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DNA-Plasmide mit destilliertem Wasser verdünnen

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Ich habe gerade das DNA-Plasmid extrahiert aus E coli und verdünne sie in EB-Puffer. Ich habe jedoch gerade herausgefunden, dass der nächste Schritt, die Elektroporation, erfordert, dass das DNA-Plasmid in destilliertem H . verdünnt wird2O. Kann mir jemand helfen, das DNA-Plasmid von EB-Puffer auf destilliertes H . zu übertragen?2Ö? Um es klar zu sagen, der EB-Puffer, den ich verwendet habe, ist von Qiagen. Es enthält 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. https://www.qiagen.com/sg/resources/faq?id=d8ef773f-6a37-4993-908b-8bbc7bc5c8d6&lang=de


Puffer EB ist einfach 10 mM Tris-Puffer, pH 8,5. Ich denke, Sie sind besorgt über die Ionen, die in Ihrer Elektroporation vorhanden sind. Es gibt zwei Dinge zu beachten:

  1. Wie hoch ist die Konzentration Ihrer DNA und wie viel benötigen Sie für die Elektroporation?
  2. In welchem ​​Endvolumen findet die Elektroporation statt?

Nach meiner Erfahrung fügt man normalerweise eine sehr kleine Menge DNA (einige Mikroliter) zu 100, 250 oder 400 µl (je nach verwendeter Küvette) Endvolumen hinzu. Hier stört eine winzige Menge Tris nicht oder verursacht keinen Kurzschluss.


B1- Zellbiologie

Im zweiten Stadium findet die Mitose statt. An jedes Ende der Zelle wird ein Chromosomensatz gezogen. Auch der Kern teilt sich.

Temperatur
Je höher die Temperatur, desto größer die Diffusionsgeschwindigkeit. Dies liegt daran, dass die Moleküle mehr kinetische Energie haben und sich daher schneller bewegen

Verwenden Sie einen Korkbohrer, um 3 Zylinder Kartoffel herzustellen - Die Verwendung eines Korkbohrers stellt sicher, dass die Zylinder den gleichen Durchmesser haben

Schneiden Sie die Zylinder mit einem Skalpell auf die gleiche Länge (ca. 3 cm)

Messen Sie die Länge jedes Zylinders mit einem Lineal und die Masse jedes Zylinders mit einer Waage

Legen Sie nun jeden Zylinder in ein Reagenzglas und fügen Sie Folgendes hinzu:
- 0,5 molare Zuckerlösung
- 0,25 molare Zuckerlösung
- destilliertes Wasser

Lassen Sie die Kartoffelzylinder über Nacht stehen, damit die Osmose stattfinden kann

Entfernen Sie die Kartoffelzylinder und rollen Sie sie auf einem Papiertuch, um Oberflächenfeuchtigkeit zu entfernen


B. Anreicherung von Nukleinsäuren durch Fällung

Konzentration der DNA durch Isopropanol-Fällung

Wenn die gereinigte genomische oder Plasmid-DNA für die ausgewählte nachgeschaltete Anwendung zu verdünnt ist, kann die DNA durch Isopropanolfällung konzentriert werden.

  1. Fügen Sie der gereinigten Probe 0,7 Volumen Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu.
  2. Vortexen, dann 15 min bei 5.000 × g bei 4 °C schleudern.
  3. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren, wobei darauf zu achten ist, dass das Pellet nicht zerstört wird.
  4. Fügen Sie 2 ml 70 % Ethanol hinzu, das auf 4 ° C vorgekühlt wurde. Kurz vortexen und 10 min bei 5.000 × g bei 4 °C schleudern.
  5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. 5–10 Minuten an der Luft trocknen. Übertrocknen Sie das Pellet nicht, da dies die Wiederauflösung der DNA erschwert.
  6. Resuspendieren Sie die DNA im gewünschten Volumen eines geeigneten Puffers (z.B., TE pH 8,0 oder 10 mM Tris-HCl pH 8,5). Um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig aufgelöst ist, inkubieren Sie 1 h bei 55 ° C.

Konzentration von mRNA durch Präzipitation

(Angepasst an das Protokoll im QuickPrep mRNA Kit.)

Glykogenlösung: 5–10 mg/ml Glykogen in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser*

Kaliumacetat: 2,5 M Kaliumacetat (pH 5,0)-Lösung (hergestellt mit RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser)

DEPC-behandeltes Wasser: Eine 0,1% (v/v) Lösung von Diethylpyrocarbonat in destilliertem Wasser herstellen, kräftig schütteln und über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen. Autoklavieren Sie die Lösung am nächsten Tag mit gelöster Kappe. Kommerziell erhältliches RNase-freies Wasser kann in diesem Protokoll anstelle von DEPC-behandeltem Wasser verwendet werden.

* 0,1% DEPC-behandeltes Wasser.

1. 75 µl (1/10 Volumen) Kaliumacetatlösung und 10 µl Glykogenlösung zu 0,75 ml mRNA in RNase-freiem Wasser hinzufügen. Fügen Sie 1,5 ml gekühltes 95%iges Ethanol (2 bis 2,5 Volumina) hinzu und inkubieren Sie die Probe bei -20 °C für mindestens 15 Minuten. Die Glykogenmenge sollte unabhängig vom Probenvolumen konstant bleiben.

2. Sammeln Sie die mRNA durch Zentrifugieren bei max. Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C für 10 min. Wenn die RNA nicht sofort verwendet wird, lagern Sie sie in diesem ausgefällten Zustand (in Ethanol) bei -80 °C.

3. Dekantieren Sie den Überstand und drehen Sie das Röhrchen über einem sauberen Papiertuch um. Klopfen Sie vorsichtig mit dem Röhrchen auf das Handtuch, um das Entfernen überschüssiger Flüssigkeit zu erleichtern. Waschen Sie das Pellet sorgfältig, indem Sie 1 ml vorgekühltes 80%iges Ethanol in das Röhrchen pipettieren und mehrmals vorsichtig umdrehen. Zentrifugieren Sie bei voller Geschwindigkeit bei 4 ° C für 10 min. Ethanol dekantieren und an der Luft trocknen lassen. Wenn alle Spuren von Ethanol verschwunden sind, lösen Sie die präzipitierte RNA in einem geeigneten Volumen RNase-freien Wassers wieder auf. Um das geeignete Resuspensionsvolumen zu bestimmen, berücksichtigen Sie die gewünschte RNA-Konzentration, die Konzentration vor der Fällung und das Volumen der der Fällung unterzogenen Probe. Der Prozentsatz der nach der Fällung wiedergewonnenen RNA hängt jedoch von der vorhandenen Gesamtmenge ab. Mit 10 µg RNA werden beispielsweise ca. 70 % zurückgewonnen. Sie möchten das Pellet daher möglicherweise in einem um 25 bis 50 % kleineren Volumen auflösen, als dies erforderlich wäre, wenn die gesamte RNA gewonnen würde.


Strategische Planung

Die für dieses Protokoll generierten Multiplex-Luciferase-Reportervektoren werden unter Verwendung einer DNA-Assembly-Plattform-Methode basierend auf dem Klonierungssystem GoldenBraid 2.0 aufgebaut (Sarrion-Perdigones et al., 2011, 2013, siehe Current Protocols in Molecular Biology Artikel von Vazquez-Vilar, et al. , 2020). Dieses System beinhaltet eine einstufige Eintopfreaktion, bei der mehrere zusammenzubauende DNA-Teile gemischt, freigesetzt und miteinander ligiert werden, um definierte Assemblierungsprodukte in einem Zielplasmid zu erzeugen. Unter Verwendung dieser Montageplattform können mehrere genetische Elemente zu einzelnen transkriptionalen Reportereinheiten kombiniert werden, die dann weiter miteinander kombiniert werden können, um mehrere transkriptionelle Reportereinheiten in einem einzigen Plasmid zu erhalten. Die Kombination aller Reporter auf einem einzigen Vektor verringert die höhere Variabilität zwischen den Experimenten sowohl für Reporter- als auch für Kontrolltranskriptionseinheiten, verglichen mit der Cotransfektion aller Reportereinheiten, die jeweils in einem individuellen Plasmid zusammengebaut sind.

Zuvor haben wir den ersten Hextuple-Multiplex-Luciferase-Assay entwickelt, um die transkriptionelle Signalübertragung durch c-Myc-, NF-κβ, TGF-β, p53 und MAPK/JNK-Antwortelemente gegen einen konstitutiv kontrollierenden Promotor (CMV-Promotor) zu untersuchen ). Wir stellten die Luciferase ELuc unter die Kontrolle des CMV-Promotors und die anderen fünf Luciferasen unter die Kontrolle von DNA-regulatorischen Elementen, die durch einen der fünf spezifischen Zellwege aktiviert wurden. Das Kontrollsignal des CMV-Promotors wird verwendet, um das Auslesen von jedem Weg zu normalisieren. Wir haben den Multiplex-Hextuple-Luciferase-Vektor und alle erforderlichen Teile, um ihn zu bauen, im öffentlichen Plasmid-Repository Addgene hinterlegt. In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail die verschiedenen Schritte, die während des Multiplex-Luciferase-Assays durchgeführt werden, unter Verwendung des gleichen Multiplex-Hextuple-Luciferase-Vektors, aber angewendet auf Sondenänderungen in fünf zellulären Signalwegen in der A549-Lungenkrebszelllinie, was die Anwendbarkeit des gleichen Multiplex-Assays demonstriert über verschiedene zelluläre Modellsysteme hinweg. Für Forscher ist es jedoch wichtig zu beachten, dass der beschriebene Multiplex-Ansatz auch auf individuelle Bedürfnisse zugeschnitten werden kann, indem andere Signalwege in den beschriebenen Assay integriert werden, wie in Current Protocols in Molecular Biology (Sarrion-Perdigones et al., im Druck) erläutert. .


Extraktion genomischer DNA aus Hefe - (13. März 2007 )

Ich habe Probleme beim Extrahieren von gDNA aus S. cerevisiae und ein kollege von mir hat das gleiche problem mit C. albicans. Wir verwenden beide ein Kit und befolgen alle Anweisungen, aber wenn wir die Proben auf Agarose laufen lassen, entspricht die DNA-Bande nicht unseren Erwartungen gemäß den Spektofotometer-Quantifizierungen.

Unsere Erträge sind großartig und 260/280-Verhältnisse liegen zwischen 1,8-2,0. Wir haben das Spektofotometer bereits mit Lachssperma mit Steherkonzentration überprüft, aber mit der Ausrüstung ist alles in Ordnung. Es muss etwas in der Extraktion sein.

und wenn wir mit PCR, Enzymverdauungen oder sogar zufälliger Priming-Markierung fortfahren, funktionieren diese Verfahren nicht / haben sehr geringe Ausbeuten.

Ist Ihre DNA frei von RNA?

-Agarose die DNA-Bande entspricht nicht unseren Erwartungen gemäß den Spektofotometer-Quantifizierungen.

eine häufige Ursache ist eine RNA-Kontamination, die dazu führen kann, dass die Spektophotometer-Messwerte etwas variieren. Die Agarose-Bande ist die eigentliche DNA-Menge.

Was DNA betrifft, die nicht mit Restriktionsenzymen schneidet. die Ursache ist, dass die DNA nicht sauber genug ist. Führen Sie 2 - 3 Phenol-Chloroform-Extraktionen durch. (wenn angemessen DNA in einem Volumen von 500 µl resuspendieren, da Sie während der Extraktion viel Volumen verlieren können.) Versuchen Sie nach der Reinigung, mit EcoRI zu schneiden. Wenn es mit EcoRI nicht schneidet, führen Sie weitere Phenol/Chloroform-Extraktionen durch. EcoRI, kann als eines der besten Enzyme überhaupt angesehen werden. Wenn es Ihre DNA nicht schneiden kann, kann es nichts.

Da die gDNA bei weitem nicht so sauber ist wie die Plasmid-DNA, geben Sie ihr mehr Zeit zum Verdauen. Achten Sie auch auf den DNA-Abbau durch Nukleasen. (dh der Verdauungsausstrich beginnt sich auf sehr kleine Fragmente um 500 bp zu zentrieren.) Da Sie die oben genannten Probleme haben, ist der Verlust Ihrer DNA durch Nuklease-Reaktivierung im Verdauungspuffer eine echte Gefahr.

Auch bei der PCR ist die DNA nicht sauber genug. Und in meinen Händen, selbst wenn es "gereinigt" ist, ist dies immer noch nicht gut genug. Ich verdünne meine Probe genomischer DNA mindestens 1:5 bis 1:50 mit sterilem destilliertem Wasser, um als Vorlage zu dienen. Die Verdünnung hilft, alle verbleibenden Verunreinigungen zu verdünnen. Und PCR verstärkt das schwache Signal. Beachten Sie, dass genomische DNA, die in SD-Wasser aufbewahrt wird, lange lebt. 5-6 Monate in meinen Händen. Bewahren Sie die DNA zur Langzeitlagerung immer in TE auf.

Aber mit allem, was gesagt wird, braucht es ein wenig Übung, um eine schöne, saubere DNA zu erhalten. Seien Sie mutig und stöbern Sie in Ihrem Protokoll herum, um zu sehen, ob es verbessert werden kann. Wenn dies nicht möglich ist, sehen Sie, welche zusätzlichen Dinge Sie mit der DNA tun können, sobald Sie sie haben.

Über die RNA-Kontamination. Es kann sein, obwohl ich immer den pH:Ch-pH-Wert überprüfe, bevor ich mit der DNA-Extraktion beginne, damit ich DNA anstelle von RNA habe.

Das Enzym, das ich verwende, schneidet DNA, ich kann den erwarteten Abstrich im Gel sehen, jedoch mit geringerer Intensität als erwartet. Ich habe bereits versucht, es über Nacht zu verdauen, aber die Ergebnisse sind die gleichen.


Fanos Tadesse 1,2 *, Demasa Negessu 2 , Tsion Bilata 2 , Ayelech Muluneh 2 und Dereje Shegu 2

1 Addis Abeba University College of Veterinary Medicine, Äthiopien

2 Nationales Diagnose- und Untersuchungszentrum für Tiergesundheit, Äthiopien

Empfangen: 13. Dezember 2019 | Veröffentlicht: 06. Januar 2020

Korrespondierender Autor: Fanos Tadesse, Addis Abeba University College of Veterinary Medicine, Äthiopien [email protected] -->

Abstrakt

Das Klonen von Genen ist eine Methode, bei der ein Stück DNA aus dem Organismus, in dem es natürlicherweise vorkommt, entnommen und in einen Klonierungswirt wie das Bakterium Escherichia coli eingebracht wird. Bakterienzellen, die fremde DNA enthalten, können die genetische Information exprimieren und die Genprodukte herstellen. Um die Klonierung in E. coli durchführen zu können, wurde der Vektor des Plasmids pHEN6c verwendet, um das cDNA-Fragment einer für Nanobody kodierenden mRNA zu klonieren. E. coli-Plasmid wurde extrahiert, gereinigt und dann unter Verwendung der Restriktionsenzyme PstI und Eco91I verdaut. Die Reinheit und Konzentration des Plasmids betrugen 1,84 bzw. 39,2 ng/μl. Der pHEN6c-Vektor sowie die Nanobody-cDNA wurden mit PstI- und Eco91I-Restriktionsenzym verdaut und dann ligiert, um ein rekombinantes Plasmid zu bilden. Die Konstrukte wurden durch das Hitzeschockverfahren in den Escherichia coli-Stamm transformiert. Die Zellen wurden über Nacht kultiviert und die Transformationseffizienz wurde zu 7867,22 Transformanten/&mgr;g bestimmt. In diesem Experiment wurde die Zielsequenz amplifiziert und Banden wurden nach einer 1% Agarosegelelektrophorese der Kolonie-PCR-Produkte erhalten. Zur Bestimmung der Größe der klonierten cDNA und des pHEN6c-Vektors wurden Auftragungen der relativen Morbidität gegen die Molekülgröße (log bp) verwendet und die Größe betrug 573 bp und 3842 bp für die cDNA bzw. den Vektor. Klonierungstechniken bergen viele vielversprechende zukünftige Forschungen in Gentechnik und Biotechnologie. Es ist daher wichtig, durch praktisches Experimentieren und Erforschung des Klonens zu lernen, das Beste der Natur (lebender Organismus) zu unserem Vorteil zu nutzen.

Schlüsselwörter: Plasmid-Klonierung Nanobody-Gen

Einführung

Die Entdeckung der Struktur und Rolle der DNA und das Aussortieren des genetischen Codes hat in den letzten 50 Jahren zu einer Explosion in unserem Verständnis von Organismen und ihrer Funktionsweise geführt. An der Spitze dieser Revolution stand das Klonen von Genen. Der Begriff „Genklonen“ umfasst ein breites Spektrum an Techniken, die es ermöglichen, DNA im Reagenzglas zu manipulieren und an lebende Organismen zurückzugeben, wo sie normal funktioniert. Die Bedeutung dieser Technologie besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, jedes DNA-Stück unter den Millionen von Basenpaaren zu isolieren, aus denen das Genom eines Organismus besteht. Dieser erste Schritt ist für eine ganze Reihe wissenschaftlicher und technologischer Studien unerlässlich, von der Untersuchung eines Gens, das eine Erbkrankheit hervorruft, bis hin zur Biotechnologie eines Hefestamms, der ein nützliches pharmazeutisches Produkt produziert [1]. Beim Klonen von Genen wird ein Stück DNA aus dem Organismus, in dem es natürlicherweise vorkommt, entnommen und in einen Klonwirt wie das Bakterium Escherichia coli eingebracht. Es ist dann möglich, die klonierte DNA zu untersuchen oder das von dem Gen kodierte Protein herzustellen. Für viele Anwendungen möchten Sie möglicherweise die klonierte DNA nachträglich in einen anderen Organismus übertragen, aber die ersten Klonierungsschritte werden fast immer in E. coli durchgeführt [2].

Unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen kann fremde DNA in bakterielle Plasmide eingefügt und repliziert werden). Bakterienzellen, die fremde DNA enthalten, können die genetische Information exprimieren und die Genprodukte herstellen. So können wir durch das Klonen dieser Zellen etwas über die Struktur und Funktionsweise spezifischer Gene und Genprodukte sowie über die Expression seltener Proteine ​​lernen. Die Plasmidtransformation in kompetente Bakterienzellen ist eine Schlüsseltechnik beim molekularen Klonen, um die genetische Konstitution anderer Organismen zu verändern [3].

Plasmide sind die am häufigsten verwendeten Vektoren für die Genklonierung und sind kleine zirkuläre DNA-Moleküle, die in vielen Bakterienarten vorkommen und einen „Replikationsursprung“ aufweisen, der die Replikation des Plasmids steuert und sicherstellt, dass die klonierte Zelle viele Kopien des Plasmids enthält, die verteilt werden zwischen den Tochterzellen, wenn sich die Zelle teilt [4]. Die genaue Kopienzahl variiert je nach Plasmid. Wenn das klonierte Gen Teil eines DNA-Moleküls mit Replikationsursprung ist, also in ein Plasmid kloniert ist, wird es beim Kopieren des Plasmids ebenfalls kopiert. Plasmide, die üblicherweise beim Klonen verwendet werden, enthalten einen selektierbaren Marker, normalerweise ein Antibiotikaresistenzgen. Dies bedeutet, dass wir einfach feststellen können, welche Bakterien das Plasmid enthalten, indem wir sie einfach auf eine Agarplatte mit dem Antibiotikum verteilen, wo das Wachstum in einem Plasmid mit einem Plasmid geschätzt wird [5].

Plasmide werden als übertragbare genetische Elemente oder "Replikons" betrachtet, die in einem geeigneten Wirt autonom replizieren können. Obwohl es zur Selbstreplikation fähig ist, verwendet es immer noch die Wirtszellmaschinerie, um diese Funktion auszuführen. Plasmide stellen einen Mechanismus für den horizontalen Gentransfer innerhalb einer Mikrobenpopulation bereit und bieten typischerweise einen selektiven Vorteil unter einem gegebenen Umweltzustand. Plasmide können Gene tragen, die in einer kompetitiven Umweltnische Resistenz gegen natürlich vorkommende Antibiotika verleihen, oder alternativ können die produzierten Proteine ​​unter ähnlichen Umständen als Toxine wirken. Plasmide können Bakterien auch die Fähigkeit verleihen, elementaren Stickstoff zu fixieren oder widerspenstige organische Verbindungen abzubauen, was bei Nährstoffmangel von Vorteil ist [6].

In diesem Experiment wurden Grundprinzipien der Gentechnik verwendet, um wissenschaftliche Herausforderungen, Forschung und Produktentwicklung zu lösen. Um unser Ziel zu erreichen, wurden Plasmide aus E. coli-Bakterienkulturen isoliert und rekombinante Plasmide, die spezifische Fragmente von Nanobody-Genkonstrukten enthielten, wurden dann in E. coli-Zellen transformiert, was den Wirtszellen Ampicillin-Resistenz verleiht. Andere grundlegende Techniken zur Analyse der Ergebnisse mittels PCR und Agarosegelelektrophorese wurden ebenfalls verwendet.

Methodik

Isolierung des Plasmids pHEN6c

Die Isolierung des Plasmids pHEN6c wurde in 7 aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt: Zellernte, Zellresuspension, Zelllyse, Neutralisation, Säulenpräparation, Laden von geklärtem Lysat, Waschen der Säule und DNA-Elution. Wir haben die E. coli-Übernachtkultur geerntet und ihre 1 ml in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben. Wir haben es in einer Mikrozentrifuge bei einer hohen Geschwindigkeit von 10600 U/min (12.000 × g) in 1 Minute zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstands wurde ein weiterer 1 ml der E. coli-Kultur zu dem Pellet gegeben und erneut mit hoher Geschwindigkeit in einer Minute zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde in einen Abfallbecher gegossen, während das Pellet sofort in 2 µl der Resuspensionslösung resuspendiert wurde. Die Mischung wurde gevortext, um eine geeignete und vollständige Resuspension sicherzustellen. Zur Lyse des resuspendierten E. coli-Pellets wurden 2 µl der Lyselösung zugegeben. Der Inhalt wurde etwa 6 bis 8 Mal vorsichtig umgedreht (anstatt einen Vortex zu verwenden, da dies das Scheren der genomischen DNA und folglich die Plasmid-DNA-Kontamination verursachen kann). Der Neutralisation folgte unmittelbar die Zugabe von 350 µl der Neutralisationslösung, um die Zelltrümmer auszufällen. Der Mischungsinhalt wurde dann 4 bis 6 Mal vorsichtig umgedreht. Der gleiche Inhalt wurde bei hoher Geschwindigkeit (12000 × g) in 10 Minuten zentrifugiert. Da unser Überstand nicht viele schwebende Partikel enthielt, erwies sich die zweite Zentrifugation als unnötig.

Die Säule wurde durch Einsetzen einer GenEute Miniprep Binding-Säule in ein Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt. 500 &mgr;l der Säulenpräparationslösung wurden zu der Miniprep-Säule hinzugefügt und bei hoher Geschwindigkeit (12.000 × g) in 30 Sekunden bis 1 Minute zentrifugiert. Die durchströmende Flüssigkeit wurde verworfen. Die vorbereitete Säule diente zur Beladung des geklärten Lysats (resultierend aus Neutralisation). Das geklärte Lysat wurde auf die bereits vorbereitete Säule gegeben und bei hoher Geschwindigkeit von 12.000 × g in 30 Sekunden bis 1 Minute zentrifugiert. Das Waschen der Säule wurde dann durchgeführt, indem 750 &mgr;l der verdünnten Waschlösung zu der mit einer Geschwindigkeit von 12.000 × g zentrifugierten Säule für 30 Sekunden bis 1 Minute ebenfalls zugegeben wurden.

Die durchfließende Flüssigkeit wurde in einen Abfallbecher verworfen und die Säule wurde erneut bei hoher Geschwindigkeit 12.000 × g in 1 bis 2 Minuten zentrifugiert, um jeglichen Ethanolüberschuss zu entfernen. Wir eluierten schließlich die DNA, indem wir die Säule in ein frisches Sammelröhrchen überführten und dann 50 μl der Elutionslösung hinzufügten und zentrifugierten.

Bestimmung der Plasmid-DNA-Reinheit, Konzentration

Die Bestimmung der Reinheit (OD 260/OD 280) und Konzentration (ƞg/μl) der isolierten Plasmid-DNA aus E.coli erfolgte mittels Spektrophotometer (Nanodrop™) mit Hilfe der angeschlossenen Computersoftware der Wert für beide Reinheit und Konzentration wurden berechnet und generiert.

Restriktionsendonuklease-Verdauung des Nanobody-Gens und des pHEN6c-Plasmids

DNA-Verdau (pHEN6c-Plasmid): Die ermittelte DNA-Plasmidkonzentration für unsere Untergruppe war niedrig (279,6 µg/µl), daher haben wir eine durchschnittliche Plasmidkonzentration von 317,57 µg/µl verwendet, die sich aus einer Kombination der vier höchsten DNA-Plasmidkonzentrationen (335,6, 353,6, 299,1 und 282 µg/μl) von anderen Untergruppen erhalten. Zu 11,75 µl destilliertem Wasser wurde ein Volumen von 31,25 µl (des DNA-Plasmids mit 317,57 µg/µl) zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 µl 10x Buffer-o (Fermantas) und 1 µl des Restriktionsenzyms Eco91I (10 Einheiten/µl .). ) und Restriktionsenzym PstI (10 Einheiten/μl). Die gesamte Mischung (50 μl) wurde dann über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Verdau und Reinigung von PCR-amplifizierter cDNA: Die bereits hergestellte und gereinigte cDNA (Nanobody-Gen-PCR-Fragmente) wurde einem Verdau durch spezifische Restriktionsenzyme unterzogen. Zu 29,41 μl destilliertem Wasser wurde ein Volumen von 13,59 μl (PCR-Fragmente) zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 μl 10x Buffer-o (Fermantas) und 1 μl Restriktionsenzym Eco91I (10 Einheiten/μl) und Restriktionsenzym PstI ( 10 Einheiten/μl). Die gesamte Mischung (50 μl) wurde dann über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zur Reinigung (Reinigung) der PCR-amplifizierten cDNA kam das GenElute TM PCR Clean-UP Kit zum Einsatz. Wir begannen mit der Vorbereitung der Säule (um die Bindung der DNA an die Membran zu maximieren). Ein Volumen von 0,5 ml der Säulenvorbereitungslösung wurde zu einer bereits in ein Sammelröhrchen eingesetzten GenElute Miniprep-Bindungssäule gegeben.

Das Sammelröhrchen wurde dann 30 Sekunden bis 1 Minute bei 12.000 rcf zentrifugiert. Der Abfall wurde verworfen. Ein Volumen von 500 µl Bindungslösung wurde zugegeben und zu 50 µl der PCR-Reaktion gemischt. Die Mischlösung wurde in die Bindungssäule überführt. Die Säule (in das Sammelröhrchen) wurde eine Minute bei 12.000-16.000 rcf zentrifugiert. Die eluierende Flüssigkeit wurde verworfen. Die verdünnte Waschlösung, 0,5 ml, wurde auf die Säule gegeben und eine Minute lang bei 12.000-16.000 rcf zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen. Um überschüssiges Ethanol zu entfernen, wurde das Sammelröhrchen (mit der Säule hinein) dann 2 Minuten bei 12.000-16.000 rcf zentrifugiert. Das Sammelröhrchen mit dem Eluat wurde verworfen, während die Säule anschließend in ein frisches 2 ml Sammelröhrchen überführt wurde. Die Elution erfolgte durch Zugabe von 50 µl der Elutionslösung auf die Säule. Um die DNA zu eluieren, wurde die Säule eine Minute lang bei 12.000-16.000 rcf zentrifugiert. Das resultierende Eluat enthielt das gereinigte PCR-Produkt und wurde sofort verwendet (oder bei –20°C gelagert).

Ligatur

Auf 13,9 µl destilliertes Wasser, 2,28 µl PCR-Fragmente, 0,82 Plasmidvektor, 2 µl Ligationspuffer (0,2 M Tris pH=7,6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 500 µg/ml BSA, 5 mM ATP) und 1 µl T4-DNA wurde in einem Röhrchen auf ein Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt. Die Lösung war 2 Stunden bei Raumtemperatur.

Transformation

Generierung von Cacl2-kompetenten Zellen: Um „Hitzeschock“-kompetente Zellen herzustellen, wurden 5 ml LB (ohne Antibiotika) inokuliert und in einem sterilen 50-ml-Röhrchen mit einer einzelnen Kolonie von einer frischen Platte versetzt. Das beimpfte Medium wurde dann über Nacht bei 37ºC inkubiert (unter kräftigem Schütteln bei 230 U/min). Am folgenden Morgen wurden 20 ml LB mit 0,2 ml der Übernachtkultur angeimpft. Das Röhrchen wurde für 90 bis 180 Minuten in einen Inkubator gestellt, um die beimpften Bakterien bis zu ihrer frühen logarithmischen Phase zu züchten. Später wurde es für 10 Minuten auf Eis überführt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 3000 Upm in Eppendorf-Röhrchen gesammelt, der Überstand wurde verworfen und dann wurde das Pellet mit 10 ml sterilem eiskaltem 0,1 M MgCl 2 resuspendiert. Das Pellet wurde erneut mit einem anderen 10 ml sterilen eiskalten 0,1 M CaCl 2 resuspendiert, gefolgt von seiner Inkubation in Eis für 1 Stunde und dann bei 7 Minuten 3000 Upm in einer 4ºC Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde gegossen und steriles eiskaltes 0,1 M CaCl 2 plus 0,3 ml steriles eiskaltes 100 %-Glycerin zugegeben. Anschließend wurde die Mischung 30 min auf Eis inkubiert.

Hitzeschock-Transformation: Es wurden drei 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen hergestellt, die jeweils 100 μl Zellsuspension enthielten und als T1, T2 bzw. T3 gekennzeichnet waren. Von den drei Röhrchen wurden T1, T2 und T2 als Positivkontrolle, Röhrchen, Teströhrchen bzw. Negativkontrollröhrchen hergestellt. Ein Aliquot von 0,05 µg gereinigter intakter Plasmid-DNA wurde zu T1 gegeben, 10 µl ungereinigter Ligierung zu T2 und T3 wurde mit seinen anfänglichen 100 µl Cacl2 belassen. Die drei Röhrchen wurden 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach ihrer Inkubation wurden die drei Röhrchen anschließend für genau 90 Sekunden in ein warmes Bad von 42 °C überführt und dann wieder für 2 Minuten auf Eis gestellt. Nach der Inkubation wurden die Zellen dann auf Ampicillin enthaltendem LB-Agar kultiviert, indem (mit einem sterilen Lazy-Spreader) 100 &mgr;l des Transformationspräparats aus jedem Röhrchen auf seinen LB-AMP-Agarplatten (mit T1, T2 und T3 markiert) verteilt wurden. Die kultivierten Platten wurden über Nacht bei 37 °C kopfüber inkubiert. Am nächsten Morgen (nach 16 bis 20 Stunden) wurde die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte bestimmt.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zuerst wurde der PCR-Mastermix hergestellt. In jedes der fünf PCR-Röhrchen wurden 50 μl Mastermix (5 μl 10x PCR-Puffer, 1 μl dNTP, 1 μl FP, 1 μl RP, 0,25 μl Taq DNA-Polymerase, 41,75 μl dH2O) gegeben. Mit sterilen Pipettenspitzen wurde eine Kolonie aus dem positiven Test (T1) entnommen und in ein PCR-Röhrchen gemischt, eine weitere Kolonie wurde aus dem Teströhrchen entnommen, da auf der Testplatte T2 keine Kolonie wuchs und wurde in ein separates PCR-Röhrchen ebenfalls. Das dritte Röhrchen, dem keine Kolonie zugesetzt wurde, diente als Negativkontrolle. Die Röhrchen wurden alle verschlossen und dann in einen Thermocycler überführt, der zwischen Schmelzen (bei 94 °C für 30 Sekunden), Tempern (bei 57 °C für 30 Sekunden) und Polymerisationstemperaturen (72 °C für 45 Sekunden) zyklisch wechselte. Die für Nanobody (Nanobody-cDNA-Insert) kodierenden Genfragmente, falls in der Probe vorhanden, wurden mit den spezifischen Primern amplifiziert: Vorwärtsprimer (FP 5'-TTCCCAGTCACGAC-3') und Rückwärtsprimer (RP 5'- CACACAGGAAACAGCTATGAC-3') Arbabi Ghahroudi, 1997.

Analyse des PCR-Produkts durch Agarosegel-Elektrophorese

Das 1% (w/v) geschmolzene Agarosegel wurde zuerst in 1x TBE in eine Schale gegossen. Anschließend gaben wir 30 µl Ethidiumbromid mit 10 mg/ml zu geschmolzenem Gel und vermischten anschließend durch Rühren mit der sterilen Pipettenspitze. Anschließend wurde ein Kamm auf den Gelhalter gelegt und mit einer gereinigten Pipettenspitze alle möglichen Luftblasen entfernt. Wir lassen das Gel 20 Minuten erstarren. Das feste Gel mit seiner Schale wurde in einen Elektrophoresepuffertank gegeben und dann wurde 1xTBE Elektrophoresepuffer zugegeben, um das Gel vollständig zu bedecken. Zu 5 µl des Proben-PCR-Produkts wurden 2 µl Ladepuffer zugegeben, während bei der Negativkontrolle nur 1 µl des PCR-Produkts mit 1 µl Ladepuffer gemischt wurde. Sowohl die Negativ- als auch die Positivkontrolle wurden mit 4 μl Ladefarbstoff gemischt und dann auf das Gel geladen. Die positive Mischung wurde ab dem zweiten Slot geladen und die negative Kontrollmischung wurde im letzten Slot geladen. Wir haben 10 μl Smart Ladder auf den ersten Slot geladen.

Wir haben den Deckel auf den Puffertank gelegt und dann die positive und negative Elektrode 1 Stunde lang mit einer Spannung von 125 V verbunden. Das Gel wurde dann zur Trennung der Banden unter UV-Licht beobachtet und mit dem in Spur 1 geladenen Marker (Hyladder™ 10 kb) verglichen Gebiet.

Molekulargewichtsbestimmung von DNA nach Auflösung durch Gelelektrophorese

Das Molekulargewicht von Nanobody-cDNA und Plasmid (Vektor) wurde durch 1% Agarosegelelektrophorese bestimmt.

Ergebnisse

Konzentration und Reinheit der Plasmid-DNA

Nach Isolierung und Reinigung der pHEN6c-Plasmid-DNA wurden deren Konzentration und Reinheit durch Nano Drop™ bestimmt. Die Proben wurden dann unter Verwendung einer Blindreferenz, bestehend aus Wasser, das als Elutionspuffer verwendet wurde, analysiert. Was die reine DNA betrifft, sollte der A260/A280-Wert zwischen 1,7-1,9 liegen, somit wurde die Plasmid-DNA in ihrer reinen Form isoliert. Unsere gepoolte DNA-Konzentration betrug 317 ng/μl, was einer gepoolten Reinheit von 1,84 entspricht, und die Ausbeute unserer DNA in 50 μl betrug 371 μg/μl multipliziert mit 50 μl, was 18,5 μg entspricht.

Verdaute cDNA-Konzentration

Die Konzentration der verdauten cDNA betrug 110,3 ng/μl, was 0,1103 war, und die Ausbeute unserer DNA in 50 μl wurde mit 50 μl multipliziert mit 0,1103 μg/μl, was 5,5 μg entspricht, gefunden.

Bestimmung des Molekulargewichts von cDNA

Zur Molekulargewichtsbestimmung der cDNA wurde sie auf 1% Agarosegel laufen gelassen und die folgenden Banden wurden erhalten und das Molekulargewicht der cDNA soll 573 bp betragen (Abbildung 1).

Bestimmung des Molekulargewichts von Plasmid-DNA (Vektor)

Zur Molekulargewichtsbestimmung der cDNA wurde sie auf 1% Agarosegel laufen gelassen und folgende Banden wurden erhalten und das Molekulargewicht der cDNA soll 3842 bp betragen (Abbildung 2).

Abbildung 1: Banden, die für die cDNA bei 1% Agarosegelelektrophorese erhalten wurden.

LEGENDE: L-Leiter, S1-Probe 1, s2-Probe2, s3-Probe 3, S4-Probe 4, S5-Probe 5, S6-Probe 6

Figur 2: Banden, die für die Vektor-DNA bei 1% Agarosegelelektrophorese erhalten wurden.

Bestimmung der Effizienz der Transformation

Die Transformationseffizienz ist ein Maß für die Menge an Zellen innerhalb der Bakterienkultur, die DNA-Moleküle aufnehmen können. Die Berechnung wurde mit der Menge an plattierter intakter Plasmid-DNA begonnen: Die Anzahl der Kolonien betrug 349 cfu (Abbildung 3) in 50 ng (0,05 µg) DNA in 1 µl wurde zu 100 µl Zellen gegeben. Die DNA-Konzentration in der Lösung = (0,05 μg /101μl) ≈ 0,00049 μg/μl. Dann wurden 100 ul Kultur zu jeder der Platten zugegeben, daher wurde die Menge an intakter Plasmid-DNA, die auf jede Platte plattiert wurde, berechnet als: 0,05 / 1101 = 4,54 x 10&supmin;&sup5; &mgr;g/&mgr;l x 100 &mgr;l = 4,54 x 10&supmin;³ &mgr;g.

Menge der plattierten DNA (μg/ml): 4,54 × 10 –3 μg/100 μl = 4,54 × 10 –3 μg /0,1 ml = 4,54 × 10 –2 μg /ml. Unter Verwendung der Formel (Transformationseffizienz = Anzahl der Kolonien auf der LB-AMP-Platte geteilt durch die plattierte DNA-Menge) wurde sie als 349 cfu/4,54 × 10 –2 μg/ml = 7687,22 cfu/1 μg/ml berechnet.

Figur 3: Koloniewachstum auf T2.

Bestimmung des Prozentsatzes von Transformanten mit dem Insert

Nach Durchführung der Kolonie-PCR wurden die amplifizierten Proben einer zufällig ausgewählten Kolonie zusammen mit einer gemeinsamen Positiv- und Negativkontrolle auf 1% Agarosegel und ohne oder schwach und wurden unter UV-Exposition erhalten.

Messung der optischen Dichte (OD) der Zelle

Die optische Dichte (OD) wurde für Zellen, die in einer logarithmischen Phase gewachsen waren, mit einem Spektrophotometer bei OD 600 gemessen und das Ergebnis ist 0,213, wobei der Standard zwischen 0,2 und 0,4 liegt.

Wachstum bei LB+Ampicilin

Das Wachstum von Kolonien wurde in der Positiv- und der Testplatte beobachtet, aber bei der dritten Probe, die eine Negativkontrolle ist, wurde kein Wachstum einer einzelnen Kolonie festgestellt (Fig. 4 und 5).

Figur 4: Kein Koloniewachstum auf T2.

Abbildung 5: Kolonienwachstum sowohl bei T1 (Positivkontrolle) als auch bei Abwesenheit von Kolonienwachstum bei T3.

Diskussion

Die Konzentration, die mit dem Nanodrop-Spektrophotometer (18,5 μg/50 μl) aus 2 ml E.coli-Kultur mit pHEN6c erhalten wurde, zeigt, dass die Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Denaturierung eine wirksame Methode ist. Unser Ergebnis stimmt mit den Ergebnissen von Sabine (2003)[7] überein, die das Verfahren alkalische Denaturierung und Ausbeute von 2-5μg DNA aus einer 1,5-ml-Kultur von E.coli, die ein von pBR322 abgeleitetes Plasmid enthält, und drei- bis fünf- von pUC-abgeleiteten Plasmiden können um ein Vielfaches höhere Ausbeuten erwartet werden. Die Transformationseffizienz stellt die Gesamtzahl der Bakterienzellen dar, die die inserierte DNA enthalten. In unserem Experiment war die Transformationseffizienz mit 7687,22 cfu/1 μg/ml Transformanten/μg hoch im Vergleich zu Baraka [8], der 1,107 x 102 Transformanten/μg erhielt. Diese Effizienz impliziert, dass unsere Plasmide erfolgreich von den Wirtsbakterien aufgenommen wurden, was das Wachstum ermöglichte auf dem mit Ampicillin ergänzten Medium. Das β-Lactamase-Protein wird von Bakterien produziert und sezerniert, die das inserierte Plasmidkonstrukt tragen, das das im LB-Agar vorhandene Ampicillin inaktiviert und Bakterienwachstum ermöglicht [9]. Auf Platten, die Ampicillin enthalten, wuchsen nur transformierte Bakterien, die das Plasmid enthalten und β-Lactamase exprimieren [10].

Untransformierte Zellen wie die Platte Nummer zwei unserer Probe konnten auf den Ampicillin-Selektionsplatten nicht wachsen, wodurch die Selektion nur positiver Transformanten ermöglicht wurde. Einige Faktoren, die die Transformationseffizienz beeinflusst haben könnten, sind die Zugabe von Calciumchlorid, die die Bakterienzelle dazu veranlasste, die DNA durch Erhöhung ihrer Membranpermeabilität aufzunehmen. Auch die Menge an nackter DNA, die in die Umgebung des Bakteriums eingebracht wird, könnte eine Rolle spielen, je mehr DNA, desto effizienter wäre die Transformation [11]. Das PCR-Produkt wurde auf 1% Agarosegel aufgelöst und eine schwache Bande konnte sowohl in den Proben als auch in der Positivkontrolle nachgewiesen werden. Amplifikationsfehler können auf einen PCR-Primerfehler oder eine schlechte Enzymaktivität der Polymerase zurückzuführen sein, ein Pufferproblem. Dies wird auch von Roux [12] unterstützt, der feststellt, dass die Primersequenz synthetisiert oder korrekt verdünnt werden konnte, Puffer und Inhibitoren wurden beschuldigt, die Amplifikation zu beeinflussen. Um dieses Problem zu lösen, ist ein neues Design für ein optimales Primerpaar erforderlich, um die erforderliche Amplifikation zu erreichen. Ein Versagen der Kolonie-PCR kann auch durch zu viele Zellen in der PCR-Reaktion verursacht werden. Um dies zu vermeiden, können Kolonien vor der Durchführung der PCR in sterilem destilliertem Wasser verdünnt werden [13].

Abschluss

Da Nanobodys eine gute Expression in mikrobiellen Systemen und die vorteilhaften biochemischen Eigenschaften (gute Löslichkeit, gute Stabilität unter rauen Bedingungen, hohe Affinität und Spezifität für das Antigen, geringe Größe und striktes monomeres Verhalten) aufweisen, sind sie ein ideales Werkzeug für Forschungszwecke oder diagnostische oder therapeutische Anwendungen. Obwohl die Kolonie-PCR in unserem Experiment nicht erfolgreich war (aufgrund von Puffer- und Enzymdefekten), waren die Klonierungsverfahren hilfreich, um die Nanobody-Gen-cDNA in das Bakteriengenom des E.Coli WK6-Stamms einzufügen. Klonierungstechniken bergen viele vielversprechende zukünftige Forschungen in Gentechnik und Biotechnologie. Es ist daher wichtig, durch praktisches Experimentieren und Erforschung des Klonens zu lernen, das Beste der Natur (lebender Organismus) zu unserem Vorteil zu nutzen.

Erklärung

Diese Arbeit wurde noch nie eingereicht und ist in ihrer Art original und ich gebe die volle Erlaubnis für die wissenschaftliche Zeitschrift iiste.org, sie zu veröffentlichen.

Verweise

  • Lodge J, Lund PA, Minchin S (2007)Genklonen: Prinzipien und Anwendungen. Taylor- und Francis-Gruppe.
  • Carson S, Robertson D (2005)Manipulation und Expression von rekombinanter DNA. San Diego: Elsevier akademische Presse.
  • Lipps G (2008) Plasmide: Aktuelle Forschung und zukünftige Trends. Caister Academic Press.
  • Hanahan D (1985)DNA-Klonierungstechniken: Ein praktischer Ansatz. In: DM Glover (Hrsg.). (IRL-Presse, Oxford) 1:109.
  • Campbell, Neil A (2005) Biologie. In: Neil A Campbell, Jane B. Reece (Hrsg.), 7. (Hrsg.). CA: Pearson-Ausbildung. Inc, San Francisco, USA, S. 384-388.
  • Kenneth H Roux (2001)Optimierung und Fehlerbehebung im PCR-Genom. Auflösung 1995 4: S185-S194.
  • Lee AB, TA Cooper (1995)Verbesserter direkter PCR-Screen für Bakterienkolonien. Bio-Techniken 18: 225-226.
  • Barakat (2011) Praxisbericht des IPMB.
  • Primrose SB, Twyman RM, Old RW (2006)Prinzipien der Genmanipulation. Blackwell Science, Inc: Malden.
  • Steven Odongo (2013) Schulungshandbuch für Studenten für IPMB.

Dekontaminationslösung (v1.4)

10% Im Laden gekauftes Bleichmittel (2L pro 20L)
1% NaOH (200g pro 20L)
1% Sparkleen oder ähnliches Waschpulver (200g pro 20L)

Gebrauchsanweisung:

  • Für die meisten Anwendungen (Abwischen von Arbeitsplatten, Geräten, Pipetten) kann die Dekon-Lösung 2-3X verdünnt, aufgewischt, einige Minuten einweichen und dann mit destilliertem Wasser und Handtüchern abgespült werden. Hartnäckigere Verschmutzungen können mit unverdünnter Mischung getroffen werden.
  • Glas und Teile können so eingestellt werden, dass sie in reinem oder verdünntem (2-3X) Dekon-Mix einweichen, dann wie gewohnt gewaschen und mit destilliertem Wasser gespült werden.
  • Lassen Sie die Dekon-Mischung nicht mit eloxiertem Aluminium in Kontakt kommen, da die Farbe sofort entfernt wird!
  • Neuester, einfachster Dekon-Mix. Auf die Zugabe von Natriumbicarb wurde verzichtet, da Sparkleen einen guten Teil davon enthält und das Reinigungsmittel für die Benetzungswirkung liefert. Vielen Dank an den Leser, der es vorgeschlagen hat!

Dekontaminationslösung (v1.3) (alte, ältere Version)
10-15% Im Laden gekauftes Bleichmittel (100-150 ml/L)
1% NaOH (10 g/l)
1% Alconox/Sparkleen/Spülmittel (10 g/L) *
90 mM Natriumbicarbonat (7,5 g/L) **

* Kommerzielle Versionen verwenden SDS, aber bei höheren Konzentrationen (=>1%) stürzt das SDS ab. Sofern Sie nicht den Duftstoff/Emulgator 2141-BG verwenden, verwenden Sie entweder eine niedrigere Konzentration von SDS (<0,1%) oder verwenden Sie die oben genannten Reinigungsmittel *

** Sparkleen und Alconox enthalten bereits Natriumbicarbonat in hohen Konzentrationen, bis zu

40% für Alconox, so dass die Zugabe von Bicarbonat möglicherweise nicht erforderlich ist.

Angenommen, Sparkleen enthält 30% Bikarbonat, 10 Gramm Sparkleen enthalten 3 Gramm Bikarbonat, was eine endgültige Lösung mit 36 ​​mM Bikarbonat ergeben würde, die immer noch Korrosionsschutz bieten könnte, hängt davon ab, wie stark Sie den 90 mM aus dem DNAzap-Patent glauben möchten. **

*** Diese Dekon-Mischung korrodiert Aluminium und Eisen/billigen Edelstahl bei hohen Konzentrationen und bei längerer Behandlung. Hochwertiger Edelstahl hält gut. ***

**** Diese Mischung eignet sich hervorragend zum Reinigen von Glaswaren, lassen Sie einen Becher eine Weile in 0,5X oder 1X Dekon-Mix stehen, je länger, desto besser. Es wird funkeln, nachdem Sie es gespült haben! Der hohe NaOH-Gehalt erinnert an Basenbäder, mit denen Chemiker eine schöne saubere Schicht auf ihr Glas ätzen. ****

Weitere Hintergründe dazu, wie ich zu diesem Rezept gekommen bin, findest du in meinem zweiten Beitrag zum Thema, Einfach bleichen


ERGEBNISSE

Nach Abschluss dieses Laborprojekts erstellen die Studierenden einen Bericht in Manuskriptform, der ihre Daten zusammenfasst. Sie müssen Gele enthalten, die Doppelverdaus, eine Standardkurve, eine Tabelle aller gesehenen und abgeleiteten DNA-Fragmentgrößen und eine zirkuläre Plasmid-Restriktionskarte enthalten. Da die Restriktionskarte von pBR322 bekannt ist, wird den Studenten die Identität des Plasmids nicht mitgeteilt. Da dieser Kurs jedes Jahr unterrichtet wird, wird die Plasmididentität jedoch nie preisgegeben und der Satz der verwendeten Restriktionsenzyme wird jedoch jedes Jahr geändert, da die Schüler repräsentative Gele herstellen und in der Lage sein müssen, die zur Konstruktion der Karte verwendete Logik zu erklären, indem sie die Identität der Plasmid wäre von geringem Nutzen.

Jeder Satz von vier Restriktionsenzymen, der in einem Jahr verwendet wird, enthält zwei Enzyme, die das Plasmid einmal schneiden, und zwei, die entweder zwei- oder dreimal schneiden. Eines der einzelnen schneidenden Enzyme wird willkürlich am Basenpaar Null des Plasmids platziert, und die Schüler werden angewiesen, andere Restriktionsstellen relativ zu dieser Enzymstelle zu kartieren.Fünf verschiedene Sätze von Enzymen, die zum Schneiden von pBR322 verwendet werden, sind unten angegeben (siehe Tabelle II). Diese Sätze funktionieren gut und haben immer interpretierbare Ergebnisse geliefert.

Set 1 2 einstellen Set 3 4 . einstellen 5 . einstellen
Bam HI (1) Öko-RI (1) Öko-RI (1) Öko-RI (1) Bam HI (1)
Ava I (1) Ava I (1) Hink II (2) Ava I (1) Ava I (1)
Hink II (2) Hink II (2) Rsa ich (3) Bsr BI (2) Bsr BI (2)
Rsa ich (3) Rsa ich (3) Sph I (1) Rsa ich (3) Hink II (2)
  • Jeder Satz enthält entweder Bam HI oder Eco RI als Referenzstelle, die bei Basenpaar Null des Plasmids angegeben ist. Die in Klammern angegebene Zahl gibt die Zahl der Endonukleasestellen in pBR322 an.

Wie aus repräsentativen Gelen hervorgeht, stellen mehrere Datenbits routinemäßig Herausforderungen für die Schüler dar und liefern hervorragende Beispiele für die Mehrdeutigkeit jeder Art von Datenanalyse sowie die Notwendigkeit einer sorgfältigen Beobachtung und Vorhersage der erwarteten Ergebnisse. In Set 2 produzieren Hinc/Rsa-Doppelverdaus ein 60 Basenpaar-Fragment, das fast nie sichtbar ist lösen Sie die beiden Fragmente. Das gleiche gilt für die 931 und 879 Basenpaarfragmente, die durch einen BglI/Eco RI-Doppelverdau hergestellt wurden. In diesem Fall ist das Dublett deutlicher, da es sich heller färbt als das größere DNA-Fragment darüber auf dem Gel. Mehrere Enzymgruppen produzieren Fragmente von 124–160 Basenpaaren, aber ihre Anwesenheit ist normalerweise leichter abzuleiten. Die Figurenlegenden kennzeichnen diese und andere Herausforderungen in den Daten.

Während jede Endonuklease, die das Plasmid nur einmal schneidet, als „Basenpaar Null“ verwendet werden kann, muss man ein Enzym wählen, das sehr zuverlässig schneidet. Sowohl Eco RI als auch Bam HI erfüllen diesen Zweck gut.

Bewertung des studentischen Lernens

Das Lernen der Studenten wurde durch die Beobachtung der Laborarbeit und schriftlichen Berichte durch die Lehrkraft, durch jährliche Kursbewertungen und durch eine webbasierte Umfrage unter Studenten bewertet, die in den letzten drei Jahren Molekularbiologie an der Lawrence University studiert haben.

Die Zunahme der studentischen Wahrnehmung ihrer Fähigkeiten und des Verständnisses der Labortechniken und -konzepte dieses Laborprojekts wurde direkt durch eine webbasierte Umfrage unter 33 Studenten des Studiengangs Molekularbiologie der Lawrence University bewertet. Befragt wurden alle Studierenden, die in den letzten zwei Jahren Molekularbiologie belegt hatten und noch auf dem Campus waren (21 Studierende) sowie 12 Absolventen, für die E-Mail-Adressen verfügbar waren. Die Gesamtrücklaufquote betrug 69 %. Die Befragten wurden gebeten, ihre Fähigkeit und ihr Selbstvertrauen bei der Durchführung bestimmter Laborfertigkeiten sowie ihr konzeptionelles Verständnis der Techniken auf einer Skala von 0–6 retrospektiv vor und nach der Einnahme von Molekularbiologie zu bewerten (Fragen finden Sie in Tabelle III ). Die Studierenden wurden auch gebeten, schriftliche Kommentare zu positiven und negativen Aspekten der Laborerfahrung abzugeben. 16 der 22 Befragten entschieden sich für längere Antworten, die alle sehr positiv waren.

F3: Verständnis für die richtige Verwendung von Mikropipetten
F4: Herstellung eines Agarosegels
F5: Verwendung eines Agarosegels zur Trennung von DNA-Fragmenten (Laden, Laufen, Färben des Gels)
F6: Berechnung und Verdünnung von Stammlösungen (wie bei Doppelverdauen)
F7: Interpretieren von Daten aus einem Agarosegel (einschließlich Bestimmung der DNA-Fragmentgrößen)
F8: Verstehen, wie Restriktions-Digests funktionieren
F9: Verständnis der Prinzipien der Gelelektrophorese
F10: Verständnis der Restriktionszuordnung
  • Die Befragten wurden gebeten, ihre Fähigkeiten (Q3-7) oder ihr Verständnis (Q8-10) sowohl vor als auch nach der Einnahme von Molekularbiologie auf einer Skala von 0-6 einzustufen, wobei 0 = keine Fähigkeit oder kein Verständnis und 6 = der Fähigkeit vollständig fähig ist oder vollständiges Verständnis des Konzepts.

Insgesamt wurde das Selbsteinschätzungsverständnis der Studierenden für gängige molekularbiologische Labortechniken nach Abschluss des Restriktionskartierungsprojekts erheblich verbessert. Dies wird durch den Vergleich der Studentenrankings der einzelnen Techniken vor der Einschreibung in den Kurs und nach dem Abschluss des Projekts deutlich. Der Anstieg des Konfidenzniveaus reichte von 2,31 bis 3,48 Punkten, was einer Steigerung des Verständnisses von 39–58 % entspricht. Im Durchschnitt bewerteten die Studierenden ihr Verständnis jeder Technik nach Abschluss der Laborübung um 2,9 Punkte höher als das Ranking der Technik vor der Einschreibung in den Kurs.

Die getrennte Bewertung der Konfidenzniveau-Rankings von Absolventen und Studenten spiegelte das Gesamtantwortmuster wider (Daten nicht gezeigt). Studenten, die derzeit an der Lawrence University immatrikuliert sind, und Studenten, die ihre Bachelor-Anforderungen inzwischen abgeschlossen haben, berichteten jeweils über eine allgemeine Zunahme ihres Vertrauensniveaus in jede Technik. Die Antworten der Studenten zeigen einen Anstieg des Konfidenzniveaus im Bereich von 2,64–4,09 Punkten oder eine Zunahme des Verständnisses von 44–68 %. Die Bewertungen neuer Absolventen zeigen einen moderateren Anstieg von 23 bis 44%, hauptsächlich weil diese Studenten ihre Fähigkeiten und ihr Verständnis vor dem Studium der Molekularbiologie höher einschätzten als die derzeitigen Studenten.

Auf die Frage nach Kommentaren zum Projekt gaben die Befragten äußerst positive Antworten. Zehn der 16 freiwilligen Antworten stammten von Studierenden, die noch an der Universität teilnehmen, während die restlichen sechs von Hochschulabsolventen stammten. Im Großen und Ganzen unterschieden sich die Antworten zwischen den beiden Gruppen nicht merklich, obwohl die Studierenden die erlernten Fähigkeiten größtenteils nicht auf andere Studiengänge oder Aspekte ihres Berufslebens anwenden konnten. Aus diesem Grund kommentierten die Studenten ständig die Nützlichkeit der Wiederholung von Techniken und die Bedeutung des Verfassens eines zusammenhängenden Laborberichts. Ein Student sagte großzügig: „Wenn es eine Klasse gibt, die mir das Gefühl gab, ein kompetenter Biologe zu sein … es war Molecular, hauptsächlich aufgrund der praktischen Erfahrung, die bei der Durchführung des Restriktionslabors erforderlich ist“, während ein anderer sagte, dass „die Wiederholung sehr wertvoll war … und ich“ Ich habe festgestellt, dass mir die Techniken und Konzepte stärker geblieben sind, als ich es bei anderen Kursen erlebt habe.“ Auch die Absolventinnen und Absolventen schätzten die Wiederholung von Labortechniken und die Auseinandersetzung mit dem wissenschaftlichen Schreiben, lobten aber meist auch den Wert der selbstständigen Laborarbeit als Vorbereitung auf die wissenschaftliche Ausbildung. Ein Befragter kommentierte begeistert: „Die Fähigkeiten, die ich im Molekularbereich erlernt habe, insbesondere die aus dem Restriktionskartierungslabor, haben mich in meiner jetzigen Position sehr erfolgreich gemacht. Tatsächlich hat mein tiefes Verständnis, das ich durch die Wiederholung des Labors gewonnen habe, es mir ermöglicht, die Aufgabe zu übernehmen, neuen Doktoranden genau die gleichen Fähigkeiten beizubringen …“ Ein anderer sagte anerkennend: „Ich bin jetzt ein Doktorand, der täglich molekulare Techniken anwendet Basis. Ich habe festgestellt, dass ich VIEL qualifizierter war als meine Kollegen von anderen Universitäten. Andere Studenten hatten ähnliche Techniken angewendet, verstanden sie aber nicht wirklich und waren sicherlich nicht bereit, selbstständig in einem Labor zu arbeiten – ich war es.“ Diese typischen Kommentare unterstreichen die Bedeutung der Wiederholung für das praktische Lernen und die Entwicklung von Problemlösungskompetenzen.

Jedes Jahr wurden schriftliche Stellungnahmen unter Verwendung eines Standardformulars für die Bewertung von Universitätslehrgängen eingeholt. Obwohl keine einzelne Frage dazu gedacht war, die Wirkung dieses einen Labors zu bewerten, forderten mehrere Fragen Kommentare zur Laborarbeit auf. Die Antworten aus 45 Evaluierungen aus den Jahren 2001–2004 sind im Folgenden zusammengefasst. Als Antwort auf die Frage „Haben Sie durch die Erfahrungen im Labor Ihr Verständnis der Prinzipien und Methoden der Materie verbessert?“ Die meisten Schüler antworteten einfach mit „Ja“, aber die folgenden Antworten sind typisch für diejenigen, die zusätzliche Kommentare geschrieben haben:

„Das Labor zur Kartierung von Restriktionsenzymen war wirklich nett und hilfreich, um zu lernen, wie man Gele laufen lässt und sie liest.“

„Ich war sehr aufgeregt, viele der Protokolle zu machen, von denen ich zuvor nur gelesen hatte.“

„Die praktische Erfahrung mit den wichtigsten Techniken hat dir auf seltsame Weise ein Gefühl von Macht gegeben.“

Als Antwort auf die Frage „Welche Aufgaben haben Ihrer Meinung nach am meisten dazu beigetragen, die Ziele des Kurses zu erreichen, und warum?“ Folgende Antworten waren typisch:

„Der erste Laborbericht [Restriction Mapping] war hart. Ich war wahrscheinlich nicht darauf vorbereitet, aber ich denke, das liegt eher an meiner Unerfahrenheit als am Kurs. Die Laborberichte haben uns geholfen, das im Labor Gelernte zu analysieren.“

„Unser Kartierungslabor hat mir sehr geholfen, dieses Thema zu verstehen.“

„Der Aufbau der Laborberichte hat uns gezwungen, wie ein Molekularbiologe zu denken.“

Die Beobachtungen des Lehrers bestätigen die Wahrnehmung der Schüler von verbesserten Fähigkeiten und Verständnis. Praktisch alle Schüler sind anfangs verwirrt, wenn sie mit ihren ersten Elektrophoreseergebnissen konfrontiert werden, und alle Schüler haben Fragen, wie sie die Pufferbedingungen ändern können, wenn ein zweites Restriktionsenzym zu einer Reaktion hinzugefügt wird. Dass die Studierenden diese Fähigkeiten beherrschen, liegt auf der Hand, da alle Studierenden schließlich in der Lage sind, komplexe Restriktionsfragmentmuster in Agarosegelen für ihre schriftlichen Berichte herzustellen und zu interpretieren.


Gehen Sie weiter und führen Sie Ihre RNA- und DNA-Extraktionen mit Zuversicht durch

Als Wissenschaftler wollen wir natürlich genau wissen, was bei unseren Experimenten vor sich geht und Fehler beheben können, ohne vorher den technischen Service rufen zu müssen.

Ich hoffe, dass dieser Artikel dazu beiträgt, einige der wissenschaftlichen Erkenntnisse rund um die Silica-Spinfilter-Methode für RNA- und DNA-Extraktionen zu klären, damit Sie Ihre eigenen Diagnosen und Korrekturen erstellen können. Wenn Sie also den technischen Service anrufen, haben Sie zuerst einige der wahrscheinlichsten Ursachen für Probleme überprüft und können viel schneller zu einer Lösung gelangen, anstatt viel Unsinn zu machen. Auch wenn das ein kostenloses Ersatz-DNA-Extraktionskit ist!

Irgendwelche Fragen? Irgendwelche anderen Probleme mit Silica-Spinfilter-Vorbereitungen, die Sie nicht verstehen? Lassen Sie es uns wissen oder stellen Sie eine Frage in unserem Abschnitt "Fragen" und wir diskutieren!

Ursprünglich veröffentlicht am 28. Juni 2010. Aktualisiert und überarbeitet am 11. Juli 2015.


Verdünnen Sie DNA-Plasmide mit destilliertem Wasser - Biologie

Projekt 1: Screening auf P-transponierbare Elemente in einem Wild-Type
Stamm von Drosophila melanogaster

Projekt 2: Isolierung und Charakterisierung von Mutationen
In Drosophila melanogaster

Projekt 1: Screening auf P-transponierbare Elemente in einem Wildtyp-Stamm von Drosophila melanogaster

Projektübersicht
Die Genome vieler Wildtypstämme der Fruchtfliege Drosophila melanogaster enthalten P-Elemente. P-Elemente sind wie andere transponierbare Elemente eine der Hauptursachen für Mutationen und spielen eine wichtige Rolle in der Evolution. P-Elemente sind kurze DNA-Abschnitte, die sich im Genom bewegen können. Wie weit verbreitet sind P-Elemente in wilden Fruchtfliegenpopulationen? Besitzt jeder in freier Wildbahn isolierte D. melanogaster-Stamm die Transposons? Sind alle P-Elemente, die in wilden Fruchtfliegen vorkommen, gleich? Um diese Fragen zu beantworten, soll in diesem Projekt untersucht werden, ob auf diesem Campus isolierte Wildtyp-Stämme von D. melanogaster P-Elemente in ihrem Genom enthalten. Sie führen dieses Projekt in 8 Laborsitzungen durch. Sie werden genomische DNA aus Wildtyp-Fruchtfliegen isolieren und versuchen, P-Element-Sequenzen aus der DNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachzuweisen und zu amplifizieren. Anschließend lassen Sie ausgewählte P-Element-PCR-Fragmente sequenzieren und vergleichen diese Sequenzen anhand eines bioinformatischen Ansatzes miteinander und mit bekannten P-Element-Sequenzen. Um eine Positivkontrolle herzustellen, werden Sie große Mengen an Wildtyp-P-Element-DNA herstellen, indem Sie Bakterienzellen mit einem rekombinanten Plasmid transformieren, das das P-Element in voller Länge enthält, das Plasmid aus den Zellen isolieren und das P-Element-enthaltende . reinigen Fragmente durch PCR und Gelelektrophorese.

Einführung

Drosophila P-Elemente
Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein idealer Modellorganismus für den Einsatz in genetischen und molekularen Analysen (weitere Informationen zu Drosophila melanogaster siehe Projekt 2). Die Genome vieler Wildtyp-Stämme von Drosophila melanogaster enthalten P-Elemente. P-Elemente sind kurze DNA-Abschnitte (<=2,9 Kilo Basenpaare [kb]), die transponierbare Elemente sind, oder Transposons (oder “springende Gene”), das heißt, sie können physikalisch von einem Chromosom ausgeschnitten und zu einem anderen wandern , oder sie können sich innerhalb eines Chromosoms von Punkt zu Punkt bewegen. P-Elemente variieren in der Länge, sind aber alle von der 2,9 kb vollständigen P-Element-Sequenz abgeleitet, die für eine Transposase kodiert (das Enzym, das seinen eigenen DNA-Abschnitt ausschneidet und bewegt). Das vollständige P-Element ist eigentlich mehr als nur das Transposase-Gen, und seine Derivate sind normalerweise unvollständig, aber der Einfachheit halber bezeichnen wir das P-Element fortan als unser “-Gen von Interesse.” Transposons sind weit verbreitet in der Natur und relativ leicht in einer bekannten DNA-Sequenz nachzuweisen, da die Transposase durch die Erkennung eines charakteristischen Transposon-Merkmals funktioniert: flankierende invertierte Wiederholungen. Wenn sich ein Transposon bewegt, springt oft nur ein Teil der DNA-Sequenz an eine neue Stelle und ein Teil der Gensequenz bleibt an der ursprünglichen Position zurück. Obwohl die Länge der P-Elemente zwischen 0,5 und 2,9 kb variieren kann, sind daher alle an den 31 Basenpaaren (bp) flankierenden invertierten Wiederholungen (dem “Transposon Footprint”) erkennbar. Eine unvollständige Exzision und Bewegung von P-Elementen führt auch zu einer hohen Kopienzahl, d. h. zum Vorhandensein vieler Kopien eines Teils oder des gesamten P-Elements, die über das gesamte Drosophila-Genom verstreut sind. Da das Ziel unseres Experiments der Nachweis von P-Elementen in einer Wildtyp-Population von Drosophila melanogaster ist, passt ihre hohe Kopienzahl gut zu unserem Zweck.

Rekombinante DNA-Technologie
Die relativ neue Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie hat es biologischen Forschern ermöglicht, große Fortschritte beim Verständnis der Strukturen und Funktionen von Genen zu machen. Vor der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie waren die komplexen Genome von Eukaryoten äußerst schwierig zu analysieren. Die rekombinante DNA-Technologie ermöglicht es Forschern, große Genome in spezifische Fragmente zu zerlegen, die dann in ein DNA-Molekül einer anderen Spezies, beispielsweise eines Bakteriums, eingefügt und relativ einfach analysiert werden können. Das DNA-Molekül, in das die Fragmente eingefügt werden, wird als Vektor bezeichnet, und rekombinante DNA-Moleküle können hergestellt werden, indem DNA-Fragmente von fast jeder Spezies in einen Vektor eingefügt werden. Rekombinante DNA-Moleküle werden üblicherweise durch das Transformationsverfahren in bakterielle "Wirts"-Zellen eingeführt. Die zum Konstruieren rekombinanter DNA-Moleküle verwendeten Vektoren sind normalerweise replikationsfähig, so dass das rekombinante DNA-Molekül, sobald es sich in einer Bakterienzelle befindet, repliziert wird, was zur Amplifikation (Replikation vieler Kopien) eines spezifischen DNA-Fragments führt. Kopien des rekombinanten DNA-Moleküls werden nach der Zellteilung an jede Tochterzelle weitergegeben. Die Insertion eines DNA-Fragments in einen Vektor und die anschließende Replikation des rekombinanten DNA-Moleküls wird oft als "DNA-Klonierung" bezeichnet. Die Fähigkeit, viele Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz herzustellen, war bei der Analyse der Genstruktur und -funktion äußerst hilfreich. Das Humangenomprojekt und andere Genomprojekte wären ohne rekombinante DNA-Technologie unmöglich. Darüber hinaus können Gene, die für medizinisch und industriell wichtige Polypeptide kodieren, in Vektoren eingefügt und in Wirtszellen erhalten und amplifiziert werden. Wirtszellen, die in der Lage sind, die Polypeptidprodukte dieser rekombinanten Gene zu synthetisieren, stellen ein Mittel zur Herstellung großer Mengen wichtiger Moleküle bereit. Beispielsweise wird Insulin, das für die Behandlung einiger Diabetes-Typen notwendig ist, von Bakterienzellen, die das Humaninsulin-Gen aus einem rekombinanten Vektor exprimieren, kostengünstig und in großen Mengen hergestellt. Die rekombinante DNA-Technologie wurde durch die Entdeckung und Entwicklung einer Reihe wichtiger "Werkzeuge" ermöglicht - von denen einige unten diskutiert werden.

Restriktionsenzyme
Restriktionsendonukleasen (oder Restriktionsenzyme), die Ende der 1960er Jahre entdeckt wurden, sind wertvolle Werkzeuge zur Charakterisierung und Manipulation von DNA-Molekülen. Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die spezifische Nukleotidsequenzen, oft 4, 6 oder 8 bp lang, erkennen und DNA nur an diesen Sequenzen schneiden. Jedes Restriktionsenzym erkennt seine eigene spezifische Nukleotidsequenz, die als "Restriktionsstelle" bezeichnet wird. Es gibt viele verschiedene Restriktionsenzyme, die viele verschiedene Nukleotidsequenzen erkennen und schneiden. Restriktionsenzyme werden von Bakterien als Abwehr gegen das Eindringen fremder DNA - insbesondere von Bakteriophagen - produziert. Ein Bakterium modifiziert seine eigene DNA, um die DNA vor Restriktionsenzymen zu schützen. Fremd-DNA, die ihren Weg in die Bakterienzelle findet, wird von den Restriktionsenzymen der Zelle erkannt und verdaut oder "eingeschränkt". Restriktionsenzyme werden aus Bakterienzellen zur Verwendung in molekularbiologischen Experimenten gereinigt.

Durch Schneiden eines gegebenen DNA-Stücks mit spezifischen Restriktionsenzymen können wir die Orte der Restriktionsstellen für diese Enzyme auf dieser DNA bestimmen und eine "Restriktionskarte" der gegebenen DNA erzeugen. Wir können die unterschiedlich großen Fragmente identifizieren, die aus dem Verdau eines bestimmten DNA-Stücks mit einem bestimmten Restriktionsenzym resultieren, indem wir die restriktionsverdaute DNA auf einem Agarosegel "elektrophoresieren", wie in gezeigt Abbildung 1. Kurz gesagt wird die verdaute DNA (bestehend aus einer Mischung von vielen Kopien von jedem dieser drei Fragmente) in eine der Probenvertiefungen an einem Ende eines Agarose-Elektrophoresegels geladen. Über das Gel wird eine Spannung angelegt, so dass die Probenvertiefungen der negativen Elektrode am nächsten sind und das entfernte Ende des Gels der positiven Elektrode am nächsten ist. DNA hat eine negative Nettoladung und wandert (bewegt) sich daher durch das Gel zur positiven Elektrode (dieser Vorgang wird Elektrophorese genannt). Das Gel besteht aus einer porösen Matrix, die wie ein Molekularsieb wirkt. Kleinere DNA-Fragmente bewegen sich schneller durch das Gel als größere DNA-Fragmente. Nachdem die Elektrophorese der verdauten DNA eine gewisse Zeit lang durchgeführt wurde, wird diese gestoppt und die DNA im Gel wird angefärbt, um sie sichtbar zu machen. Die DNA ist oft als diskrete Banden sichtbar. Jede Bande stellt eine Ansammlung vieler DNA-Fragmente dar, die alle die gleiche Größe haben und somit die gleiche Strecke im Gel gewandert sind. Restriktionsenzyme ermöglichen es uns auch, große Genome in spezifische, kleine Fragmente zu zerlegen, die in Vektoren eingefügt werden können, um rekombinante DNA-Moleküle herzustellen.

Erzeugung rekombinanter DNA-Moleküle
Die Kombination zweier unterschiedlicher DNA-Moleküle wird dadurch erleichtert, dass viele Restriktionsenzyme an ihren Schnittstellen kurze Bereiche einzelsträngiger DNA hinterlassen. Dies führt zur Bildung von kohäsiven oder "klebrigen" Enden an den Restriktionsstellen. Wenn zwei DNA-Moleküle mit demselben Restriktionsenzym geschnitten werden, haben sie komplementäre klebrige Enden, die durch Basenpaarung mit Hilfe von Enzymen, die DNA-Ligasen genannt werden, miteinander verbunden (ligiert) werden können.

Figur 2 zeigt ein Beispiel für einen Fall, in dem sowohl eine zirkuläre Vektor-DNA als auch menschliche genomische DNA mit dem Restriktionsenzym EcoR I geschnitten werden, das die Restriktionsstelle erkennt

und schneidet zwischen G und A an beiden Strängen, wobei kurze Überhänge von einzelsträngiger DNA auf beiden Seiten der Restriktionsstelle zurückbleiben. Wenn dieser bestimmte Vektor nur eine EcoR I-Stelle hat, führt der Verdau zu einem linearen Vektor mit zwei klebrigen Enden, der wie folgt aussieht (N steht für ein beliebiges Nukleotid):

Ein klebriges Ende eines DNA-Moleküls kann sich aufgrund der komplementären Paarung zwischen Nukleotidbasen in den einzelsträngigen Überhängen, die an den Restriktionsstellen erzeugt werden, mit einem klebrigen Ende eines anderen DNA-Moleküls verbinden oder daran anlagern:

-------------------------------------------Diese Basen können sich mit diesen Basen paaren

Der Verdau von humaner genomischer DNA mit EcoR I führt zu einer sehr großen Anzahl linearer DNA-Moleküle mit klebrigen Enden, die zu den klebrigen Enden der verdauten Vektor-DNA komplementär sind. Jedes dieser humanen DNA-Fragmente kann mit der Vektor-DNA durch Basenpaarung zwischen komplementären klebrigen Enden kombiniert werden. Die verdauten DNA-Moleküle werden zusammen in Lösung gebracht, und die klebrigen Enden treffen sich, wenn sich die DNA-Moleküle zufällig in der Lösung bewegen und aneinanderstoßen. Die Behandlung mit einem DNA-Ligase-Enzym verbindet die DNA-Moleküle, die Basenpaare aufweisen, kovalent, um ein ringförmiges, rekombinantes DNA-Molekül zu bilden. Das DNA-Fragment, das mit der Vektor-DNA ligiert wird, wird als "Insert" bezeichnet.

Rekombinante Moleküle können auch durch Verdauen von Vektor-DNA mit einem Gemisch aus zwei verschiedenen Restriktionsenzymen und Verdauen der zu klonierenden DNA mit denselben zwei Restriktionsenzymen hergestellt werden. Dieser Vorgang wird "direktionale" Klonierung genannt, da die Insert-DNA in einer spezifischen Orientierung in die Vektor-DNA gespleißt wird, wie in Fig. 3 gezeigt.

Vektoren
Bei der Erzeugung rekombinanter DNA-Moleküle können mehrere verschiedene Vektortypen verwendet werden. Diese Vektoren stammen von Bakteriophagen (Viren, die Bakterienzellen infizieren), Bakterien, aber auch von Eukaryoten wie Hefen. In diesem Labor verwenden wir einen bakteriellen Vektor, und diese Diskussion beschränkt sich auf Phagen und bakterielle Vektoren. Eine gute Diskussion eukaryotischer Vektoren findet sich in Kapitel 10 des Lehrbuchs, Griffiths, A.J.F., W.M. Gelbart, J. H. Miller und R. C. Lewontin (1999). Moderne genetische Analyse. New York. NS. Freeman und Co. Einige nicht-eukaryotische Vektoren, die häufig verwendet werden, umfassen:

Plasmide
Plasmide sind kleine, zirkuläre DNA-Moleküle. Plasmide können durch Transformation in kompetente Bakterienzellen eingeführt werden. Innerhalb der Bakterienzelle existiert ein Plasmid und repliziert sich unabhängig vom viel größeren Bakteriengenom, wie in 4 dargestellt. Plasmide können (und wurden) manipuliert, um Gene zu tragen, die den Zellen, die sie enthalten, Resistenz gegen spezifische Antibiotika verleihen. Plasmide können auch Gene tragen, die für bestimmte Enzyme kodieren, die verwendet werden können, um Bakterienzellen zu "markieren", indem die Zellen auf die Anwesenheit dieser Enzyme untersucht werden. Da Plasmide in Bakterienzellen replizieren, ermöglichen sie die Amplifikation des inserierten DNA-Moleküls in viele Kopien. Ein Nachteil von Plasmidvektoren besteht darin, dass sie keine großen Inserts enthalten können. Die meisten Plasmidvektoren können nur Inserts enthalten, die kleiner als 10 Kilobasen (kb) sind (1 kb = 1.000 Basenpaare). In diesem Laborprojekt verwenden wir ein rekombinantes Plasmid namens pPi25.1 (mit freundlicher Genehmigung von B. Engels). pPi25.1 enthält P-Element-Sequenzen. Eine linearisierte Restriktionsschnittstellenkarte von pPi25.1 ist in gezeigt Abbildung 5. Der Plasmidvektor, der Teil des rekombinanten Plasmids pPi25.1 ist, wird pBR322 genannt.

Abbildung 5. Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pPi25.1. Ein P-Element voller Länge und ein Stück flankierender chromosomaler DNA von Chromosomenposition 17C auf jeder Seite davon wurden mit dem Restriktionsenzym aus dem Chromosom geschnitten. BamH1 und inseriert in den ebenfalls mit . geschnittenen Plasmidvektor pBR322 BamH1 (beachten Sie, dass das Plasmid linearisiert gezeigt ist) (von O'Hare, K., Rubin, G. M. 1983. Structures of P transposable elements and their sites of insert and excision in the Drosophila melanogaster Genom.Zelle 34:25-35)

Bakteriophage Lambda Vektoren
Derivate des Bakteriophagen Lambda können verwendet werden, um größere DNA-Fragmente zu klonieren – Fragmente in der Größenordnung von 15 bis 20 kb. Das lineare Phagen-Lambda-Genom kann in einen Klonierungsvektor umgewandelt werden, indem ein Großteil seines zentralen Teils entfernt wird, der dann durch fremde DNA-Fragmente ersetzt werden kann, was zu rekombinanten Molekülen führt. Die rekombinanten Phagen werden dann in E. coli-Wirtsbakterienzellen repliziert.

Cosmid-Vektoren
Cosmidvektoren sind Hybride zwischen Plasmid- und Phagenvektoren. Cosmide können verwendet werden, um Insertfragmente mit einer Länge von bis zu 45 kb zu klonieren. Cosmide können in Bakterienzellen in zirkulärer Plasmidform gehalten werden, und sie können aus den Zellen durch Verpacken in Phagenpartikel gereinigt werden.


Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren zur Herstellung vieler Kopien oder Amplifikation einer bestimmten DNA-Sequenz (wie beispielsweise eines bestimmten Gens oder einer bestimmten Region des Genoms). Die PCR wird unter Verwendung eines Paares spezifischer Primer durchgeführt, die selbst einzelsträngige DNA-Sequenzen sind, normalerweise etwa 20 Basen lang. Ein Primer ist so konzipiert, dass er in der Sequenz zu einer bestimmten Region des Genoms komplementär ist, und ein Primerpaar, das eine bestimmte Region des Genoms flankiert, wird verwendet, um diese genomische Region, die als Matrize bezeichnet wird, zu amplifizieren (viele Kopien davon herzustellen). Die Primer leiten die Replikation der genomischen DNA durch ein Enzym namens Taq DNA Polymerase oder Taq an. Taq-DNA-Polymerase wird aus einem Bakterium namens Thermus aquaticus isoliert, das im sehr heißen Wasser geothermischer Quellen lebt und dessen Enzyme alle bei hohen Temperaturen aktiv sind. Taq DNA Polymerase ist bei 94 °C stabil und bei 72 °C optimal aktiv. Eine PCR-Reaktion findet in einem Mikrozentrifugenröhrchen (auch "Eppendorf-Röhrchen" genannt) statt. Die Reaktionsmischung enthält normalerweise genomische DNA (Templat), Primerpaare, Taq, freie Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs – A, C, T und G) und die geeigneten Puffer und Salze, einschließlich Magnesium – ein notwendiger Cofaktor für das Taq-Enzym. Das Mikrozentrifugenröhrchen mit der Reaktionsmischung wird in einen Thermocycler (eine Maschine zum Variieren der Temperatur über eine voreingestellte Anzahl von Zyklen) gegeben. Bei der PCR wird genomische DNA erhitzt, um die doppelsträngigen DNA-Moleküle zu denaturieren und sie einzelsträngig zu machen Denaturierungsschritt) Das Reaktionsgemisch wird dann abgekühlt, sodass Primer an komplementäre Sequenzen auf gegenüberliegenden Strängen der genomischen DNA des Templates anlagern können (durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Basen: AT, GC), die das zu amplifizierende DNA-Segment flankieren (Dies ist das Annealing). Die Reaktion wird dann auf eine Zwischentemperatur gebracht, und unter Verwendung freier Desoxyribonukleotide, die dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, verlängert die Taq-DNA-Polymerase diese Primer von ihren 3'-Enden aufeinander zu, wie in Abbildung 6 gezeigt (dies wird als Extension bezeichnet). , oder Elongationsschritt). Dies repliziert die Region zwischen den beiden Primern und erzeugt zwei doppelsträngige DNA-Moleküle aus dem ursprünglichen. Nachdem diese Replikationsrunde abgeschlossen ist Anschließend wird die Reaktionsmischung erhitzt, um die doppelsträngigen DNA-Moleküle zu denaturieren, und dann wird die Temperatur gesenkt, damit die Primer wieder anlagern können – diesmal mit der doppelten Anzahl an Templaten. Die Reaktion wird dann wieder auf eine Zwischentemperatur gebracht, wodurch eine Verlängerung ermöglicht wird. Dieser Vorgang wird für eine Reihe von Zyklen (normalerweise 20-30 Zyklen) wiederholt, was zur Produktion vieler Kopien der DNA-Matrizensequenz führt. Diese Kopien werden als PCR-Produkt(e) oder "Amplikons" bezeichnet. Wenn alles wie geplant verläuft, sollte sich die Anzahl der Amplikons in jedem Zyklus verdoppeln. Wie viele Kopien eines bestimmten Amplikons sollten wir also bei einem gegebenen Molekül Template-DNA am Ende von 40 Zyklen haben?
Abhängig von der Anzahl der Nukleotidbasenpaare, die zwischen den beiden in einer PCR-Reaktion verwendeten Primern vorhanden sind, werden bei der Reaktion unterschiedlich große DNA-Fragmente (Produkte) erzeugt. Wir können die unterschiedlich großen DNA-Fragmente identifizieren, die aus PCR-Reaktionen resultieren, indem wir das/die Produkt(e) dieser Reaktion auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterziehen.

DNA-Sequenzierung
DNA-Sequenzierungstechniken werden verwendet, um die Basenpaarsequenz eines bestimmten DNA-Fragments zu bestimmen. Derzeit ist die am häufigsten verwendete Methode zur DNA-Sequenzierung automatisiert und basiert auf der Didesoxy-Sequenzierungsmethode von Sanger, die von Fred Sanger entwickelt wurde. Diese Technik verwendet eine DNA-Matrize, die einzelsträngig gemacht wird, und die DNA-Synthese in Gegenwart von Didesoxynukleotiden, denen eine 3'-OH-Gruppe fehlt, so dass sie keine Phosphodiesterbindung bilden können. Didesoxynukleotide können in eine wachsende Kette eingebaut werden, aber sie beenden die Synthese. Jede Sequenzierungsreaktion verwendet vier Reaktionsröhrchen, die jeweils eine DNA-Matrize für die interessierende Sequenz, DNA-Polymerase-Enzym und einen einzelsträngigen DNA-Primer enthalten, der komplementär zu Vektorsequenzen (oder einer anderen bekannten Sequenz neben der zu sequenzierenden DNA) ist. Jedes der vier Röhrchen erhält eine kleine Menge eines von vier verschiedenen Didesoxynukleotiden (ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP) zusammen mit den vier normalen dNTPs. Jedes ddNTP ist mit seinem eigenen einzigartigen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Zum Beispiel kann ddATP grün markiert sein, ddCTP kann blau markiert sein, ddGTP kann lila markiert sein und ddTTP kann rot markiert sein. Die Reaktionsröhrchen werden dann bei der optionalen Temperatur für das DNA-Polymerase-Enzym inkubiert. Das DNA-Polymerase-Enzym beginnt am Primer und synthetisiert einen neuen DNA-Strang, der komplementär zum sequenzierten DNA-Matrizenstrang ist. In jedem gegebenen Röhrchen werden verschiedene Kettenlängen erzeugt, die jeweils dem Punkt entsprechen, an dem das jeweilige ddNTP eingebaut wurde und das Kettenwachstum beendet wurde. Jeder neu synthetisierte DNA-Strang wird somit mit einer Farbe markiert, die von dem ddNTP abhängt, das sich an seinem 3'-Ende befindet. In jedem der vier Reaktionsröhrchen wird ein spezifischer Satz unterschiedlich langer DNA-Stränge neu synthetisiert. Die Größe hängt davon ab, wo das jeweilige ddNTP zum wachsenden Strang hinzugefügt wurde und die Synthese beendet wurde. Der Wissenschaftler führt dann die Produkte jeder der 4 separaten Reaktionen in derselben Spur eines speziellen elektrophoretischen Gels aus, das als Polyacrylamidgel bezeichnet wird und DNA-Moleküle trennt, die sich in der Größe um ein Nukleotid unterscheiden. Ein Scanner wird dann verwendet, um das Gel zu lesen, die Farbe jeder Bande zu erkennen und so das ddNTP am Ende des Fragments zu bestimmen. Der Scanner liest von der Unterseite des Gels nach oben und bestimmt die Farbe jeder Bande, um die Sequenz des neu synthetisierten Strangs in einem 5’ -? 3’ Richtung. Erkennt der Scanner beispielsweise die folgende Farbabfolge von der Unterseite des Gels nach oben (von den kürzesten zu den längsten neu synthetisierten Fragmenten): Rot, Grün, Blau, Rot, Rot, Violett, Grün, dann ist die Reihenfolge der neu synthetisierter Strang ist 5’-TACTTGA-3’.

BLAST-Suchen und andere bioinformatische Analysen
Einfach ausgedrückt, ist “Bioinformatik” der Einsatz von Computern bei der Analyse biologischer Daten. Bei den bioinformatisch analysierten Daten handelt es sich häufig um Sequenzdaten (entweder Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen). Sobald beispielsweise die Nukleotidbasenpaarsequenz eines bestimmten DNA-Moleküls bestimmt wurde, können Sie es mit einem bioinformatischen Ansatz analysieren. Um die Sequenz zu analysieren, können Sie eine BLAST-Suche durchführen. BLAST steht für Basic Local Alignment Search Tool. Bei einer BLAST-Suche übermitteln Sie eine interessierende Sequenz (die “query”-Sequenz, die in diesem Fall eine Nukleotidsequenz ist) an eine spezielle World Wide Web-Site, die vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) entwickelt und verwaltet wird. . Wenn Sie eine BLAST-Suche durchführen, wird ein Computeralgorithmus verwendet, um Ihre Abfragesequenz mit Sequenzen in den Computerdatenbanken zu vergleichen. Diese können alle bekannten Nukleotidsequenzen oder eine Untergruppe umfassen, auf die Sie Ihre Suche beschränken. Laut der NCBI-Website


“ BLAST findet Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen. Das Programm vergleicht Nukleotid- oder Proteinsequenzen mit Sequenzdatenbanken und berechnet die statistische Signifikanz von Übereinstimmungen. BLAST kann verwendet werden, um funktionelle und evolutionäre Beziehungen zwischen Sequenzen abzuleiten sowie Mitglieder von Genfamilien zu identifizieren.”

Wenn die BLAST-Suche abgeschlossen ist, erhalten Sie eine Liste aller Sequenzen, die Ähnlichkeitsbereiche mit Ihrer Abfragesequenz teilen. Der Ähnlichkeitsgrad, den jede Sequenz mit der Abfrage teilt, wird basierend auf mehreren unterschiedlichen Bewertungen bewertet, und die Sequenzen werden in absteigender Reihenfolge der Ähnlichkeit mit der Abfragesequenz geordnet. Eine BLAST-Suche kann Ihnen sagen, welche anderen Sequenzen (durch Evolution) mit Ihrer verwandt sind. Es gibt zahlreiche weitere Möglichkeiten, Sequenzen bioinformatisch zu analysieren, die wir im Unterricht und im Labor diskutieren.

Dieses Laborprojekt

Transformation von Bakterienzellen mit rekombinanten Molekülen
Wir haben eine sehr kleine Menge eines rekombinanten Plasmids namens pPi25.1 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von B. Engels). pPi25.1 enthält P-Element-Sequenzen. Wir werden E. coli-Bakterienzellen verwenden, um die Massenmengen dieses Plasmids herzustellen, die wir benötigen. Dazu wird das Plasmid durch den Transformationsprozess in E. coli-Zellen eingebracht. Die zu transformierenden Bakterienzellen müssen zunächst auf besondere Weise behandelt werden, um sie "kompetent" zu machen, Fremd-DNA aufzunehmen. Bei der Transformation nehmen kompetente Bakterienzellen unter besonderen Bedingungen fremde DNA-Moleküle aus dem umgebenden Medium auf.

Selektion von Zellen, die Plasmide enthalten
Der Plasmidvektor, der Teil des rekombinanten Plasmids ist, das das P-Element enthält, wird pBR322 genannt. Eine einfache Karte von pBR322 wird bereitgestellt. pBR322 enthält ein Gen, das den Zellen, die das Plasmid tragen, eine Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin verleiht. Zellen, die pBR322 tragen, können daher von Zellen ohne pBR322 unterschieden und gereinigt werden, indem das Zellgemisch mit und ohne das Plasmid auf einem Ampicillin enthaltenden Medium gezüchtet wird. Zellen mit pBR322 gedeihen auf dem ampicillinhaltigen Medium, während das Antibiotikum Zellen, denen das Plasmid fehlt, am Wachstum auf den Platten hindert. PBR322 enthält auch ein weiteres Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Tetracyclin bietet. Außerdem besitzt pBR322 einzelne Restriktionsstellen für viele häufig verwendete Restriktionsenzyme (jedes dieser Enzyme schneidet somit pBR322 nur an einer bestimmten Stelle, wodurch das Plasmid linearisiert wird). Viele dieser Restriktionsstellen befinden sich innerhalb des Tetracyclin-Resistenzgens. Die Insertion von fremden DNA-Fragmenten (wie Drosophila P-Element-Sequenzen) in diese Restriktionsschnittstellen wird somit das Tetracyclin-Resistenzgen zerstören, was es unfähig macht, eine Resistenz gegen Tetracyclin bereitzustellen. Zellen, die rekombinante Plasmide mit P-Element-Sequenzinserts im Tetracyclin-Resistenzgen tragen, wachsen nicht auf Platten, die Tetracyclin enthalten.

In diesem Projekt plattieren Sie Zellen, die Sie mit pPi25.1 und mit dem Kontrollplasmid pBR322 zu transformieren versucht haben, auf zwei verschiedene Arten von Nähragarplatten. Die erste Art von Platten enthält Ampicillin. Die zweite Art von Platten enthält Tetracyclin.

Was erwarten Sie auf den verschiedenen Platten, die Sie einrichten werden?

Amplifikation von P-Element-spezifischen Sequenzen aus den rekombinanten Plasmiden
Nachdem Sie Ihre p𗜙.1-Plasmid-DNA gereinigt haben, richten Sie eine PCR-Reaktion ein, um die P-Element-Sequenzen spezifisch zu amplifizieren. Die Primer für diese PCR-Reaktion wurden entworfen, nachdem die Nukleotidbasenpaarsequenz des P-Elements untersucht wurde (erhältlich im World Wide Web). Nachdem die PCR-Reaktion abgeschlossen ist, führen Sie die PCR-Produkte auf einem Agarose-Elektrophoresegel aus. Sie suchen auf dem Gel nach einer Bande, die P-Element-Sequenzen enthält, und schneiden diese Bande tatsächlich mit einer Rasierklinge aus dem Gel, um so eine reine Probe der P-Element-DNA für die Sequenzierung und Verwendung als Positivkontrolle für a . vorzubereiten P-Element-Sequenz.
Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von P-Elementen
Um das Vorhandensein von P-Elementen in Ihren genomischen DNA-Proben von Fliegen zu überprüfen, verwenden Sie eine PCR-basierte Strategie. Sie isolieren zunächst genomische DNA aus dem lokalen Stamm sowie aus anderen Stämmen von Drosophila melanogaster. Sie werden das oben beschriebene Paar von PCR-Primern verwenden, um zu versuchen, P-Elemente im Genom des lokalen Stammes von Drosophila zu amplifizieren und nachzuweisen. Sie werden auf dem Gel nach Banden suchen, die P-Element-Sequenzen enthalten können. Sie schneiden mit einer Rasierklinge ausgewählte Banden aus dem Gel und extrahieren die DNA aus der Agarose, um so reine DNA-Proben für die Sequenzierung und Analyse vorzubereiten.
Analyse Ihrer Sequenzdaten mit einem bioinformatischen Ansatz
Nachdem die Nukleotidbasenpaarsequenzen Ihrer PCR-Produkte bestimmt wurden, analysieren Sie diese mit einem bioinformatischen Ansatz. Um die Sequenzen zu analysieren, führen Sie BLAST-Suchen durch. Sie führen auch andere bioinformatische Analysen durch, die wir im Unterricht und im Labor diskutieren.

Überblick über das Lab-Projekt
* = Arbeit mit positiver Kontroll-P-Element-DNA aus rekombinantem Plasmid p𗜙.1
# = Arbeit mit genomischer DNA von Fliegen
*# = Arbeite sowohl mit positiver Kontroll-P-Element-DNA aus rekombinantem Plasmid p𗜙.1 als auch mit genomischer Fliegen-DNA

Laborsitzung 1
1) *Transformieren Sie E. coli-Zellen mit Plasmid, das positive Kontroll-P-Element-DNA enthält, und plattieren Sie die Zellen.

Laborsitzung 2
1) #Beginnen Sie mit der Isolierung genomischer DNA aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster.
2) *Identifizieren Sie Transformantenkolonien auf Ihren Platten aus Laborsitzung 1 und berechnen Sie die Transformationseffizienz.

Laborsitzung 3
1) #Beenden Sie die Isolierung der genomischen DNA aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster.
2) #Einrichten und Durchführen von PCR-Reaktionen, um mutmaßliche P-Element-Sequenzen unter Verwendung von genomischer DNA von Fliegen als Matrize zu amplifizieren. In Sitzung 5 werden Sie eine elektrophoretische Analyse des/der PCR-Produkte(s) durchführen.

Laborsitzung 4
1) *Ihr Lehrer wird 2 ml Kulturen ausgewählter Kolonien von Ihren Platten züchten, die Sie in Sitzung 1 eingerichtet haben.
2) *Sie werden rekombinante Plasmid-DNA, die die P-Element-positiven Kontrollsequenzen enthält, aus diesen kultivierten Zellen isolieren.
3) * Richten Sie eine PCR-Reaktion ein, um spezifisch P-Element-Sequenzen aus dem rekombinanten Plasmid zu amplifizieren. Bewahren Sie diese PCR-Produkte für die elektrophoretische Analyse in Sitzung 5 auf.

Laborsitzung 5
1) *#Laufen Sie ein Gel auf allen PCR-Produkten und isolieren Sie ausgewählte DNA-Banden.

Laborsitzung 6
1) *#Bereinigen Sie die DNA in den Banden, die während der Laborsitzung aus den Gelen ausgeschnitten wurden. 5. Senden Sie die DNA zur Sequenzierung weg.

Laborsitzung 7
1) *#Empfangen und organisieren Sie Ihre Sequenzanalysedaten.

Laborsitzung 8
1) *#Analysieren Sie Ihre Sequenzanalysedaten, indem Sie BLAST-Suchen usw. durchführen. Experimentelle Verfahren

Laborsitzung 1
1. Transformieren Sie E. coli-Zellen mit Plasmid, das positive Kontroll-P-Element-DNA enthält, und plattieren Sie die Zellen.

Während dieser Laborsitzung beginnen Sie mit der Vorbereitung großer Mengen der P-Element-Positivkontroll-DNA. Sie werden ein rekombinantes Plasmid namens p𗜙.1, das P-Element-Sequenzen enthält, in kompetente E.coli-Zellen, "Transformieren" der Bakterienzellen. Anschließend werden die Zellen auf Nähragarplatten ausplattiert, die das Antibiotikum Ampicillin enthalten, das untransformierte Zellen abtötet. Sie werden auch einige Kontrollexperimente durchführen. Sie transformieren E. coli-Zellen mit einem reinen Plasmid namens pBR322, das das Vektorplasmid von p𗜙.1 ist (pBR322 = p𗜙.1 – P-Element-Sequenzen). Sie werden Ihre beiden Sätze transformierter Zellen auf zwei verschiedenen Plattentypen ausplattieren. Eine Art von Platte enthält Ampicillin, während die andere ein anderes Antibiotikum namens Tetracyclin enthält. PBR322 enthält Gene sowohl für die Ampicillin-Resistenz als auch für die Tetracyclin-Resistenz, sodass mit pBR322 transformierte Zellen auf beiden Plattentypen wachsen sollten. Machen Sie nach Beobachtung der Restriktionskarten von p𗜙.1 und pBR322 eine Vorhersage darüber, auf welchen Platten Zellen, die mit diesem rekombinanten Plasmid transformiert wurden, wachsen werden.

Verfahren
1) Besorgen Sie sich zwei Mikrozentrifugenröhrchen mit Plasmid-DNA, markiert mit pBR322 und p𗜙.1, und zwei Mikrozentrifugenröhrchen mit 90 &mgr;l Verdünnungsflüssigkeit (sterile Kochsalzlösung). Pipettieren Sie 10 &mgr;l pBR322-Plasmid-DNA-Probe in eines der Röhrchen mit 90 &mgr;l Verdünnungsflüssigkeit, um eine 10-1-Verdünnung herzustellen. Beschriften Sie dieses Röhrchen mit “pBR322 DNA Only control”. Wiederholen Sie dies für die Plasmid-DNA-Probe p𗜙.1, und legen Sie diese beiden verdünnten (10-1) DNA-Proben für eine Weile beiseite.

2) Besorgen Sie sich ein Mikrozentrifugenröhrchen mit kompetenten E. coli-Zellen und legen Sie es auf Eis.

3) Klopfen Sie vorsichtig mit der Fingerspitze auf das Röhrchen mit den kompetenten Zellen, um sicherzustellen, dass die Zellen gut suspendiert sind.

4) Übertrage mit einer Pipette 0,2 ml (200 &mgr;l) kompetenter Zellen in das Röhrchen, das den Rest der unverdünnten pBR322-Plasmid-DNA enthält. Verschließen Sie das Röhrchen und klopfen Sie mit der Fingerspitze darauf, um die Zellen mit der DNA zu mischen. Legen Sie das Röhrchen für 20 Minuten auf Eis. Die kompetenten Zellen, die in CaCl2 suspendiert sind, beginnen die rekombinante Plasmid-DNA aufzunehmen.

5) Übertrage auf ähnliche Weise mit einer Pipette 0,2 ml (200 &mgr;l) kompetenter Zellen in das verbleibende Röhrchen mit unverdünnter p𗜙.1-Plasmid-DNA. Verschließen und klopfen Sie wie zuvor und stellen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang auf Eis.

6) Übertragen Sie auf ähnliche Weise mit einer Pipette 0,2 ml (200 &mgr;l) kompetenter Zellen in ein Röhrchen mit der Aufschrift “Cells Only”, das nur 5 &mgr;l sterile Kochsalzlösung enthält. Verschließen und klopfen Sie wie zuvor und stellen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang auf Eis.

7) Nach der 20-minütigen Eisbehandlung die drei Röhrchen für 1,5 Minuten in ein 42 °C warmes Wasserbad stellen. Dieser Hitzeschock erleichtert die Aufnahme von DNA durch die Bakterienzellen.

8) Übertragen Sie die Röhrchen 1,5 Minuten lang auf Eis.

9) Geben Sie mit einer Pipette 0,8 ml (800 &mgr;l) LB (L Broth, ein nährstoffreiches Bakterienwachstumsmedium) in jedes Röhrchen, einschließlich der beiden “ DNA Only control” Röhrchen.

10) Die Röhrchen 20 Minuten bei 37 °C inkubieren, dann auf jedes Röhrchen klopfen, um seinen Inhalt gut zu mischen. Stellen Sie sie für weitere 20 Minuten bei 37 ° C zurück. Diese Inkubationszeit ermöglicht es den Zellen, sich von der CaCl2-Behandlung zu erholen und mit der Expression der Ampicillin-Resistenz- und/oder Tetracyclin-Resistenzgene auf dem Plasmid zu beginnen. Mischen Sie den Inhalt jedes Röhrchens durch Klopfen.

11) Sie werden nun Ihre Transformationsmischungen verdünnen, bevor Sie sie auf Selektivagarmedium ausplattieren. Übertrage 0,1 ml (100 &mgr;l) des pBR322-Transformationsgemisches in ein Röhrchen, das 9,9 ml Verdünnungsflüssigkeit enthält. Dies ist eine 1:100 (oder 10-2) Verdünnung. Stellen Sie auch eine 10-3-Verdünnung her, indem Sie 1,0 ml der 10-2-Verdünnung in ein Röhrchen mit 9,0 ml Verdünnungsflüssigkeit überführen

12) Wiederholen Sie Schritt 11 für die p𗜙.1 Transformationsmischung.

13) Unter Verwendung der "Spread-Plating-Technik" (die Ihr Laborlehrer Ihnen erklären und demonstrieren wird), plattieren Sie 0,2 ml (200 µl) jeder der drei Verdünnungen des pBR322-Transformationsgemisches (unverdünnt, 10-2, 10-3) auf LBAmp-Platten und auch auf LBTet-Platten.

14) Wiederholen Sie Schritt 13 für die drei Verdünnungen des p𗜙.1 Transformationsgemisches unter Verwendung von LBAmp- und LBTet-Platten.

15) 0,1 ml (100 µl) der “Cells Only” sowohl auf einer LBAmp- als auch einer LBTet-Platte ausplattieren. Außerdem werden 0,2 ml (200 &mgr;l) von jeder der beiden “DNA Only-Kontrolle” (10-1 Verdünnungen von Plasmid-DNA-Proben + 800 &mgr;l LB) auf separate LB-Platten (Platte mit LB, aber ohne Antibiotikum) ausplattiert.

16) Es sollten insgesamt 16 Teller sein. Inkubieren Sie diese Platten mit der Oberseite nach unten bei 37 °C. Morgen früh wird Ihr Lehrer die Platten zur Lagerung bis nächste Woche in den Kühlschrank stellen.

17) Darüber hinaus muss Ihr Laborlehrer mehrere Verdünnungen (versuchen Sie 3 verschiedene Verdünnungen: 10-4, 10-5, 10-6) von nicht transformierten E. coli-Zellen, die die Amplifikations- und Transformationsverfahren auf Nähragarplatten durchlaufen haben, ausplattieren kein Antibiotikum. Dies dient als Kontrolle, die es Ihnen ermöglicht, den Titer (die Konzentration) der ursprünglichen Zellsuspension zu bestimmen und somit die erzielten Transformationseffizienzen zu berechnen.

Laborsitzung 2
1. Beginnen Sie mit der Isolierung genomischer DNA aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster.
2. Identifizieren Sie Transformantenkolonien auf Ihren Platten aus Laborsitzung 1 und berechnen Sie die Transformationseffizienz.

Während dieser Laborsitzung beginnen Sie auch mit der Isolierung genomischer DNA aus Fruchtfliegen. Sie werden etwa 50 erwachsene Fliegen betäuben und dann in einem speziellen Puffer, der die DNA stabil hält, zermahlen (homogenisieren). Das resultierende Homogenat wird dann mit einem Detergens behandelt, um die Zellmembranen aufzubrechen, und einem Protease-Enzym, um Proteine ​​​​zu zerstören. Schließlich mischen Sie das Homogenat mit einer Kombination aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol und bewahren es bis zur nächsten Laborsitzung im Gefrierschrank auf.
Sie werden auch die Platten, die Sie in der letzten Sitzung vorbereitet haben, auf Bakterienkolonien untersuchen. Sie werden die Anzahl der Kolonien auf jeder Ihrer Platten zählen und die Transformationseffizienz bestimmen. Teil 1. Isolierung genomischer DNA aus Drosophila melanogaster

Verfahren
1) Sie erhalten zunächst ein Fläschchen mit Fruchtfliegen. Betäuben Sie alle Fliegen in der Durchstechflasche, wie von Ihrem Laborlehrer demonstriert. Legen Sie die betäubten Fliegen auf eine weiße Papierkarte und betrachten Sie sie mit einem Seziermikroskop. Weitere Informationen zu Fruchtfliegen finden Sie unter Projekt 2.

2) Üben Sie das Bewegen der Fliegen auf der weißen Papierkarte mit einem feinen Pinsel. Übertragen Sie ungefähr 50 Fliegen in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie das Röhrchen auf Eis.

3) Gib 500 &mgr;l HOM*-Puffer zu den Fliegen im Mikrozentrifugenröhrchen. Homogenisieren Sie die Fliegen mit einem blauen Plastikhomogenisator. Verwenden Sie mehrere Striche und seien Sie nicht zu grob. Fügen Sie dem Röhrchen weitere 500 µl HOM-Puffer hinzu und homogenisieren Sie die Fliegen weiter, bis keine Körperteile mehr zu erkennen sind.

(*HOM: 80 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 160 mM Saccharose, pH 8,0)

4) Übertragen Sie das Homogenat in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie weitere 500 &mgr;l HOM in das ursprüngliche Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und überführen Sie dies dann in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen.

5) 75 &mgr;l 10% SDS und 25 &mgr;l 10 mg/ml Proteinase K hinzufügen.

6) Inkubieren Sie dies für mindestens 1 Stunde bei 68 ° C.
Führen Sie während dieser Inkubation Teil 2 der heutigen Laborsitzung durch.

7) Kühlen Sie es nach der Inkubation bei 68 °C auf Eis ab, bis es Raumtemperatur erreicht hat.

8) Fügen Sie eine Menge Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu, die der Flüssigkeitsmenge in Ihrem Röhrchen entspricht (

2ml) und mischen. Bewahren Sie diese bis zur nächsten Laborperiode im Gefrierschrank auf.

Teil 2. Untersuchung von Transformationsplatten
1) Besorgen Sie sich die Platten, die Sie in der letzten Sitzung vorbereitet haben.

2) Ihr Lehrer zeigt Ihnen, wie Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte effektiv zählen und die Transformationseffizienz bestimmen.

Beenden Sie Teil 1 der heutigen Lab-Sitzung.

Laborsitzung 3
1. Beenden Sie die Isolierung der genomischen DNA der Fruchtfliege Drosophila melanogaster.
2. Richten Sie PCR-Reaktionen mit genomischer DNA als Matrize ein und führen Sie sie durch.

Während dieser Laborsitzung werden Sie den Prozess der Isolierung genomischer DNA aus Fruchtfliegen abschließen. Sie führen eine Reihe von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Extraktionen durch, um Verunreinigungen aus der DNA zu entfernen, und Sie werden die DNA mit Ethanol von anderen Verunreinigungen entfernen. Sie werden Ihre genomische DNA der Fliegen in einem Puffer namens TE auflösen. Schließlich werden Sie PCR-Reaktionen einrichten und durchführen, um mutmaßliche P-Element-Sequenzen unter Verwendung Ihrer genomischen DNA der Fliegen als Vorlage nachzuweisen.

Verfahren
1) Nehmen Sie Ihre Probe aus Laborsitzung 2 aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen.

2) Zentrifugieren Sie Ihre Probe bei 5.000 U/min für 5 Minuten.

3) Übertrage die wässrige (obere) Schicht in ein sauberes 15 ml Zentrifugenröhrchen und füge 1 Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu. Mischen und 5 Minuten bei 5.000 U/min zentrifugieren.

4) Übertragen Sie die wässrige (obere) Schicht in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 1 Volumen Chloroform hinzu. Mischen und 5 Minuten bei 5.000 U/min zentrifugieren.

5) Übertragen Sie die wässrige (obere) Schicht in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 1 Volumen Chloroform hinzu. Mischen und 5 Minuten bei 5.000 U/min zentrifugieren.

6) Überführe die wässrige (obere) Schicht in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und gebe 225 &mgr;l 8 M Kaliumacetat (KOAc) dazu. Mischen und für mindestens 30 Minuten auf Eis legen.

7) Zentrifugieren Sie dies bei 13.000 U/min für 20 Minuten.

8) Den Überstand in ein sauberes Röhrchen überführen und 1 Volumen 95 % Ethanol dazugeben. Inkubieren Sie dies für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die genomische DNA von Drosophila auszufällen.

9) Zentrifugieren Sie dies bei 10.000 U/min für 10 Minuten. Entfernen Sie das Ethanol und lassen Sie das Pellet leicht an der Luft trocknen.

10) Resuspendiere das Pellet in 50 &mgr;l TE-Puffer.

11) Übertragen Sie die gesamte resuspendierte DNA in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und beschriften Sie das Röhrchen entsprechend.

Verfahren
1) Beschriften Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Ihren Initialen und dem Buchstaben Q (für “Quantifizierungsprobe”). Geben Sie 250 &mgr;l destilliertes Wasser in das Röhrchen.

2) Geben Sie mit der 2 µm Mikropipette 0,5 µm DNA aus Ihrer Probe in das Q-Röhrchen. Durch Vortexen gut mischen.

3) Bestimmen Sie die Konzentration Ihrer DNA-Proben mit dem UV-Spektrophotometer. Ihr Lehrer wird es demonstrieren.

4) Beschriften Sie ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen mit Ihren Initialen, Probenabkürzungen und P (für PCR). Berechnen Sie aus Ihren Quantifizierungsdaten das erforderliche Probenvolumen, um 40 ng genomische Drosophila-DNA in das Röhrchen zu geben (dies wird wahrscheinlich zwischen den Proben unterschiedlich sein, und Sie müssen möglicherweise DNA-Aliquots mit TE-Puffer verdünnen). Geben Sie die entsprechende Menge DNA, Primer und PCR-Reaktionsmischung in das Röhrchen und geben Sie es in den Thermocycler. Wenn sich alle Proben im Thermocycler befinden, wird er eingeschaltet und die richtige Anzahl von Zyklen durchlaufen.
Nachdem die PCR-Reaktionen abgeschlossen sind, wird Ihr Lehrer den Thermocycler abschalten und Ihre Proben bis nächste Woche für Sie aufbewahren.
Bewahren Sie den Rest Ihrer genomischen DNA von Drosophila im Gefrierschrank auf.

Laborsitzung 4
1. Ihr Ausbilder hat 2 ml Kulturen ausgewählter Kolonien von Ihren Platten gezüchtet, die Sie in Sitzung 1 eingerichtet haben.
2. Sie werden aus diesen kultivierten Zellen rekombinante Plasmid-DNA isolieren, die die P-Element-positiven Kontrollsequenzen enthält.
3. Richten Sie eine PCR-Reaktion ein, um spezifisch P-Element-Sequenzen aus dem rekombinanten Plasmid zu amplifizieren. Bewahren Sie diese PCR-Produkte für die elektrophoretische Analyse während der Sitzung 6 auf.

Am Nachmittag vor dieser Laborsitzung wählte Ihr Lehrer Bakterienkolonien aus Ihren Platten aus, die Sie in Sitzung 1 erstellt haben. Diese Bakterienkolonien bestehen aus Zellen, die mit dem rekombinanten Plasmid p𗜙.1 (enthält P-Element-Sequenzen) transformiert wurden. Ihr Ausbilder beimpfen 2 ml LB (Nährlösung) + Ampicillin mit jeder Kolonie. Die beimpften Kulturen wurden über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Während dieser Laborsitzung werden Sie Plasmid-DNA aus diesen flüssigen Übernachtkulturen isolieren. Anschließend richten Sie eine PCR-Reaktion ein, um die P-Element-Sequenzen zur Verwendung als Positivkontrolle zu amplifizieren. Sie werden diese PCR-Produkte für die elektrophoretische Analyse während der Sitzung 6 aufbewahren.

Teil 1. Isolierung rekombinanter Plasmid-DNA

Verfahren
1) Jedes Schülerpaar sollte zwei Reagenzgläser mit 2 ml Übernachtkulturen erhalten, die jeweils von einer einzelnen Kolonie von Zellen ausgehen, die mit dem rekombinanten Plasmid p𗜙.1 (enthält P-Element-Sequenzen) transformiert wurden.

2) Gießen Sie 1,5 ml über Nacht in ein entsprechend gekennzeichnetes Mikrozentrifugenröhrchen. Gießen Sie 1,5 ml der anderen Übernachtkultur in ein zweites entsprechend gekennzeichnetes Mikrozentrifugenröhrchen. Die folgenden Anweisungen gelten für jedes der beiden Mikrozentrifugenröhrchen.

3) Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei voller Geschwindigkeit für 20 Sekunden, um die Zellen zu pelletieren.

4) Gießen Sie den Überstand aus dem Röhrchen. Den Überstand verwerfen.

5) Resuspendieren der Bakterien in 100 &mgr;l (0,1 ml) GTE-Puffer durch gründliches Vortexen.

6) Geben Sie 200 &mgr;l (0,2 ml) NS-Lösung in jedes Röhrchen, um die Bakterien zu lysieren. Mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Lassen Sie das Röhrchen 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

7) Gib 100 &mgr;l (0,1 ml) Kaliumacetat (KOAc) in das Röhrchen. Durch kräftiges Schütteln des Röhrchens mischen. Sie sollten einen schweren, geronnenen Niederschlag aus bakterieller genomischer DNA, Protein, Lipid und Kohlenhydraten sehen.

8) Zentrifugieren Sie das Röhrchen 2 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit.

9) Entfernen Sie den Überstand mit einer Kunststoff-Transferpipette. Versuchen Sie, den schwimmenden weißen Schmutz und das Pellet zu vermeiden. Übertragen Sie den Überstand in ein neues, entsprechend gekennzeichnetes Mikrozentrifugenröhrchen.

10) Gib 500 &mgr;l (0,5 ml) Isopropanol in das Röhrchen, das den Überstand enthält. Mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen.

11) Zentrifugieren Sie das Röhrchen 2 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit.

12) Entfernen Sie den Überstand mit einer Kunststoff-Transferpipette und verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet enthält Plasmid-DNA. Resuspendiere das Pellet in 100 &mgr;l (0,1 ml) 50 mM Tris, pH 8,3.

13) Füge 50 &mgr;l 8 M Ammoniumacetat (NH4Ac) hinzu. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens und legen Sie es in ein Trockeneis/Ethanol-Bad, bis der Inhalt fest gefroren ist (

14) Lassen Sie den Inhalt des Röhrchens bei Raumtemperatur auftauen und zentrifugieren Sie es dann 2 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit.

15) Der Überstand enthält die Plasmid-DNA. Übertragen Sie diesen Überstand in ein neues, entsprechend gekennzeichnetes Mikrozentrifugenröhrchen.

16) Füge 500 &mgr;l Ethanol hinzu. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 2 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit.

17) Gießen Sie den Ethanolüberstand aus dem Röhrchen. Entsorgen Sie das Ethanol. Drehen Sie das Röhrchen schnell und entfernen Sie dann den Rest des Ethanols aus dem Röhrchen, wobei das Plasmid-DNA-Pellet ungestört bleibt.

18) Lassen Sie das Pellet etwa 5 Minuten lang an der Luft trocknen, dann resuspendieren Sie das Pellet in 25 &mgr;l TE-Puffer.

Verfahren
1) Beschriften Sie für jede Ihrer DNA-Proben ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Ihren Initialen, dem Namen der DNA-Probe und dem Buchstaben Q (für “Quantifizierungsprobe”). Geben Sie 998 &mgr;l destilliertes Wasser in jedes Röhrchen.

2) Geben Sie mit der 5-40 &mgr;l-Mikropipette 2,0 &mgr;l jeder Ihrer rekombinanten Plasmid-DNA-Proben in das entsprechend gekennzeichnete Q-Röhrchen. Mischen Sie jede Vertiefung durch Vortexen.

3) Bestimmen Sie die Konzentration Ihrer DNA-Proben mit dem UV-Spektrophotometer. Ihr Lehrer wird es demonstrieren. Wählen Sie die DNA-Probe mit der glaubwürdigsten Konzentration für die weitere Analyse.

4) Verdünnen Sie ein Aliquot Ihrer Plasmid-DNA-Probe auf eine Konzentration von 8 ng/µl.

5) 5 &mgr;l (= 40 ng) rekombinante Plasmid-DNA in das Röhrchen mit PCR-Reaktionsmix (Reaktionspuffer, Desoxynukleotidtriphosphate [dNTPs], Primer und Taq-DNA-Polymerase) geben und in den Thermocycler geben. Wenn sich alle Proben im Thermocycler befinden, wird er eingeschaltet und die richtige Anzahl von Zyklen durchlaufen.
Nachdem die PCR-Reaktionen abgeschlossen sind, wird Ihr Lehrer den Thermocycler abschalten und Ihre Proben bis nächste Woche für Sie aufbewahren.

Laborsitzung 5
1. Führen Sie ein Gel auf den PCR-Produkten durch und isolieren Sie das DNA-Fragment.
In dieser Laborsitzung analysieren Sie Ihre PCR-Produkte, indem Sie sie auf einem speziellen, niedrig schmelzenden Agarosegel elektrophoresieren. Aus den Ergebnissen dieses Experiments können Sie die Größe des amplifizierten P-Element-DNA-Fragments bestimmen, das aus Ihrer PCR-Reaktion resultierte. Sie isolieren die Fragmente, die reine P-Element-DNA enthalten, indem Sie sie mit einer Rasierklinge aus dem Gel schneiden. Dabei stellen Sie reine P-Element-DNA her.

Teil 1. Elektrophoretische Analyse von PCR-Produkten

Verfahren
1) Nehmen Sie die Röhrchen mit all Ihren PCR-Reaktionsprodukten aus dem Gefrierschrank und erhitzen Sie sie 5 Minuten lang in einem 70 °C warmen Wasserbad, dann legen Sie sie auf Eis.

2) Sie erhalten ein weiteres Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Lambda-Hind III". Dieses Röhrchen enthält Phagen ? DNA vollständig mit Hind III verdaut. Diese verdaute DNA besteht aus DNA-Fragmenten bekannter Länge, die als DNA-Größenstandard auf Ihrem Elektrophorese-Gel dienen. Legen Sie dieses Röhrchen für 5 Minuten in ein 70 °C warmes Wasserbad und stellen Sie es dann auf Eis, bis Sie es verwenden können.

3) Fügen Sie 5 µl Elektrophorese-Probenpuffer zu den Röhrchen hinzu, die Ihre PCR-Produkte enthalten. Tippen Sie auf die Röhrchen, um den Inhalt zu mischen.
Achtung: Das in den Schritten 4-8 verwendete Gel und Reservoirpuffer enthalten Ethidiumbromid (etBr), ein Karzinogen. Beim Umgang mit etBr-haltigen Gegenständen Handschuhe tragen!

4) Laden Sie den gesamten Inhalt des "Lambda-Hind III"-Röhrchens und 25 &mgr;l jeder PCR-Reaktion in die Probenvertiefungen eines Agarosegels wie gezeigt:

5) Decken Sie die Elektrophoreseeinheit ab und stecken Sie die Kabel in das Netzteil. Die Kabel sind farbkodiert, so dass das rote Kabel in den Pluspol und das schwarze Kabel in den Minuspol gesteckt wird. Die Probenvertiefungen im Gel sollten sich am nächsten an der negativen (schwarzen) Elektrode befinden.

6) Schalten Sie die Stromquelle ein und stellen Sie die Spannung auf etwa 100 Volt ein. Elektrophorese durchführen, bis das Bromphenolblau (Farbstoff) in den Proben bis auf 5 mm zum positiven (roten) Elektrodenende des Gels gewandert ist. Bei 100 Volt sollte dies etwa 1 Stunde dauern.

7) Nachdem Ihr Gellauf abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und ziehen Sie die Kabel ab. Entfernen Sie das Gel aus dem Gerät und legen Sie es auf einen ultravioletten (UV) Transilluminator.

8) Schalten Sie den UV-Transilluminator ein und fotografieren Sie Ihr Gel mit einem Gel-Imager, wie von Ihrem Lehrer gezeigt.

9) Bestimmen Sie die Größe(n) der DNA-Fragmente in allen Banden im & #8220PCR Products” Bahnen Ihres Gels.

10) Konsultieren Sie die Sequenz des P-Elements und entscheiden Sie, welche Banden auf dem Gel Fragmente der reinen P-Element-DNA enthalten. Ihr Lehrer zeigt Ihnen, wie Sie diese Banden mit einer sauberen Rasierklinge aus dem Gel herausschneiden und so reine P-Element-DNA zur Verwendung als Positivkontrolle für eine P-Element-Sequenz isolieren. Nachdem Sie die entsprechenden DNA-Banden ausgeschnitten haben, legen Sie jede von ihnen in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie die Röhrchen im Kühlschrank.

Laborsitzung 6
1. Bereinigen Sie die DNA in den Banden, die während der Laborsitzung aus den Gelen geschnitten wurden 5.
2. Senden Sie die DNA zur Sequenzierung weg.

Um Ihre PCR-Produkte sequenzieren zu lassen, müssen Sie Ihr PCR-Produkt von kontaminierender Agarose reinigen. Dazu verwenden Sie “Spin-Säulen” aus einem im Handel erhältlichen Kit.Anschließend senden Sie Ihre gereinigten DNA-Proben an ein Biotechnologieunternehmen, um sie sequenzieren zu lassen.

Teil 1. Reinigung des PCR-Produkts

Verfahren
1) Besorgen Sie sich eine Masse für Ihr PCR-Produkt: Tarieren Sie die Waage mit einem leeren Mikrozentrifugenröhrchen und wiegen Sie dann Ihre Gelscheibe in ihrem Röhrchen.

2) Geben Sie mit einer Mikropipette Puffer QG in das Röhrchen mit der Gelscheibe (fügen Sie 300 ul QG für jede 10 mg Gelscheibe hinzu), erhitzen Sie die Gelscheibe in Puffer in einem 65 ° C-Heizblock für 10 Minuten oder bis sie vollständig geschmolzen ist.

3) Entfernen Sie die Gelscheibenlösung vom Heizblock und fügen Sie Isopropanol hinzu (100 &mgr;l für jede 10 mg Gelscheibe).

4) Übertragen Sie die Gelscheibenlösung mit Ihrer Mikropipette auf eine Spinsäule. Stellen Sie die Spinsäule in ein Sammelröhrchen und zentrifugieren Sie sie 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit (wenn Sie zu viel Volumen haben, um in die Säule zu passen, füllen Sie die Säule zu etwa 2/3, zentrifugieren Sie diese und verwerfen Sie den Durchfluss. Dann fügen Sie . hinzu den Rest Ihrer Lösung auf die Säule geben und ein zweites Mal zentrifugieren).

5) Den Durchfluss aus dem Sammelröhrchen verwerfen.

6) Waschen der Spinsäule durch Zugabe von 500 &mgr;l QG-Puffer zu der Spinsäule und Zentrifugieren bei voller Geschwindigkeit für 1 Minute. Den Durchfluss aus dem Sammelröhrchen verwerfen.

7) Waschen Sie die Spinsäule ein zweites Mal, diesmal durch Zugabe von 750 &mgr;l Puffer PE in die Spinsäule und zentrifugieren Sie bei voller Geschwindigkeit für 1 Minute. Den Durchfluss aus dem Sammelröhrchen verwerfen.

8) Trocknen Sie die Spinsäule, indem Sie eine weitere Minute in der Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min schleudern.

9) Um Ihre DNA zu eluieren, bewegen Sie Ihre Spin-Säule in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 50 &mgr;l Puffer TE zu Ihrer Säule und lassen Sie den Puffer mindestens 1 Minute lang in die Säulenmatrix eindringen.

10) Eluieren durch Zentrifugieren bei voller Geschwindigkeit für 1 Minute. Ihre DNA befindet sich jetzt im Boden des Mikrozentrifugenröhrchens.

11) Bestimmen Sie die Konzentration Ihrer DNA-Proben mit dem UV-Spektrophotometer wie in den Laborsitzungen 3 und 4.

12) Ihr Ausbilder zeigt Ihnen, wie Sie Ihre DNA-Probe(n) für den Versand an das Biotechnologieunternehmen zur Sequenzierung vorbereiten.

Laborsitzung 7
Empfangen und organisieren Sie Ihre Sequenzanalysedaten.
Wir haben die Daten aus der Sequenzierung Ihrer DNA-Proben erhalten. Die Daten werden per E-Mail verschickt und sind online verfügbar. Ihr Lehrer zeigt Ihnen, wie Sie die Sequenzierungsdaten abrufen und interpretieren. Sie sollten sich mit den Daten vertraut machen und sie organisieren, damit Sie sie in der nächsten Lab-Sitzung analysieren können.

Laborsitzung 8
Analysieren Sie Ihre Sequenzanalysedaten, indem Sie BLAST-Suchen durchführen. Sie werden auch andere bioinformatische Analysen durchführen, die wir im Unterricht und im Labor besprechen. Bitte bringen Sie noch heute einen Laptop mit ins Labor, wenn Sie können!
Ihr Instruktor zeigt Ihnen, wie Sie Ihre DNA-Sequenz(en) analysieren, indem Sie eine BLAST-Suche durchführen. Anschließend führen Sie eine umfangreiche bioinformatische Analyse Ihrer Sequenzdaten durch. Auf diese Weise sollten Sie in der Lage sein, viele Fragen zu beantworten, einschließlich der folgenden:

-Haben die P-Element-Positivkontroll-DNAs die erwartete Sequenz?
-Sind Ihre Sequenzen aus genomischen DNA-P-Element-Sequenzen von Drosophila amplifiziert?
- Wenn Ihre aus genomischer DNA von Drosophila amplifizierten Sequenzen tatsächlich P-Element-Sequenzen sind, sind sie dann genau wie die veröffentlichte Wildtyp-P-Element-Sequenz? Wenn nicht, wie unterscheiden sie sich?
- Wenn Ihre aus genomischer DNA von Drosophila amplifizierten P-Element-Sequenzen keine P-Element-Sequenzen sind, was sind sie dann? Wie hätten sie mit den von Ihnen verwendeten Primern amplifiziert werden können?

Sie sollten sich andere Fragen überlegen, und Ihre Gruppe wird das gesamte Projekt und die Ergebnisse besprechen. Spaß haben!

Interpretation von Elektrophoresedaten

1) 7 zeigt die Längen (in kb) der DNA-Fragmente in jeder Bande, die aus der Elektrophorese von 1 DNA resultieren, die mit Hind III allein geschnitten wurde (die DNA-Größenstandards in diesem Experiment). Untersuchen Sie die Banden in der Lambda-Hind III-Spur Ihres Gels und bestimmen Sie die Länge der Fragmente, aus denen jede Bande besteht. Beispielsweise stellt die Bande, die der Probenvertiefung am nächsten ist, das größte Fragment dar, das 23,1 kb lang ist. Bestimmen Sie den Abstand (in mm), um den jede dieser Lambda-Hind III-Banden aus den Probenvertiefungen gewandert ist. Tragen Sie die Migrationsstrecke (in mm) jeder Lambda-Hind III-Bande auf der X-Achse und die DNA-Fragmentlänge (in kb) dieser Bande auf der Y-Achse auf halblogarithmischem Millimeterpapier auf. Zeichnen Sie eine Linie durch die Punkte in Ihrem Diagramm. Bestimmen Sie anhand dieser Grafik die Länge der Fragmente, aus denen jede Bande in den experimentellen Spuren Ihres Gels oder Autoradiogramms basierend auf ihren Migrationsstrecken besteht. Gehen Sie für jedes Band wie folgt vor:

a) Ermitteln Sie die Migrationsdistanz des Bandes auf der X-Achse Ihres Graphen.
b) Finden Sie den Punkt auf der Geraden, der direkt über dieser X-Koordinate liegt.
c) Finden Sie den Punkt auf der Y-Achse, der direkt links von diesem Punkt auf der Linie liegt. Diese Y-Koordinate ist die Größe des Fragments (in kb).

Projekt 2: Isolierung und Charakterisierung von Mutationen in Drosophila melanogaster

Einer der am häufigsten verwendeten Organismen in genetischen Studien ist die Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Thomas Hunt Morgan leistete 1911 Pionierarbeit bei genetischen Studien mit Drosophila an der Columbia University. Heute gibt es ein großes Wissen über die Genetik der Fruchtfliege. Drosophila hat vier Chromosomenpaare (eine relativ kleine Anzahl), die ausführlich charakterisiert wurden. In weniger als zwei Wochen durchläuft die Fruchtfliege eine bestimmte Entwicklungssequenz vom befruchteten Ei zur Larve, Präpuppe, Puppe, dann zum Erwachsenen. Der Genetiker kann die Vererbung von morphologischen, physiologischen und Entwicklungsmustern verfolgen. In diesem Projekt führen Sie (der Genetiker) ein Screening durch, um Drosophila-Mutanten zu identifizieren und zu charakterisieren, die morphologische Anomalien aufweisen. Anschließend charakterisieren Sie die Mutationen, die Sie identifizieren, in der Hoffnung, etwas über die beteiligten Gene zu erfahren.

Die Chromosomen von Drosophila melanogaster

Die einzelne Drosophila hat vier Chromosomenpaare. Ein Weibchen hat jeweils zwei der Chromosomen 1 (häufig als X-Chromosom bezeichnet), 2, 3 und 4. Ein Männchen hat ein X-Chromosom, ein Y-Chromosom und jeweils zwei der Chromosomen 2, 3 und 4. Das Y-Chromosom und Chromosom 4 sind beide sehr klein und tragen wenige Gene. Die meisten Gene der Fliege werden auf den Chromosomen X, 2 und 3 getragen. Die X- und Y-Chromosomen sind an der Geschlechtsbestimmung beteiligt und werden daher als Geschlechtschromosomen bezeichnet. Die Chromosomen 2, 3 und 4 werden Autosomen genannt. Bei der Fruchtfliege wird das Geschlecht durch die relative Anzahl von X-Chromosomen und Autosomen bestimmt. Wenn eine Fliege zwei X-Chromosomen und zwei von jedem Autosom hat (ein X:Autosom-Verhältnis von 1:1), entwickelt sie sich als Weibchen. Wenn eine Fliege nur ein X-Chromosom und zwei von jedem Autosom hat (ein X:Autosom-Verhältnis von 1:2), entwickelt sie sich als Männchen. Bei Drosophila bestimmt das Y-Chromosom nicht die Männlichkeit! (Dies steht im Gegensatz zu Säugetieren, bei denen das Vorhandensein des Y-Chromosoms die Männlichkeit bestimmt.). Tatsächlich entwickelt sich eine Fliege mit zwei X-Chromosomen und einem Y-Chromosom als Weibchen.

Entwicklung von Drosophila melanogaster

Die Paarung bei der Fruchtfliege erfolgt 6-8 Stunden, nachdem das erwachsene Weibchen aus ihrer Puppenhülle geschlüpft ist. Eier können zu diesem Zeitpunkt gelegt oder später behalten und gelegt werden. Ein Weibchen erhält etwa 4000 Spermien von einem Männchen und speichert sie in speziellen Säcken. Die Spermien werden nach und nach freigesetzt, während die Eier produziert werden. Jedes Weibchen kann mehrere hundert befruchtete Eier auf die Oberfläche einer Nahrungsquelle legen. Jedes befruchtete Ei entwickelt sich über einen Zeitraum von 24 Stunden zu einer Larve. Die Larve gräbt sich in die Nahrungsquelle ein und frisst Hefezellen. Vier bis fünf Tage und zwei Häutungen (Abwurf der äußeren Kutikula der Larve) später klettert die Larve auf eine feste Oberfläche und verpuppt sich zu einer Präpuppe, die sich in einer harten Puppenhülle bedeckt. Die Präpuppe entwickelt sich in 12 Stunden zu einer Puppe. In den nächsten 4-5 Tagen entwickelt sich die Puppe zu einem Erwachsenen, der beim Schlüpfen aus der Puppenhülle hervortritt. Die Fliege ist anfangs lang und dünn, mit hochgeklappten Flügeln und hell gefärbt. Allmählich dehnen sich die Flügel aus und die Fliege nimmt eine rundere Form und dunklere Farbe an. Der gesamte Lebenszyklus, der bei 25 °C 10-14 Tage dauert, ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Der Lebenszyklus von Drosophila.

Die Untersuchung von Mutationen in Drosophila melanogaster

Mutationen sind mächtige Werkzeuge in der genetischen Analyse. Die Logik hinter der Mutationsanalyse ist, dass wir etwas über die Funktion eines Gens lernen können, indem wir untersuchen, was schief geht, wenn dieses Gen nicht richtig funktioniert. Gene können von ihren Wildtypformen durch Mutationen verändert werden, die oft die Genfunktion stören oder vollständig eliminieren. Die Mutationsanalyse wurde als "genetische Dissektion" bezeichnet. Die erste Stufe einer genetischen Dissektion ist die Jagd nach Mutanten (einzelnen Organismen, die mutierte Gene tragen). Mutanten treten in jeder Population mit geringer Häufigkeit spontan auf. Durch die Verwendung von Mutagenen können wir jedoch die Wahrscheinlichkeit, nützliche Mutanten zu finden, dramatisch erhöhen. Die Verwendung eines Mutagens zur Induktion von Mutationen wird als Mutagenese bezeichnet. Ein Mutagen, das sich bei der Induktion von Mutationen bei Drosophila als äußerst wirksam erwiesen hat, ist die Chemikalie Ethylmethansulfonat (EMS). EMS kann eine Ethylgruppe (-CH2CH3) an viele Positionen an allen vier in der DNA vorkommenden Basen hinzufügen, wodurch ihre Paarungseigenschaften verändert werden. Die häufigste durch EMS induzierte Veränderung ist die Addition einer Ethylgruppe an Guanin (G), die es ihm ermöglicht, sich mit Thymin (T) zu paaren. Diese illegitime Paarung führt in der nächsten Replikationsrunde zu GC --> AT-Übergängen (siehe Griffiths Lehrbuch, S. 596).
EMS induziert einen hohen Anteil an Punktmutationen. Dieses Mutagen wird erwachsenen Fliegen leicht verabreicht, indem man sie auf Filterpapier legt, das mit einer gemischten wässrigen Lösung aus EMS und Zucker getränkt ist. Männer, die mit 0,025 M EMS gefüttert werden, produzieren Spermien, die auf 70 % aller X-Chromosomen und auf fast jedem Chromosom 2 und 3 tödliche Mutationen tragen für Mutanten, die ungewöhnliche Phänotypen aufweisen (siehe Griffiths Lehrbuch, S. 202). In diesem Projekt screenen Sie mit EMS mutagenisierte Fliegen, um Mutanten mit abnormalen Phänotypen zu finden.

Die Verwendung des Attached-X-Chromosoms bei der Drosophila-Mutagenese

Die Mehrheit der interessanten Mutationen, die in einem Screening nach einer EMS-Mutagenese entdeckt werden, ist rezessiv und ergibt somit keinen mutierten Phänotyp, es sei denn, er ist homozygot. Eine Ausnahme von diesem Erfordernis der Homozygotie für die Expression rezessiv mutierter Phänotypen sind die X-Chromosom-gebundenen Mutationen bei männlichen Fliegen. Da eine männliche Fliege nur ein X-Chromosom hat (und daher für alle X-chromosomalen Gene hemizygot genannt wird), exprimiert sie den abnormalen Phänotyp, der mit jeder rezessiven Mutation auf dem X verbunden ist. Durch die Verwendung eines speziellen Chromosoms, das als Attached-X . bezeichnet wird Chromosom (dargestellt als X^X) ist es möglich, Männchen der F1-Generation auf interessante Mutationen auf dem X-Chromosom zu untersuchen. Das Attached-X-Chromosom ist ein zusammengesetztes Chromosom, das durch die Verschmelzung von zwei X-Chromosomen gebildet wird. Ein X^X-Chromosom wird als einzelne Einheit vererbt, und Fliegen, die ein X^X-Chromosom tragen, sind weiblich. Ein Weibchen, das ein X^X-Chromosom hat und auch ein Y-Chromosom hat, kann mit einem normalen Männchen gepaart werden, um X^X/Y-Weibchen und X/Y-Männchen F1-Nachkommen zu produzieren, wie in Abbildung 2 gezeigt machen es möglich, eine schnelle EMS-Mutagenese und einen Mutanten-Screen durchzuführen, indem EMS an Männchen der Elterngeneration verfüttert, sie mit X^X-Weibchen gepaart und die resultierenden F1-Nachkommen-Männchen auf abnormale Phänotypen untersucht werden. Ein Schema zur Durchführung dieser Art von Mutagenese und Screening ist in Abbildung 3 skizziert. In der F1-Generation tragen nur die Männchen mutagenisierte X-Chromosomen. Da Männchen für alle X-chromosomalen Gene hemizygot sind, werden in diesen F1-Männchen rezessive X-chromosomale Mutationen exprimiert.

In diesem Laborprojekt erhalten Sie eine große Gruppe von F1-Nachkommen, die aus der Verpaarung von EMS-behandelten Wildtyp-Männchen mit Attached-X-Weibchen entstanden sind. Diese Gruppe von F1-Fliegen sollte eine Reihe von X-gebundenen Mutanten enthalten. Sie sind auf der Suche nach interessanten Mutanten. Sie werden zu zweit arbeiten, aber die gesamte Klasse wird bei dieser Mutantensuche zusammenarbeiten und Sie können Mutanten miteinander teilen. Sie werden diese Mutanten entdecken, indem Sie nach Fliegen suchen, die vom Wildtyp abweichende Phänotypen aufweisen. Ein Beispiel für einen solchen Phänotyp wären Augen, die eine andere Farbe als die dunkelrote Augenfarbe des Wildtyps haben. Sie können auch Fliegen mit ungewöhnlich aussehenden Flügeln, Borsten oder anderen Körperteilen finden. Sobald Sie so viele interessante Mutanten wie möglich identifiziert haben, möchten Sie diese charakterisieren. Bei einer bestimmten Mutation möchten Sie feststellen, ob diese Mutation auf die nächste Generation übertragen werden kann. Sie möchten auch feststellen, ob sich jede Mutation tatsächlich auf dem X-Chromosom befindet. Sie sollten Experimente entwerfen, um diese Fragen zu beantworten. Sobald Sie festgestellt haben, welche Ihrer Mutationen übertragbar sind, ist es an der Zeit, eine auszuwählen, um sie genauer zu untersuchen. Sie sollten die Mutation einer bestimmten Region des X-Chromosoms zuordnen. Dieses Laborhandbuch soll Ihnen eine Orientierungshilfe sein. Es soll Sie nicht Schritt für Schritt durch jedes Experiment führen. Diese Analyse sollten Sie möglichst selbstständig durchführen! Mit Hilfe Ihrer Dozenten sollten Sie Experimente zu den oben genannten Fragestellungen konzipieren und durchführen. Ein möglicher Zeitplan für dieses Projekt ist unten skizziert.

Experimentelle Verfahren (Arbeiten in 4er-Gruppen)

Während dieser Laborsitzung beginnen Sie mit dem Screening auf mutierte Fliegen. Sie werden zunächst eine Gruppe von Wildtyp-Drosophila anästhesieren und untersuchen. Sie sollten sich mit dem Aussehen einer Wildtypfliege vertraut machen und lernen, Männchen von Weibchen zu unterscheiden. Sobald Sie sich bei der Arbeit mit Fliegen wohl fühlen, erhalten Sie eine Kulturflasche mit F1-Nachkommen von EMS-behandelten Wildtyp-Männchen, die mit Attached-X-Weibchen verpaart sind. Die Flasche enthält angehängte X F1-Weibchen und X*/Y F1-Männchen. (Siehe Abbildung 3) Sie konzentrieren sich auf die Männchen und suchen nach Fliegen mit abnormalen Phänotypen.

Sie erhalten:

ein Fläschchen mit Wildtyp-Fruchtfliegen
ein Fliegenanästhetikum
Fliegenanästhesie-Chemikalie
eine weiße Papierkarte
ein Pinsel
ein Seziermikroskop
eine große Gruppe von F1-Nachkommen, die aus der Paarung von EMS-behandelten Wildtyp-Männchen mit
Attached-X-Weibchen.
ein Fläschchen mit jungfräulichen Attached-X-Weibchen [ C(1)A, y ]
leere Fliegenkulturfläschchen

Untersuchung von Wildtyp-Fruchtfliegen

Sie erhalten zunächst ein Fläschchen mit Wildtyp-Fruchtfliegen. Betäuben Sie alle Fliegen in der Durchstechflasche wie unten beschrieben und wie von Ihrem Laborlehrer demonstriert.

1) Entfernen Sie die untere Kappe Ihres Fliegenanästhetikums und nehmen Sie das Schaumgummipolster im Inneren des Geräts heraus.

2) "Laden" Sie Ihr Fliegen-Anästhetikum, indem Sie etwa 10 Tropfen Fly Nap-Anästhetikum auf das Schaumgummikissen geben und das Kissen wieder in das Gerät legen. Setzen Sie die untere Kappe wieder auf.

3) Entfernen Sie die obere Kappe von Ihrem Fliegenanästhetikum. Klopfen Sie den Boden der Durchstechflasche mit Fliegen leicht und schnell auf einem Pad auf Ihrer Werkbank und entfernen Sie dann den Stopfen von der Durchstechflasche. Drehen Sie die Fliegenampulle schnell über die Oberseite des offenen Anästhesiegeräts und klopfen Sie das Ganze leicht und schnell auf ein Pad, damit die Fliegen in das Anästhesiegerät fallen.

4) Verschließen Sie das Narkosemittel schnell und halten Sie die Fliegen in der Narkosekammer, bis sie alle aufhören, sich zu bewegen (dies sollte ein paar Minuten dauern).

5) Schütten Sie die betäubten Fliegen aus dem Anästhesiegerät auf eine weiße Papierkarte und betrachten Sie sie mit einem Seziermikroskop.

6) Üben Sie das Bewegen der Fliegen auf der weißen Papierkarte mit einem feinen Pinsel. Beachten Sie die dunkelrote Wildtyp-Farbe der Augen.

7) Trennen Sie die Männchen von den Weibchen anhand der Diagramme in Abbildung 4 und im Laborraum. Männchen haben einen schmaleren Hinterleib als Weibchen, und das hintere Ende des männlichen Hinterleibs ist dunkler pigmentiert als das des Weibchens. Männchen haben dunkle Genitalien an den äußersten hinteren Enden ihres Abdomens, die den Weibchen fehlen. Männchen haben auch spezielle Borsten, die als "Sexkämme" bezeichnet werden, an ihrem vordersten Beinpaar. Wenn Sie Schwierigkeiten haben, Männchen von Weibchen zu unterscheiden, indem Sie auf das Ende des Bauches schauen, werden die Geschlechtskämme ein Männchen positiv identifizieren.

8) Sobald Sie sich wohl fühlen, mit Fliegen zu arbeiten und Männchen von Weibchen zu unterscheiden, ist es an der Zeit, mit dem Screening auf mutierte Fliegen zu beginnen!

Abbildung 4. Unterscheidung von männlichen und weiblichen Drosophila

Sie erhalten eine große Gruppe von F1-Nachkommen, die aus der Paarung von EMS-behandelten Wildtyp-Männchen mit Attached-X-Weibchen stammen.

1) Betäuben und untersuchen Sie die Fliegen sorgfältig, wobei Sie sich auf die Männchen konzentrieren. Die Männchen und Weibchen sollten leicht zu unterscheiden sein, da die angehängten X-Weibchen gelbe Körper haben, während die Männchen, sofern sie nicht durch eine neu induzierte Mutation verändert werden, die die Körperfarbe beeinflusst, dunkelbraune Körper haben. Die Weibchen haben gelbe Körper, weil die angehängten X-Chromosomen die Mutation gelb (abgekürzt y) tragen. Der Name des angehängten X-Chromosoms, das diese Weibchen tragen, ist C(1)A, y. Dies steht für "Verbindungschromosom 1 (das X) von Armentrout (dem Wissenschaftler, der das Chromosom hergestellt hat), das die Mutation trägt, gelb ". Beide X-Chromosomen, aus denen C(1)A, y besteht, tragen die gelbe Mutation, sodass die Weibchen für diese rezessive Mutation homozygot sind und die mutierte gelbe Körperfarbe aufweisen. Denken Sie daran, dass, wenn Sie ein gelb gefärbtes Männchen sehen, dies möglicherweise auf eine neu induzierte X-chromosomale Mutation zurückzuführen ist und Sie es weiter untersuchen sollten.

2) Suchen Sie nach Männchen, die Unterschiede zum Wildtyp aufweisen. Rette jedes mutant aussehende Männchen, das du in seinem eigenen Kulturfläschchen findest. Wenn Sie absolut keinen Mutanten finden können, machen Sie sich keine Sorgen! Dies wird eine Teamleistung sein, und Sie können bei Bedarf einen Mutanten von einer anderen Gruppe von Schülern erhalten. Ihr Lehrer wird Ihnen auch zusätzliche Mutanten zur Verfügung stellen.

3) Entwerfen und starten Sie mit Hilfe Ihres Laborlehrers (wenn Sie es wünschen) ein Experiment, um festzustellen, ob die von Ihnen identifizierten Mutationen auf die nächste Generation übertragbar sind. Sie erhalten alles (einschließlich Fliegen), das Sie zum Aufbau dieser Experimente benötigen. Sie sollten Ihren Ansatz mit Ihrem Lehrer besprechen. Sie sollten auch darüber nachdenken, wie Sie Ihre Mutationen einer Region des X-Chromosoms zuordnen.

Während dieser Laborphase interpretieren Sie die Ergebnisse Ihres Experiments, um festzustellen, ob jede Ihrer neu identifizierten Mutationen übertragbar ist.

1) Betäuben Sie die Fliegen in den Fläschchen, die Sie während der Laborsitzung 1 gekreuzt haben. Untersuchen Sie alle Fliegen. Diese Fliegen, die Nachkommen der Kreuzung(en), die Sie während der Laborsitzung 1 aufgestellt haben, sind die F2-Generation. Suchen Sie nach F2-Fliegen, die die mutierten Phänotypen aufweisen, die Sie während der Laborsitzung 1 identifiziert haben. Achten Sie auf Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen.

-Welche Ihrer Mutationen sind übertragbar?

-Können Sie von den übertragbaren Mutationen feststellen, ob sie dominant oder rezessiv sind? Können Sie feststellen, ob es sich um X-chromosomal oder autosomal handelt? Erklären Sie Ihre Argumentation.

-Wenn eine bestimmte Mutation nicht übertragen wurde, überlegen Sie, woran das liegen könnte.

2) Wenn eine bestimmte Mutation übertragbar ist, beginnen Sie Ihr Experiment, um sie einer Region des X-Chromosoms zuzuordnen. Sie erhalten jungfräuliche weibliche Fruchtfliegen, die homozygot für ein mehrfach markiertes X-Chromosom sind.Dieses mehrfach markierte X-Chromosom trägt mehrere verschiedene rezessive Mutationen, die leicht zu identifizieren sind. Ein Beispiel für ein mehrfach markiertes X-Chromosom ist das
y cv v f Chromosom. Dieses Chromosom trägt rezessive mutierte Allele von vier Genen, die entlang des Chromosoms beabstandet sind. Diese Gene sind:

y = gelb (entspricht dem Telomer oder dem äußersten linken Ende des X-Chromosoms, Kartenposition = 0) Weibliche Fliegen homozygot (oder männliche Fliegen hemizygot) für Mutationen in Gelb haben eine sehr hellgelbe Körperfarbe, im Gegensatz zum braunen Körper Farbe von Wildtypfliegen.

cv = crossaderless (Map Position = 13.7, was bedeutet, dass es 13.7 Map Units rechts vom Telomer ist) Weibliche Fliegen homozygot (oder männliche Fliegen hemizygot) für Mutationen in crossaderless fehlt ein bestimmter Satz von Adern, die in ihren Flügeln sein sollen .

v = zinnoberrot (Kartenposition = 33,0, was bedeutet, dass es sich um 33 Karteneinheiten rechts vom Telomer handelt) Weibliche Fliegen homozygot (oder männliche Fliegen hemizygot) für Mutationen in zinnoberrot haben eine abnormale rosa Augenfarbe im Gegensatz zum dunkelroten Auge Farbe von Wildtypfliegen.

f = gegabelt (Map-Position = 56,7, was bedeutet, dass es 56,7 Map-Einheiten rechts vom Telomer ist) Weibliche Fliegen homozygot (oder männliche Fliegen hemizygot) für Mutationen in gegabelt haben eine abnormal scharfe Biegung am Ende ihrer Borsten, was dazu führt, dass gegabelte Borsten sehen ganz anders aus als die geraden, spitzen Borsten der Wildtyp-Fruchtfliege.

Eine schematische Karte des y cv v f-Chromosoms würde so aussehen:

Wenn die Mutation, die Sie kartieren möchten, X-chromosomal ist, erstellen Sie eine Kreuzung von Männern, die für Ihre neu identifizierte Mutation hemizygot sind, mit jungfräulichen Frauen, die für das mehrfach markierte X-Chromosom homozygot sind. Sie werden die Ergebnisse dieses Experiments während der Laborsitzung 3 interpretieren.

Während dieser Labphase setzen Sie Ihre Kartierungsexperimente fort. Sie werden die Ergebnisse der Kreuze(n) interpretieren, die Sie während der Übungssitzung 2 eingerichtet haben, und ein weiteres Kreuz (oder andere Kreuze) erstellen.

1) Betäuben Sie die Fliegen in den Fläschchen, in denen Sie in Laborsitzung 2 gekreuzt haben. Diese Fliegen, die Nachkommen der Kreuzungen, die Sie in Laborsitzung 2 eingerichtet haben, sind die F3-Generation. Untersuche alle Fliegen. Suchen Sie nach Fliegen, die die mutierten Phänotypen aufweisen, die Sie während der Laborsitzung 1 identifiziert haben. Achten Sie auf Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen.

-Wie sehen die männlichen Fliegen aus?

-Wie sehen die weiblichen Fliegen aus?

- Weist eine der Fliegen den mutierten Phänotyp auf, den Sie in Laborsitzung 1 identifiziert haben?

- Können Sie anhand Ihrer Ergebnisse feststellen, ob Ihre neu identifizierte Mutation dominant oder rezessiv ist?

- Können Sie anhand Ihrer Ergebnisse feststellen, ob Ihre neu identifizierte Mutation allelisch zu einer bekannten Mutation ist?

2) Die F3-Weibchen sind heterozygot für das X-Chromosom, das Ihre neu identifizierte Mutation trägt, und das mehrfach markierte X-Chromosom. Während der Meiose kann es bei diesen Weibchen zu einem Crossing-Over zwischen diesen beiden X-Chromosomen kommen, was dazu führt, dass Eier rekombinante X-Chromosomen tragen. Durch die Untersuchung der F4-Nachkommen, die aus einer Kreuzung dieser Weibchen mit entsprechenden männlichen Fliegen stammen, können Sie die Rekombinationsfrequenzen zwischen Ihrer neu identifizierten Mutation und den bekannten Mutationen auf den mehrfach markierten X-Chromosomen bestimmen. Auf diese Weise können Sie eine Kartenposition für Ihre neue Mutation berechnen.
Da Sie es mit X-chromosomalen Mutationen zu tun haben, können Sie planen, Ihre Analyse der F4-Nachkommen auf die F4-Männchen zu beschränken. Jedes F4-Männchen erbt ein einzelnes X-Chromosom von seiner heterozygoten F3-Mutter und zeigt die Phänotypen, die mit allen Mutationen auf diesem X-Chromosom verbunden sind. Jedes F4-Männchen ist in Bezug auf die verschiedenen Mutationen, mit denen Sie arbeiten, entweder vom Elterntyp oder rekombinant. Die Bestimmung des Prozentsatzes der rekombinanten männlichen F4-Nachkommen ermöglicht es Ihnen, eine Kartenposition für Ihre neu identifizierte Mutation zu berechnen.
Da Sie nur die Männchen der F4-Generation betrachten, spielt der Genotyp der Männchen, die Sie mit Ihren F3-heterozygoten Weibchen kreuzen, keine Rolle. Sie können diese Männer nur als Samenspender betrachten. Bilden Sie eine Kreuzung Ihrer F3-heterozygoten Weibchen mit verfügbaren Männchen.

Während dieser Laborphase sollten Sie in der Lage sein, Ihr vorgeschlagenes Kartierungsexperiment abzuschließen und zu bestimmen, welcher Region des X-Chromosoms jede Ihrer Mutationen zugeordnet ist.

1) Betäuben Sie die Fliegen in den Fläschchen, in denen Sie in Laborsitzung 3 gekreuzt haben. Diese Fliegen, die Nachkommen der Kreuzungen, die Sie in Laborsitzung 3 eingerichtet haben, sind die F4-Generation. Untersuche alle Fliegen. Trennen Sie die Männchen von den Weibchen und entsorgen Sie die Weibchen. Sie werden diese Analyse nur auf die F4-Männchen konzentrieren.

2) Wählen Sie drei Mutationen aus, auf die Sie Ihre Aufmerksamkeit richten möchten. Diese drei Mutationen müssen Ihre neu isolierte Mutation und zwei der Mutationen auf dem mehrfach markierten X-Chromosom umfassen. Sie können Ihre Studie nun als Dreipunktkreuz betrachten, wie auf den Seiten 156-167 des Lehrbuchs Griffiths et al. (2002) Moderne genetische Analyse, 2. Auflage. New York, W. H. Freeman und Gesellschaft. Ihre erste Aufgabe besteht darin, den Phänotyp (Mutante oder Wildtyp) jedes der F4-Männchen in Bezug auf die drei von Ihnen in Betracht gezogenen Mutationen zu bestimmen. Sie können dann die Anzahl der F4-Männchen ermitteln, die in Bezug auf jede der drei Mutationen vom Elterntyp und vom rekombinanten Typ sind.

3) Nachdem alle F4-Männchen hinsichtlich des Phänotyps bewertet wurden, bestimmen Sie, welche Klasse von Nachkommen die doppelten Kreuzungen darstellen. Bestimmen Sie die Anzahl der einzelnen Kreuzungen, die zwischen jeder der drei Mutationen aufgetreten sind. Mit diesen Zahlen sollten Sie die drei Mutationen relativ zueinander abbilden können. Da Sie die Kartenpositionen von zwei der Mutationen kennen, sollten Sie in der Lage sein, eine Kartenposition für Ihre neu isolierte Mutation zu bestimmen.

4) Zeichnen Sie eine Karte des X-Chromosoms, die die Kartenpositionen Ihrer neu isolierten Mutation und der beiden anderen von Ihnen verwendeten Mutationen zeigt.