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Werden Spermien eine Chemotaxis gegenüber Saccharose zeigen?

Werden Spermien eine Chemotaxis gegenüber Saccharose zeigen?


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Ich habe mich gefragt, ob Spermien eine Chemotaxis gegenüber Saccharose zeigen? Einer meiner Freunde erzählte mir, dass Samenzellen in Gegenwart von Salzen sterben. Also denke ich, dass sich Spermien vom Salz entfernen werden. Kann mir jemand einen Hinweis zu diesem Bereich geben.


AKTUALISIEREN (Antwort warum Saccharose?):

Also hätte ich die Dinge klarer machen sollen. Ich dachte daran, ein Experiment zu machen, indem ich einige Samenzellen und ihre Auswirkungen auf Zucker und Salz nahm und sie dann unter einem Klappmikroskop betrachtete. Da ich kein Biologe bin, wollte ich eine Anleitung. Die üblichen verfügbaren Substanzen, die mir in den Sinn kamen, waren Zucker und Salz.


Wenn Sie "Sperma chemotaxis Saccharose" googeln, erfahren Sie einiges Interessantes. Bemerkenswerterweise weist der Wikipedia-Artikel über die Chemotaxis von Spermien darauf hin, dass die wichtigen Chemoattraktoren für Spermien (die Dinge, die Spermien durch Chemotaxis anziehen) verschiedene Signalmoleküle sind, die von der Eizelle abgegeben werden.

Es ist nicht klar, warum Sie unbedingt denken würden, dass Saccharose Spermien anziehen oder Salz sie abstoßen würde. Im ersten Fall (Saccharose) ist nicht ersichtlich, warum Spermien erwarten, Saccharose zu sehen. Wenn ich mich recht erinnere, ist Saccharose in der Tierphysiologie eigentlich ziemlich selten, außer als Energiequelle in Pflanzen, die Tiere essen; und Saccharose wird größtenteils in Monosaccharide zerlegt, bevor sie den Dünndarm verlässt, so dass es nicht so ist, als würde sie im Körper zirkulieren. Zum Beispiel schlägt ein Laborprotokoll zur Untersuchung der Chemotaxis tierischer Spermien vor, Saccharose als Verdichtungsmittel hinzuzufügen, das die Chemotaxis nicht stört, was darauf hindeutet, dass Spermien ziemlich unabhängig von Saccharose sind. Im zweiten Fall (Salz) ist es nicht offensichtlich, dass Spermien unbedingt die Dinge meiden würden, die sie töten. Diese Dinge können mit ihrer Arbeit zusammenhängen! Es wird erwartet, dass die meisten Samenzellen bei der menschlichen Fortpflanzungsstrategie absterben.

Im Klartext: Es gibt eine riesige Anzahl von Spermien, die wirklich hart miteinander konkurrieren, um eine Eizelle zu finden und zu befruchten, keine Saccharose zu finden oder Salz zu vermeiden. Die Chemotaxis, die Spermien zeigen, wird ihnen helfen, dieses Ziel zu erreichen. Es scheint also (laut Wikipedia), dass sie den Signalen folgen, die "Ei" sagen, nicht denen, die "Zucker" sagen.

Aktualisieren: Sorry, habe gerade erst das Update zu Q gesehen. Danke für die Klarstellung - hört sich nach Spaß an! Ich war neugierig auf die Klappskope.

Wenn Sie ein Experiment durchführen möchten, haben Sie meiner Meinung nach einen guten Anfang damit, zuerst zu wissen, dass Salz ihre Beweglichkeit beeinträchtigt. Das ist ein Kontrollexperiment, z.B. Das allererste, was Sie tun sollten, um sicherzustellen, dass die Welt so funktioniert, wie andere Leute sagen, dass sie es sollte. (Erste Regel der experimentellen Wissenschaft: Vertraue nie jemandem!). Schlagen Sie ein Protokoll nach, das eine Spermien-hemmende Salzkonzentration vorschlägt (idealerweise koscheres Salz, kein Kochsalz, das eine Reihe anderer Stoffe wie Jod enthält). Geben Sie Spermien in dieser Salzkonzentration und dann auch in ein Medium, in dem sie Chemotaxis zeigen sollten (das Protokoll, auf das ich verlinkt habe, könnte hier hilfreich sein). Sehen Sie, ob Sie die Salzhemmung reproduzieren können, idealerweise in einem Medium, das ansonsten mit dem Medium identisch ist, das eine Chemotaxis ermöglicht.

Versuchen Sie als nächstes andere Dinge. Leider sind Chemoattractants wahrscheinlich Proteine/kleine Moleküle, die Sie nicht im Supermarkt kaufen können. Aber Sie könnten versuchen, kreativ zu werden. Ich kann ethisch nicht empfehlen, dass Sie versuchen, eine menschliche Quelle zu finden, weil das ziemlich schnell seltsam wird, obwohl es der offensichtliche Vorschlag ist (ich nehme an, Sie sprechen von menschlichem Sperma). Möglicherweise gibt es eine tierische Quelle für solche Dinge, die nicht zu teuer ist.

Sie könnten jedoch mit Chemoattraktoren und Chemotaxis zur Hölle sagen und versuchen, nur die Beweglichkeit der Spermien zu verstehen. Sie könnten andere osmotische Schocks mit einfachen billigen Chemikalien wie Glycin ausprobieren. Es sieht so aus, als ob es in der Literatur einige Hinweise darauf gibt, dass Calciumionen die Spermienmotilität beeinflussen. Oder Sie könnten mit dem pH-Wert spielen, mit Essig oder Lauge oder der Temperatur. Ich wette, dass all dies die Spermienmotilität beeinflusst (wahrscheinlich zum Schlechteren). Oder Sie probieren die Wirkung verschiedener schräger Hippie-Kräuter aus dem Bioladen aus. Es hört sich so an, als ob Sie nur nach einem einfachen, unterhaltsamen Experiment suchen, und wenn das Ihr Ziel ist, dann empfehle ich Ihnen, eine Reihe von Dingen auszuprobieren und zu sehen, was passiert. Auf diese Weise ist es wahrscheinlicher, dass Sie etwas Interessantes finden.

Wenn Sie ein ausgeklügelteres Experiment wünschen, dann ist es meiner Meinung nach Ihre Zeit wert, sich hinzusetzen und zu versuchen, sich über die Funktionsweise von Spermien zu informieren und dann ein Experiment zu entwerfen, das eine Hypothese wirklich eindeutig testet. Ich bin hier kein Experte, aber der Yoshida-Artikel, auf den ich verlinke, sieht so aus, als ob er eine gute Literaturübersicht enthält.

Ich hoffe, das hilft.


Auch in schwachem Zustand zieht der Eierstockduft Samenzellen an

Mäuse sind bekannt dafür, einen scharfen Geruchssinn zu haben, aber nicht nur ihre Nasen können einen Geruch aufnehmen, wie eine neue Studie zeigt.

In der Analytical Chemistry dieser Woche berichten Wissenschaftler der Indiana University Bloomington über biochemische Maschinen, die es Mäusespermien ermöglichen, den schwächsten Gerüchen zu folgen. Selbst wenn Eierstockextrakte 100.000-fach verdünnt wurden, fanden einige Samenzellen noch ihre Spuren.

„Es ist bekannt, dass Spermien eine Chemotaxis gegenüber Extrakten aus verschiedenen weiblichen Fortpflanzungsorganen zeigen, aber die Rolle der Chemotaxis bei der Fortpflanzung ist nicht bekannt“, sagte Stephen C. Jacobson, außerordentlicher Professor für Chemie an der IUB. "Die Chemikalien, die tatsächlich Spermien anziehen, wurden nicht identifiziert. Eine systematische Untersuchung verschiedener Verbindungen, die von den weiblichen Fortpflanzungsorganen unter verschiedenen Bedingungen freigesetzt werden, könnte unser Verständnis dieser Prozesse verbessern."

Zu verstehen, warum, wie und wann Spermien von Eierstöcken angezogen werden, kann Wissenschaftlern helfen, Probleme mit der menschlichen Empfängnis zu verstehen.

"Defekte bei der Spermien-Chemotaxis können eine Ursache für Unfruchtbarkeit sein, und folglich könnte die Spermien-Chemotaxis möglicherweise als diagnostisches Instrument zur Bestimmung der Spermienqualität oder als therapeutisches Verfahren bei männlicher Unfruchtbarkeit verwendet werden", sagte Jacobson.

Das Projekt ist eine Zusammenarbeit zwischen Forschungsgruppen unter der Leitung von Jacobson und dem IUB Distinguished Professor of Chemistry Milos V. Novotny. Ihre Arbeit führte zur Entwicklung eines "Flow-Through"-Geräts, einer Art Flüssigkeitslaufband für Spermien, mit dem die Forscher die seitliche Bewegung der Spermien beim Schwimmen der Zellen durch ein flüssiges Medium verfolgen können.

Das Gerät speist drei Flüssigkeitsströme in eine einzige Kammer. Jenseits der Kammer werden die Ströme in drei Austrittsströme aufgeteilt. Die Flussrate kann einfach durch Anheben oder Absenken der Höhe des Quellmediums, in diesem Fall einer Pufferlösung, reguliert werden. Die Forscher befestigten ein Mikroskop und eine Kamera am Gerät und zeichneten dann während der Tests Videos der Spermien auf.

"Wir haben in einem mikrofluidischen Gerät die Fähigkeit kombiniert, einen chemischen Gradienten mit dem Transport von Spermien zu erzeugen, um die Chemotaxis der Spermien zu untersuchen", sagte Jacobson. „Der Einsatz von mikrofluidischen Geräten scheint ein idealer Ansatz zu sein, um den chemischen Gradienten präzise zu steuern und chemotaktische Ereignisse genau zu verfolgen. Diese Kombination führte zu einer höheren Wiederholbarkeit der experimentellen Bedingungen im Verlauf der Assays, die mit herkömmlichen Assays derzeit nicht möglich ist. Diese Ergebnisse sind ein wichtiger erster Schritt auf dem Weg zu einer einfach zu bedienenden Plattform zur schnellen Bewertung und Quantifizierung von Chemotaxis."

Die Forscher hoffen, dass ihr Gerät anderen Wissenschaftlern helfen wird, die Chemotaxis aller Zelltypen genauer zu untersuchen. Das Verfahren eliminiert auch das Phänomen des "Trappings", das dazu führt, dass die Studienergebnisse mehrdeutig werden.

"Die Fähigkeit, Chemotaxis vom Fangen zu unterscheiden, hilft zu bestimmen, ob Spermien von der Testsubstanz angezogen wurden oder die Schwimmgeschwindigkeit in der Nähe der Testsubstanz reduziert wurde", sagte Jacobson. "Im letzteren Fall kann die Testsubstanz die Spermien negativ beeinflusst haben, was zu einer Bewegungsunterdrückung geführt hat."

Novotny ist der Lilly Chemistry Alumni Chair im Bloomington Department of Chemistry der Indiana University, wo er auch das Institut für Pheromonforschung leitet.

Die IUB-Wissenschaftler Sachiko Koyama und Dragos Amarie leiteten die Experimente und wurden dabei von Helena A. Soini unterstützt. Die Studie wurde von der Indiana University und dem Lilly Chemistry Alumni Chair Fund unterstützt. Analytical Chemistry ist eine Zeitschrift der American Chemical Society.

Quelle der Geschichte:

Materialien zur Verfügung gestellt von Universität von Indiana. Hinweis: Der Inhalt kann hinsichtlich Stil und Länge bearbeitet werden.


Stachelhäuter, Teil B

Hussein Hamzeh, . U. Benjamin Kaupp , in Methoden der Zellbiologie , 2019

1.1 Der Signalweg

Die Spermien-Chemotaxis wurde hauptsächlich bei Seeigeln, aber auch bei anderen wirbellosen Meerestieren untersucht (Carre & Sardet, 1981 Guerrero et al., 2010 Kaupp, 2012 Shiba, Baba, Inoue & Yoshida, 2008 Ward, Brokaw, Garbers & Vacquier, 1985). Seeigel leben in Kolonien auf dem Meeresboden und geben Eier und Spermien zur äußeren Befruchtung ins Meerwasser ab. Beim Laichen werden die Gameten in einem makroskopischen Maßstab durch Wasserfluss abgegeben. Seeigel-Eier haben einen Durchmesser von etwa 75–150 µm. Um ihr effektives Zielvolumen um mehrere Größenordnungen zu vergrößern, setzen Eier speziesspezifische chemoattraktive Peptide (8–15 Aminosäuren lang) frei. Der Chemolockstoff aus dem Seeigel A. punctulata, genannt Resact, besteht aus 14 Aminosäureresten. Eine Schätzung legt nahe, dass Spermien aus einer Entfernung von etwa 0,5 cm von der Eizelle angezogen werden (Kashikar et al., 2012).

Eine umfassende Darstellung aller beteiligten Moleküle würde den Rahmen dieses Aufsatzes sprengen. Für eine detailliertere Zusammenfassung verweisen wir auf frühere Bewertungen auf A. punctulata ( Kaupp & Alvarez, 2016 Kaupp & Strünker, 2017 Wachten, Jikeli, & Kaupp, 2017 ) oder Strongylocentrotus purpuratus Spermien (Darszon, Guerrero, Galindo, Nishigaki & Wood, 2008 Darszon, Nishigaki, Beltran & Trevino, 2011 Nishigaki et al., 2014). Die wichtigsten Signalisierungskomponenten sind in Abb. 1 A dargestellt. Die Bindung von Resact an einen Chemorezeptor, der sich entlang des Flagellums der Spermien befindet, aktiviert einen zellulären Signalweg. Der Chemorezeptor gehört zur Familie der membranüberspannenden Guanylatzyklasen (GC), die den zellulären Botenstoff 3′,5′ cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) synthetisieren (Garbers et al., 1988 Kaupp et al., 2003). Das erste Signalisierungsereignis ist ein Anstieg von cGMP. cGMP wiederum öffnet K + -selektive zyklische Nukleotid-gesteuerte (CNGK) Kanäle und K + -Ionen verlassen die Zelle (Bönigk et al., 2009 Galindo, de la Vega-Beltrán, Labarca, Vacquier, & Darszon, 2007 Strünker et al., 2006). Die darauf folgende Hyperpolarisation – das Membranpotential (Vm) im Ruhezustand etwa −50 mV – ruft einen gleichzeitigen Anstieg des intrazellulären pH-Werts (pHich) und Na + Konzentration ([Na + ]ich) über einen spermienspezifischen, spannungsgesteuerten Na + /H + -Austauscher (sNHE) ( Lee & Garbers, 1986 Nomura & Vacquier, 2006 Seifert et al., 2015 Wang, King, Quill, Doolittle & Garbers, 2003 Windler et al., 2018). Die Alkalisierung verschiebt die Spannungsabhängigkeit des spermienspezifischen Ca 2 + -Kanals CatSper (Kationenkanal der Spermien) zu negativeren Spannungen. Diese Verschiebung ermöglicht es CatSper, sich während der Erholung von der Hyperpolarisation zu öffnen (Seifert et al., 2015). Der daraus resultierende Anstieg der intrazellulären Ca 2 + -Konzentration ([Ca 2 + ]ich) moduliert den Flagellenschlag. Die Erholung von der Hyperpolarisation beinhaltet einen einwärts gerichteten Na + -Strom, der von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch nukleotidgesteuerten (HCN) Kanälen getragen wird ( Gauss, Seifert &. Kaupp, 1998 Seifert et al., 2015 ), Schließung von CNGK-Kanälen nach cGMP-Hydrolyse durch eine Phosphodiesterase (PDE) oder eine Kombination aus beidem. Die Wiederherstellung der Ca 2 + -Grundlinienspiegel wird über einen Na + /Ca 2 + /K + -Austauscher (NCKX) und eine Ca 2 + -ATPase (PMCA) erreicht (Guaratne & Vacquier, 2006 Su & Vacquier, 2002, 2006). Abb. 1 B zeigt vier Hauptsignale während der Chemotaxis: eine Änderung von Vm, pHich, [Na + ]ich, und [Ca 2 + ]ich im Stopped-Flow-Gerät gemessen, wie später im Text erläutert. Die überlagerten Fluoreszenzantworten veranschaulichen die Abfolge der Signalereignisse: Zuerst Hyperpolarisation, gefolgt von gleichzeitigem H + -Export und Na + -Import und schließlich ein Anstieg von Ca 2 + .

Abb. 1 . Modell des Signalweges, der die chemotaktische Steuerung von . steuert A. punctulata Sperma. (A) Die Bindung der Chemoattractant-Reaktion an den Chemoattractant-Rezeptor (GC) stimuliert die Synthese von cGMP, das K + -Kanäle (CNGK) öffnet und die Zelle hyperpolarisiert. Hyperpolarisation aktiviert einen Natrium/Protonen-Austauscher (sNHE) die anschließende intrazelluläre Alkalisierung verschiebt die Spannungsabhängigkeit des Ca 2 + -Kanals CatSper zu negativeren Membranpotentialen. Während der Erholung von der Hyperpolarisation, wahrscheinlich erleichtert durch die Aktivität des HCN1/HCN2-Kanals, öffnen sich die CatSper-Kanäle und Ca 2 + fließt in die Zelle. Schließlich wird Ca 2 + extrudiert und die Grundwerte werden durch einen Na + /Ca 2 + -K + -Austauscher (NCKX) und eine Ca 2 + -Pumpe (PMCA) wiederhergestellt. (B) Signale repräsentieren Veränderungen von Ca 2 + (blau, Fluo-4), Vm (rot, FluoVolt), pHich (grün, pHrodo Red) und Na + (schwarz, ANG2). Spermien wurden zuerst mit ASW gemischt und dann durch Photofreisetzung von cGMP aus DEACM-käfigem cGMP stimuliert. Signale wurden von Spermien desselben Tieres aufgezeichnet und dann auf den UV-Puls ausgerichtet.

Panel (A): Modifiziert nach Kaupp, U.B., &amp. Strünker, T. (2017). Signalübertragung in Spermien: Mehr anders als ähnlich. Trends in der Zellbiologie, 27, 101–109.


Mäusesperma zeigt eine Chemotaxis gegenüber Allurin, einem verkürzten Mitglied der Cystein-reichen sekretorischen Proteinfamilie

Allurin, ein 21 kDa Protein, das aus Eigelee des Frosches isoliert wurde Xenopus laevis, wurde zuvor in Zweikammer- und mikroskopischen Assays gezeigt, dass es Froschsperma anzieht. cDNA-Klonierung und -Sequenzierung haben gezeigt, dass Allurin ein verkürztes Mitglied der Cystein-Rich-Sekretorischen Protein-(CRISP)-Familie ist, zu deren Mitgliedern Spermien-bindende Proteine ​​von Säugetieren gehören, von denen postuliert wurde, dass sie eine Rolle bei der Spermatogenese, der Spermienkapazität und der Spermien-Ei-Bindung spielen Säugetiere. Hier zeigen wir, dass Allurin ein Chemoattraktant für Mäusesperma ist, wie durch eine 2,5-fache Stimulation der Spermienpassage durch eine poröse Membran und durch Analyse der Spermienbahn innerhalb eines Alluringradienten durch Zeitraffermikroskopie bestimmt. Die Chemotaxis wurde von einer allgemeinen Änderung der Trajektorie von kreisförmig zu linear begleitet, wodurch die Spermienbewegung entlang der Gradientenachse erhöht wurde. Allurin erhöhte die Spermiengeschwindigkeit nicht, obwohl es einen bescheidenen Anstieg der Flagellenschlagfrequenz erzeugte. Es wurde beobachtet, dass Oregon Green 488-konjugiertes Allurin an die subäquatoriale Region des Mausspermikopfes und an das Mittelstück des Flagellums bindet. Diese Ergebnisse zeigen, dass Spermien über 300 Millionen Jahre Wirbeltier-Evolution die Fähigkeit behalten haben, verkürzte Crisp-Proteine ​​zu binden und darauf zu reagieren.

Höhepunkte

► Mäusesperma zeigt eine gerichtete Beweglichkeit gegenüber Allurin, einem Chemoattraktant für Amphibien. ► Oregon-Grün-konjugiertes Allurin bindet in einem regionenspezifischen Muster an Mäusesperma. ► Allurin stimuliert eine bescheidene Erhöhung der Schlagfrequenz. ► Mäusespermien zeigen keine Geschwindigkeitserhöhungen als Reaktion auf Allurin. ► Spermien haben die Reaktion auf Allurin über 300 Millionen Jahre der Evolution bewahrt.


Resultate und Diskussionen

Um die Funktion von Calaxin bei der Regulation der Spermienmotilität bei Chemotaxis zu testen, verwendeten wir einen Inhibitor der Proteine ​​der neuronalen Calciumsensorfamilie, Repaglinid, der spezifisch an Calaxin in Spermiengeißeln bindet (Abb. S1) (13). Wir fragten zunächst, ob Calaxin eine entscheidende Rolle bei der Chemotaxis der Spermien spielt. Während chemotaktischer Bewegungen zeigen Spermien eine einzigartige Drehbewegung, die mit einer Geißeländerung in eine asymmetrische Wellenform verbunden ist, gefolgt von einer Geradeausbewegung (11). Wir beobachteten die chemotaktische Bewegung der Spermien in Richtung einer mit SAAF gefüllten Glaskapillare in Abwesenheit und Gegenwart von Repaglinid ( Abb. 1EIN ). Sperma in künstlichem Meerwasser zur Kontrolle (ASW) mit 0,5% (Vol./Vol.) Lösungsmittel (DMSO) zeigte eine sehr starke Chemotaxis in Richtung der Glaskapillare. Spermien im ASW, die 150 µM Repaglinid enthielten, zeigten jedoch nicht die einzigartige Drehbewegung und zeigten eine weniger wirksame Chemotaxis ( Abb. 1EIN ). Die Analyse des linearen Chemotaxis-Index (LECI) (11) zeigte quantitativ eine signifikant verringerte chemotaktische Eigenschaft, die durch Repaglinid bei 𾄀 µM gefördert wird ( Abb. 1 .).B ). Die Spermien-Schwimmgeschwindigkeit zeigte keine dramatische Veränderung nach der Repaglinid-Behandlung ( Abb. 1C ). Eine Hypothese ist, dass der Verlust des chemotaktischen Verhaltens durch Repaglinid durch eine Wirkung auf K . verursacht werden könnteATP Kanäle (13). Die Behandlung mit Glibenclamid, einem spezifischen KATP Kanalinhibitor, hatte keinen Einfluss auf das chemotaktische Verhalten ( Abb. 1B ). Diese Daten legen nahe, dass Calaxin für die Chemotaxis der Spermien essentiell ist.

Repaglinid hemmt die Chemotaxis der Spermien. (EIN) Spermien-Trajektorien in Richtung einer SAAF-gefüllten Kapillare (rot) in Abwesenheit (Oberer, höher) und Präsenz (Untere) von 150 µM Repaglinid. (Skalenbalken, 100 µm.) Trajektorien von drei repräsentativen Spermien werden gezeigt (Rechts). (B) Quantifizierung der Chemotaxis mit LECI. n = 12�. (C) Repaglinid verändert die Schwimmgeschwindigkeit der Spermien während der Chemotaxis nicht signifikant. n = 30. (D) Pseudofarbendarstellung von [Ca 2+ ]ich wenn Spermien in Abwesenheit (DMSO) oder Gegenwart von 150 µM Repaglinid zu einem Chemoattraktant schwimmen. Die Trajektorien der Spermien und die Position relativ zum Chemoattraktant (rot) werden in einer Pseudofarbendarstellung des Flagellenteils angezeigt (Rechts). (E) Maximale Fluo-8H-Fluoreszenzintensität des Flagellenteils während der Chemotaxis. Die Behandlung mit Repaglinid verändert das Maximum [Ca 2+ ] nichtich. n = 12�. Pfeile in EIN und D Bewegungsrichtung angeben. *P < 0,01 vs. 0 µM **P < 0,001 vs. 0 µM.

Die Spermienchemotaxis wird von einer oszillatorischen [Ca 2+ ]ich Zunahme, gefolgt von Änderungen der Flagellanasymmetrie (Film S1). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass Repaglinid die Chemotaxis durch Hemmung der oszillatorischen [Ca 2+ ] verändertich erhöhen, verglichen wir [Ca 2+ ]ich durch Fluo-8H visualisierte Dynamik während der Spermien-Chemotaxis in Abwesenheit und Anwesenheit von Repaglinid. Mit Repaglinid behandelte Spermien zeigten vorübergehend erhöhte [Ca 2+ ]ich in der Nähe des Chemoattraktans ähnlich wie Kontrollspermien ( Abb. 1D Film S2). Die durchschnittliche maximale Intensität der Fluo-8H-Fluoreszenz während der Chemotaxis wurde durch Repaglinid nicht beeinflusst ( Abb. 1E ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Hemmung der Flagellenwellenform durch Repaglinid nicht auf eine Wirkung auf [Ca 2+ ] zurückzuführen ist.ich, sondern eine direkte Wirkung auf Calaxin.

Um zu verstehen, wie die Chemotaxis durch Repaglinid gehemmt wird, wurde die Asymmetrie der Flagellenwellenform im Detail mit einer Hochgeschwindigkeitskamera analysiert. In der chemotaktischen Wende zeigen Spermien eine vorübergehende Änderung der Flagellanasymmetrie ( Abb. 2EIN Film S3). Mit 150 µM Repaglinid behandelte Spermien zeigten weiterhin eine vorübergehende Geißel-Asymmetrie, aber die Bewegungsbahn war aufgrund unvollständiger Drehung instabil, was zu einer weniger effektiven chemotaktischen Bewegung führte (Film S4). Interessanterweise konnten mit Repaglinid behandelte Spermien keine asymmetrische Wellenform aufrechterhalten und kehrten schnell zu einer symmetrischen Form zurück, im Gegensatz zu Kontrollspermien, die während einer Umdrehung eine starke Asymmetrie aufwiesen ( Abb. 2EIN , Sternchen Filme S3 und S4). Eine detaillierte Analyse ergab, dass mit Repaglinid behandelte Spermien während einer Runde mehrere asymmetrische Veränderungen aufwiesen ( Abb. 2B , Pfeilspitzen Abb. 2C ), und die Dauer des asymmetrischen Zustands wurde verkürzt ( Abb. 2 B, Center, und D ). Eine solche Verkürzung der Dauer könnte zum Verlust einer starken Drehung führen, die für die chemotaktische Bewegung wesentlich ist. Die Flagellenwelle setzt sich aus einer großen Hauptkrümmung (P-Krümmung) und einer kleineren Rückkrümmung (R-Krümmung) (9) zusammen (siehe Abb. S3). Die Asymmetrie der Flagellenwellenform an der chemotaktischen Kurve wurde sowohl von einer Zunahme der P-Krümmung als auch einer Abnahme der R-Krümmung begleitet. Mit Repaglinid behandelte Spermien erreichten eine ähnliche Wellenformasymmetrie wie die Kontrollspermien ( Abb. 2B , Rechts), und als Ergebnis waren die maximalen asymmetrischen Indizes die gleichen wie bei Kontrollspermien ( Abb. 2E ). Eine verringerte Dauer der asymmetrischen Wellenform und die resultierende Wiederherstellung der symmetrischen Wellenform führten zu einer schwachen Ausrichtung der Spermienbewegung zum Chemoattraktant.

Die Behandlung mit Repaglinid reduziert die Nachhaltigkeit der asymmetrischen Flagellarwellenform bei chemotaktischen Wendungen. (EIN) Sequentielle Bilder von Spermien. Sternchen entsprechen den ersten ein oder zwei Pfeilspitzen in B. (B) (Links) Spermien-Trajektorien in einer Drehbewegung. Pfeile zeigen die Bewegungsrichtung an. Pfeilspitzen zeigen Asymmetriepunkte an. (Center) Asymmetrischer Index. Rohdaten in Punkten werden geglättet (durchgezogene Linie). (Rechts) Maximale Geißelkrümmungen der Haupt- (blau) und Rückwärtsbiegung (rot) während einer chemotaktischen Drehung. (C) Die Anzahl der Asymmetrien während einer chemotaktischen Runde wird durch Repaglinid erhöht. n = 8�. (D) Die Dauer einer Asymmetrie wird durch Repaglinid deutlich verkürzt. n = 12�. (E) Der maximale asymmetrische Index während der Chemotaxis wird durch Repaglinid nicht signifikant verändert. n = 6�. *P < 0,05 vs. 0 µM, **P < 0,01 vs. 0 µM.

Um die direkte Wirkung von Repaglinid auf Flagella-Axoneme zu untersuchen, verwendeten wir als nächstes ein Modell, in dem Spermien mit 0,04 % Triton X-100 demembraniert und durch 1 mM ATP reaktiviert wurden. Der Reaktivierungslösung wurden verschiedene Konzentrationen von Ca 2+ zugesetzt, und die Spermienwellenform wurde analysiert. Reaktivierte Spermien zeigten Ca 2+ -abhängige Veränderungen der Asymmetrie der Flagellenwellenform, wie zuvor berichtet (8). Spermiengeißeln zeigten in Lösungen mit hoher Ca 2+ -Konzentration eine stärker asymmetrische Wellenform ( Abb. 3 EIN und B ). Analyse asymmetrischer Indizes bei verschiedenen [Ca 2+ ]ich zeigten, dass die Flagellanasymmetrie bei mehr als 10 𢄦 M Ca 2+ signifikant wurde ( Abb. 3B ). Allerdings wurde die Geißelverbiegung reaktivierter Spermien, die mit 150 µM Repaglinid behandelt wurden, bei hohen Ca 2+ -Konzentrationen abgeschwächt, obwohl sich die Geißelverbiegung bei niedrigen Ca 2+ -Konzentrationen fortpflanzte ( Abb. 3C ). Der Vergleich der Biegekrümmung entlang der Geißellänge bei Ca 2+ -Konzentrationen zwischen 10 � M (pCa10) und 10 𢄥 M (pCa5) zeigte, dass die Repaglinid-Behandlung die Krümmungsausbreitung stark beeinträchtigte, insbesondere im distalen Teil der Geißeln bei pCa5 ( Abb. 3C ). Ein ähnlicher Effekt wurde durch spezifische Antikörper gegen Calaxin beobachtet ( Abb. 3D ). Diese Wellendämpfung trat sowohl in der P-Kurve als auch in der R-Kurve bei pCa5 und in der P-Kurve bei pCa10 auf ( Abb. 3 C und D ). Die Behandlung mit Glibenclamid hatte sowohl bei niedrigen als auch bei hohen Ca 2+ -Konzentrationen keinen Einfluss auf die Flagellenamplitude (Abb. S2). Ein Calmodulin-Inhibitor W-7 verringerte leicht die P-Krümmung, verursachte jedoch keine signifikante Abschwächung der Flagellenkrümmung (Abb. S2), was darauf hindeutet, dass die Abschwächung der Flagellenkrümmung auf eine spezifische Hemmung von Calaxin zurückzuführen ist, nicht der von CaM-ähnlichen Proteinen im Axonem.

Calaxin reguliert die Ausbreitung der asymmetrischen Geißelverbiegung, indem es das dyneingetriebene Gleiten der Mikrotubuli unterdrückt. (EIN) Geißelbiegemuster bei pCa10 (Links) und pCa5 (Rechts). Alle 5 ms wurden 20 Biegeformen gewählt. Die Geißelkrümmung wird gegen den Abstand von der Basis der Geißel aufgetragen (Untere). Daten von 20 Kurven werden überschrieben. (B) Flagellare asymmetrische Indizes von Flagellen eines demembranierten Spermienmodells wurden bei verschiedenen Ca 2+ -Konzentrationen aufgetragen. n = 18�. *P < 0,05 vs. pCa10, **P < 0,001 vs. pCa10. (C und D) Geißelbiegemuster und die Krümmung bei pCa10 (Links) und pCa5 (Rechts) in Gegenwart von 150 µM Repaglinid (C) oder Anti-Calaxin-Antikörper (D). (Unterseite) Die maximale Geißelkrümmung gegen den Abstand von der Basis der Geißel ist für P-Krümmungen und R-Krümmungen aufgetragen. n = 30�. *P < 0,01, **P < 0,001.

Calaxin hat drei Ca 2+ -bindende Motive (EF-Hand) (Aminosäuren 62�, 98� und 151�) (12). Die Assoziation von Calcium mit Calaxin wurde mittels isothermer Titrationskalorimetrie untersucht (ITC Abb. 4EIN ). Die ITC-Daten für Ca 2+ konnten in Übereinstimmung mit der Motivvorhersage an ein sequenzielles Bindungsmodell mit drei Stellen angepasst werden ( Abb. 4EIN ). Zwei der drei EF-Handmotive zeigten eine endotherme Bindung (∆h1 = 8,0 kcal/mol und Ka1 = 2,3 × 10 5 M 𢄡 ∆h2 = 5,1 kcal/mol und Ka2 = 2,2 × 10 5 M 𢄡 ), und einer war eine exotherme Stelle (∆h3 = 𢄣.4 kcal/mol und Ka3 = 3,5 × 10 4 M 𢄡 ). Eine positive Enthalpie spiegelt hydrophobe Wechselwirkungen wider, wie in den Fällen der Ca 2+ -Bindung an Calmodulin (14) und der (+)-Abscisinsäure (ABA)-Bindung an PYL1 (15).

Die Ca 2+ -Bindung an Calaxin unterdrückt die dyneingetriebene Mikrotubuli-Translokation. (EIN) Isotherme Titrationskalorimetrie, die drei Bindungsstellen für Ca 2+ in Calaxin zeigt. (Unterseite) Lage von drei EF-hand Ca 2+ -bindenden Motiven in Calaxin. (B) Sequentielle Dunkelfeldbilder der Mikrotubuli-Translokation bei pCa10 oder pCa5 in Gegenwart oder Abwesenheit von Calaxin. Pfeile geben die Translokationsrichtung an. Pfeilspitzen repräsentieren die Minus- (gelb) oder Plus- (grün) Enden der Mikrotubuli. (C) Geschwindigkeit der Mikrotubuli-Translokation. (Oberer, höher) Calaxin unterdrückt die Translokation bei pCa5 drastisch. n = 73�. (Untere) Repaglinid (n = 40�), Anti-Calaxin-Antikörper (n = 107�) und eine Mutation in EF-Hand 2 von Calaxin (n = 89�) heben die Calaxin-vermittelte Suppression der Mikrotubuli-Translokation auf. Offener Balken, Kontrolle geschlossener Balken, Vorhandensein von Repaglinid, Anti-Calaxin-Antikörper oder einer Calaxin-Mutante. *P < 0,01, **P < 0,001. (D) Vorgeschlagenes Modell der Calaxin-Funktion bei der Spermien-Chemotaxis. Ein Chemoattraktant induziert Ca 2+ -Einstrom und erhöht [Ca 2+ ]ich löst eine Asymmetrie der Flagellenwellenform aus. Die Ca 2+ -Bindung führt zu einer Konformationsänderung von Calaxin, seiner Assoziation mit der Dynein-Motordomäne, einer Unterdrückung der Mikrotubuli-Gleitbewegung und der Ausbreitung einer asymmetrischen Welle, die für die Drehbewegung erforderlich ist.

Da Calaxin ein starker Kandidat für einen direkten Regulator der motorischen Aktivität von Dynein ist (12), fragten wir schließlich, ob Calaxin das Gleiten polymerisierter Singulett-Mikrotubuli durch gereinigtes Außenarm-Dynein in vitro moduliert. Nachdem Dynein des äußeren Arms in einer Kammer an einem Glasobjektträger befestigt wurde, wurden Mikrotubuli in Gegenwart von 1 mM ATP hinzugefügt und die Mikrotubuli-Translokation wurde aufgezeichnet ( Abb. 4 .).B Filme S5, S6, S7 und S8). Außenarm-Dynein von Ciona Spermien translozierte Mikrotubuli bei 4,6 ± 1,5 μm/s bei pCa10. Eine Erhöhung der Konzentration von Ca 2+ auf pCa5 hatte einen geringen Einfluss auf die Translokationsgeschwindigkeit ( Abb. 4C ). Die Zugabe von Calaxin reduzierte jedoch die Geschwindigkeit der Mikrotubuli-Translokation bei pCa5 signifikant ( Abb. 4C ). Repaglinid hob die Suppression der Mikrotubuli-Translokation bei pCa5 auf ( Abb. 4C ). Ein spezifischer Antikörper gegen Calaxin hob ebenfalls die Suppressionswirkung von Calaxin auf ( Abb. 4C ). Um die Ca 2+ -Bindung von Calaxin zu unterbrechen, stellten wir eine Calaxin-Mutante mit E118A-Substitution im EF-Hand-Motiv 2 her ( Abb. 4EIN ). Die E118A-Mutante von Calaxin zeigte selbst bei pCa5 keine Suppression der Mikrotubuli-Translokation ( Abb. 4C ).

Analyse von Chlamydomonas Mutanten weisen darauf hin, dass Dyneine des äußeren Arms für die Umwandlung der Wellenformasymmetrie als Reaktion auf Änderungen der Ca 2+ -Konzentration essentiell sind (16 �). Calaxin bindet an die schwere Kette β des Außenarm-Dyneins (12, 19) und unterdrückt das Gleiten der Mikrotubuli bei hohen Ca 2+ -Konzentrationen ( Abb. 4 B und C ). Eine solche Unterdrückung ist wahrscheinlich erforderlich, um die asymmetrische Biegung auszubreiten. Tatsächlich werden sowohl die P- als auch die R-Biegung demembranierter Spermien durch die Behandlung mit dem Calaxin-Inhibitor Repaglinid abgeschwächt ( Abb. 3C ) oder durch Anti-Calaxin-Antikörper ( Abb. 3D ). Während der Chemotaxis von mit Repaglinid behandelten Spermien breitet sich die asymmetrische Wellenform nicht aus, sondern wird vorzeitig symmetrisch ( Abb. 2EIN ). Es ist allgemein anerkannt, dass die Fortpflanzung der Flagellenkrümmung aus dem abwechselnden Gleiten von Dublett-Mikrotubuli resultiert, die von Dyneinen angetrieben werden. Mechanisches Feedback von einer Biegung beeinflusst das Gleiten der Mikrotubuli in einer benachbarten Biegung (20). Daher könnte die Unterdrückung des Gleitens der Mikrotubuli durch Calaxin die benachbarte Biegung beeinflussen, um eine asymmetrische Wellenform auszubreiten ( Abb. 4D ).

Umwandlung der asymmetrischen Wellenform in Chlamydomonas Flagellen treten bei � 𢄦 M Ca 2+ im Wildtyp auf, jedoch nicht in Mutanten ohne äußere Arme (17). ATP-sensitive Mikrotubuli-Bindung von Chlamydomonas Außenarm-Dynein ist kritisch zwischen � 𢄦 M und � 𢄥 M Ca 2+ (21). Obwohl das Grundniveau von [Ca 2+ ]ich ist zu niedrig (㰐 𢄧 M) für eine Schätzung mit Fluo-8H in Ciona Spermien, maximaler asymmetrischer Index während der chemotaktischen Drehbewegung ( Abb. 2E ) war vergleichbar mit dem von demembranierten Spermien bei � 𢄥 M Ca 2+ ( Abb. 3B ), was darauf hindeutet, dass das Maximum [Ca 2+ ]ich während der chemotaktischen Wende ist � 𢄥 M. Dieser Vorschlag ist mit der Tatsache kompatibel, dass [Ca 2+ ]ich steigt von 10 𢄧 auf 10 𢄦 M durch den Chemoattraktant speract in Seeigeln (22). Die Unterdrückung des Gleitens der Mikrotubuli in vitro ist bei � 𢄥 M signifikant ( Abb. 4C ) und stimmt sowohl mit der Ca 2+ -Antwort in Spermiengeißeln ( 3 ) als auch mit der hydrophoben Wechselwirkung überein, die durch die Ca 2+ -Bindung an zwei EF-Handmotive gebildet wird, wie von ITC vorgeschlagen ( 4 .).EIN ). Diese Ergebnisse unterstützen weiter die Idee, dass die Ca 2+ -abhängige Unterdrückung der Mikrotubuli-Translokationsaktivität von Dynein durch Calaxin eine Voraussetzung für die Drehungsbewegung während der Spermienchemotaxis ist ( Abb. 4D ). Daher wird die Ca 2+ -vermittelte Regulierung des Dyneins des äußeren Arms als kritisch für die richtige Ausbreitung der asymmetrischen Flagellenwellenform angesehen. Die vorliegende Studie zeigt nicht nur die wesentliche Rolle von Calaxin bei der Spermien-Chemotaxis, sondern auch die Bedeutung des Außenarm-Dyneins bei der Ca 2+ -abhängigen Regulation der asymmetrischen Geißelbeugung. Da Calaxin häufig in metazoischen Zilien und Flagellen vorkommt (12), werden weitere Studien wahrscheinlich zu wichtigen Entdeckungen in der Ca 2+ -abhängigen Regulation verschiedener Zilien-vermittelter Prozesse führen.


Werden Spermien eine Chemotaxis gegenüber Saccharose zeigen? - Biologie

Die Verhaltensmerkmale von Spermien sind an die Fortpflanzungsstrategie jeder Art angepasst. Bei polyandren Arten bilden Spermatozoen oft bewegliche Cluster, was für die Konkurrenz mit Spermien anderer Männchen von Vorteil sein könnte [1]. Trotz dieses vermuteten Vorteils für den Fortpflanzungserfolg [2, 3] ist wenig darüber bekannt, wie Spermien solche funktionellen Anordnungen bilden. Zuvor haben wir berichtet, dass Männchen des Küstenkalmars Loligo bleekeri produzieren zwei morphologisch unterschiedliche Euspermatozoen, die mit deutlich unterschiedlichem Paarungsverhalten verbunden sind [4]. Consort- und Sneaker-Männchen verwenden zwei unterschiedliche Besamungsorte, eine innerhalb und eine außerhalb des Körpers des Weibchens. Hier zeigen wir, dass Spermien ein sich selbst anziehendes Molekül freisetzen, das nur Sneaker-Spermien zum Schwärmen bringt. Wir haben CO . identifiziert2 als Chemoattraktant für Spermien und membrangebundene Flagellare Carboanhydrase als Sensor. Die stromabwärtige Signalübertragung resultiert aus der Erzeugung von extrazellulärem H + , intrazellulärer Azidose und Erholung von einer Azidose. Diese Signalereignisse rufen Ca 2+ -abhängiges Drehverhalten hervor, was zu chemotaktischem Schwärmen führt. Diese Ergebnisse beleuchten die verzweigte Evolution der Spermien, die den unterschiedlichen Befruchtungsstrategien dieser Spezies zugrunde liegt.

Grafische Zusammenfassung

Höhepunkte

► Kleine, hinterhältige Tintenfischmännchen produzieren Spermatozoen, die zu CO . ausschwärmen2 ► Sneaker, aber kein Consort, Spermien säuern ihren intrazellulären pH-Wert durch extrazelluläre Ansäuerung durch Carboanhydrase an ► Erholung von intrazellulärer Azidose ruft Ca 2+ -abhängiges chemotaktisches Schwärmen hervor ► Das Schwärmen durch Sneaker-Spermien könnte eine evolutionäre Anpassung an die Paarungstaktik sein


Vorteile von Microscale

Die Verwendung eines mikrofluidischen Geräts für diese Experimente ist vorteilhaft, da es hilft, eine realistischere Umgebung zu erfassen, in der die Chemotaxis der Spermien untersucht werden kann. Die Größe der Eileiter kann von 7 bis 12 cm reichen. in length, but the diameter of tube is normally less than 1 cm. Therefore, it makes sense that this kind of assay would be performed on a device that is relatively of the same scale. While the channel sizes for our device are definitely much smaller than that of the correct anatomical structure, the use of a microscale device will facilitate more accurate results than say an assay that is much larger than that of anatomical structures. Furthermore, it is unlikely that larger models would be able to efficiently capture what we are trying to assess. The gradients in larger devices would take longer to diffuse, and it would potentially take longer for sperm to detect. In a microfluidic assay, the gradients will form rather quickly, and it should take no time at all for the sperm to detect the gradients and to migrate more quickly.


Resultate und Diskussionen

Attractant Plumes Surrounding Eggs.

Field measurements within giant kelp forests (Macrocystis pyrifera) previously characterized the mixing properties of fluid into which abalone naturally spawn (13). These determinations specified the range of fluid-dynamic conditions for testing in present laboratory trials. Shears were 4.8 to 13.4 s −1 in adjacent open habitats, in contrast to 0.3 to 2.4 s −1 within the native crevices and under ledges where adult red abalone live and spawn (13). Spawning abalone thus aggregated at sites where water motion was substantially retarded (Fig. 1).

Theoretically, surface areas and volumes of egg-derived tryptophan plumes peaked in still water or in weak shears and decreased thereafter (Fig. 2 and Table S1). Weak shears (0.1–0.5 s −1 ) and slow flows [Pe of 1.5–7.5 Peclet number is a dimensionless ratio, reflecting flow speed (i.e., advection) relative to coefficient of molecular diffusion for l -tryptophan) resulted in elevated concentrations that decreased with increasing distance from an egg. The plumes thus expanded along the principal flow axis, relative to diffusion alone (i.e., still water Fig. 2B and Table S1). In contrast, strong shears (2.0–10.0 s −1 ) and fast flows (Pe of 30–151) rapidly reduced tryptophan concentrations below threshold in all but a very small region near the eggs (Fig. 2 E und g). Consequently, plume-maximizing shears were those most closely simulating flows in native spawning habitats (13).

Theoretical concentration distributions (nmol L −1 , in pseudocolor) of tryptophan surrounding red abalone eggs (black spheres) in still-water and in Taylor–Couette flows. Each plot is a 2D slice, cut through the center of an egg (EINg). White arrows denote flow velocity vectors (speeds and directions). Die x axis is parallel to the direction of flow and the ja axis is orthogonal to flow, but parallel to the direction of shear. Tryptophan plumes were produced through 3D numerical simulations that used a coupled convection-diffusion model, taking into account egg rotation rate at each shear, and assuming a constant and continuous tryptophan release over the entire egg surface for 4 min at 0.18 fmol egg −1 min −1 (SI Materials and Methods). Model parameters (flow speed and direction, fluid shear, attractant release rate and diffusion coefficient, egg diameter and rotational velocity, water temperature) accurately portrayed conditions in our current experiments on sperm behavior, gamete encounter rates, and fertilization success. (Scale bar, 200 μm.)

Effects of Chemical Communication and Fluid Shear on Sperm Behavior.

Results of Taylor–Couette flow experiments strongly supported the theoretical predictions, validating the physical model of tryptophan plume dynamics (Materialen und Methoden provides details on Taylor–Couette apparatus and experimental protocols). Sperm swam faster and navigated directly toward egg surfaces within the predicted plumes (Fig. 3 EIN und B und 4 EIN und C). In contrast, male gametes positioned outside of the plumes swam slower and did not orient significantly with respect to an egg (Figs. 3 EIN und C und 4 F und h). Shear exerted a strong modulatory effect on sperm behavior (Tables S2 and S3). Swim speed and orientation toward an egg peaked at the weakest shears tested (0.1–0.5 s −1 ) and then decreased as shear strengthened. At 2.0 to 10.0 s −1 , flow-generated torques increasingly overwhelmed sperm behavior (13). These higher shears prevented male gametes from swimming actively across streamlines. Sperm aligned parallel to streamlines and cells tumbled at frequencies predicted by theory for passively transported particles (13). Whereas weak shears promoted, strong shears inhibited sperm locomotory performance and suppressed the attractant plume of egg-derived chemical signals.

(EIN) Representative swimming paths of individual red abalone sperm surrounding conspecific eggs in FSW as a function of shear. For each experimental treatment, a dashed line denotes the predicted behavioral threshold concentration (3 × 10 −10 mol L −1 ). This line demarcates the theoretical active space (i.e., closer to egg) from inactive space (i.e., further from egg) of an attractant plume. Active space was defined as the portion of a plume maintaining tryptophan greater than the threshold level that caused faster sperm swimming and orientation with respect to a chemical gradient. Small circles are successive digital images of sperm heads captured at 0.033-s intervals, and each arrowhead denotes the direction of travel for an individual cell. Sperm displacement caused by flow was subtracted on a frame-by-frame basis, so each computer-generated path reflects the actual track swum. To eliminate selection bias, a random numbers generator was used in choosing representative paths for each flow treatment. Orientation rosettes show distributions of directional tracks by sperm populations positioned inside (B) oder draußen (C) the active spaces of hypothesized tryptophan plumes. Zum B und C, complete data sets, not representative paths, were used to establish distributions and in calculating mean unit vector lengths (R) and angular headings (θ) relative to a line between each sperm head and the center of an egg. Sperm moving directly toward an egg would follow a 0° heading. A Rayleigh test (z-value) was used to compare each mean direction against a uniform circular distribution, and to calculate the P Wert. Sperm orientation toward an egg was significant inside the predicted active space at 0, 0.1, 0.5, 1.0, and 2.0 s −1 (V test: du ≥ 2.65, n ≥ 26 P < 0.04, all comparisons).

Effects of fluid shear on direction of sperm swimming with respect to an egg (EIN und F) (as described in more detail in Fig. 3), direction of sperm swimming with respect to flow (B und g), sperm translational swim speed (C und h), sperm encounter rate with a theoretical, tryptophan active space surrounding an egg (D), and sperm–egg encounter rate (E). Male gametes were imaged while swimming either “inside” or “outside” the active spaces of theoretical tryptophan plumes. Complete data sets, not representative paths, were used to establish mean unit vector lengths (R) with respect to an origin in EIN, B, F, und g. Experiments were performed in the presence of FSW alone (solid line) or with addition of active or denatured tryptophanase (dotted or dashed lines, respectively). Each dependent variable was described as a function of log-shear, using least-squares regression to establish the best fit (F tests for FSW and denatured enzyme treatments: F ≥ 7.39, df ≥ 1, 116 P < 0.001, all comparisons). Symbols are mean values (±SEM), and error bars are smaller than symbol sizes in some cases.

Effects of Chemical Communication and Fluid Shear on Sperm–Egg Encounter Rate and Fertilization Success.

Straighter and faster paths need not indicate that chemically mediated behavior increases encounter rates, or ultimately enhances fertilization success. As a function of shear, magnitudes of sperm swim speed and orientation (relative to an egg surface), male–female gamete contact rates, and percentages of fertilized eggs, all were highly correlated (Pearson product–moment correlation, R 2 ≥ 0.73, df = 6 P < 0.05, all comparisons Figs. 4 and 5 and Tables S2–S5). Thus, fertilization success could be forecasted accurately from sperm swimming behavior alone.

Effects of fluid shear on fertilization success (i.e., percentage of fertilized eggs). Egg density was held constant (10 3 cells mL −1 ) and, in separate treatments, sperm density was tested at (EIN) 10 6 , (B) 10 5 , or (C) 10 4 cells mL −1 . Experiments were performed in the presence of FSW alone (solid line) or with addition of active or denatured tryptophanase (dotted or dashed lines, respectively). Fertilization success was described as a function of log-shear, using least-squares regression to establish the best fit (F tests: F ≥ 50.5, df ≥ 1, 58 P < 0.001, all comparisons). Symbols are mean values (±SEM), and error bars are smaller than symbols in some cases.

Similar trends emerged across all sperm treatments. The percentages of fertilized eggs peaked at 0.1 to 0.5 s −1 , and then decreased as shear increased. At sperm concentrations of 10 5 and 10 4 cells mL −1 , maximal percentages of fertilized eggs were approximately 1.5 times those measured in still water (Fig. 5 B und C). In contrast, the maximal value decreased (1.2 times) slightly at a higher sperm density (10 6 cells mL −1 ), as overall fertilization levels approached saturation (an asymptote of 100% eggs fertilized Fig. 5EIN). Compared with still water, fertilization success was elevated significantly at 0.1 to 0.5 s −1 , was approximately the same at 1.0 to 2.0 s −1 , and was depressed significantly at 4.0 to 10.0 s −1 (Fig. 5 and Table S5). Weak shears therefore promoted sperm chemoattraction as well as reproductive success.

As always, correlation does not imply causation. Whereas results showed a strong association between egg-derived attractant plumes and sperm behavioral performance, these experiments were not designed to show a cause-and-effect relationship. Consequently, we determined whether eliminating the chemical signal around eggs would prevent fertilization. Freshly spawned eggs and sperm were placed in Taylor–Couette chambers containing filtered seawater (FSW) as before, but now with addition of activated or denatured (i.e., boiled) tryptophanase (2 μg mL −1 ). This enzyme, when active, selectively digests free tryptophan in solution.

The addition of activated tryptophanase had profound consequences for sperm–egg interactions. First, the enzyme did not affect sperm membranes, receptors, or behaviors, or the proclivity of male or female gametes for fertilization (22). It did, however, extinguish the signal surrounding an egg, as evidenced by sperm inability to navigate within hypothesized plumes, even from a distance of 100 μm, or less (Fig. 6 and Tables S6 and S7). HPLC indicated no measurable accumulation of tryptophan in seawater, when both enzyme and eggs were present. Second, elimination of the tryptophan and sperm chemoattraction precipitated a significant decrease in gamete encounter rate and fertilization success (Figs. 4 and 5 and Tables S8 and S9). Conversely, there was no decay in sperm navigation (toward an egg) and swim speed, encounter rate, or fertilization with the denatured tryptophanase (Figs. 4 and 5, Fig. S2, and Tables S6–S9). Tryptophan release by eggs, therefore, was a causative agent and critical determinant of fertilization success.

Effects of fluid shear and tryptophanase on representative swimming paths of individual red abalone sperm (EIN) and on orientation distributions of directional tracks by sperm populations positioned inside (B) oder draußen (C) of theoretical tryptophan plumes surrounding eggs. All experimental procedures and analyses, except for enzyme addition, were the same as described for Fig. 3. A Rayleigh test (z-value) was used to compare each mean direction against a uniform circular distribution, and to calculate the P Wert. Sperm orientation toward an egg was not significant in still water and at each tested shear (V tests: du ≤ 1.38 P ≥ 0.39).

Sperm chemoattraction and fluid shear each had significant effects on fertilization dynamics. Which process plays the ascendant role? To answer this question, we performed a series of stepwise multiple regressions on the fertilization data. Taken as a whole, our experiments measured percentages of fertilized eggs over a wide range of shears (0–10 s −1 , from abalone spawning to open kelp forest habitats), sperm densities (10 4 –10 6 cells mL −1 , from sperm-limiting to sperm-saturating conditions), and in the presence of active or denatured tryptophanase. Shear—not chemoattraction—explained most (55–64%) of the variation in fertilization success at low sperm densities (10 4 and 10 5 sperm mL −1 Table S10). In contrast, at a high sperm density (10 6 mL −1 ), chemoattraction had a significantly greater impact (67% of variation in fertilization). Thus, shear dominated chemical communication only under limiting sperm conditions. Shear did not damage either sperm or eggs (13). Instead, acting to facilitate or inhibit, it modulated the strength of chemically mediated, gamete interactions.

Chemical Communication, Fluid Shear, and Evolution of Sexual Reproduction.

The evolution of gamete size and morphology is a major unsolved problem in reproductive biology. Under conditions in which reproductive success is chronically limited by sperm availability, adults and gametes are under selection for mechanisms that increase sperm–egg contact (25). One such mechanism could involve changes in the physical size of the egg, because enlarging the “target” increases the probability of sperm–egg collision (25 ⇓ –27). Models of evolution have focused, traditionally, on postzygotic consequences of egg size for larval or juvenile survivorship (28, 29). Another implication of the target size hypothesis, however, is that prezygotic benefits to fertilization could drive the evolution of egg size and, in turn, anisogamy (25).

To date, theoretical models of gamete size evolution have not considered effects of fluid motion on sperm–egg encounter probabilities. Because shear is a natural feature of nearly all reproductive habitats, it may exert strong selective pressure on gamete morphology. In fact, shear initiates egg rotation at an angular velocity directly proportional to gamete size (i.e., radius) (11, 13, 30). As a consequence of this rotation, fluid accelerates when it approaches an egg, compressing or closing streamlines and locally increasing shear stress near an egg surface. The likelihood of sperm “slipping” around an egg surface, rather than encountering it, increases significantly with rotation rate (13). Thus, a larger egg is not always a better target.

For red abalone, chemoattraction provides a cheap evolutionary alternative for increasing egg target size without enlarging cytoplasmic and/or cell volume. Egg cytoplasm is an expensive commodity. It contains a vast array of organic molecules and provides a rich biochemical environment for synthesizing natural products after fusion, as required in embryo development (31). In contrast, the free amino acid l -tryptophan is taken up by maternal abalone from a dietary source and incorporated directly in egg cytoplasm during oogenesis. Thus, signal production, as well as release (via diffusion), consumes little or no metabolic energy and expends less than 1% of total cytoplasmic tryptophan reserves (24). Whereas tryptophan acts as a sperm attractant, it also is a precursor for synthesizing many neurotransmitters and neuromodulators. As a metabolic substrate essential to the development of the larval nervous system, tryptophan could be an honest indicator of egg fitness for prospective sperm suitors (32). Furthermore, red abalone eggs stop releasing tryptophan as they age and become infertile (24). Our results, therefore, suggest that endogenous signaling pathways have been coopted for external communication, as an adaptation to increase the likelihood of reproductive success. Because egg signaling and sperm response are possibly tuned to meet specific fluid-dynamic constraints, shear may act as a critical selective pressure that drives gamete evolution and determines fitness.


Cell migration

Cell migration is a central process in the development and maintenance of multicellular organisms. Processes such as tissue formation during embryonic development, wound healing, and immune responses, all require the orchestrated movement of cells in particular directions to specific locations. Errors during this process have serious consequences, including intellectual disability, vascular disease, tumor formation and metastasis. An understanding of the mechanism by which cells migrate may lead to the development of novel therapeutic strategies for controlling, for example, invasive tumor cells.

Cells often migrate in response to specific external signals, including chemical signals and mechanical signals. Due to a highly viscous environment, cells need to permanently produce forces in order to move. Cells achieve active movement by very different mechanisms. Many less complex prokaryotic organisms (and sperm cells) use flagella or cilia to propel themselves. Eukaryotic cell migration typically is far more complex and can consist of combinations of different migration mechanisms. It generally involves drastic changes in cell shape which are driven by the cytoskeleton, for instance a series of contractions and expansions due to cytoplasmic displacement. Two very distinct migration scenarios are crawling motion (most commonly studied) and blebbing motility.

The migration of cultured cells attached to a surface is commonly studied using microscopy. As cell movement is very slow (only a few µm/minute), time-lapse microscopy videos are recorded of the migrating cells to speed up the movement. Such videos reveal that the leading cell front is very active with a characteristic behavior of successive contractions and expansions. It is generally accepted that the leading front is the main motor that pulls the cell forward.

Zellmigration: Phase images of BSC 1 cells migrating in a scratch assay in the absence of serum over a period of 15 hours.


The stochastic dance of circling sperm cells: sperm chemotaxis in the plane

Biological systems such as single cells must function in the presence of fluctuations. It has been shown in a two-dimensional experimental setup that sea urchin sperm cells move toward a source of chemoattractant along planar trochoidal swimming paths, i.e. drifting circles. In these experiments, a pronounced variability of the swimming paths is observed. We present a theoretical description of sperm chemotaxis in two dimensions which takes fluctuations into account. We derive a coarse-grained theory of stochastic sperm swimming paths in a concentration field of chemoattractant. Fluctuations enter as multiplicative noise in the equations for the sperm swimming path. We discuss the stochastic properties of sperm swimming and predict a concentration-dependence of the effective diffusion constant of sperm swimming which could be tested in experiments.

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GENERAL SCIENTIFIC SUMMARY Introduction and background. Sensing the environment and moving actively in it are fundamental aspects of life. In many species, sperm cells can sense chemical cues from the egg and as a response actively steer towards the egg. This phenomenon of sperm chemotaxis is commonly studied in a two-dimensional experimental setup. In the absence of chemoattractant, sperm cells swim along circular paths. In the presence of a chemoattractant concentration gradient, however, their swimming circles drift on average gradient-upwards. A pronounced variability of the swimming paths is usually observed.

Wichtigste Ergebnisse. We develop a theoretical description of sperm chemotaxis taking into account nonequilibrium fluctuations. We employ a stochastic differential geometric description of the noisy swimming paths. We make a prediction about the effective diffusion coefficient of sperm swimming circles which can be tested in experiments: in our theory, this diffusion coefficient depends on the chemoattractant concentration measuring this dependence should reveal properties of the chemotactic signaling network such as its sensitivity threshold.

Wider implications. We have studied a particular biological example of cell locomotion guided by cellular signaling sytems which have to cope with imperfect sensory inputs and signal processing and still navigate the cell in a robust way. Similiar demands apply not only to sperm cells, but to many active cellular processes guided by external signals and in particular the locomotion of many microorganisms.

Abbildung. Simulated sperm swimming path (green) in a concentration gradient of a chemoattractant (blue). The sperm cell is equipped with a cellular signaling system which elicits a noisy chemotactic swimming response. The resulting sperm swimming path can be described as a swimming circle whose center (red) moves stochastically with net drift gradient-upwards.

This article was amended on 19 December 2008 to include the email address for F Jülicher.


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