen: die Objektivlinse mit geringer Leistung (10X), die Hochtrockenobjektivlinse (40X) und die Ölimmersionsobjektivlinse (100X). Mittels eines Revolvers wird das gewünschte Objektiv in die Arbeitsposition gedreht.

Auf beiden Seiten des Mikroskopsockels befinden sich die Dreh- und Feineinstellknöpfe, mit denen das Bild scharf gestellt wird. Die Drehung dieser Knöpfe bewegt die Probe und die Objektive entweder näher oder weiter auseinander. Die Grobeinstellung bewegt den Objektivrevolver in großen Schritten und bringt das Objekt annähernd in den Fokus. Die Feineinstellung bewegt den Objektivrevolver für eine präzise Endfokussierung langsamer. Bei einigen Mikroskopen bewegt die Drehung der Fein- und Kurseinstellungsknöpfe den Objekttisch anstelle des Objektivrevolvers.

Vergrößerung allein ist nicht das einzige Ziel eines Mikroskops. Ein gegebenes Bild kann originalgetreu vergrößert werden, ohne dass die Details vergrößert werden. Das wahre Maß eines Mikroskops ist sein Auflösungsvermögen. Das Auflösungsvermögen des Objektivs ist seine Fähigkeit, feine Details zu erkennen und kleine Objekte deutlich sichtbar zu machen. Es wird als kleinster Abstand zwischen zwei Punkten oder Linien gemessen, bei denen sie als separate Einheiten anstelle eines verschwommenen Bildes sichtbar sind. Das auf der Linse eingravierte Auflösungsvermögen der Objektivlinse ermöglicht es uns vorherzusagen, welches Objektiv zur Beobachtung einer bestimmten Probe verwendet werden sollte. Eine gute Auflösung im Mikroskop garantiert jedoch kein sichtbares Bild, das Auflösungsvermögen des menschlichen Auges ist stark eingeschränkt. Oft ist eine weitere Vergrößerung erforderlich, um ein gutes Bild zu erhalten.

Wenn die Ölimmersionsobjektivlinse verwendet wird, wird der Unterschied zwischen der Lichtbiegefähigkeit (oder dem Brechungsindex des die Probe haltenden Mediums) und der Objektivlinse wichtig. Da der Brechungsindex von Luft geringer ist als der von Glas, werden Lichtstrahlen beim Übergang vom Objektträger in die Luft gebeugt oder gebrochen, wie in Abbildung 3-9 gezeigt. Viele dieser Lichtstrahlen werden in einem so großen Winkel gebrochen, dass sie die Objektivlinse vollständig verfehlen. Dieser Lichtverlust ist so stark, dass die Bilder deutlich verschlechtert werden. Ein Tropfen Immersionsöl mit einem glasähnlichen Brechungsindex zwischen Objektträger und Objektiv verringert diese Brechung und erhöht die Lichtmenge, die von der Probe in das Objektiv gelangt. Dies führt zu einer höheren Auflösung und einem klareren Bild.

Abbildung 3.9. Lichtbrechung bei 100X. Licht, das aus dem Objektträger in die Luft in Richtung der Objektivlinse austritt, wird aufgrund des unterschiedlichen Brechungsindex zwischen Luft und Glas gebrochen. Während die durch diesen Unterschied verursachte Krümmung bei 100X und 400X nicht wichtig ist, ist diese Brechung bei 1000X problematisch und verursacht eine Unschärfe des Bildes und einen erheblichen Lichtverlust. Immersionsöl hat einen Brechungsindex, der dem von Glas sehr ähnlich ist. Das Einbringen eines Öltropfens zwischen Objektiv und Dia verhindert das Ablenken der Lichtstrahlen und klärt das Bild. Die blau gestrichelte Linie stellt einen potentiellen Lichtstrahl dar, wenn kein Immersionsöl vorhanden ist. Die rot gestrichelte Linie stellt einen Lichtstrahl dar, wenn Immersionsöl vorhanden ist.

Die Abbildung der Probe wird durch eine Reihe von Spiegeln und/oder Prismen fortgesetzt, die sie zum Okular hin biegen. Am Okular erfolgt eine weitere Vergrößerung, die ein sogenanntes virtuelles Bild erzeugt. Die Gesamtvergrößerung ist gleich dem Produkt aus Okularvergrößerung und Objektivvergrößerung. Meistens vergrößern Okularlinsen das 10-fache, was zu Gesamtvergrößerungen von 100, 400 oder 1000X führt, je nachdem, welches Objektiv verwendet wird. Viele moderne Mikroskope verfügen auch über fokussierbare Okulare, um Unterschiede zwischen einzelnen Personen und sogar zwischen einzelnen Augen auszugleichen. Die Einstellung dieser ist wichtig und wird im Folgenden beschrieben.

3 - 2 Bedienungsablauf

Im Folgenden beschreiben wir detaillierte Anweisungen für die Verwendung eines Mikroskops. Dadurch erhalten Sie eine Wertschätzung ihrer Funktionsweise. Diese Anweisungen wurden so allgemein wie möglich verfasst, aber es kann erforderlich sein, dass Ihr Lehrer Änderungen für die genauen Mikroskope, die Sie verwenden, vornimmt. Lichtmikroskope, die in Lehrlabors verwendet werden, sind auf einfache Handhabung ausgelegt und sollten mit etwas Übung automatisch werden.

Heben Sie den Objektivrevolver mit dem Kurseinstellknopf an. Dies bietet einen besseren Zugang zum Positionieren des Objektträgers auf der Bühne.

Drehen Sie den Objektivrevolver so, dass sich das 10X-Objektiv in Betriebsposition befindet.

Öffnen Sie die Irisblende etwa zur Hälfte.

Schalten Sie die Beleuchtung im Sockel ein, indem Sie den Druckschalter drücken.

Legen Sie einen gefärbten Objektträger auf den Objekttisch und positionieren Sie die Probe mit bloßem Auge direkt über der Mitte des Kondensors.

Verwenden Sie das Rändelrad unter den Okularen, um den Pupillenabstand zwischen den beiden Okularen einzustellen. Dies ist wichtig, um Proben mit beiden Augen betrachten zu können, um die Bildqualität zu maximieren und Ermüdung durch längere Verwendung eines Auges zu vermeiden.

Verschieben Sie den Mikroskop-Kondensor mit dem Kondensor-Einstellknopf, bis sich die Oberseite des Kondensors fast in der höchsten Position befindet. Es sollte genug Platz sein, um ein Blatt Papier zwischen die Bühne und den Kondensator zu schieben, aber nicht mehr. Dadurch wird das Licht auf die Folie fokussiert.

Drehen Sie den Grobeinstellungsknopf im Uhrzeigersinn, um das 10X-Objektiv näher an den Objektträger zu bringen. Blicken Sie durch die Okulare und drehen Sie, ohne die Grobeinstellung zu stören, langsam den Feineinstellknopf, bis das Präparat möglichst scharf ist.

Der linke Okulartubus ist fokussierbar, um Refraktionsunterschiede der Augen auszugleichen. Das richtige Verfahren besteht darin, das Objekt nur durch das rechte Okular scharf zu fokussieren. Fokussieren Sie dann für das linke Auge, indem Sie die Manschette des linken Augentubus vollständig gegen den Uhrzeigersinn drehen. Während die Probe mit dem linken Auge betrachtet wird, drehen Sie dann nur den Rändelring im Uhrzeigersinn, bis die Probe scharf ist. Stellen Sie den Feineinstellungsknopf während dieses Vorgangs nicht ein.

Entfernen Sie ein Okular, um die hintere Blende des Objektivs zu sehen. Schließen Sie die Kondensor-Irisblende und öffnen Sie sie wieder, bis die Blätter der Blende gerade aus dem Blickfeld verschwinden. Setzen Sie das Okular wieder ein und betrachten Sie die Probe. Die Irisblende kann zur Kontrastverbesserung leicht geschlossen werden, insbesondere bei der Betrachtung von ungefärbten Proben.

Ungefärbte Exemplare weisen nur einen minimalen Kontrast zu ihrer Umgebung auf. Infolgedessen können sie normalerweise effektiver betrachtet werden, indem die Blende auf oder nahe der minimalen Öffnung eingestellt wird. Eine Verringerung der Blendeneinstellung erhöht die Auflösung, den Kontrast und die Schärfentiefe, führt jedoch zu Beugungsproblemen und opfert die Auflösung. Spielen Sie mit der Blendeneinstellung und wählen Sie den besten Kompromiss durch Versuch und Irrtum.

Sobald das Objekt mit dem 10X-Objektiv scharf fokussiert ist, ist es möglich, den Objektivrevolver zum 40X-Objektiv zu drehen, ohne die Position des Grobeinstellungsknopfes zu ändern. Da die meisten Lichtmikroskopobjektive parfokal sind, ist nur sehr wenig Nachfokussierung mit dem Feineinstellknopf erforderlich. Denken Sie daran, dass die Einstellung der Irisblende geändert werden muss, damit bei zunehmender Vergrößerung mehr Licht durch die Probe dringen kann.

Wenn die Probe mit dem 100X-Ölimmersionsobjektiv betrachtet werden soll, muss Immersionsöl auf den Objektträger aufgetragen werden.

Drehen Sie das 40X-Objektiv leicht zur Seite, damit ein Tropfen Immersionsöl auf die Probe aufgetragen werden kann, ohne dass es auf das 40X-Objektiv gelangt.

Einen Tropfen Immersionsöl in die Mitte des auf dem Objektträger gebildeten Lichtkreises geben.

Drehen Sie den Objektivrevolver vorsichtig, bis das 100X-Objektiv einrastet. Die Objektivlinse sollte sich im Öl befinden, darf aber den Objektträger nicht berühren.

Erhöhen Sie die Lichtintensität nach Bedarf und drehen Sie den Feineinstellknopf, um eine scharfe Fokussierung der Probe zu erhalten. Nehmen Sie gegebenenfalls weitere Anpassungen vor, um eine optimale Ausleuchtung zu erzielen.

Wenn das Mikroskop nicht parfokal ist, muss das Objektiv so nah wie möglich an den Objektträger abgesenkt werden, ohne diesen zu berühren. Dies geschieht nur, während Sie von der Seite des Mikroskops auf das Objektiv und den Objektträger schauen. Bringen Sie das Präparat ins Blickfeld, indem Sie das Objektiv mit dem Grobstellknopf langsam anheben. Fokussieren Sie anschließend mit dem Feineinstellknopf und passen Sie die Beleuchtung nach Bedarf an. Sollte dies beim ersten Mal nicht erfolgreich sein, wiederholen Sie den gesamten Vorgang.

In vielen Fällen muss eine Präparation nur unter der Ölimmersionslinse beobachtet werden. Lokalisieren Sie in diesem Fall zuerst die Probe und zentrieren Sie sie mit dem Objektiv mit geringer Brechkraft im Feld. Fügen Sie dann Öl hinzu und drehen Sie das Ölimmersionsobjektiv in Position.

3 - 3 Häufige Probleme

Bestimmte echte oder offensichtliche Probleme können beim Betrieb Ihres Mikroskops auftreten. Hier ist eine Anleitung zur Fehlerbehebung, die Ihnen hilft, wenn Sie Schwierigkeiten haben, eine Probe zu fokussieren.

Die Probe kann bei 10X fokussiert werden, ist jedoch bei 40X schwer zu finden oder verschwommen.

Dies wird oft durch Immersionsöl auf dem 40X-Objektiv verursacht. Wischen Sie das 40X-Objektiv mit Objektivpapier ab, um das Öl zu entfernen und neu zu fokussieren. Dies kann verhindert werden, indem niemals eine Probe mit dem 40X-Objektiv betrachtet wird, nachdem einem Objektträger Immersionsöl hinzugefügt wurde.

Die Probe kann mit 10X fokussiert werden, aber wenn das 40X-Objektiv gedreht wird, berührt es den Objektträger.

In den meisten Fällen wird dies dadurch verursacht, dass der Objektträger verkehrt herum auf die Bühne gelegt wird – mit dem Abstrich zur Bühne. Überprüfen Sie Ihre Folie sorgfältig, um sicherzustellen, dass sie richtig auf der Bühne platziert ist.

Der Feineinstellknopf dreht sich nicht in die für eine scharfe Fokussierung erforderliche Richtung.

Dies zeigt an, dass es bis an die Grenzen seiner Gewinde gedreht wurde, je nachdem, entweder nach oben oder nach unten. Schrauben Sie es auf etwa die Hälfte des Gewindeabstands (etwa vier Umdrehungen) zurück, verwenden Sie die Grobeinstellung, um das Objektiv so weit anzuheben oder abzusenken, dass das Präparat sichtbar wird, und fokussieren Sie dann mit der Feineinstellung neu.

Was ich sehe, sieht nicht nach Bakterien aus.

Stellen Sie sicher, dass Sie sich in der richtigen Fokusebene befinden und auf den Abstrich und nicht auf Staub auf den Linsen fokussieren. Um dies zu überprüfen, bewegen Sie die Folie, während Sie sie betrachten. Alles im Abstrich sollte sich im Sichtfeld bewegen.

Was ich sehe, sieht nicht nach Bakterien aus. Teil II

Wenn Sie sich in der richtigen Fokusebene befinden, kann es zu Problemen bei der Abstrichpräparation kommen. Hast du zu viel wärmefixiert? War die Menge der aufgetragenen Kultur ausreichend? Haben Sie die Folie richtig gefärbt? Viele offensichtliche Mikroskopprobleme können auf eine schlechte Vorbereitung des Objektträgers zurückgeführt werden.

3 - 4 Richtige Pflege des Mikroskops

Die folgenden Regeln, Vorsichtsmaßnahmen und Wartungshinweise helfen dabei, Ihr Mikroskop in einem guten Betriebszustand zu halten.

Verwenden Sie beim Tragen des Mikroskops beide Hände: eine hält den Arm des Mikroskops fest, die andere unter der Basis. Vermeiden Sie Erschütterungen Ihres Mikroskops.

Um das Mikroskop und die Linsensysteme sauber zu halten:

Berühren Sie niemals die Linsen. Wenn die Linsen verschmutzt sind, wischen Sie sie vorsichtig mit einem Linsentuch ab.

Wenn im Sehfeld verschwommene Flecken erscheinen, kann dies an Flusen oder Schlieren auf dem Okular liegen. Wenn sich die Flecken beim Drehen des Okulars bewegen, ist der Staub auf dem Okular und die Reinigung der äußeren Linse des Okulars ist in Ordnung. Wenn die Bildqualität durch das Wechseln der Objektivlinsen verbessert wird, reinigen Sie die Objektivlinse mit Linsenpapier.

Lassen Sie niemals einen Objektträger auf dem Mikroskop, wenn es nicht verwendet wird.

Entfernen Sie nach der Verwendung immer Öl von der Ölimmersionsobjektivlinse. Sollte versehentlich Öl auf eines der Objektive mit geringerer Vergrößerung geraten, wischen Sie es sofort mit einem Linsentuch ab.

Halten Sie den Objekttisch des Mikroskops sauber und trocken. Wenn Flüssigkeiten verschüttet werden, trocknen Sie die Bühne mit einem Stück Käsetuch. Sollte Öl auf die Bühne gelangen, befeuchten Sie ein Stück Käsetuch mit Xylol und reinigen Sie die Bühne, dann wischen Sie sie trocken.

Bewahren Sie Ihr Mikroskop bei Nichtgebrauch in seinem Schrank auf. Bringen Sie das Objektiv mit geringer Vergrößerung an seinem tiefsten Punkt über dem Objekttisch an. Achten Sie darauf, dass der Kreuztisch nicht über die Kante des Mikroskoptisches hinausragt. Wickeln Sie das Stromkabel um die Basis.

Um ein Zerbrechen des Mikroskops zu vermeiden:

Erzwingen Sie die Einstellungen niemals. Alle Einstellungen sollten frei und einfach funktionieren. Wenn etwas nicht richtig funktioniert, versuchen Sie nicht, es selbst zu beheben, sondern benachrichtigen Sie sofort Ihren Lehrer.

Lassen Sie niemals eine Objektivlinse in den Objektträger oder das Deckglas einklemmen oder diese sogar berühren.

Fokussieren Sie mit der Grobeinstellung niemals nach unten, während Sie durch das Mikroskop blicken. Neigen Sie Ihren Kopf immer zur Seite mit den Augen parallel zum Objektträger und beobachten Sie das Objektiv, während Sie es näher an den Objektträger heranbewegen. Dadurch wird verhindert, dass Sie das Objektiv in die Folie einschlagen.

Tauschen Sie niemals Objektive oder Okularlinsen verschiedener Mikroskope aus und entfernen Sie auf keinen Fall die Frontlinsen von Objektiven.

Versuchen Sie niemals, zwei Mikroskope gleichzeitig zu tragen

Wenn Sie diese Regeln befolgen, werden Sie nie Probleme mit Ihrem Mikroskop haben.

3 - 5 Färbung von Mikroorganismen

Die vorläufige Identifizierung von Bakterien basiert normalerweise auf ihrer Zellmorphologie und -gruppierung und der Art und Weise, in der sie auf bestimmte Färbeverfahren reagieren. Der Zweck dieses Abschnitts besteht darin, einige gängige Färbereaktionen zu demonstrieren, die zur Kategorisierung von Mikroorganismen verwendet werden.

Abbildung 3.2. Ein ungefärbter Bakterienabstrich. Ungefärbte Bakterien bestehen meist aus Wasser und sind bei Betrachtung durch ein Lichtmikroskop nahezu transparent (Bild links). Beachten Sie, dass die meisten Mikroben nicht sichtbar sind, aber ein Staubfleck in der Mitte des Sichtfelds ist sichtbar. Flecken haften an den positiven und negativen Ladungen von Bakterien, binden sich jedoch nicht so leicht an den Hintergrund eines Objektträgers. Sie unterscheiden daher Mikroben von ihrer Umgebung. Angefärbte Bakterien sind in der Mitte und auf der rechten Seite bei 40X und 100X gezeigt.

Ungefärbte Bakterien sind bei Betrachtung mit dem Lichtmikroskop praktisch transparent und daher schwer zu erkennen, wie in Abbildung 3-2 gezeigt. Die Entwicklung von Farbstoffen zur Färbung von Mikroorganismen war ein bedeutender Fortschritt in der Mikrobiologie. Flecken dienen mehreren Zwecken:

Flecken unterscheiden Mikroorganismen von ihrer Umgebung

Sie ermöglichen eine detaillierte Beobachtung mikrobieller Strukturen bei hoher Vergrößerung

Bestimmte Färbeprotokolle können helfen, zwischen verschiedenen Arten von Mikroorganismen zu unterscheiden.

Die meisten Farbstoffe bestehen aus zwei funktionellen chemischen Gruppen, wie in Abbildung 3-3 gezeigt. Die Chromophorgruppe, die den Farbstoffen ihre charakteristische Farbe verleiht, und die Auxochromgruppe, die eine ionisierbare chemische Struktur enthält, hilft, den Farbstoff zu solubilisieren und die Bindung an verschiedene Teile von Mikroorganismen zu erleichtern. Früher wurden Farbstoffe als sauer oder basisch klassifiziert, je nachdem, ob das Pigment bei neutralem pH-Wert negativ oder positiv geladen war. Genauer gesagt können Farbstoffe als anionisch (-) oder kationisch (+) bezeichnet werden. Dies ist die Konvention, die in diesem Handbuch verwendet wird. Kationische Farbstoffe (Kristallviolett, Methylenblau) reagieren mit negativ geladenen Bakteriengruppen. Anionische Farbstoffe (Eosin, Nigrosin) reagieren mit Gruppen, die eine positive Ladung haben. Da die meisten Bakterien viele positive und negative Gruppen in ihren Zellwänden und anderen Oberflächen haben, reagieren sie sowohl mit kationischen als auch mit anionischen Farbstoffen.

Abbildung 3.3. Die Struktur von Kristallviolett. Die auxochromen Gruppen von Kristallviolett sind der geladene Kohlenstoff im Zentrum des Moleküls. Dies wird typischerweise durch ein Cl – -Ion neutralisiert. Die Chromophorgruppe besteht aus den drei Benzolringen und dem zentralen Kohlenstoff. Diese Strukturen absorbieren leicht Licht.

Färbeprotokolle können in 3 Grundtypen unterteilt werden, einfach, differentiell und spezialisiert. Einfache Färbungen reagieren einheitlich mit allen Mikroorganismen und unterscheiden nur die Organismen von ihrer Umgebung. Unterschiedliche Färbungen unterscheiden zwischen verschiedenen Bakterien, abhängig von der chemischen oder physikalischen Zusammensetzung des Mikroorganismus. Die Gram-Färbung ist ein Beispiel für eine differentielle Färbung. Spezialisierte Farbstoffe erkennen spezifische Zellstrukturen wie Geißeln und Endosporen.

3 - 6 Vorbereitung eines Bakterienabstrichs zur Färbung

Vor dem Färben und Beobachten einer Mikrobe unter dem Mikroskop muss ein Abstrich angefertigt werden. Das Ziel der Abstrichpräparation ist es, eine geeignete Konzentration von Zellen auf einen Objektträger zu bringen und dort dann zu zementieren, damit sie bei der anschließenden Färbung nicht ausgewaschen werden. Abbildung 3-4 zeigt die Vorbereitung des Abstrichs.

Die besten Abstriche werden aus Bakterien hergestellt, die auf einer festen Oberfläche wie einem Agar-Schrägstrich oder einer Platte gewachsen sind. Etwas Wachstum aus einer Kultur wird mit destilliertem oder Leitungswasser vermischt, um eine leicht trübe Lösung zu bilden, und diese wird auf einem sauberen, fettfreien Objektträger verteilt. Beim Färben von Brühenkulturen wird ein Tropfen Brühe ohne zusätzliches Wasser direkt auf einen Objektträger übertragen. Das Verfahren zum Anfertigen eines Abstrichs ist wie folgt:

Sollen mehrere Kulturen mit derselben Färbung untersucht werden, können bis zu 6 Ausstriche auf demselben Objektträger angefertigt werden. Bevor Sie den Objektträger vorbereiten, teilen Sie ihn in die entsprechende Anzahl von Abschnitten auf und beschriften Sie jeden Abschnitt deutlich auf der Unterseite des Objektträgers.

Wenn Ihre Kultur auf einem Schrägagar oder einer Agarplatte gezüchtet wurde. Geben Sie einen kleinen Tropfen Wasser auf einen sauberen, fettfreien Objektträger. Als nächstes mit einer sterilen Schlaufe oder einer geraden Drahtnadel etwas des Wachstums auf den Wassertropfen übertragen und die Nadel herumreiben, bis das Material gleichmäßig emulgiert ist. Verteilen Sie den Tropfen über einen Teil des Objektträgers, um einen dünnen Film zu erhalten. Die Suspension sollte nur leicht trüb sein.

Wenn Sie eine Bouillonkultur verwenden, muss die Bouillonkultur eine deutlich sichtbare Trübung aufweisen. Übertragen Sie eine Schleife voller Kultur aus der Brühe auf einen sauberen, fettfreien Objektträger. Verteilen Sie den Tropfen über einen Teil des Objektträgers, um einen dünnen Film zu erhalten.

Lassen Sie den Film an der Luft trocknen. Um einen guten Fleck zu erhalten, ist es wichtig, den Ausstrich vollständig trocknen zu lassen. Überschüssiges Wasser, das auf dem Objektträger verbleibt, kocht während der Fixierphase, wodurch die meisten vorhandenen Mikroben aufplatzen. Wenn Sie diesen Schritt überstürzen, erhalten Sie eine schlechte endgültige Färbung.

Nach dem Trocknen "fixieren" Sie den Ausstrich auf dem Objektträger, indem Sie den Boden des Objektträgers mehrmals für eine Sekunde durch die Spitze der Brennerflamme führen. Berühren Sie nach der Wärmefixierung den erhitzten Teil des Objektträgers mit Ihrer Hand. Es sollte angenehm warm sein, aber nicht brennend heiß.

Achten Sie darauf, den Objektträger nicht zu wenig zu fixieren (der Ausstrich wird abgewaschen) oder zu erhitzen (die Zellen werden aufgerissen oder verformt). Die richtige Menge an Wärmefixierung wird durch Erfahrung gelernt.

Lassen Sie den Ausstrich abkühlen und tragen Sie den Fleck auf.

3 - 7 Der einfache Fleck

Bei einer einfachen Färbung wird der Ausstrich mit einer Lösung eines einzelnen Farbstoffs gefärbt, der alle Zellen in der gleichen Farbe färbt. Die Differenzierung von Zelltypen oder -strukturen ist nicht das Ziel der einfachen Färbung. Bestimmte Strukturen, die durch dieses Verfahren nicht angefärbt werden, können jedoch leicht gesehen werden, beispielsweise Endosporen und Lipideinschlüsse.

Einfache Flecken sind, gut einfach. Man macht einen Abstrich und trägt einen einzelnen Fleck auf den Objektträger auf. Unten ist ein Verfahren für einen einfachen Fleck.

Einen Abstrich des zu untersuchenden Organismus vorbereiten und hitzefixieren.

Bedecken Sie den Ausstrich mit der Färbelösung. Wenn Kristallviolett oder Safranin verwendet wird, lassen Sie eine Minute Zeit zum Färben. Die Verwendung von Methylenblau erfordert 3-5 Minuten, um eine gute Färbung zu erzielen.

Waschen Sie die Farbe vorsichtig mit Leitungswasser ab und tupfen Sie den Objektträger mit Löschpapier, einem saugfähigen Papierpad oder einem Papiertuch trocken.

Drei Schritte, war das jetzt nicht so einfach?

Der obige Film zeigt den einfachen Fleck.

Abbildung 3-10 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme, wie eine einfache Färbung aussehen sollte.

Abbildung 3.10. Der einfache Fleck. Eine Mikrophotographie eines einfachen Flecks bei 1000-facher Vergrößerung. Beachten Sie, dass alle Zellen, unabhängig von Spezies oder Zellwandkonstruktion, dieselbe Farbe aufweisen.

3 - 8 Der Gramm-Fleck

Die Gram-Färbung unterscheidet bei richtiger Durchführung fast alle Bakterien in zwei Hauptgruppen. Zu einer Gruppe, den grampositiven Bakterien, zählen beispielsweise die Erreger der Krankheiten Diphtherie, Milzbrand, Tetanus, Scharlach und bestimmte Formen von Lungenentzündung und Mandelentzündung. Eine zweite Gruppe, die gramnegativen Bakterien, umfasst Organismen, die Typhus, Ruhr, Gonorrhoe und Keuchhusten verursachen. Bei Bakterien wird die Reaktion auf Gram-Färbungsreagenzien durch unterschiedliche Zellwandstrukturen erklärt. Gram-positive Mikroben haben eine viel dickere Zellwand, während die von Gram-negativen Mikroben dünner ist. Mikroben aus der Archaea-Domäne enthalten andere Zellwandstrukturen als bei Mikroben, die üblicherweise im Labor gefunden werden (Bakterien-Domäne). Sie weisen jedoch immer noch eine speziesspezifische Gram-Färbungsreaktion auf, obwohl die zugrunde liegenden makromolekularen Strukturen unterschiedlich sind.

Die Gram-Färbung ist eine der nützlichsten Differenzialfärbungen in der Bakteriologie, einschließlich der diagnostischen medizinischen Bakteriologie. Der differentielle Färbeeffekt korreliert mit Unterschieden in der Zellwandstruktur von Mikroorganismen (zumindest Bakterien, aber nicht wie oben erwähnt Archaeen). Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, die folgenden Vorsichtsmaßnahmen zu treffen:

Die zu färbenden Kulturen sollten jung sein - in Brühe oder auf einem festen Medium inkubiert, bis das Wachstum gerade sichtbar ist (möglichst nicht älter als 12 bis 18 Stunden). Alte Kulturen einiger grampositiver Bakterien erscheinen gramnegativ. Dies gilt insbesondere für endosporenbildende Bakterien, wie zum Beispiel Arten der Gattung Bazillus. In dieser Klasse sind viele der Kulturen länger als 2 Tage gewachsen. Für die meisten Bakterien ist dies kein Problem, aber beachten Sie, dass sich die Färbeeigenschaften einiger Kulturen ändern können!

Wenn möglich, sollten die zu färbenden Kulturen auf einem zuckerfreien Medium gezüchtet werden. Viele Organismen produzieren in Gegenwart bestimmter Kohlenhydrate erhebliche Mengen an Kapsel- oder Schleimmaterial. Dies kann die Entfärbung beeinträchtigen und bestimmte gramnegative Organismen wie z Klebsiella kann als eine Mischung aus rosa und violetten Zellen erscheinen.

Gram-Färbungsverfahren

Nachfolgend finden Sie ein Verfahren, das in den Lehrlabors gut funktioniert.

Bedecken Sie den Objektträger mit Kristallviolettfärbung und warten Sie eine Minute.

Waschen Sie den Fleck nach einer Minute (sanft!) mit einer minimalen Menge Leitungswasser ab. Lassen Sie das meiste Wasser ab und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Es kann hilfreich sein, den Objektträger vertikal zu halten und eine untere Ecke des Papierhandtuchs oder Löschpapiers zu berühren.

Bedecken Sie den Objektträger eine Minute lang mit Jodlösung. Das Jod wirkt als Beizmittel (Fixer) und bildet mit dem Kristallviolett einen Komplex, der es in der Zelle fixiert.

Mit Leitungswasser kurz abspülen.

Kippen Sie den Objektträger der Länge nach über das Waschbecken und tragen Sie die Alkohol-Aceton-Entfärbungslösung (tropfenweise) so auf, dass die Lösung den gesamten Objektträger von einem Ende zum anderen überspült. Alle Ausstriche auf dem Objektträger sind bei diesem Verfahren gründlich und gleich zu behandeln. Bearbeiten Sie die Probe auf diese Weise für ca. 2-5 Sekunden und spülen Sie sie sofort mit Leitungswasser ab. Dieses Verfahren entfärbt Zellen mit einem gramnegativen Zellwandtyp, jedoch nicht solche mit einem grampositiven Zellwandtyp. Lassen Sie das meiste Wasser ab und fahren Sie fort.

Da die entfärbten gramnegativen Zellen gefärbt werden müssen, um sichtbar zu sein, bedecken Sie den Objektträger 30 Sekunden bis eine Minute lang mit der Safranin-Gegenfärbung.

Kurz ausspülen und den Objektträger trocken tupfen. Notieren Sie jede Kultur als Gram-positiv (lila Zellen) oder Gram-negativ (rosa Zellen).

Das obige Video zeigt das Gram-Färbungsverfahren, während Abbildung 3-11 die Ergebnisse einer Gram-Färbung für grampositive und gramnegative Bakterien zeigt.

Abbildung 3.11. Der Gram-Fleck. Eine Mikrophotographie von grampositiven und gramnegativen Bakterien. Beachten Sie, dass die Gram-Reaktion von der Zellwandstruktur abhängt. EIN) E coli ein häufiger gramnegativer Stäbchen im Dickdarm. B) Staphylococcus epidermidis auf der Haut gefundene grampositive Kokken. C) Bacillus cereus ein im Boden gefundenes grampositives Stäbchen.

3 - 9 Der Endosporen-Fleck

Zellen von Bazillus, Desulfotomakulum und Clostridium (und mehrere andere, weniger bekannte Gattungen – siehe Bergeys Handbuch) können als Reaktion auf Nährstoffbeschränkungen Endosporen entwickeln, die eine bemerkenswerte Beständigkeit gegen Hitze, Trockenheit, Strahlung und viele chemische Mittel besitzen. Jede Zelle kann nur einen Endospor produzieren. Es handelt sich daher nicht um eine reproduktive Spore, wie es bei einigen Organismen wie z Streptomyces und die meisten Formen. Die Endosporen sind im Wesentlichen eine spezialisierte Zelle, die eine vollständige DNA und viele Proteine ​​enthält, aber wenig Wasser. Diese Dehydration trägt zur Sporenresistenz bei und macht sie metabolisch inaktiv. Die Endosporen entwickeln sich an einer für ihre Art charakteristischen Position in der vegetativen Zelle. Schließlich lysiert die Zelle und setzt eine freie Endospore frei.

Endosporen-Färbungsverfahren

Endosporen-Färbungen erfordern Wärme, um die Färbung in die Zellen zu treiben. Damit eine Endosporenfärbung erfolgreich ist, muss die Temperatur der Färbung nahe am Siedepunkt liegen und die Färbung kann nicht austrocknen. Die meisten fehlgeschlagenen Endosporen-Färbungen treten auf, weil die Färbung während des Verfahrens vollständig verdunsten konnte.

Legen Sie den hitzefixierten Objektträger über ein dampfendes Wasserbad und legen Sie ein Stück Löschpapier über den Bereich des Abstrichs. Das Löschpapier sollte den Ausstrich vollständig bedecken, aber nicht über die Kanten des Objektträgers hinausragen. Wenn es über die Ränder hinausragt, fließt der Fleck durch Kapillarwirkung über den Rand des Objektträgers und verursacht ein Durcheinander.

Sättigen Sie das Löschpapier mit der 5-6% igen Lösung von Malachitgrün. Lassen Sie den Dampf den Objektträger fünf Minuten lang erhitzen und füllen Sie den Fleck wieder auf, wenn er auszutrocknen scheint.

Kühlen Sie den Objektträger auf Raumtemperatur ab. Gründlich und vorsichtig mit Leitungswasser ausspülen.

Tragen Sie Safranin für eine Minute auf. Gründlich aber kurz mit Leitungswasser spülen, trocken tupfen und untersuchen. Reife Endosporen färben sich sowohl frei als auch in der vegetativen Zelle grün. Vegetative Zellen färben sich rosa bis rot.

Das obige Video zeigt die Endosporenfärbung

Abbildung 3-12 zeigt eine Mikrophotographie einer Endosporen-Färbung.

Abbildung 3.12. Der Endosporen-Fleck. Eine Mikrophotographie einer Endosporen-Färbung. Im Bild vorhandene Sporen färben sich grün, während sich die vegetativen Zellen rot färben. EIN) Staphylococcus epdiermidis die keine Endosporen bildet. B) Der endosporenbildende Stab, Bacillus cereus.

3 - 11 Färben üben

Bei der Untersuchung und Identifizierung von Bakterien ist das Mikroskop unverzichtbar! Die Reihe mikroskopischer Beobachtungen in dieser Übung soll veranschaulichen, wie Bakterien in ihrer Grundform, der Zelle, individuell betrachtet werden können. Die zweite und dritte Periode hier stimmen mit denen von Experiment 1 überein, in dem vom Schüler isolierte Organismen mikroskopisch untersucht werden (und könnten interessanter sein als die in dieser Übung beschriebenen!).

Zeitraum 1

Materialien

Heuaufgüsse und diverse andere Artikel aus der Natur

Folie mit Schlieren von Bacillus cereus und Staphylococcus epidermidis

Einfacher Fleck.

  1. Sie erhalten einen Objektträger mit zwei Ausstrichen. Befolgen Sie die Anweisungen für Mikroskopie und Färbung, fixieren Sie den Objektträger heiß und stellen Sie sicher, dass der Objektträger mit der Ausstrichseite nach oben durch die Flamme geht.
  2. Für das Färbeverfahren stehen Handschuhe zur Verfügung. Legen Sie den Objektträger auf das Färbegestell in der Spüle und bedecken Sie den Objektträger eine Minute lang mit Kristallviolett. Sehen Sie sich für eine Überprüfung die Anweisungen für den einfachen Fleck an.
  3. Spülen Sie die Farbe vorsichtig mit Leitungswasser ab und tupfen Sie den Objektträger mit einem Papiertuch oder Löschpapier trocken.
  4. Holen Sie mit beiden Händen das Lichtmikroskop aus dem Schrank (entsprechend Ihrer Tischnummer). Dies ist die Art von Mikroskop, die wir immer verwenden werden, um gefärbte Ausstriche zu beobachten.
  5. Sofern der Ausbilder keine anderen Anweisungen hat, die direkter auf das von Ihnen verwendete Mikroskop anwendbar sind, verwenden Sie das einfache Verfahren, das in der Bedienungsanleitung beschrieben ist. Beziehen Sie sich auf dieses Verfahren, wenn Sie die Zellen in den beiden Abstrichen in den folgenden Schritten untersuchen.
  6. Legen Sie den Objektträger so auf den Objekttisch, dass er wie oben abgebildet ausgerichtet ist. Stellen Sie sicher, dass die Clips auf der Bühne die Folie sicher halten.
  7. Beginnen Sie Ihre Beobachtungen mit dem Bacillus cereus Abstrich. (Siehe Abbildung unten) Wenn Sie diesen Organismus mit dem Ölimmersionsobjektiv beobachten, werden Sie feststellen, dass die Zellen relativ groß und stäbchenförmig sind (Bazillen) und normalerweise in Ketten liegen. Notieren Sie Ihre Beobachtungen auf der nächsten Seite.
  8. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Abstrich von Staphylococcus epidermidis. Zellen dieses Organismus sind Kugeln (Kokken), die normalerweise in Clustern (Staphylokokken) und Paaren angeordnet sind.
  9. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie sicher, dass das Mikroskop richtig verstaut ist (d. h. alles Öl abgewischt, 10X-Objektiv eingesetzt, Tisch zentriert). Es wird empfohlen, die Folie aufzubewahren. (Um Immersionsöl von Ausstrichen zu entfernen, legen Sie einige Stücke Linsenpapier auf den Objektträger, um das Öl aufzusaugen. Geben Sie dann mehrere Tropfen Xylol auf das Linsenpapier. Ziehen Sie das jetzt mit Xylol getränkte Papier vom Objektträger ab. Xylol ist brennbar! Von Flammen fernhalten!)

Abbildung 3.13. Einfacher Fleck. Ein einfacher Fleck von S. epidermidis und B. cereus. S. epidermidis (EIN), B. cereus alt (B), B. cereus jung (C)

Nasspräparat

  1. Zur Beobachtung lebender Mikroorganismen stehen verschiedene Proben inklusive Heuaufguss zur Verfügung. Um die Mikroorganismen in den verfügbaren wässrigen Materialien zu untersuchen, ist es notwendig, nasse Einfassungen herzustellen. Die Vorgehensweise ist relativ einfach:
  2. Nehmen Sie mit einer Kapillarpipette oder einer Impföse einen Teil des Materials von der Gras- und Blattoberfläche und vom Boden der Probe auf. Einen Tropfen suspendierten Materials auf einen sauberen Objektträger geben.
  3. Verteile mit einem Zahnstocher eine sehr dünne Schicht Vaseline auf einem kleinen Teil deiner Handfläche. Nehmen Sie ein sauberes Deckglas (immer an den Kanten gehalten) und kratzen Sie vorsichtig alle vier Kanten entlang Ihrer Handfläche, wobei Sie an jeder Kante eine dünne Linie Vaseline aufnehmen.
  4. Legen Sie das Deckglas direkt auf den Tropfen auf dem Objektträger, sodass einige Luftblasen eingeschlossen werden. Legen Sie ein kleines, mehrlagiges Stück Papiertuch über das Deckglas und drücken Sie es fest. Entsorgen Sie das Stück Papiertuch in das Desinfektionsmittel.
  5. Untersuchen Sie die Nassfassung mit Ihrem Lichtmikroskop oder einem vom Dozenten aufgestellten Phasen-CONTRAST-Mikroskop an einer speziellen Station im hinteren oder seitlichen Bereich des Labors.
  6. Entsorgen Sie den Objektträger ohne das Deckglas zu entfernen in den Desinfektionsmittelbehälter auf dem Objekttisch. (Auf Seite viii finden Sie Anweisungen zur Bereinigung.)

Falls Sie es noch nicht getan haben, zeigt Abbildung 1-2 einen Film über die Arten von Lebensformen, die in einem Heuaufguss vorkommen.

Periode 2

Materialien

Bakterienkulturen, die entweder in einem flüssigen Medium (Heart Infusion Broth) oder schräg auf einem Allzweckmedium wachsen, gefolgt von einer Suspension in Kochsalzlösung:

Escherichia coli - junge Kultur, 12-15 Stunden bebrütet

Bacillus cereus - junge Kultur, 12-15 Stunden bebrütet

Bacillus cereus - alte Kultur, 2-3 Tage bebrütet

Abbildung 3.14. Grammflecken. Gramflecken von Demonstrationsarten. Unten sind typische Gram-Färbungsreaktionen von zwei Spezies gezeigt. E coli (EIN), B. cereus alt (B), B. cereus jung (C). Die Bilder sind etwas größer als das, was in einem Lichtmikroskop sichtbar wäre, um die Klarheit zu verbessern.

  1. Bereiten Sie auf einem sauberen Glasobjektträger Abstriche der drei Kulturen vor. Gehen Sie zur Abstrichvorbereitung, wenn Sie eine Auffrischung benötigen. Erst wenn die Abstriche haben vollständig getrocknet sollte der Objektträger wärmefixiert werden.
  2. Führen Sie das Gram-Färbungsverfahren wie beschrieben durch.
  3. Wie bei jedem gefärbten Ausstrich werden definitive Beobachtungen mit dem 100X-Ölimmersionsobjektiv gemacht. Beachten Sie die bereits angegebenen Mikroskopanweisungen und denken Sie daran, den Objektträger zunächst mit dem 10X-Objektiv zu fokussieren und dann zum Ölimmersionsobjektiv zu bewegen.
  4. Denken Sie daran, dass die jungen Kulturen von B. cereus und E coli sind Ihre positiven bzw. negativen Kontrollkulturen für die Beobachtung der wahrscheinlichen Gramm-Variabilität der älteren B. cereus Kultur.
  5. Notieren Sie anhand der folgenden Abbildungen Ihre Beobachtungen in Ihrem Notizbuch und notieren Sie die Gram-Reaktion (positiv bei Violett, negativ bei Rot) und die Zellform. Gibt es einen Unterschied zwischen den beiden Kulturen von? Bacillus cereus? Ist die Grammvariabilität für die ältere Kultur offensichtlich? Erinnern Sie sich aus der Einleitung zu Experiment 1 daran, dass wir uns auf alte und junge Kulturen beziehen können, dies jedoch nicht für einzelne Zellen tun sollten. (Denken Sie daran, die Röhrchen und Objektträger ordnungsgemäß zu entsorgen)

Periode 3

Materialien

Dieses Experiment wird im Unterricht durchgeführt.

Junge Bakterienkulturen, die auf Schrägen von Heart Infusion Agar wachsen:

Staphylococcus epidermidis

Pseudomonas fluorescens

Notieren Sie die Nummer Ihres Unbekannten!

Abbildung 3.15. Typische Reaktionen von Beispielstämmen für den Test. Die klassischen Gram-Reaktionen für Staphylococcus epidermidis (A) und Pseudomonas fluorescens (B). Bestimmen Sie daraus, ob es sich um Gramm (+) oder Gramm (-) handelt. Beachten Sie, dass wir keine Unbekannten anzeigen, da dies im Unterricht erfolgen muss. Die Bilder sind etwas größer als das, was in einem Lichtmikroskop sichtbar wäre, um die Klarheit zu verbessern.

  1. Bereiten Sie auf einem sauberen Glasobjektträger hitzefixierte Abstriche der drei Kulturen vor und beachten Sie, dass diese Kulturen auf einem festen Medium wachsen. Daher müssen die Zellen bei der Anfertigung der Ausstriche in einem Tropfen Wasser dispergiert werden, da ein Ausstrich immer eine getrocknete Zellsuspension ist. Achten Sie darauf, die Ausstriche nicht zu dick zu machen! S. epidermidis und P. fluoreszenz sind Ihre positiven und negativen Kontrollkulturen (jeweils) für Ihr Unbekanntes.
  2. Führen Sie das Gram-Färbungsverfahren durch und notieren Sie die Gram-Reaktion und die Zellform. Notieren Sie Ihre Ergebnisse. Füllen Sie Ihre Beschreibung Ihres Unbekannten aus und geben Sie sie ab. Speichern Sie Ihre Folie, bis Ihre benotete Unbekannte zurückgegeben wird.

Periode 4

Materialien

36-48 Stunden Kultur von Klebsiella pneumoniae wachsen auf einer Schräge von EMB Agar (ein Medium mit hohem Zuckergehalt)

Tropfflasche mit gefilterter Tusche

3-tägige Kultur von Mycobacterium smegmatis wächst auf einer Schräge aus Trypticase-Soja-Agar plus 1% Glycerin

18-24 Stunden Kultur von Micrococcus luteus (die Negativkontrollkultur) wächst in Nährbrühe

Tropfflaschen mit Karbolfuchsin (frisch hergestellt), saurem Alkohol und Methylenblau

Kapselfleck

Abbildung 3.16. Der Kapselfleck. Ein Kapselfleck mit Tusche bei 1000-facher Vergrößerung. Die Zellen von Klebsiella pneumoniaesind von einem dunklen Hintergrund umgeben. Die Kapsel ist der klare Bereich, der die Zellen umgibt. Die Mikrophotographien sind aus Gründen der Klarheit leicht vergrößert.

  1. Nutzung der Kultur von Klebsiella pneumoniae, Geben Sie eine Schleife Wasser auf einen Objektträger und emulgieren Sie darin etwas Wachstum aus der Schräg- oder Plattenkultur des vorgesehenen Organismus. Fügen Sie der Zellsuspension einen Tropfen gefilterter Tusche hinzu. Es funktioniert oft gut, den Tuschetropfen neben der Zellsuspension auf dem Objektträger zu platzieren.
  2. Besorgen Sie sich ein sauberes Deckglas (keine Fingerabdrücke, Flecken, Schmutz usw.) und umranden Sie es leicht mit Vaseline. Die Vaseline kann vorsichtig von einer dünnen Schicht auf der Handfläche abgeschabt werden. Legen Sie ein kleines, mehrlagiges Stück Papiertuch (ca. 1-2 cm2) über das Deckglas und drücken Sie das Papiertuch fest nach unten in das Desinfektionsmittel.
  3. Fokussieren Sie mit dem normalen Lichtmikroskop zunächst mit dem 10X-Objektiv, wechseln Sie dann zum 45X-Objektiv und dann - falls erforderlich - zum 100X-Ölimmersionsobjektiv. Stellen Sie die Lichtintensität mit der Irisblende nach Bedarf ein. Im Bereich der klaren Kapsel ist der Umriss der Zelle zu erkennen.
  4. Alternativ kann das Phasenmikroskop verwendet werden. Beachten Sie die Vorsichtsmaßnahmen bei der Verwendung dieses Mikroskops. Hervorragende Beobachtungen können nur mit dem 40X-Objektiv (das kein Immersionsöl benötigt) gemacht werden.
  5. Wenn Sie fertig sind, werfen Sie den Objektträger direkt in das Desinfektionsmittel, ohne das Deckglas zu entfernen. Verwerfen Sie niemals Kapselflecken und andere nasse Träger mit den gefärbten Ausstrichen, da noch lebensfähige Zellen vorhanden sind und die Objektträger desinfiziert werden müssen!. Notieren Sie Ihre Beobachtungen unten.
Säurefeste Beize

Abbildung 3.17. Der säurefeste Fleck. Eine Mikrofotografie von Mycobacterium smegmatis (rosa) und Micrococcus luteus (blau) bei 1000-facher Vergrößerung. M. smegmatis ist säurefest, behält den Farbstoff Karbolfuchsin und erscheint dadurch rosa. M. luteus ist nicht säurefest, verliert bei der Entfärbung das Karbolfuchsin und wird mit Methylenblau gegengefärbt.

  1. Bereiten Sie einen gemischten Abstrich von zwei Organismen wie folgt vor: Geben Sie einen Tropfen des Micrococcus luteus Brühekultur auf einer Folie. Fügen Sie in diesem Drop Zellen aus dem Mycobacterium smegmatis Kultur. Verteilen Sie die Zellen so weit wie möglich (die Mykobakterium Zellen neigen dazu, zu verklumpen) und bereiten einen Abstrich von der Größe eines Nickels vor. Lassen Sie es vollständig an der Luft trocknen und fixieren Sie es dann gut durch Hitze, indem Sie den Objektträger ein- oder zweimal durch die Flamme führen.
  2. Führen Sie das säurefeste Verfahren durch (Seite 148, Beobachten des Objektträgers mit dem normalen Lichtmikroskop) und notieren Sie Ihre Beobachtungen unten.
  3. Wie bei allen gefärbten Ausstrichen den Objektträger in den entsprechenden Behälter entsorgen.

3 - 12 Zusammenfassung von Mikroskopie und Färbung

Das Färben und Betrachten von Mikroben unter dem Mikroskop ist oft für ihre Identifizierung und Klassifizierung erforderlich. Die Identität einer Mikrobe kann helfen, die Ursache einer Krankheit oder die Quelle des Verderbens von Lebensmitteln zu bestimmen. Mikroskope spielen auch eine wichtige Rolle in der Genetik, Zellstruktur, Biochemie und vielen anderen wissenschaftlichen Disziplinen. Hoffentlich hat Ihnen diese kurze Einführung geholfen, die Visualisierung von Mikroorganismen zu verstehen.


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Grundlagen der Mikrobiologie

Manchmal ist es praktisch, die gesamte Bakterienmorphologie zu bestimmen, ohne dass scharfe Färbe- oder Hitzefixierungstechniken verwendet werden, die die Form der Zellen verändern. Dies kann der Fall sein, wenn sich das Bakterium nicht gut anfärbt oder wenn es wünschenswert ist, Beobachtungen zu Form und Größe von Bakterien zu bestätigen, die entweder in einem nassen oder hängenden Objektträger beobachtet wurden. Die Färbung der Proben wird durchgeführt, um die Sichtbarkeit der Proben zu erhöhen, spezifische morphologische Merkmale hervorzuheben und Proben zu erhalten. Die Färbung der Probe macht die inneren und äußeren Strukturen der Zelle besser sichtbar, indem der Kontrast zum Hintergrund erhöht wird.

  • Auf der Unterseite eines Objektträgers sollte mit einem Glasätzwerkzeug ein Kreis markiert werden. Auf derselben Folie können sich mehrere Kreise befinden.
  • Der Schlitten muss fettfrei sein. Eine gute Methode zum Reinigen eines Objektträgers besteht darin, mehrmals darauf zu atmen und anschließend kräftig mit einem weichen Tuch oder Papiertuch zu reiben, um den Nebel zu entfernen. Wenn der Objektträger sofort nach dem Anhauchen beschlagfrei ist, ist er ausreichend sauber.
  • Um einen Abstrich aus einer Trockenkultur herzustellen, sollte ein sehr kleiner Tropfen destilliertes Wasser über den eingekreisten Bereich gegeben werden. Nach aseptischem Entfernen des Materials aus einer Kultur wird es mit dem Tropfen vermischt oder direkt auf den Objektträger gegeben, wenn es sich um eine verdünnte Kulturbrühe handelt. Es braucht sehr wenig Material, um einen erfolgreichen Abstrich zu produzieren.
  • Der Tropfen wird vollständig an der Luft getrocknet, was bei der Zubereitung eines kleinen Tropfens kurze Zeit in Anspruch nimmt.
  • Während man den Objektträger mit einer Wäscheklammer festhält, wird dieser schnell durch eine Flamme geführt. Drei schnelle Durchgänge reichen in der Regel aus, um die Bakterien abzutöten und anhaften zu lassen.
  • Nach dem Abkühlen des Objektträgers wird das Färbeverfahren durchgeführt.

Färbemethoden können grob in zwei Arten eingeteilt werden, einfach und differentiell und umfassen Negativfärbung, Gramfärbung, Endosporenfärbung, Kapselfärbung, Flagellenfärbung, säurefeste Färbung usw.

Bei dieser Art der Färbung werden Bakterienzellen mit einem einzigen Reagenz gefärbt. Hierzu werden positiv geladene Farbstoffe wie Methylenblau, Kristallviolett etc. verwendet. Diese Farbstoffe werden von den Zellen aufgenommen und binden an negativ geladene Zellbestandteile (Zellwand, Nukleinsäuren). Die Färbung kann je nach Farbstofftyp (kationisch oder anionisch) positiv oder negativ sein (Abb. 6.1).


  • Bereiten Sie einen dünnen Ausstrich der Bakterienkultur vor, indem Sie eine Schleife voller Kultur auf einen sauberen Objektträger legen und ihn langsam in kreisenden Bewegungen auf der Oberfläche des Objektträgers verteilen. Lassen Sie den Ausstrich trocknen.
  • Erhitzen Sie den Ausstrich, indem Sie ihn schnell auf die Bunsenflamme geben.
  • Den Ausstrich 2 oder 1 min mit Methylenblau/Kristallviolett fluten. bzw.
  • Wasche den Ausstrich mit Leitungswasser und trockne ihn.
  • Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl hinzu und beobachten Sie unter der 100X-Linse des Lichtmikroskops.
  • Zellen erscheinen blau (Methylenblau) oder violett (Kristallviolett). Suchen Sie nach verschiedenen Zellformen.
  • Einen Tropfen Nigrosin in die Nähe eines Endes eines sauberen Objektträgers geben.
  • Mischen Sie eine Schleife voller Kultur darin.
  • Bereiten Sie einen Ausstrich dieser Mischung mit dem Rand eines anderen Objektträgers vor.
  • Trocknen Sie es an der Luft und beobachten Sie es unter der Ölimmersionslinse.

Ungefärbte Bakterienzellen erscheinen im Kontrast zu einem dunklen Hintergrund.


Die einfache Färbung hängt davon ab, dass sich Bakterien chemisch von ihrer Umgebung unterscheiden und somit kontrastreich mit ihrer Umgebung gefärbt werden können. Bakterien unterscheiden sich auch chemisch und physikalisch voneinander und können auf ein bestimmtes Färbeverfahren unterschiedlich reagieren. Dies ist das Prinzip der Differentialfärbung. Differenzialfärbung kann zwischen Bakterienarten unterscheiden.

Die Gram-Färbung (benannt nach Christian Gram, dänischer Wissenschaftler und Arzt, 1853–1938) ist die nützlichste und am weitesten verbreitete Differenzialfärbung in der Bakteriologie. Es teilt Bakterien in zwei Gruppen ein, Gram-negativ und Gram-positiv. Der erste Verfahrensschritt besteht in der Färbung mit dem basischen Farbstoff Kristallviolett. Dies ist der primäre Fleck. Anschließend erfolgt die Behandlung mit einer Jodlösung, die als Beizmittel wirkt, dh die Wechselwirkung zwischen Bakterienzelle und Farbstoff verstärkt, so dass der Farbstoff fester gebunden bzw. die Zelle stärker angefärbt wird. Der Ausstrich wird dann durch Waschen mit einem Mittel wie 95 % Ethanol oder Isopropanol-Aceton entfärbt. Gram-positive Bakterien behalten beim Waschen mit dem Entfärber den Kristallviolett-Jod-Komplex, während Gram-negative Bakterien ihren Kristallviolett-Jod-Komplex verlieren und farblos werden. Schließlich wird der Ausstrich mit einem basischen Farbstoff, der sich in der Farbe von Kristallviolett unterscheidet, gegengefärbt. Dieser Gegenfleck ist normalerweise Safranin. Das Safranin färbt die farblosen, gramnegativen Bakterien rosa, verändert jedoch nicht die dunkelviolette Farbe der grampositiven Bakterien. Das Endergebnis ist, dass grampositive Bakterien eine tiefviolette Farbe haben und gramnegative Bakterien eine rosa bis rote Farbe haben (Abb. 6.3). Die Gram-Färbung liefert nicht immer eindeutige Ergebnisse. Die Arten unterscheiden sich hinsichtlich der Leichtigkeit, mit der der Kristallviolett-Jod-Komplex durch Ethanol entfernt wird. Gram-positive Kulturen können oft Gram-negativ werden, wenn sie zu alt werden. Daher ist es immer am besten, junge, kräftige Kulturen anstelle von älteren mit Gram zu färben. Darüber hinaus sind einige Bakterienarten gramvariabel. Das heißt, einige Zellen in derselben Kultur sind Gram-positiv und einige Gram-negativ. Daher sollte man immer sicherstellen, dass Gram-Färbungen auf mehreren Kulturen unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass ein bestimmter Bakterienstamm wirklich Gram-positiv oder Gram-negativ ist. Undeutliche Gram-Färbungsergebnisse können durch einen einfachen Test mit KOH bestätigt werden. Einen Tropfen 10% KOH auf einen sauberen Objektträger geben und mit einer Schleife voller Bakterienpaste mischen. Warten Sie 30 Sekunden und ziehen Sie dann die Schlaufe langsam durch die Aufhängung und nach oben und von der Rutsche weg. Ein gramnegativer Organismus produziert einen schleimigen Faden, während ein grampositiver Organismus flüssig bleibt.


6.4.2 Säurefeste Färbung (Ziehl-Neelsen und Kinyoun)

Einige Bakterienarten der Gattungen Mycobacterium und Nocardia sowie der Parasit Cryptosporidium färben sich mit einfachen Färbungen nicht leicht. Diese Mikroorganismen können jedoch durch Erhitzen mit Carbolfuchsin angefärbt werden. Die Hitze treibt den Farbstoff in die Zellen. Sobald die Mikroorganismen das Carbolfuchsin aufgenommen haben, werden sie durch Säurealkohol nicht leicht entfärbt und werden daher als säurefest bezeichnet. Diese Säurebeständigkeit ist auf den hohen Lipidgehalt (Mykolsäure) in der Zellwand dieser Mikroorganismen zurückzuführen. Das säurefeste Färbeverfahren von Ziehl-Neelsen (entwickelt von Franz Ziehl, einem deutschen Bakteriologen, und Friedrich Neelsen, einem deutschen Pathologen, Ende des 19. Säurefeste Mikroorganismen behalten diesen Farbstoff und erscheinen rot (Abb. 6.4). Nicht säurebeständige Mikroorganismen, die als nicht säurebeständig bezeichnet werden, erscheinen nach der Entfärbung durch den Säurealkohol durch die Gegenfärbung mit Methylenblau blau oder braun. Eine Modifikation dieses Verfahrens, bei der ein Benetzungsmittel (Tergitol Nr. 7) anstelle von Hitze verwendet wird, um die Durchdringung von Flecken zu gewährleisten, ist als Kinyoun-Färbeverfahren bekannt (entwickelt von Joseph Kinyoun, einem deutschen Bakteriologen, in den frühen 1900er Jahren).


Bakterien in Gattungen wie Bacillus und Clostridium produzieren eine ziemlich resistente Struktur, die in einer ungünstigen Umgebung lange Zeit überleben und dann eine neue Bakterienzelle hervorbringen kann. Diese Struktur wird als Endospor bezeichnet, da sie sich innerhalb der Bakterienzelle entwickelt. Endosporen haben eine kugelförmige bis elliptische Form und können entweder kleiner oder größer als die Bakterienstammzelle sein. Die Position der Endosporen innerhalb der Zelle ist charakteristisch und kann zentral, subterminal oder terminal sein. Endosporen verfärben sich nicht leicht, aber wenn sie einmal verfärbt sind, widerstehen sie einer Entfärbung stark. Diese Eigenschaft ist die Grundlage der Schaeffer-Fulton- (Alice B. Schaeffer und MacDonald Fulton waren in den 1930er Jahren Mikrobiologen am Middlebury College, Vermont) oder der Wirtz-Conklin-Methode (Robert Wirtz und Marie E. Conklin waren Anfang des 20. Jahrhunderts Bakteriologen) Endosporen zu färben. Die Endosporen sind mit Malachitgrün gefärbt. Hitze wird verwendet, um das Eindringen von Flecken zu ermöglichen. Der Rest der Zelle wird dann entfärbt und mit Safranin hellrot gegengefärbt.

  • Tragen Sie mit einem Wachsstift die Namen der jeweiligen Bakterien auf den Rand von vier sauberen Glasobjektträgern.
  • Eine Bakterienart mit einer Impföse aseptisch auf jeden der jeweiligen Objektträger übertragen, an der Luft trocknen (oder einen Objektträgerwärmer verwenden) und hitzefixieren.
  • Legen Sie den zu färbenden Objektträger auf eine heiße Platte oder ein Bad mit kochendem Wasser, das mit einer Färbeschlaufe oder einem Gestell ausgestattet ist. Decken Sie den Ausstrich mit einem Papiertuch ab, das in der Größe des Objektträgers zugeschnitten ist.
  • Tränken Sie das Papier mit der Malachitgrün-Färbelösung. Erhitzen Sie vorsichtig auf der Heizplatte (nur bis der Fleck dampft) für 5 bis 6 Minuten, nachdem die Malachitgrün-Lösung zu dämpfen beginnt. Ersetzen Sie die Malachitgrün-Lösung, wenn sie verdunstet, damit das Papier während des Erhitzens gesättigt bleibt. Lassen Sie den Objektträger nicht trocken werden.
  • Entfernen Sie das Papier mit einer Pinzette, lassen Sie den Objektträger abkühlen und spülen Sie den Objektträger 30 Sekunden lang mit Wasser.
  • 60 bis 90 Sek. mit Safranin gegenfärben.
  • Spülen Sie den Objektträger 30 Sekunden lang mit Wasser.

Einheit 4 Biologie Laborbericht

Unter einem leistungsstarken Lichtmikroskop ist es möglich, etwas so Kleines wie ein einzelnes Bakterium zu sehen. Allerdings können verschiedene Bakterienarten auch bei hoher Vergrößerung sehr ähnlich aussehen. In solchen Fällen verwenden Wissenschaftler eine Vielzahl von Flecken, um Bakterienarten zu unterscheiden. Diese Technik wird als differentielle Färbung bezeichnet.

In dieser Aktivität werden Sie beobachten, wie verschiedene Arten von Bakterien erscheinen, wenn sie mit dieser Technik gefärbt werden.

Sie müssen einen 1-seitigen Laborbericht unter Verwendung der nachstehenden Abschnitte zur wissenschaftlichen Methode schreiben. Ihr Pearson-Bericht sind Ihre Daten zur Unterstützung Ihres Berichts. Hängen Sie den Pearson-Bericht als Teil Ihrer Laborberichtsergebnisse an. Die Pearson-Fragen sollen Ihnen helfen, das Thema zu verstehen, und können in Ihrem Bericht verwendet werden, um Ihre Ergebnisse zu untermauern.

Führen Sie die Schritte der wissenschaftlichen Methode für Ihre Wahl der Laboroption aus. Bitte verwenden Sie diese Überschriften in Ihrer Arbeit.

Nennen Sie den Zweck des Labors.

Dies ist eine Untersuchung des aktuellen Wissensstandes zu der gestellten Frage. Verwenden Sie Hintergrundinformationen aus glaubwürdigen Referenzen, um eine kurze Zusammenfassung der Konzepte im Lab zu schreiben. Listen und zitieren Sie Referenzen im APA-Stil.

Hypothese / Vorhergesagtes Ergebnis:

Eine Hypothese ist eine „gebildete Vermutung“. Geben Sie basierend auf dem, was Sie in der Einführung gelernt und geschrieben haben, an, was Sie von den Laborverfahren erwarten.

Fassen Sie die Verfahren zusammen, die Sie im Labor verwendet haben.

Der Abschnitt Methoden sollte auch klar angeben, wie die Daten (Zahlen) während des Labors gesammelt wurden. Diese werden im Abschnitt Ergebnisse/Ergebnisse berichtet.

Geben Sie hier alle Ergebnisse / Daten an, die während des Laborverfahrens generiert wurden.

Geben Sie in diesem Abschnitt deutlich an, ob Sie die erwarteten Ergebnisse erzielt haben und ob das Ergebnis wie erwartet war. Hinweis: Sie können Antworten auf alle Multiple-Choice- oder Essay-Fragen verwenden, die Sie im Lab ausgefüllt haben, um die Ergebnisse und das Gelernte zu diskutieren.

Geben Sie Referenzen im APA-Format an. Dazu gehören eine Literaturliste und In-Text-Zitate für Literaturstellen, die im Abschnitt Einführung verwendet werden.

Geben Sie Ihrer Arbeit einen Titel und eine Nummer und identifizieren Sie jeden Abschnitt wie oben angegeben. Obwohl die Hypothese eine Antwort aus einem Satz ist, müssen die anderen Abschnitte Absätze sein, um Ihr Experiment angemessen zu erklären.

Senden Sie Ihre Aufgabe als MS-Word-Dokument.

Welche Bakterienformen haben Sie beobachtet?

Die Formen, die ich beobachte, waren bakterielle Stäbchenformen.

Viele Bakterienarten haben die Grundformen, die Sie in Teil A beobachtet haben. Eine Methode, mit der Wissenschaftler ähnlich aussehende Bakterien unterscheiden können, ist die Gram-Färbung. Je nachdem, woraus ihre äußersten Hüllen bestehen (z. B. Zellwände, Membranen oder andere Hüllen), verfärben sich Gram-gefärbte Bakterien entweder violett oder rötlich-rosa.

· Gram-positive Bakterien werden lila.

· Gram-negative Bakterien verfärben sich rötlich-rosa.

3. Klicken Sie im Menü für zusammengesetzte Mikroskopbilder auf die Miniaturansicht mit dem Titel Cholera-Bakterien.

4. Wählen Sie als NächstesStrep-Bakterien (Kokken, Gram-Färbung). (Sie müssen möglicherweise fast bis zum Ende der Liste scrollen.)

Von den beiden Arten, die Sie sich angesehen haben, ist eine Gram-positiv und eine Gram-negativ. Welcher ist welcher?

Kokken-Gramm-Färbung ist positiv und Cholera-Bakterien-Gramm-Färbung ist negativ.

Teil C – Die säurefeste Beize

Die Gram-Färbung funktioniert nicht bei allen Bakterienarten. Säurefeste Bakterien haben beispielsweise eine einzigartige, säureresistente Lipidzellwand, die den Gram-Färbungsprozess stört. Die säurefeste Beize verbindet sich jedoch mit dieser Lipidabdeckung. Säurefeste Organismen erscheinen in einer säurefesten Färbung rot vor blauem Hintergrund.

5. Klicken Sie im Menü für zusammengesetzte Mikroskopbilder auf die Miniaturansicht mit dem Titel Tuberkulosebakterien (säurefeste Färbung).

Notieren Sie Ihre Beobachtungen der Form und des Aussehens der Tuberkulosebakterien.

Die Tuberkulose (säurefester Satin) hat wachsartige Zellen von Mykobakterien. Die Formen sind rote Stäbchen.

Teil D -Endosporen und Flecken

Einige Bakterien bilden robuste Strukturen, die als Endosporen bekannt sind. Eine Endospore ist eine ruhende Zelle, die gegen Hitze (einschließlich Kochen), Austrocknung, Nährstoffmangel und physische Schäden sehr widerstandsfähig ist. Endosporen erscheinen unter dem Mikroskop als große Klumpen an den Enden einiger Bakterien.

6. Klicken Sie im Menü für zusammengesetzte Mikroskopbilder auf die Miniaturansichten mit den Titeln Botulismus-Bakterien (Malachit-Färbung) und Botulismus-Bakterien (Gram-Färbung).

Notieren Sie Ihre Beobachtungen des Auftretens der Endosporen mit den beiden verschiedenen Färbungen.

Botulismus-Bakterien (Malachit-Satin) haben grüne und rote Stäbchenform. Botulismus-Bakterien (Gramm-Färbung)

hat rote und violette Stangen, die sich in allen Stangenformen zeigen.

Teil E - Der Flagellenfleck

Einige Bakterien haben Geißeln &8211 peitschenartige Strukturen, die für die Fortbewegung verwendet werden. Oft sind sie unter dem Mikroskop schwer zu erkennen, da sie sehr dünn sind. Eine Technik namens Flagellen-Färbung umhüllt bakterielle Flagellen mit Flecken, wodurch sie dicker und sichtbarer werden.

7. Klicken Sie im Menü für zusammengesetzte Mikroskopbilder auf die Miniaturansicht mit dem Titel Flagellare Bakterien.

Notieren Sie Ihre Beobachtungen über das Auftreten der Bakterien und ihrer Geißeln. Wie viele Geißeln hat jedes Bakterium?

Die Sache, die ich beobachte, ist eine Fleckgeißel und jedes Bakterium hat eine unterschiedliche Anzahl von Geißeln.

Angenommen, Sie haben eine Bakterienprobe, die eine Mischung aus stäbchenförmigen und kugelförmigen Bakterien enthält.

Wie viele Bakterienarten konnten Sie nur mit der Gram-Färbungstechnik in der Probe identifizieren? Erklären Sie Ihre Argumentation.

Selbst wenn Sie eine Mischung aus stäbchenförmigen und kugelförmigen Bakterien haben, würden Sie zwei Arten verwenden, weil Sie

würde ein negatives gram Bakterien und ein positives gram.bacteria bekommen.

Die Färbung ist nicht die einzige Möglichkeit, mit der Wissenschaftler zwischen verschiedenen Bakterienarten unterscheiden können.

Schlagen Sie eine andere Methode vor, mit der verschiedene Bakterienarten unterschieden werden können, die unter dem Mikroskop ähnlich aussehen. Erklären Sie, wie diese Methode funktionieren würde. (Hinweis: Verschiedene Arten können unterschiedliche Nährstoff- oder Stoffwechselanforderungen haben.)


Schau das Video: Endospore Formation (Januar 2023).