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1.6: DNA-Supercoiling und Topoisomerasen - Biologie

1.6: DNA-Supercoiling und Topoisomerasen - Biologie


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Das Abwickeln der Helix während der DNA-Replikation (durch die Wirkung der Helikase) führt zu Supercoiling der DNA vor der Replikationsgabel.

  • Dieses Supercoiling nimmt mit dem Fortschreiten der Replikationsgabel zu.
  • Wenn das Supercoiling nicht entlastet wird, verhindert es physikalisch die Bewegung der Helikase.

Die Topologie der DNA kann beschrieben werden durch drei Parameter:

  1. Verknüpfungsnummer (L) Ein ganzzahliger Wert. "Positiv" wird als Rechtshänder bezeichnet.
  2. Twist (T) Eine reelle Zahl (die "scheinbare" Verknüpfungsnummer)
  3. Writhe (W) Eine reelle Zahl ("Supercoils" in der DNA-Struktur)

Betrachten Sie geschlossene zirkuläre DNA:

  • Verknüpfungsnummer ist ein ganze Zahl Wert.
  • Es bezieht sich darauf, wie oft die beiden Stränge des Duplex eine vollständige 360-Grad-Drehung machen.

Für zirkulär geschlossene DNA, wie die E coli Genom, die Verknüpfungsnummer kann nur geändert werden, wenn wir Folgendes tun:

  1. die Duplex physisch brechen
  2. einführen (oder entfernen) a 360-Grad-Drehung
  3. ligieren (kovalent schließen) den Bruch.

Abbildung 1.6.1: Dreht sich um die Verknüpfungsnummer zu ändern

Experiment mit Gummischlauch "Helix"

Schneiden Sie zwei Längen von 1/8 "Gummischläuchen ab, die jeweils etwa 20" lang sind. Führen Sie ein kleineres Schlauchstück oder ein Stück Pipettenspitze in die Enden ein, damit die Enden verbunden werden können. Diese beiden Gummischlauchstücke repräsentieren jeden Strang eines DNA-Duplex. DNA kann ligiert oder verbunden werden, wenn wir 5' (Phosphat) und 3' (Hydroxyl) Enden haben. Wir brauchen also einen Weg, um zu verfolgen, welches Ende für jedes Rohrstück welches ist.

  1. Sie können entweder "5" und "3" an gegenüberliegenden Enden jedes Teils schreiben und sie in entgegengesetzte Richtungen ausrichten, oder
  2. Markieren Sie an einem Schlauchstück beide Enden mit einem Sharpie. Nur ähnlich gefärbte Enden können ligiert werden (siehe Abbildung oben)

Auf diese Weise können Sie die richtige "Ausrichtung" der Stränge beibehalten, wenn Sie die Stränge des Duplex "ligieren".

  • Geben Sie eine Linking-Nummer = +2 ein (zwei 360 ° Rechtshänder-Drehungen in den Duplex)
  • dann "ligieren" Sie die Enden (achten Sie darauf, dass Sie die Strangorientierung beibehalten, d.h. Sie verbinden die entsprechenden beiden Stränge).

Bestätigen Sie, dass die korrekte Verknüpfungsnummer eingeführt wurde, indem Sie den Duplex auf einer Seite "schmelzen" und alle Windungen in einen kleinen Bereich des Duplex erzwingen (auf diese Weise einfach zu zählen).

  • Bestätigen Sie, dass ein Blick in die Helix auf die Windungen erfolgt, die sie sind "Rechtshändig" (egal, in welche Richtung Sie die Helix hinunterschauen).

Beachten Sie, dass der "Duplex", wenn er zwischen Daumen und Zeigefinger gehalten und hängen darf, eine "supercoiled" Topologie im Gegensatz zu "entspannt" bevorzugt Topologie].

  • Bestätigen Sie, dass die "Superspulen" tatsächlich linkshändig wenn Sie auf die Superspulen hinabblicken (unabhängig von der Richtung auf den Superspulen).
  • Die "Supercoil" ist höchstwahrscheinlich volle 360° anstatt 180°. Halten Sie in jedem Fall die Enden des Duplex so, dass eine linkshändige 360° "Supercoil" vorhanden ist.
  • Zählen Sie nun, wie oft sich die Stränge des "Duplex" kreuzen. In dieser Konformation werden die Stränge des "Duplex" nicht tatsächlich kreuzen (Hinweis: Sie können eine Strangkreuzung haben und später wieder aufheben, um ein Nettoergebnis von keiner Kreuzung zu erhalten).

Als Reaktion auf die Einführung der +2 Verknüpfungszahl kann der "Duplex" also +2 (180°) "Superspulen" annehmen, so dass die resultierenden scheinbare Verknüpfungsnummer (d.h. "Twist"Wert) der beiden Stränge ist null

Notiz

Eine Superspule gilt als positiv, wenn sie "linkshändig" ist.

  • Entfernen einer "positiv"Superspule durch Abwickeln um 180°.
  • Halten Sie nun die Enden des "Duplex" fest und zählen Sie die scheinbare Verknüpfungsnummer (d.h. "Wendungen"). Es wird einen einzigen Rechtshänder geben."Twist".
  • Somit hat eine einzelne "positive" Superspule von 180º die Wirkung, eine einzelne "positive" Verdrillung zu entfernen (d. h. die scheinbare Verknüpfungszahl um 1 zu reduzieren).

Die Writhe Zahl bezieht sich auf die Anzahl der vorhandenen Superspulen.

  • Obwohl es den Anschein hat, dass die Konsequenz der Einführung Supercoiling (Writhe) ändert die Verknüpfungsnummer, es ist nicht.
  • Die Folge von Writhe ist, dass die Verdrehen (ersichtlich Verknüpfungsnummer) verändert (erhöht oder verringert).

DNA hat eine bevorzugte "Twist"-Wert (bevorzugte scheinbare Verknüpfungsnummer) für eine bestimmte Länge der DNA:

  • Watson und Cricks Modell des DNA-Duplex hatte 10 Basenpaare pro Runde.
  • Unter physiologischen Bedingungen von Salz (0,15 M NaCl) und Temperatur DNA nimmt bevorzugt etwa 10,6 bp/Umdrehung an.
  • Writhe wird in die DNA eingeführt, um diesen Wert für den "Twist" (scheinbare Verknüpfungsnummer) zu erreichen.

Bei einer gegebenen (festen) Bindungszahl über eine gegebene DNA-Länge kann die DNA entweder positive oder negative Supercoils annehmen, um einen "Twist" (scheinbare Bindungszahl) zu erreichen, so dass es 10,6 Basenpaare/Umdrehung gibt.

Gestängenummer ändert sich beim Supercoiling nicht (es kann sich nur ändern, indem man den Duplex unterbricht)

  • Writhe hat den Effekt, dass die scheinbare Verknüpfungsnummer geändert wird.
  • Eine Superspule ist so definiert, dass sie die scheinbare Verknüpfungszahl um +/- 1 ändern kann.

Der Twist-Wert (scheinbare Verknüpfungszahl) für eine gegebene DNA-Länge hängt mit der Anzahl der Basenpaare pro Umdrehung zusammen, die die DNA annehmen möchte:

Bindungszahl = (Größe der DNA in Basenpaaren)/(Basenpaare/Umdrehung) + Writhe

oder

Verknüpfungsnummer = Anzahl der Drehungen + Krümmung

dies wird normalerweise abgekürzt als

Verknüpfung = Twist + Writhe

L = T + W


Wenn wir zum Beispiel ein zirkulär geschlossenes DNA-Molekül mit einer Länge von 5300 Basenpaaren und einer bevorzugten Konformation von 10,6 Basenpaaren pro Umdrehung haben, kann es diese Konformation erreichen, ohne ein Supercoiling (d. h. Krümmung) einführen zu müssen?

Scheinbare Bindungszahl (Twist) = (5300 Basenpaare) / (10,6 Basenpaare/Umdrehung)

Scheinbare Verknüpfungszahl (Twist) = 500

Mit anderen Worten, um die gewünschte Konformation von 10,6 bp/Umdrehung in der Helix zu erreichen, sind auf der Länge von 5300 Basenpaaren genau 500 Windungen erforderlich.

Verknüpfungsnummer = 500 + Writhe

Wir können ganzzahlige Werte für die Verknüpfungsnummer haben, und wir können sicherlich 500 einführen, was überhaupt kein Writhe erfordern würde:

500 = 500 + 0

Was ist das DNA-Molekül war 5200 Basenpaare?

Scheinbare Verknüpfungszahl (Twist) = (5200 Basenpaare) / (10,6 Basenpaare/Umdrehung)

Scheinbare Verknüpfungszahl (Twist) = 490,6

Wir können entweder 490 oder 491 als Verknüpfungsnummer einführen, aber nicht 490.6. Was passiert, wenn das DNA-Molekül eine Verknüpfungszahl von 490 enthält?

Verknüpfungsnummer = Twist + Writhe

490 = 490,6 + Writhe

Writhe = -0,6

In diesem Fall nimmt die DNA eine negative 0,6-Superspirale an (etwa 108° einer rechtshändigen Superspirale), was die scheinbare Bindungszahl von 490 auf 490,6 erhöht (und 10,6 Basenpaare pro Umdrehung im Duplex erreicht).

Wie viele Basenpaare pro Umdrehung wären in der DNA, wenn die DNA für diese DNA-Länge mit einer Verknüpfungszahl von 490 keine Supercoil-Struktur annehmen könnte?

Verknüpfungsnummer = Twist + Writhe

490 = Drehung + 0

Drehung = 490 Drehungen

Twist = (5200 Basenpaare) / (bp/Turn) = 490 Umdrehungen

bp/Umdrehung = 5200 Basenpaare/490 Umdrehungen

bp/Umdrehung = 10,61

Es gibt etwas mehr als 10,6 Basenpaare pro Umdrehung in der DNA

Ein kleines zirkulär geschlossenes Genom

Das Genom des Simian Virus 40 (SV40) ist ein zirkuläres, geschlossenes, doppelsträngiges DNA-Genom. Für die Zwecke dieser Diskussion hat es 5300 Basen. Wir erwarten, dass die DNA unter physiologischen Bedingungen 10,6 Basenpaare pro Umdrehung aufweist (d. h. ein Twist = 10,6 bp/Turn). In diesem Fall ohne Writhe wäre die Verknüpfungsnummer:

Verknüpfungszahl = 5300 bp/(10,6 bp/Umdrehung) + 0

Verknüpfungszahl = 500 Umdrehungen

d.h. wir würden 500 360° Drehungen der DNA-Stränge über die Länge des zirkulären Genoms erwarten.

  • Diese Form (mit 10,6 Basenpaaren pro Runde) ohne Writhe repräsentiert den "Standard", oder unverzerrt, DNA-Helix.
  • Dies wird auch als bekannt "entspannt" Form von DNA, und der Duplex könnte physikalisch angelegt werden eben auf einer Oberfläche, weil sie kein Writhe benötigt, um den bevorzugten Wert von 10,6 Basenpaaren pro Drehung zu erreichen:

Abbildung 1.6.2: Standard-DNA-Helix

Wenn jedoch die Replikation von SV40 anfänglich abgeschlossen ist, wird beobachtet, dass in der DNA eine offene Duplexregion verbleibt:

Abbildung 1.6.3: DNA mit offener Region

Das Ergebnis ist, dass es ungefähr 475 Windungen der Helix innerhalb der Duplex-DNA gibt (d. h. die Verknüpfungszahl = 475).

  • Die DNA soll sein unterschwellig.
  • Eine offene Fläche ist energetisch ungünstig.
  • Das kovalent geschlossene Molekül kann nicht Passen Sie dies an, indem Sie die Verknüpfungszahl erhöhen. Das heißt, es kann nicht spontan brechen Sie einen oder beide Stränge des Duplexes, führen Sie weitere 25 Windungen in den Duplex ein (erhöhen Sie die Verknüpfungszahl um 25) und ligieren Sie den Duplex erneut.

Die DNA hat drei Auswahl:

  1. Es kann die Anzahl der anpassen Basenpaare pro Runde im gesamten Molekül von gewünschten 10,6 bp/Umdrehung bis 11,2 bp/Umdrehung (d. h. 5300 bp/475 Umdrehungen). (HINWEIS: ein Zunahme in der Anzahl der Basenpaare pro Runde wird verringern der Twist-Wert; unterschwellig DNA hat eine größere Anzahl von Basenpaaren pro Runde).
  2. Die DNA kann sich zu einer "Supercoil"-Topologie zusammenrollen und den gewünschten Twist-Wert (10,6) mit der gegebenen Verknüpfungszahl (475 in diesem Fall) beibehalten.
  3. Der Duplex kann für den größten Teil der Struktur mit einem Twist von 10,6 bp/Turn existieren und dann haben eine Region ohne Twist (nicht unbedingt ein geschmolzener Duplex). Dies ist aufgrund der erforderlichen Geometrie der Bindungswinkel ziemlich ungünstig.

Somit werden für das 5300 bp SV40 Genom mit einer Linking Number von 475, um einen Wert von 10,6 bp/Twist aufrechtzuerhalten, insgesamt 25 negative Supercoils (Writhe=25) benötigt:

475 = (5300/10,6) + Writhe

-25 = Sich winden

  • Das heißt, 25 negative Superspulen (fünfundzwanzig 180° Drehungen des DNA-Duplex, Rechtshändig wenn Sie auf das Supercoiling hinunterblicken).

Topoisomerasen

Die Enzyme, die die DNA-Topologie kontrollieren, sind entscheidend für die DNA-Replikation und -Transkription.

  • Wenn sich die Replikationsgabel öffnet, wird der Bereich des Duplex vor der Gabelung überdreht - d.h. es hat weniger Basenpaare pro Runde.
  • Die Verknüpfungsnummer hat sich nicht geändert, aber die Länge der DNA, die alle Windungen enthält, ist effektiv kürzer.
  • Um 10,6 bp/Turn in dieser Region zu halten, die DNA nimmt positive Supercoils an.

Zum Beispiel kann während der frühen Stadien der SV40-Replikation der Duplex um den Replikationsursprung anfangs eine Region von 750 Basen schmelzen (öffnen). Da die Verknüpfungsnummer (500) unverändert ist, wird sie effektiv nur verteilt auf:

5300 - 750 = 4550 Basen.

Angenommen, es wurde kein Supercoiling eingeführt:

500 = 4550 Basenpaare / (X Basenpaare/Twist) + 0

= 9,1 Basenpaare/Twist

Wenn also kein Supercoiling eingeführt wird, die DNA muss eine Konformation von 9,01 Basenpaaren/Helixdrehung innerhalb der Region vor der Replikationsgabel annehmen.

  • Dies ist energetisch ungünstig, und eine Option für die DNA besteht darin, a supercoiled Konfiguration um 10,6 bp/Twist zu erreichen:

500 = (4550/10,6) + Writhe

70.8 = Krümmen

  • Somit führt die Bewegung der wachsenden Gabel dazu, dass die DNA positive Supercoils annimmt.
  • In diesem Fall hat die DNA 70,8 linkshändige Supercoils (jeweils 180°) angenommen.
  • Twist (=basepairs * [twist/basepair]) und Writhe sind beides Real Zahlen.

Typ I Topoisomerase

  • Topoisomerasen vom Typ I schneiden einen DNA-Strang (d. h. er "schneidet" den DNA-Duplex).
  • Das 5'-Phosphat des eingeschnittenen Strangs ist kovalent an ein Tyrosin im Protein gebunden.
  • Das 3'-Ende der Kerbe geht dann einmal durch den Duplex.
  • Der Nick wird dann wieder versiegelt und die Verknüpfungsnummer um den Wert +1 geändert.
  • Dies kann daher zur Entfernung von eine einzelne negative Superspule.

In E coli, Typ-I-Topoisomerase kann nur negativ supercoiled DNA entlasten (negatives Supercoiling ist das Endergebnis des neu replizierten DNA-Genoms). Bei Eukaryoten kann die Typ-I-Topoisomerase auch positiv supercoiled DNA entlasten.

Die Nettoergebnis von E coli topoI kann wie folgt dargestellt werden:

Abbildung 1.6.4: E. Coli Topoisomerase I

Typ II Topoisomerasen

  • Topoisomerasen vom Typ II spalten tatsächlich die Duplex-DNA, indem sie die Bindungsnummer ändern.
  • Topoisomerasen vom Typ II können eine einzelne positive Superspule in eine negative Superspule umwandeln.
  • Somit wird die Verknüpfungszahl in einem einzigen Schritt um zwei (-2) reduziert.
  • Topoisomerasen vom Typ II sind sowohl an der Dekatenation von Tochterchromosomen als auch an der Dekatenation beteiligt Entlastung des positiven Supercoilings vor der Replikationsgabel.
  • E coli DNA gyrase ist ein Beispiel für eine Topoisomerase vom Typ II.

Abbildung 1.6.5: Typ II Isomerase-Aktivität


DNA-Supercoiling, Topoisomerasen und Cohesin: Partner bei der Regulierung der Chromatinarchitektur?

Obwohl sich unser Wissen über die Chromatinorganisation in den letzten Jahren erheblich weiterentwickelt hat, ist vieles über die Beziehungen zwischen verschiedenen Merkmalen der Genomarchitektur noch unbekannt. Es wird angenommen, dass die Faltung von Säugetiergenomen in räumliche Domänen von Architekturproteinen, anderen DNA-bindenden Proteinen und verschiedenen Formen von RNA abhängt. Darüber hinaus weisen neue Erkenntnisse auf die Möglichkeit hin, dass die dreidimensionale Organisation des Genoms durch die DNA-Topologie kontrolliert wird. In diesem Szenario werden Kohäsin, CCCTC-bindender Faktor (CTCF), Transkription, DNA-Supercoiling und Topoisomerasen integriert, um verschiedene Schichten der Genomorganisation zu bestimmen, und der Beitrag aller vier zur Genkontrolle ist eine wichtige Richtung zukünftiger Studien. Aus dieser Perspektive betrachten wir aktuelle Studien, die neue Erkenntnisse darüber geben, wie DNA-Supercoiling die Chromatinstruktur prägt.

Schlüsselwörter: CTCF DNA Topologie Cohesin Genom Organisation Topoisomerase Transkription.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Figuren

Chromatin-Konformationserfassung im gesamten Genom (Hi-C)…

Whole-genome Chromatin Conformation Capture (Hi-C) erkennt chromosomale Umlagerungen. Überblick über die Hi-C-Methode.…

Das 3D-Genom und die Faktoren…

Das 3D-Genom und Faktoren, die zu seiner Organisation beitragen. ( EIN ) In…

Supercoiling trägt zur Schleifenbildung bei.…

Supercoiling trägt zur Schleifenbildung bei. ( EIN ) Supercoiled DNA faltet sich zu plektonem…


Topo2008: DNA-Topoisomerasen in Biologie und Medizin

Die DNA-Topoisomerasen sind eine Gruppe faszinierender Enzyme, die ein wichtiges, aber gefährliches Spiel mit der DNA spielen. Sie brechen und verbinden entweder einen oder beide Stränge der Doppelhelix, um die Probleme der Verwicklung und Verknüpfung zu lösen, die als Folge von DNA-Manipulationen (Replikation, Transkription und Rekombination) in allen Zellen auftreten. Dieses grundlegende Problem mit der DNA-Struktur wurde von Watson und Crick fast schon bei der Beschreibung der Doppelhelix erkannt (1). Da die elterlichen DNA-Stränge an einer Replikationsgabel getrennt werden, werden die doppelhelikalen Windungen komprimiert und vor der Gabelung überwunden. Die resultierende Torsionsspannung verhindert eine weitere Replikation, wenn sie nicht entlastet wird. Diese Überwindung entspricht einem positiven Supercoiling. Alternativ führt jede Drehung der Replikationsgabel zu einer Verwindung der replizierten Regionen, was letztendlich zu einer Verknüpfung (Verkettung) der Tochterchromosomen führt, die entfernt werden müssen, wenn eine Aufteilung erfolgen soll, ohne die DNA zu brechen (2). Die Transkription kann auch zur Bildung von sowohl positivem als auch negativem Supercoiling führen (3), und andere Prozesse, insbesondere Rekombination, können zur Verknotung von DNA-Strängen führen. Diese Komplexitäten der doppelhelikalen DNA werden unter der Bezeichnung DNA-Topologie zusammengefasst (4). Die topologischen Probleme der DNA-Helix müssen sehr früh in der Evolution aufgetreten sein, sobald DNA-Genome lang genug wurden, dass eine einfache Rotation des gesamten Moleküls zur Beseitigung des Supercoilings undurchführbar wurde.

Die einzige praktikable Lösung für diese Schwierigkeiten besteht darin, die DNA durch Aufbrechen eines oder beider Stränge aufzudrehen, zu entkoppeln und zu entknoten, indem man Stränge durcheinander passieren lässt oder an der Bruchstelle eine Rotation erlaubt. Diese Strategien werden von den verschiedenen Klassen von Topoisomerase-Enzymen übernommen, die in den 1970er Jahren entdeckt wurden. Die Typ-I-Enzyme brechen und verbinden einen Strang der Helix und lassen entweder Einzelstränge durcheinander hindurch (Typ IA) oder lassen ein gebrochenes Ende um den intakten Strang rotieren (Typ IB). Enzyme vom Typ I können Supercoiling von DNA entfernen. Im Gegensatz dazu passieren Topoisomerasen vom Typ II in einer ATP-abhängigen Reaktion ein doppelhelikales Segment durch einen doppelsträngigen Bruch in einem anderen und können so verknüpfte Chromosomen lösen (dekatenieren) und Knoten entfernen. Eine Untergruppe dieser Enzyme, DNA-Gyrasen, kann ein negatives Supercoiling (Abwickeln) in die DNA einführen. Die meisten Zelltypen exprimieren eine Reihe von Topoisomerase-Enzymen, um die Topologie ihrer DNA zu regulieren.

Diese Manipulationen der DNA-Helix haben jedoch ihren Preis. Die gebrochenen DNA-Stränge müssen effizient wieder zusammengefügt werden, um schwerwiegende Folgen für die Zelle zu vermeiden. Die Entführung von Topoisomerase-Mechanismen, um stabile Einzelstrang- und insbesondere Doppelstrangbrüche zu erzeugen, ist ein Merkmal einer Vielzahl von natürlichen und synthetischen Chemotherapeutika, was die Topoisomerase-Enzyme zu wichtigen Wirkstoffzielen macht (5,6).

In den 1990er Jahren fanden in New York und Amsterdam regelmäßige Treffen zu DNA-Topoisomerasen statt. In den letzten Jahren sind diese Treffen jedoch hinfällig geworden, und es fehlte uns an einem regelmäßigen Forum, um Fragen im Zusammenhang mit DNA-Topologie und Topoisomerasen zu diskutieren. Glücklicherweise organisierten Nynke Dekker, Paola Arimondo und Mary-Ann Bjornsti 2007 ein ausgezeichnetes Topoisomerase-Treffen in Fréjus, Frankreich. Dadurch wurde die Dynamik für ähnliche Treffen in der Zukunft wiederhergestellt, einschließlich der Topo2008, die letztes Jahr in Norwich stattfand, VEREINIGTES KÖNIGREICH. Auf diesem Gebiet, das nach wie vor ein faszinierendes und dynamisches Forschungsgebiet ist, werden enorme Fortschritte erzielt. Die Themen des Treffens reichten von Diskussionen über die Feinheiten des DNA-Knotens bis hin zur Übertragung grundlegender Arbeiten zu Topoisomerasen in die Wirkstoffforschung.

Diese Ausgabe von NAR enthält eine spezielle Sammlung von Übersichten und Zusammenfassungen, die das Gebiet der DNA-Topologie und der DNA-Topoisomerasen abdecken und den Inhalt des Norwich-Meetings widerspiegeln. Zechiedrich und Kollegen diskutieren, wie eine Fehlregulation der Topologie zu zellulären Dysfunktionen führen kann und überlegen, wie Zellen solche topologischen Probleme verhindern können (7). Die Kontrolle des Supercoilings in Bakterienzellen wurde ausführlich untersucht Dorman und Corcoran diskutieren solche Studien und die Auswirkungen des Supercoilings auf bakterielle Virulenz und Infektionskrankheiten (8). Gadelle und Forterre überprüfen die Ursprünge und Phylogenien dieser Enzyme und schlagen vor, dass sie aus einer angestammten Virosphäre stammen (9).

Mondragón und Kollegen überprüfen strukturelle Arbeiten an Typ-I-Enzymen, die zu einem tieferen Verständnis ihrer Reaktionsmechanismen geführt haben (10). Ein Schlüsselmerkmal vieler Enzyme vom Typ I und Typ II besteht darin, dass sie in ihren Reaktionsmechanismen Mg 2+ -Ionen benötigen. Sissi und Palumbo diskutieren die Rolle von Mg 2+ -Ionen in der Struktur und Funktion der Topoisomerase, insbesondere einen vorgeschlagenen Zwei-Metall-Ionen-Mechanismus für die DNA-Spaltung (11). Die DNA-Spaltung in Typ-II-Enzymen erfolgt in einer Region des Enzyms, die als 𠆍NA-Gate’ und Collins bekannt ist et al. beschreiben die Verwendung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energietransferexperimenten, um die Dynamik des DNA-Gates von Typ-II-Topoisomerasen zu untersuchen (12). Der Doppelstrangbruchmechanismus für Typ-II-Enzyme hat wichtige Auswirkungen auf die Rolle der Topoisomerase II in eukaryotischen Zellen, und Roca diskutiert die Auswirkungen dieses Mechanismus im Zusammenhang mit der eukaryotischen Chromatinstruktur (13).

Bakterielle Topoisomerase I ist ein potenzielles, wenn auch derzeit ungenutztes Ziel für antibakterielle Wirkstoffe Tse-Dinh diskutiert das Screening nach neuen Wirkstoffen, die auf dieses Enzym abzielen (14). Deweese und Osheroff untersuchen die DNA-Bruch-Reunion-Reaktion von Typ-II-Enzymen und wie Verbindungen, die den Topoisomerase-II-Spaltungskomplex stabilisieren, als zytotoxische Mittel wirken und als Antikrebsmedikamente verwendet werden können (15).

Diese Übersichtssammlung veranschaulicht die Breite der Forschungsarbeiten im Bereich DNA-Topologie/Topoisomerase und beleuchtet einige der noch offenen Fragen. Wir möchten uns bei den Autoren bedanken, die sowohl an der Tagung (Topo2008) teilgenommen als auch zu dieser hervorragenden Rezensionsreihe beigetragen haben, die hoffentlich weitere Begeisterung für dieses Gebiet wecken wird. Wir gehen davon aus, dass das nächste Treffen dieser Reihe 2010 in den USA stattfinden wird.


DNA-Supercoiling, Topoisomerasen und Cohesin: Partner bei der Regulierung der Chromatinarchitektur?

Obwohl sich unser Wissen über die Chromatinorganisation in den letzten Jahren erheblich weiterentwickelt hat, ist vieles über die Beziehungen zwischen verschiedenen Merkmalen der Genomarchitektur noch unbekannt. Es wird angenommen, dass die Faltung von Säugetiergenomen in räumliche Domänen von Architekturproteinen, anderen DNA-bindenden Proteinen und verschiedenen Formen von RNA abhängt. Darüber hinaus weisen neue Erkenntnisse auf die Möglichkeit hin, dass die dreidimensionale Organisation des Genoms durch die DNA-Topologie kontrolliert wird. In diesem Szenario werden Kohäsin, CCCTC-bindender Faktor (CTCF), Transkription, DNA-Supercoiling und Topoisomerasen integriert, um verschiedene Schichten der Genomorganisation zu bestimmen, und der Beitrag aller vier zur Genkontrolle ist eine wichtige Richtung zukünftiger Studien. Aus dieser Perspektive betrachten wir aktuelle Studien, die neue Erkenntnisse darüber geben, wie DNA-Supercoiling die Chromatinstruktur prägt.

Schlüsselwörter: CTCF DNA Topologie Cohesin Genom Organisation Topoisomerase Transkription.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

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Inhalt

In den 1970er Jahren entdeckte James C. Wang als erster eine Topoisomerase, als er E coli Topoisomerase I. Topo EC-Codes sind wie folgt: ATP-unabhängig (Typ I), EC 5.6.2.1 ATP-abhängig (Typ II): EC 5.6.2.2.

Die Gesamtfunktion der DNA-Topoisomerase besteht darin, den topologischen Zustand der DNA in der Zelle zu steuern. Es gibt zwei Typen oder Familien dieser Enzymfamilie vom Typ I und vom Typ II. Die Typ-I-Familie führt einen DNA-Strang durch einen Bruch im gegenüberliegenden Strang. Mit anderen Worten, das DNA-Topoisomerase-Typ-I-Enzym spaltet nur einen DNA-Strang. Die Typ-II-Familie führt eine Duplexregion (zwei Stränge) von demselben Molekül oder einem anderen Molekül durch eine doppelsträngige Lücke. Zusammenfassend spaltet Typ II beide DNA-Stränge, was zu einem Doppelstrangbruch führt. Topoisomerasen können entweder negative Supercoils, sowohl positive als auch negative Supercoils, lindern oder positives und negatives Supercoiling in der DNA induzieren. Die Enzyme können auch die Verkettung (wenn zwei einzelne zirkuläre DNA-Stränge nach der Replikation miteinander verbunden werden) und die Dekatenation (die Trennung von zwei verbundenen, geschlossenen, zirkulären Chromosomen) fördern und können auch die Verschränkung von linearen Chromosomen lösen. [2]

Die doppelhelikale Konfiguration von DNA-Strängen erschwert ihre Trennung, was von Helikaseenzymen benötigt wird, wenn andere Enzyme die Sequenzen, die Proteine ​​kodieren, transkribieren oder wenn Chromosomen repliziert werden sollen. Bei zirkulärer DNA, bei der doppelhelikale DNA umgebogen und kreisförmig verbunden ist, sind die beiden Stränge topologisch verknüpft oder verknotet. Ansonsten sind identische DNA-Schleifen mit unterschiedlicher Anzahl von Drehungen Topoisomere und können nicht ohne das Brechen von DNA-Strängen ineinander umgewandelt werden. Topoisomerasen katalysieren und steuern das Entknoten oder Entkoppeln von DNA [3], indem sie vorübergehende Brüche in der DNA unter Verwendung eines konservierten Tyrosins als katalytischen Rest erzeugen. [1]

Die Insertion von (viraler) DNA in Chromosomen und andere Formen der Rekombination können auch die Wirkung von Topoisomerasen erfordern.

Topologisch verknüpfte zirkuläre Moleküle, auch Catenane genannt, nehmen während des Replikationsprozesses zirkulärer Plasmide eine positive Supercoiled-Form an. Die Trennung von Catenanen wird von Topoisomerasen vom Typ IIA durchgeführt, von denen kürzlich festgestellt wurde, dass sie positiver supergeknäulter DNA effizienter entkoppeln. Experimente haben gezeigt, dass positive superspiralisierte DNA im ersten gebundenen DNA-Segment eine scharfe DNA-Krümmung bereitstellt, die es der Topoisomerase ermöglicht, erfolgreich zu binden und daher ihre enzymatische Reaktion mit dem folgenden Segment in einer spezifischen Innen-Außen-Struktur fortzusetzen. Auf der anderen Seite bietet negative Supercoiled-DNA keine solche Biegung und der Zugang des Enzyms zum ersten Segment ist nahezu unmöglich, wodurch die Aufhebung der Verknüpfung verhindert wird. [4]

Topoisomerase kommt auch in den Mitochondrien von Zellen vor. [5] Die Mitochondrien erzeugen ATP und spielen eine Rolle beim programmierten Zelltod und Alterung. [6] Die mitochondriale DNA tierischer Zellen ist eine zirkuläre, doppelsträngige DNA, die zur Replikation der Aktivität der Topoisomerase benötigt. Die in den Mitochondrien gefundenen Topoisomeraseklassen sind I, IIβ, IIIα. [5]

Hefe Bearbeiten

Hefezellen verwenden bekanntlich drei Topoisomerasen: Topoisomerase I, aus der IB-Unterfamilie, wird für das Wachstum benötigt. Es verleiht der Replikationsgabel die Fähigkeit, sich vorwärts zu bewegen, und entfernt positive und negative Supercoils, die mit der Transkription verbunden sind. Topoisomerase II aus der IIA-Unterfamilie wird für die Dekatenierung verbundener Chromosomen und die Vorbereitung für die Segregation während der Mitose benötigt. Topoisomerase II kann keine negativen Supercoils induzieren, kann aber sowohl positive als auch negative Supercoils wie Topoisomerase I relaxieren und kann Topoisomerase I ersetzen, wenn sie fehlt. Zum Zellwachstum wird Topoisomerase III aus der IA-Familie verwendet. Ohne Topoisomerase III können die Rekombinationsraten bei Mitose und Meiose ansteigen, was das Wachstum der Zellen verlangsamt. In S. pombe Zellen, III wird verwendet, um die Zellteilung aufrechtzuerhalten.

Höhere Eukaryoten Bearbeiten

Höhere eukaryotische Organismen sind komplexere Organismen und erfordern typischerweise eine komplexere zelluläre Maschinerie. Diese Organismen haben im Allgemeinen eine Topoisomerase I, zwei Typ-IIA-Topoisomerasen und zwei Typ-III-Enzyme. Topoisomerase I hilft bei der Bewegung der Replikationsgabel und entspannt Supercoils, die mit der Transkription verbunden sind. Es wird auch zum Entspannen von Magnetspulen verwendet, die sich bilden, wenn Chromosomen in Vorbereitung auf die Mitose kondensieren. Die beiden Topoisomerasen vom Typ IIA, IIα und IIβ, werden verwendet, um ineinander verflochtene Tochterduplexe zu entkoppeln sowie die Zellteilung bzw. die Unterdrückung der Rekombination zu unterstützen. Es wird angenommen, dass Typ IIIα und IIIβ in der Embryogenese wirken und mit Helikasen interagieren.

Eubakterien Bearbeiten

E coli enthält vier DNA-Topoisomerasen: zwei Enzyme vom Typ IA (I und III) und zwei Enzyme vom Typ IIA (DNA-Gyrase und Topoisomerase IV). DNA-Topoisomerase III und IV haben ähnliche Funktionen. Topoisomerase III ist nicht in der Lage, positive Supercoils zu relaxieren, aber sie unterstützt die Bewegung der Replikationsgabel auf Plasmid-DNA in vitro. Es kann die Wicklung, die sich hinter der Replikationsgabel abspielt, dekatenieren, indem es sich auf Kerben in der DNA konzentriert. Topoisomerase IV ist das wirksamste dekatenierende Enzym in E coli. Es entspannt auch negative Superspulen. DNA-Gyrase nutzt die Hydrolyse von ATP, um negatives Supercoiling in bakteriellen Chromosomen zu erzeugen. Es entspannt positive Supercoils vor der Replikationsgabel und wirkt bei der Chromosomenkondensation. Schließlich hilft Topoisomerase I, zusammen mit Topoisomerase IV und DNA-Gyrase, etwas negatives Supercoiling zu erzeugen.

Archaeen Bearbeiten

Es gibt nur begrenzte Kenntnisse über die archaealen Genomsequenzen. Daher ist auch das Wissen über die Topoisomerase-Enzyme begrenzt. Sie enthalten eine reverse Gyrase, eine Topoisomerase vom Typ IA und eine Topoisomerase VI. Die Funktionen der Topoisomerasen in Archaeen sind vergleichbar mit den Enzymen in Eubakterien. Der einzige bemerkenswerte Unterschied besteht darin, dass die Topoisomerase VI in Archaeen für die Dekadenierung von DNA-Replikationszwischenprodukten verantwortlich ist und sowohl positive als auch negative Supercoils relaxiert.

Bakteriophage Bearbeiten

Die Bakteriophage (Phagen) T4-Gyrase (Typ II Topoismerase) ist ein Multisubunit-Protein bestehend aus den Produkten der Gene 39, 52 und wahrscheinlich 60. Es katalysiert die Relaxation von negativ oder positiv superhelikaler DNA und wird bei der Phagen-DNA-Replikation während der Infektion des E coli bakterieller Wirt. Da der Gastgeber E coli DNA-Gyrase kann den Verlust der Phagen-T4-Genprodukte teilweise kompensieren, Mutanten, die entweder in den Genen 39, 52 oder 60 defekt sind, heben die Phagen-DNA-Replikation nicht vollständig auf, sondern verzögern vielmehr ihre Initiation. [7] Mutanten, die in den Genen 39, 52 oder 60 defekt sind, zeigen eine erhöhte genetische Rekombination sowie eine erhöhte Basensubstitution und Deletionsmutation, was darauf hindeutet, dass die vom Wirt kompensierte DNA-Synthese weniger genau ist als die durch Wildtyp-Phagen gerichtete. [8] Mutanten mit Defekten in den Genen 39, 52 und 60 haben auch eine reduzierte Fähigkeit zur Multiplizitätsreaktivierung, einer Form der rekombinatorischen Reparatur, die verschiedene Arten von DNA-Schäden behandeln kann. [9]

DNA-Topologie ist die tertiäre Konformation der DNA, wie Supercoiling, Knotting und Catenation. Die Topologie der DNA kann durch die meisten Stoffwechselprozesse gestört werden: RNA-Polymerase kann positive Supercoils verursachen, indem sie die DNA vor dem Enzym überwindet, und kann auch negative Supercoils verursachen, indem sie die DNA hinter dem Enzym unterwindet. DNA-Polymerase hat den gleichen Effekt bei der DNA-Replikation. Positives und negatives Supercoiling gleichen die gesamte globale Topologie der DNA aus, sodass die Topologie insgesamt gleich bleibt. Wenn sich die DNA-Replikations- oder Transkriptionsgabel jedoch vorwärts bewegt und das positive Supercoiling zunimmt, wickeln sich die DNA-Stränge immer enger umeinander, was es für die Polymerase schwieriger macht, sich vorwärts zu bewegen. Wichtig ist, dass die lokale Topologie der DNA vor und hinter der Polymerase entlastet wird, damit Replikation und Zellteilung ablaufen können. Dafür werden DNA-Topoisomerasen verwendet. [10]

Topologische Probleme Bearbeiten

Es gibt drei Haupttypen von Topologien:

Außerhalb der wesentlichen Prozesse der Replikation oder Transkription muss die DNA so kompakt wie möglich gehalten werden, und diese drei Zustände helfen dabei. Wenn jedoch eine Transkription oder Replikation stattfindet, muss die DNA frei sein, und diese Zustände behindern die Prozesse ernsthaft. Außerdem werden während der Replikation der neu replizierte DNA-Duplex und der ursprüngliche DNA-Duplex miteinander verflochten und müssen vollständig getrennt werden, um die genomische Integrität bei der Zellteilung sicherzustellen. Wenn eine Transkriptionsblase fortschreitet, wird die DNA vor der Transkriptionsgabel überwunden oder positiv superspiralisiert, während die DNA hinter der Transkriptionsblase unterwunden oder negativ superspiralisiert wird. Während der Replikation wird die DNA vor der Replikationsblase positiv supercoiled, während die DNA hinter der Replikationsgabel verschränkt wird und Präcatenane bildet. Eines der wichtigsten topologischen Probleme tritt ganz am Ende der Replikation auf, wenn die Tochterchromosomen vollständig entwirrt werden müssen, bevor die Mitose auftritt. Topoisomerase IIA spielt eine wesentliche Rolle bei der Lösung dieser topologischen Probleme.

Viele Medikamente wirken durch Interferenz mit den Topoisomerasen [11] Die Breitspektrum-Fluorchinolon-Antibiotika wirken, indem sie die Funktion der bakteriellen Typ-II-Topoisomerasen stören. Diese niedermolekularen Inhibitoren wirken als effiziente antibakterielle Mittel, indem sie die natürliche Fähigkeit der Topoisomerase, Brüche in der chromosomalen DNA zu erzeugen, missbrauchen.

Einige Chemotherapeutika, die Topoisomerase-Hemmer genannt werden, wirken, indem sie die eukaryontischen Topoisomerasen vom Säugetiertyp in Krebszellen stören. Dadurch werden DNA-Brüche induziert, die letztendlich zum programmierten Zelltod (Apoptose) führen. Dieser DNA-schädigende Effekt kann, abgesehen von seinen potentiell heilenden Eigenschaften, zu sekundären Neoplasien beim Patienten führen. [ Zitat benötigt ]

Topoisomerase I ist das Antigen, das von Anti-Scl-70-Antikörpern bei Sklerodermie erkannt wird.

Topoisomerases can fix these topological problems and are separated into two types depending on the number of strands cut in one round of action: [12] Both these classes of enzyme utilize a conserved tyrosine. However these enzymes are structurally and mechanistically different. For a video of this process click here.


Mechanism of action:

Topoisomerase cleaves and ligates DNA in a single reaction and without the use of any energy. But for completion of any biological reaction, energy must require. Than how topoisomerase performs this function without any energy?

Here topoisomerases perform covalent intermediate interaction mechanisms. Topoisomerase interacts as an intermediate between two ends of the broken DNA strand. When a DNA molecule is broken, the phosphodiester bond between the DNA molecule is also broken.

The tyrosine residue of activated topoisomerase attacks directly the phosphodiester bonds of broken DNA. The tyrosine is now bound with the phosphate of the broken DNA strand at -5′ end. The other -3’OH end remains free and held by the topoisomerase domain.

The interaction between tyrosine of active topoisomerase and phosphate of DNA is weak covalent and it conserves energy for rejoining strands. Another strand (in case of topoisomerase I) or another double helix (in case of topoisomerase II) passed through the broken end. Here the free -OH group destroys the weak intermediate covalent bond between phosphate and tyrosine (of topoisomerase) and rejoined with phosphate by a phosphodiester bond.

Topoisomerase is released from the site of action and moves to another site for performing another reaction. Importantly, an energy molecule is not utilized by any topoisomerase. Then what happens with ATP molecule which is consumed by topoisomerase-II? The energy of ATP hydrolysis is used to promote conformational changes in the topoisomerase-DNA complex, not for cleaving and ligating.

Enzyme open bridge

Conformational changes in the shape of the enzyme are very important for relaxing DNA molecules. here the energy from ATP hydrolysis (in the case of topo II) is utilized to perform this function.

In the first step, the enzyme recognizes the DNA molecule as a substrate and binds to it. More specifically, its affinity is higher in the case of supercoiled DNA.

Now in the second step, tyrosine dependent activity leads to create a gap between a DNA strand and covalently binds to phosphate. Here the enzyme opens both the end by making the conformational change in its shape and creates a bridge for another strand to pass through it.

In the next step, the intact DNA strand is passed through it and one special domain of topoisomerase held DNA strand until the bridge is closed and broken DNA stand is joined.

Image credit: “Molecular biology of the gene”, 7th edition by Watson. The image represents different steps of topoisomerase activity and conformational changes in the enzyme.

At last one final time, the enzyme opens up and releases the active site and move to another site. The mechanism is similar in both types of topoisomerase. But topoisomerase-I passes a single strand and topoisomerase-II passes double-stranded DNA.

Additionally, topoisomerase-II is dimeric or tetrameric because it has to work on breaking and ligating both strands of DNA. Energy (in the form of ATP) is required for making conformational changes in these extra domains.

Topoisomerase maintains the speed of replication by unwinding DNA and releasing tension. Supercoiled DNA has twists and writhes which makes it complex. We will discuss twists, writhes, cccDNA, and linking number in the next article.


Schau das Video: DNA Supercoiling and Topoisomerases (Dezember 2022).