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Was sind Respirasomen?

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Ich habe Wikipedia gelesen, verstehe es aber nicht gut. Meinen wir Komplex I, II, III und IV, wenn wir Respirasomen sagen?


Der Artikel sagt, dass es mehrere Respirasomen gibt, von denen jedes aus mehreren anderen mitochondrialen Komplexen oder Cytochromen besteht. Der Artikel macht ein Beispiel für drei häufig beobachtete Respirasomen, wenn es heißt:

Die am häufigsten beobachteten Superkomplexe sind Komplex I/III, Komplex I/III/IV und Komplex III/IV.

Die kurze Antwort auf Ihre Frage lautet also, dass sich ein Respirasom auf eine Reihe von mehreren Cytochromen bezieht, deren kombinierte Wirkung zur Atmung führt.

Dieses Papier geht ins Detail und wiederholt, dass der Begriff "Respirasom" verwendet wird, um mehrere Cytochrom-Superkomplexe zu beschreiben.


Identifizierung und Charakterisierung von Respirasomen in Kartoffel-Mitochondrien

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In: Pflanzenphysiologie, Bd. 2, No. 134, Nr. 4, 2004, p. 1450-1459.

Forschungsergebnis : Beitrag zur Zeitschrift › Artikel

T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Respirasomen in Kartoffel-Mitochondrien

Von N2 – Pflanzenmitochondrien wurde zuvor gezeigt, dass sie respiratorische Superkomplexe umfassen, die Cytochrom-c-Reduktase (Komplex III) und NADH-Dehydrogenase (Komplex I) der Zusammensetzung I1III2 und I2III4 enthalten. Hier berichten wir über die Entdeckung zusätzlicher Superkomplexe in Kartoffel-(Solanum tuberosum)-Mitochondrien, die von geringerer Häufigkeit sind und Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV) enthalten. Hochaktive Mitochondrien wurden aus Kartoffelknollen und -stängeln isoliert, durch Digitonin solubilisiert und anschließend durch Blue-native (BN) Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) analysiert. Die Visualisierung von Superkomplexen durch In-Gel-Aktivitätsfärbungen für Komplex IV ergab fünf neue Superkomplexe von 850, 1.200, 1.850, 2.200 und 3.000 kD in Kartoffelknollenmitochondrien. Diese Superkomplexe haben III2IV1, III2IV2, I1III2V1, I1III2IV2 und I1III2IV4 Zusammensetzungen, wie durch zweidimensionale BN/Natriumdodecylsulfat (SDS)-PAGE und BN/BN-PAGE in Kombination mit Aktivitätsfärbungen für Cytochrom-c-Oxidase gezeigt. Kartoffelstamm-Mitochondrien enthalten ähnliche Superkomplexe, aber Komplex IV ist teilweise in einer kleineren Version vorhanden, der das Cox6b-Protein und möglicherweise andere Untereinheiten fehlen. In Mitochondrien aus Kartoffelknollen und -stängeln waren jedoch etwa 90% des Komplexes IV in monomerer Form vorhanden. Es wurde vorgeschlagen, dass der Superkomplex I1III2IV4 eine Grundeinheit für die Atmung in Säugetiermitochondrien darstellt, die als Respirasom bezeichnet wird. Respirasomen kommen auch in Kartoffelmitochondrien vor, wiesen jedoch unter allen angewendeten Bedingungen geringe Konzentrationen auf. Wir spekulieren, dass Respirasomen unter in-vivo-Bedingungen häufiger vorkommen.

AB – Pflanzenmitochondrien umfassten zuvor respiratorische Superkomplexe, die Cytochrom-c-Reduktase (Komplex III) und NADH-Dehydrogenase (Komplex I) der Zusammensetzung I1III2 und I2III4 enthalten. Hier berichten wir über die Entdeckung zusätzlicher Superkomplexe in Kartoffel-(Solanum tuberosum)-Mitochondrien, die von geringerer Häufigkeit sind und Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV) enthalten. Hochaktive Mitochondrien wurden aus Kartoffelknollen und -stängeln isoliert, durch Digitonin solubilisiert und anschließend durch Blue-native (BN) Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) analysiert. Die Visualisierung von Superkomplexen durch In-Gel-Aktivitätsfärbungen für Komplex IV ergab fünf neue Superkomplexe von 850, 1.200, 1.850, 2.200 und 3.000 kD in Kartoffelknollenmitochondrien. Diese Superkomplexe haben III2IV1, III2IV2, I1III2V1, I1III2IV2 und I1III2IV4 Zusammensetzungen, wie durch zweidimensionale BN/Natriumdodecylsulfat (SDS)-PAGE und BN/BN-PAGE in Kombination mit Aktivitätsfärbungen für Cytochrom-c-Oxidase gezeigt. Kartoffelstamm-Mitochondrien enthalten ähnliche Superkomplexe, aber Komplex IV ist teilweise in einer kleineren Version vorhanden, der das Cox6b-Protein und möglicherweise andere Untereinheiten fehlen. In Mitochondrien aus Kartoffelknollen und -stängeln waren jedoch etwa 90% des Komplexes IV in monomerer Form vorhanden. Es wurde vorgeschlagen, dass der I1III2IV4-Superkomplex eine Grundeinheit für die Atmung in Säugetiermitochondrien darstellt, die als Respirasom bezeichnet wird. Respirasomen kommen auch in Kartoffelmitochondrien vor, wiesen jedoch unter allen angewendeten Bedingungen geringe Konzentrationen auf. Wir spekulieren, dass Respirasomen unter in-vivo-Bedingungen häufiger vorkommen.


Vergleichendes Profiling von N-Respirasomen sagt abweichende mitochondriale Bioenergetik bei Einzelzellauflösung voraus

Mitochondrien decken den Energiebedarf der Zelle. Die Zusammensetzung und der Funktionszustand des mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungssystems sind informative Indikatoren für die Homöostase von Organellen und die bioenergetische Kapazität. Hier beschreiben wir eine hochempfindliche und reproduzierbare Methode zur Einzelzellvisualisierung und Quantifizierung von mitochondrialen respiratorischen Superkomplexen als neuartiges Mittel zur Messung der Integrität der mitochondrialen Atmungskette. Wir wenden einen Proximity Ligation Assay (PLA) an und führen vergleichende Studien von mitochondrialen CI, CIII, CIV-haltigen Superkomplexen (oder N-Respirasomen) in fixiertem Gehirngewebe von Mensch und Maus, tumorigenen Zellen, iPSCs und iPSC-abgeleiteten NPCs und Neuronen durch. Unser optimierter Ansatz ermöglicht quantitative vor Ort Beurteilungen selbst subtiler mitochondrialer Läsionen im Zusammenhang mit einer abweichenden Atmung. Durch die Kombination quantitativer Proteomik mit Einzelzell-Imaging-Analyse berichten wir auch über den mechanistischen Beitrag der MICOS-Komplex-Untereinheit CHCHD3 zur Regulierung von N-Respirasomen. Insgesamt etabliert unser PLA-basiertes Profiling von N-Respirasomen eine sensitive und komplementäre Technik zum Nachweis zelltypspezifischer mitochondrialer Störungen in fixierten Materialien.

Schlüsselwörter: Gehirn, Mitochondrien, mitochondriale Erkrankungen, mitochondriale respiratorische Superkomplexe, Proximity Ligation Assay


Verwandte Begriffe aus der Biologie

  • Elektronentransportzug – Manchmal als Atmungskette bezeichnet, bezieht sich dies auf eine Reihe von Proteinen, die sich auf der inneren Mitochondrienmembran befinden und hochenergetische Elektronen aufnehmen, die durch den Zitronensäurezyklus produziert werden. Wenn sich die Elektronen durch mehrere Glieder dieser Kette bewegen, verlieren sie allmählich Energie, die wiederum verwendet wird, um einen Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran zu erzeugen.
  • F1FÖ-ATP-Synthase – Das auf mitochondrialen Cristae vorhandene Enzym, das für die Synthese von Adenosintriphosphat (ATP) verantwortlich ist.
  • Mitochondrien – Eukaryontische Organellen, die von einer Doppelmembran umhüllt sind und im Zytoplasma der Zelle gefunden werden. Ihre Hauptfunktion besteht darin, an der aeroben Atmung teilzunehmen und ATP zu erzeugen.

1. Auf welchen dieser mitochondrialen Strukturen findet man Cristae?
A. Die äußere Membran
B. Die innere Membran
C. Die Matrix
D. Alles das oben Genannte

2. Welche Aussage zu Cristae ist richtig?
A. Die faltige Form von Cristae vergrößert die Oberfläche der inneren Mitochondrienmembran.
B. Cristae befinden sich im Kern.
C. Cristae spielen keine Rolle dabei, dass Mitochondrien mit anderen Mitochondrien in den Zellen kommunizieren können.
D. Cristae sind Teil der Plasmamembran.

3. Welche der folgenden Aussagen ist richtig?
A. Die Größe der Oberfläche der Cristae-Membran ist proportional zur Kapazität einer Zelle zur ATP-Erzeugung.
B. Cristae-Membranen sind bei Krankheiten wie Parkinson und Alzheimer deformiert.
C. Die zylindrischen Verbindungen zwischen Cristae-Membranen und der inneren Membrangrenze der Mitochondrien werden Cristae-Junctions genannt.
D. Alles das oben Genannte.


Abstrakt

Ustilago maydis ist ein aerober Basidiomycet, der für seine ATP-Versorgung auf oxidative Phosphorylierung angewiesen ist, was auf das Mitochondrium als Schlüsselfigur in seinem Energiestoffwechsel hinweist. Mitochondriale Atmungskomplexe I, III2, und IV treten in supramolekularen Strukturen auf, die als Respirasom bezeichnet werden. In dieser Arbeit haben wir die Untereinheitszusammensetzung und die Kinetik der NADH:Q-Oxidoreduktase-Aktivität des Digitonin-solubilisierten Respirasoms (1600 kDa) und des freien Komplexes I (990 kDa) charakterisiert. In Gegenwart von 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinon (DBQ) und Cytochrom C, sowohl das respiratorische NADH:O2 und die NADH:DBQ-Oxidoreduktase-Aktivitäten wurden durch Rotenon, Antimycin A oder Cyanid gehemmt. Für die Atmungsaktivität wurde ein Wert von 2,4 für das oxidierte/sauerstoffreduzierte Verhältnis von NADH bestimmt, während die ROS-Produktion weniger als 0,001% der Sauerstoffverbrauchsrate betrug. Die Analyse der NADH:DBQ-Oxidoreduktase-Aktivität zeigte, dass das Respirasom 3-mal aktiver war und eine höhere Affinität als der freie Komplex I aufwies. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kontakte zwischen den Komplexen I, III2 und IV im Respirasom erhöhen die katalytische Effizienz von Komplex I und regulieren seine Aktivität, um die ROS-Produktion zu verhindern.


Experimentelle Verfahren

Zellkulturen

Die CI-defiziente Zelllinie (CI-KD) trägt eine homoplasmatische m.4681TϬ-Mutation im MT-ND2 Untereinheitsgen, das aufgrund einer p.L71P-Substitution zu einem schweren CI-Assembly-Defekt führt (Ugalde et al., 2007). Die CIII-Mutante (CIII-KO)-Zelllinie enthält eine homoplasmatische Deletion von 4�senpaaren im MT-CYB Gen, das die de novo Synthese von Cytochrom B (Ranaet al., 2000). Der mutierten CIV-Zelllinie (CIV-KO) fehlt Holo-COX aufgrund des homoplasmatischen m.6930GϪ-Übergangs in der MT-COI Gen, das ein Stoppcodon erzeugt, das zu einem vorhergesagten Verlust der letzten 170 Aminosäuren des COX1-Polypeptids führt (Bruno et al., 1999). HeLa-Zellen, die entweder mit dem leeren pWPXLd-ires-PuroR-Vektor transduziert wurden oder LYRM7-001-HA (MZM1L-HA) überexprimieren, wurden wie zuvor beschrieben erzeugt (Sanchez et al., 2013).

Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glukosegehalt (DMEM, Life Technologies), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und Antibiotika, kultiviert. Um die mitochondriale Translation zu blockieren, wurden dem Kulturmedium sechs Tage lang 15 µg/ml Doxycyclin zugesetzt. Die Zellen wurden unter exponentiellen Bedingungen gezüchtet und zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet.

In-vitro-Import

Radiomarkierte COX7A2L-, COX6A- und RISP-Proteine ​​wurden durch gekoppelte Transkription und Translation in Gegenwart von 35 S-Methionin (PerkinElmer) unter Verwendung des TNT SP6 Quick Coupled Systems (Promega) erhalten. Importexperimente wurden wie zuvor beschrieben an frisch isolierten Mitochondrien aus Herzgewebe durchgeführt (Mourier et al., 2014a).

Immunpräzipitation

Ein Milligramm mitochondriales Protein aus HEK293-transduzierten Zellen wurde wie für BNE-Analysen in 600 μl von 4 g/g Digitonin-zu-Protein-Puffer solubilisiert. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 13.000 U/min bei 4 °C wurden 50 µg des Überstands als Eingangsfraktion abgetrennt. Der verbleibende Überstand wurde in Harz-Spin-Säulen (Pierce Co-IP Kit, Thermo Scientific) co-immunpräzipitiert, in denen zuvor 15 μg Antikörper gegen DDK-tag (Oncogene), CORE2 oder COX1 immobilisiert worden waren. Die Mischung wurde über Nacht bei 4°C in einem rotierenden Schüttler vorsichtig inkubiert und 1 min bei 1000 g zentrifugiert, um die Durchflussfraktion abzutrennen. Die Säule wurde dreimal mit Lysis Buffer gewaschen, der 1% NP-40 enthielt, und Proteine ​​wurden eluiert. Das Immunpräzipitat wurde in drei Aliquots aufgeteilt, mit 5× Loading Sample Buffer behandelt und vor dem Laden 5 Minuten auf 95 °C erhitzt.

Blaue native Elektrophorese- und In-Gel-Aktivitätsassays

Mitochondriale Pellets und blaue native Analysen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Moreno-Lastres et al., 2012 Mourier et al., 2014a). Native PAGE™ Novex® 3-12% Bis-Tris Protein Gele (Life Technologies) oder selbst hergestellte 4-10% Polyacrylamid-Gradientengele wurden mit 60-80 μg mitochondrialem Protein beladen. Nach der Elektrophorese wurden Proteine ​​über Nacht bei 40 V auf Nitrozellulose- oder PVDF-Membranen übertragen und mit spezifischen Antikörpern sondiert.

Antikörper

Western-Blot wurde mit primären Antikörpern gegen COX7A2L (ProteinTech), Myc (Origene), Turbo-GFP (Origene), HA (Roche), β-Actin (Sigma) und gegen die folgenden humanen OXPHOS-Untereinheiten durchgeführt: NDUFS1 ( GeneTex) NDUFA9, NDUFB8, CORE2, RISP, CYC1, UQCRB, UQCRQ, COX1, COX4, COX5A, COX6C, SDHA, SDHB (Mitosciences) und COX5B (Santa Cruz). Als sekundäre Antikörper (Molecular Probes) wurden Peroxidase-konjugierte Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-IgGs verwendet. Immunreaktive Banden wurden mit einem ECL-Prime-Western-Blotting-Nachweisreagenz (Amersham) in einem ChemiDoc™ MP Imager (Biorad) nachgewiesen. Die optischen Dichten der immunreaktiven Banden wurden unter Verwendung der Analysesoftware ImageLab™ (Biorad) und ImageJ gemessen.

Indirekte Immunfluoreszenz

Die Zellen wurden 15 min mit 4% Paraformaldehyd fixiert, 15 min mit 0,1% Triton X-100 permeabilisiert und 1 h in Blockierungspuffer, der 10% Ziegenserum enthielt, inkubiert. Deckgläser wurden mit einem Antikörper gegen die monoklonale Komplex-V-α-Untereinheit und einem Texas Red-konjugierten Anti-Maus-Sekundärantikörper (Abcam) inkubiert. Deckgläser wurden gespült, in ProLong Gold Antifade-Reagenz (Molecular Probes) auf Glasobjektträger montiert, und die Zellen wurden mit einem konfokalen Mikroskop Zeiss LSM 510 Meta und einem 63× Planapochromat-Öl-Eintauchobjektiv (NA: 1,42) betrachtet. Sequentielles Scannen der grünen und roten Kanäle wurde durchgeführt, um einen Durchblutungseffekt zu vermeiden. Die Zellen wurden zufällig mit 0,5-1,0 μm-Scheiben und einer Auflösung von 1024� Pixeln abgebildet. Für die Kolokalisationsanalyse wurde das Plugin “Merge Channels” aus der ImageJ 1.48v-Software verwendet.

Statistische Datenanalyse

Alle Experimente wurden mindestens in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittelwerte der Standardabweichung (SD) dargestellt. Statistisch P Werte wurden durch Anwendung der Friedman und Mann-Whitney U Tests mit dem Programm SPSS v21.0.

Ethik-Erklärung

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Federation of European Laboratory Animal Science Associations durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz in Nordrhein-Westfalen in Deutschland genehmigt.

Höhepunkte

COX7A2L interagiert bevorzugt mit dem Atmungskettenkomplex III

COX7A2L ist unerlässlich, um das III . zu stabilisieren2+IV Superkomplex

COX7A2L ist für die Biogenese oder Aufrechterhaltung des Respirasoms nicht erforderlich

Biogenese des III2+IV Superkomplex ist für die Bildung von Atemwegssomen nicht notwendig


Analyse von Superkomplexen der mitochondrialen Atmungskette mittels blauer nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE)

Mitochondrien sind zelluläre Organellen, die Energie in Form von ATP durch einen als oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) bezeichneten Prozess gewinnen, der über die Proteinkomplexe der Elektronentransportkette (ETC) erfolgt. In den letzten Jahren ist eindeutig klar geworden, dass mitochondriale Komplexe der ETC keine statischen Einheiten in der inneren Mitochondrienmembran sind. Diese Komplexe sind dynamisch und aggregieren bei Säugetieren in verschiedenen stöchiometrischen Kombinationen, um Superkomplexe (SCs) oder Respirasomen zu bilden. Es wurde vorgeschlagen, dass die Nettoatmung über SCs effizienter ist als über isolierte Komplexe. Es muss jedoch noch festgestellt werden, ob die Aktivität eines bestimmten SC mit einer Krankheitsätiologie verbunden ist. Hier beschreiben wir eine vereinfachte Methode zur Visualisierung und Bewertung der In-Gel-Aktivität von SCs und den einzelnen Komplexen mit guter Auflösung mit blauer nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE). © 2016 von John Wiley & Sons, Inc.


Die Organisation des Superkomplexes der Atmungskette ist unabhängig von COX7a2l-Isoformen

Die Organisation einzelner Atmungskettenkomplexe in Superkomplexe oder Respirasomen hat aufgrund der Auswirkungen auf die zelluläre Energieumwandlung großes Interesse auf sich gezogen. Kürzlich wurde berichtet, dass häufig verwendete Mausstämme eine kurze COX7a2l (SCAFI) Genisoform enthalten, die angeblich die Bildung von Komplex IV-haltigen Superkomplexen ausschließt. Diese Behauptung hat möglicherweise schwerwiegende Auswirkungen auf zahlreiche Studien an Mäusen, die sich mit wichtigen Themen des Stoffwechsels befassen, einschließlich der Anpassung an Raumfahrt. Mit mehreren komplementären experimentellen Ansätzen zeigen wir, dass Mäuse mit der kurzen COX7a2l-Isoform eine normale Biogenese und Steady-State-Spiegel von Komplex IV-haltigen Superkomplexen und folglich eine normale Atmungskettenfunktion aufweisen. Darüber hinaus verwenden wir einen Maus-Knockout von Lrpprc und zeigen, dass der Verlust von Komplex IV die Respirasomenbildung beeinträchtigt. Wir schließen daraus, dass das Vorhandensein der kurzen COX7a2l-Isoform in den häufig verwendeten C57BL/6-Mausstämmen deren Verwendung in der Stoffwechselforschung nicht verhindert.

Copyright © 2014 Die Autoren. Herausgegeben von Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Figuren

Unterschiedlich Cox7a2l Isoformen haben keine…

Unterschiedlich Cox7a2l Isoformen haben keine unterschiedlichen Auswirkungen auf die Aktivität der Atmungskette (A) PCR…

Die Kurze Cox7a2l Isoform macht…

Die Kurze Cox7a2l Isoform beeinflusst nicht die supramolekulare Organisation der Atemwege…

Komplexe IV-haltige Respirasomen sind vorhanden…

Komplexe IV-haltige Respirasomen sind in Mausstämmen vorhanden, die den Short enthalten Cox7a2l Isoform…

Die Montage von Komplex IV…

Der Aufbau von Komplex IV, der Respirasomen enthält, ist in Mausstämmen, die…


Ergebnisse

Das Rinderherz I + III2 + IV Superkomplex wurde durch BN-PAGE bis zur Homogenität gereinigt, gefolgt von Elektroelution, eine Voraussetzung für die Durchführung einer Kryoelektronenmikroskopie-Studie. Die Herstellung von gefrorenen hydratisierten Kryo-EM-Gittern durch Adsorption der gereinigten Probe auf löchrige Kohlenstofffilmgitter und Einfrieren führte jedoch zu inhomogen verteilten Partikeln in den Gitterlöchern. Wir verwendeten daher löchrige Kohleschichtgitter, die mit einer dünneren zweiten Kohleschicht bedeckt waren, an der die Partikel adsorbieren konnten. Dieser Ansatz führte zu gleichmäßig verteilten Molekülen (Abb. 1). Einzelpartikelanalyse, einschließlich Klassifizierung und Mittelung von zweidimensionalen Projektionen, zeigte, dass die Respirasommoleküle bevorzugt an einigen Positionen auf dem Kohlenstoffträgerfilm ausgerichtet waren. Der am häufigsten vorkommende Projektionstyp hat eine dreieckige Form (Abb. 1, Einsatz), wie auch zuvor in negativ gefärbten Proben festgestellt (5). An diesen Kryo-EM-Proben haben wir eine Elektronentomographie durchgeführt und aus 21 Tilt-Serien die 3D-Volumina der Proben rekonstruiert. Aus diesen Tomogrammen wurden 2.466 Subtomogramme mit einzelnen Respirasomen für die 3D-Mittelung extrahiert. Eine Kombination aus XMIPP (X-Window-based Microscopy Image Processing Package) Maximum Likelihood (ML) Global Alignment (11) und lokaler Verfeinerung durch Kreuzkorrelation mit AV3 Toolbox (15) wurde verwendet, um eine Durchschnittsstruktur zu erstellen. Die Auflösung des Respirasoms ist anisotrop (Abb. S1) und korreliert mit der Winkelabtastung (Abb. S2). Die höchste erreichbare Auflösung unserer durchschnittlichen Struktur in Richtung senkrecht zum einfallenden Strahl beträgt 1,7 nm und die niedrigste beträgt 2,55 nm parallel zum Strahl. Wir haben die gesamte Rekonstruktion auf 2,2 nm gefiltert, was bei der ersten Null der Kontrastübertragungsfunktion liegt.

Kryoelektronenmikroskopische Aufnahme von isolierten Rinderrespirasomen. (Skalenbalken: 100 nm.) (Einsatz) Zweidimensionale Projektionskarte des Respirasoms in einer Draufsichtposition aus Einzelpartikelbildanalyse. (Skalenbalken: 10 nm.)

Die Rekonstruktion zeigt ein Respirasom mit Abmessungen von 27 × 21 nm in der Membranebene (Abb. 2 B und C) und einer maximalen Höhe von 23 nm (Abb. 2B), gebildet durch die riesige hydrophile Domäne von Komplex I. Im Vergleich mit bekannten 3D-Strukturen der einzelnen Komplexe sind viele relevante Merkmale erkennbar, wie etwa hervorstehende Dichten im Zentrum, verbunden durch eine lokale zweizählige Symmetrieachse (Abb. 2, Pfeile .). ), die auf die Position der Kern-I- und -II-Untereinheiten des dimeren Komplexes III hinweisen. Komplex III2 sitzt im Bogen des Membranarms von Komplex I und Komplex IV ist an der Spitze von NADH-Dehydrogenase und Komplex III2 (Abb. 2, Pfeilspitzen). Um die Kryo-EM-Karte genau zu interpretieren, überlagerten wir die hochauflösenden Röntgenstrukturen der Rinderkomplexe III2 (12) und IV (13). Zur Modellierung der Komplex-I-Einheit werden die Röntgendaten mittlerer Auflösung der Hefe Yarrowia lipolytica verwendet wurden (14). Die Anpassung wurde mit Korrelationskoeffizienten zwischen 0,83–0,92 für die Rinderstrukturen erreicht, was auf eine einzigartige, enge Anpassung mit hoher Zuverlässigkeit der Komponenten in der endgültigen Hybridstruktur hinweist (Abb. 3 .). EIN, B, und D, und Abb. S3). Keine wesentlichen Teile der einzelnen Komplexe erweitern die 3D-Kryo-EM-Rekonstruktion, was darauf hindeutet, dass das Respirasom im Grunde die Summe seiner Komponenten ist. Basierend auf der Anpassung stellt unsere 3D-Struktur ein vollständiges Respirasom dar, einschließlich der peripheren Armdomäne von Komplex I (Abb. 3 EIN und B, Pfeilspitzen), die bei negativ gefärbten Proben teilweise fehlt (16). Einige kleine Unterschiede bestehen zwischen der EM-Rekonstruktion und den Röntgenkarten (Abb. 3 EIN, B, und D, orangefarbene Pfeilspitzen), die höchstwahrscheinlich Detergensmoleküle sind, die das Respirasom umgeben. Iteratives Multireferenz-Alignment und -Klassifikation (17) zeigte das Vorhandensein des peripheren Arms in allen fünf Klassen mit leichten Abweichungen (Abb. S4). Die Subtraktion zweier Rekonstruktionen, die zwei verschiedene Klassen repräsentieren, ergab eine Dichte (Abb. S4, roter Stern), die auf eine mögliche Konformationsänderung in der hydrophilen Domäne von Komplex I zurückgeführt werden kann. Um dies zu beweisen, sind zusätzliche Experimente erforderlich. Der vollständige Komplex I von Rindern und Schafgarbe gleich sind, bilden die peripheren Matrizenarme den gleichen Winkel (Abb. 3EIN, gelb) und die Biegung des Membranarms ist nahezu gleich (Abb. 3D, Doppelpfeilspitze). Die Überlagerung des kleineren prokaryotischen Komplexes I aus Thermophilus weist auf eine ähnliche Gesamtform hin (Abb. S5) und zeigt zusätzlich deutlich die Lage der akzessorischen Untereinheiten der eukaryontischen Enzyme. Diese akzessorischen Proteine ​​scheinen meist in Clustern angeordnet zu sein.

Kryo-EM-Karte von I + III2 + IV Superkomplex: (EIN und B) von der Seite gesehen, (C) von der Matrixseite aus gesehen zeigt der Pfeil auf den Komplex III2, Pfeilspitze zu Komplex IV bzw. Doppelpfeilspitze zum gekrümmten Membranarm von Komplex I. (D) Von der Spitze aus gesehen. Konturebene ist 0,1. Horizontale Linien an EIN und D zeigen die Position der Membran an. (Skalenbalken: 10 nm.)

Anpassung der hoch- und mittelaufgelösten Strukturen der Komplexe I, III2, und IV zur 3D-Kryo-EM-Karte von I + III2 + IV Superkomplex: (EIN) Seitenansicht, Pfeilspitze zeigt auf Flavoproteine ​​(B) Seitenansicht von der Membran, Pfeile zeigen auf die Kern-I- und -II-Untereinheiten des Komplexes III2, Pfeilspitze zu Flavoproteinen (C) Schnitt durch das raumfüllende Respirasommodell auf Membranebene, der Lücken zwischen den Komplexen innerhalb des Superkomplexes (D) Draufsicht aus dem Intermembranraum, Doppelpfeilspitze zeigt auf die Biegung des Komplexes I in der Membran (E) raumfüllendes Respirasommodell von der Membran aus gesehen, rote und hellblaue Pfeilspitzen zeigen die Schnittebene in C und F (F) Schnitt durch das raumfüllende Respirasommodell auf Matrixebene. In Grün, Röntgenstruktur des bovinen dimeren Komplexes III in Lila, Röntgenstruktur des bovinen monomeren Komplexes IV in Gelb, die Dichtekarte von Komplex I von Yarrowia lipolytica. Horizontale Linien an E zeigen die Position der Membran an. Orangene Pfeilspitzen an EIN, B, und D weisen auf die Position von Waschmittelmizellen hin. (Skalenbalken: 10 nm.)


Autorenbeiträge

Konzeptualisierung: MO, SB und FF Methodik: JB, AA, AB, FF und MO Validierung: FF und MO Formale Analyse: JB, AA und SR Untersuchung: JB, AA, SR, LM-B, HD, JD, VK- und FF-Ressourcen: AB, SB, FF und MO Datenkuration: JB, AA, SR, FF und MO Writing – Originalentwurf: JB, AA und MO Writing – Review and Editing: JB, AA, HD, VK, AB, SB, FF und MO Visualisierung: JB, AA und MO Supervision: SB, FF und MO Projektverwaltung: MO Finanzierung Akquise: AA, VK, AB, SB, FF und MO.