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Bestimmen Sie, ob Aromaten aus dem Polyketid- oder Shikimat-Weg stammen

Bestimmen Sie, ob Aromaten aus dem Polyketid- oder Shikimat-Weg stammen


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Gibt es eine Möglichkeit zu bestimmen, ob eine aromatische Verbindung aus dem Polyketid- oder Shikimat-Weg stammt, indem man ihre Struktur betrachtet? Wenn das so ist, wie?


Aromaten, die aus dem Shikimat-Weg stammen, ergeben eine Struktur wie diese

Während Aromaten, die aus dem Polyketid-Weg stammen, eine alternative Struktur in der Verteilung der OH-Gruppen aufweisen.


Wenn beide Wege dasselbe Molekül produzieren, können Sie nicht sagen: Es ist das gleiche Molekül.

Sie könnten auf beiden Seiten einige Enzyme ausschalten und sehen, welche die Leistung beeinflussen. Oder Sie könnten die Zellen mit einem radioaktiv markierten Vorläufer von nur einem Signalweg anreichern und dann sehen, ob die Ausgabe auch markiert ist.

Sie sagen jedoch "indem Sie seine Struktur betrachten", also gehe ich davon aus, dass kein zusätzliches Experiment durchgeführt werden kann - dann nein, außer in dem trivialen Fall, in dem nur einer der Wege das Molekül produziert (in diesem Fall kam es offensichtlich davon) einer).


Evolution eines sekundären Stoffwechselwegs aus dem Primärstoffwechsel: Shikimat- und Quinatbiosynthese in Pflanzen

Der Shikimat-Weg synthetisiert aromatische Aminosäuren, die für die Proteinbiosynthese essentiell sind. Shikimat-Dehydrogenase (SDH) ist ein zentrales Enzym dieses primären Stoffwechselwegs und produziert Shikimat. Das strukturell ähnliche Quinat ist ein sekundärer Metabolit, der von der Quinat-Dehydrogenase (QDH) synthetisiert wird. SDH und QDH gehören zur gleichen Genfamilie, die nach einer definierenden Genduplikation kurz vor der Angiospermen/Gymnospermen-Spaltung in zwei phylogenetische Kladen zerfiel. Nicht-Samenpflanzen, die vor dieser Duplikation divergiert haben, enthalten nur ein einziges Gen dieser Familie. Erhaltene Vertreter der Chlorophyten (Chlamydomonas reinhardtii), Moosen (Physcomitrella patens) und Lykophyten (Selaginella moellendorfii) kodierte fast ausschließlich SDH-Aktivität in vitro. Eine rekonstruierte Vorfahrensequenz, die den Knoten kurz vor der Genduplikation darstellt, kodierte auch für die SDH-Aktivität. Die Quinat-Dehydrogenase-Aktivität wurde nur in Samenpflanzen nach Genduplikation gewonnen. Chinate Dehydrogenasen von Gymnospermen, hier dargestellt durch Pinus taeda, können an ein evolutionäres Zwischenprodukt erinnern, da sie gleiche SDH- und QDH-Aktivitäten kodieren. Das zweite Exemplar in P. taeda behielt eine Spezifität für Shikimat ähnlich der Aktivität, die in der Angiosperm-SDH-Schwestergruppe gefunden wurde. Das Codon für einen Tyrosinrest innerhalb des aktiven Zentrums zeigte eine Signatur positiver Selektion an dem Knoten, der die QDH-Klade definiert, wo es sich in ein Glycin änderte. Das Ersetzen des Tyrosins durch ein Glycin in einer stark Shikimat-spezifischen Angiospermen-SDH war ausreichend, um eine gewisse QDH-Funktion zu erlangen. Daher waren nur sehr wenige Mutationen notwendig, um die Evolution von . zu erleichtern QDH Gene.


1. Einleitung

Aromatische und von Aromaten abgeleitete Verbindungen (ADC) sind wertvolle Massen- oder Feinchemikalien mit einer Vielzahl wichtiger Anwendungen. Sie dienen als Bausteine ​​für viele wertvolle Verbindungen, darunter Polymere wie Kunststoffe, Harze und Fasern, und werden als Schmiermittel, Farbstoffe und Pestizide verwendet. Darüber hinaus werden sie für die Herstellung unverzichtbarer Nutra- und Pharmazeutika benötigt. [ 1-4 ] Ihr überwiegender Teil wird in energieintensiven und umweltbelastenden Prozessen aus Erdöl gewonnen. Die steigende Nachfrage, die Begrenzung fossiler Ressourcen und die aktuelle Umweltkrise haben die dringend notwendige Umstellung auf eine nachhaltige, biobasierte Produktion von Kraftstoffen und Chemikalien aus nachwachsenden Rohstoffen immer stärker ins Blickfeld gerückt. [ 5 ] Neben der grünen Chemie ist die mikrobielle Biokatalyse eine vielversprechende Strategie, um Aromaten bei Umgebungstemperatur und -druck ohne den Einsatz toxischer Katalysatoren herzustellen und dadurch den Energieverbrauch und die Abfallerzeugung zu reduzieren. [ 6 ] Der Fortschritt auf diesem Gebiet wurde kürzlich in mehreren Publikationen zusammengefasst, die einen breiten Überblick über verschiedene Wirtsorganismen geben. [ 1-4, 7, 8 ] Die hier vorgestellte Übersicht beleuchtet speziell die Anwendung verschiedener Pseudomonas Spezies als mikrobielle Zellfabrik zur Herstellung industriell relevanter Aromaten und ADC. Dazu gehören die de novo-Synthese solcher aus erneuerbaren und reichlich verfügbaren Rohstoffen und damit verbundene gentechnische Strategien, die eine effiziente Biokonversion ermöglichen. Darüber hinaus werden Biotransformationsansätze von natürlichen und hergestellten aromatischen Substraten in wertschöpfende Produkte erläutert, mit einem Fokus auf die einzigartige Stressresistenz von Pseudomonas Ermöglichen der Verwendung organischer Lösungsmittel in zweiphasigen Fermentationen. Die Valorisierung von Lignin- und Kunststoff-ableitbaren Aromaten und metabolische Trichterbildung von heterogenen Mischungen davon wird ebenfalls diskutiert.


Behauptungen

1. Verfahren zur Identifizierung eines Testmittels, das ein oder mehrere Enzyme hemmen kann, die Teil eines Shikimat-Wegs sind, wobei das Verfahren das Einführen des Testmittels in modifizierte Saccharomyces-Hefe umfasst, wobei die modifizierte Saccharomyces-Hefe umfasst:

i) eine Unterbrechung eines endogenen Saccharomyces-Hefe-Gens, das für das Shikimat-Weg-Enzym kodiert, und ii) ein ergänzendes Gen, das ein heterologes Enzym kodiert, das homolog zu dem Enzym ist, das durch das endogene Saccharomyces-Hefe-Gen kodiert wird, wobei eine Hemmung des Wachstums der modifizierten Saccharomyces-Hefe relativ zu einer Kontrolle ist ein Hinweis darauf, dass das Testmittel das Shikimatweg-Enzym hemmt, und wobei die Kontrolle das Wachstum der modifizierten Saccharomyces-Hefe umfasst, in die das Testmittel eingeführt wird, und wobei das Wachstum der modifizierten Saccharomyces-Hefe auf einem Medium durchgeführt wird, das mit einer oder mehreren aromatischen Aminosäuren ergänzt wird, so dass das Wachstum der modifizierten Hefe unabhängig von der Funktion des ergänzenden Gens ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mehrere verschiedene Testmittel in mehrere verschiedene Saccharomyces-Hefekulturen eingeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mehreren Testmittel unterschiedliche Testmittel sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das endogene Saccharomyces-Hefe-Gen, das zerstört oder deletiert ist, ARO1 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ergänzende Gen homolog zum endogenen Saccharomyces-Hefegen ist, das zerstört oder deletiert ist und von einer Spezies stammt, die für Säugetiere, Insekten, Vögel, Fische oder Pflanzen infektiös ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsgen von einem prokaryontischen Pathogen stammt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ergänzende Gen von einem eukaryontischen Pathogen stammt.


Regulatorische Architektur der Phenylpropanoid-Biosynthese

Aufgrund der umfangreichen Informationen, die über seine strukturellen und regulatorischen Gene zur Verfügung stehen, ist der Phenylpropanoid-Weg ein hervorragendes System, um ein Verständnis für die genetische Manipulation komplexer Naturstoffwege in Pflanzen zu entwickeln. Uns fehlen jedoch noch wichtige Informationen über die Punkte der Flusskontrolle an und innerhalb der verschiedenen in Abb. 1 dargestellten Verzweigungspfade und das potenzielle Übersprechen zwischen den Pfaden. Wichtig ist auch das Ausmaß, in dem Reaktionssätze in metabolischen Kanälen oder „Metabolonen“ organisiert sind, was zur Absonderung von Zwischenprodukten aus diffundierbaren zytosolischen Pools führt (Srere, 1987). Alle diese Faktoren können das Ergebnis von Versuchen, den Spiegel einer bestimmten Verbindung durch transgene Ansätze zu erhöhen oder zu verringern, stark beeinflussen. Die Beantwortung dieser Fragen erfordert interdisziplinäre Ansätze unter Einbeziehung der Molekular-, Zell- und Strukturbiologie.

Unser Verständnis der Flusskontrolle und des Cross-Talks in der Phenylpropanoid-Biosynthese stammt hauptsächlich aus Studien, in denen bestimmte Enzyme des Stoffwechselwegs in transgenen Pflanzen überexprimiert oder herunterreguliert wurden. Ein solcher Ansatz hat gezeigt, dass das Eintrittspunkt-Enzym PAL für die Produktion von Chlorogensäure (CGA, Caffeoylchininsäure) in Tabakblättern direkt geschwindigkeitsbestimmend ist, dass jedoch zusätzlich zum PAL-Kontrollfluss in Flavonoide und Lignin (Howles et al., 1996). CGA wurde mit der Resistenz gegen Mikroben und Insekten in Verbindung gebracht ( Yao et al., 1995). et al., 1999 ).

Bei Kartoffelknollen führte die Schaffung einer künstlichen Senke für Tryptophan durch die transgene Expression eines Tryptophan-Decarboxylase-Gens zu verringerten Phenylalanin-Pools und verringerten Konzentrationen von wundinduziertem CGA und Lignin, was zu einer erhöhten Anfälligkeit für Phytophthora infestans ( Yao et al., 1995). Der CGA-Spiegel wird auch in Tabak durch die Herunterregulierung von C4H, dem zweiten Enzym im Phenylpropanoid-Weg, reduziert, und dies wird von einer Feedback-Hemmung der PAL-Aktivität begleitet, möglicherweise als Folge einer Feedback-Hemmung der PAL-Expression durch Cinnamat oder ein Derivat davon ( Blount et al., 2000). Im Gegensatz dazu führte eine Überexpression von C4H nicht durchgängig zu erhöhten CGA-Spiegeln ( Blount et al., 2000 ), was bestätigt, dass PAL und nicht C4H der Kontrollpunkt des Flusses in den Phenylpropanoid-Weg in Tabakblättern ist.

Chalcon-Isomerase (CHI) katalysiert eine nahezu diffusionsbegrenzte Reaktion, die auch spontan bei zellulärem pH-Wert auftreten kann und wird daher im Allgemeinen nicht als potenziell geschwindigkeitsbestimmendes Enzym für die Flavonoid-Biosynthese angesehen. Eine Überexpression von CHI in Tomatenfruchtschalen führt jedoch zu einem 80-fachen Anstieg der Flavonolspiegel ( Muir et al., 2001), und eine dreifache Erhöhung des Flavonolspiegels kann durch die Expression von Luzerne-CHI in . erreicht werden Arabidopsis (C. J. Liu und R. A. Dixon, unveröffentlichte Ergebnisse). CHI scheint daher eine Komponente der Flusskontrolle in den Flavonoid-Zweig der Phenylpropanoid-Biosynthese zu sein.

Der Phenylpropanoid-Weg stellt einige der am besten charakterisierten Beispiele für metabolische Kanalisierung im Pflanzenstoffwechsel dar. Metabolisches Channeling beinhaltet die physikalische Organisation von aufeinanderfolgenden Enzymen in einem Stoffwechselweg in Komplexe, durch die Zwischenprodukte des Stoffwechselweges ohne Diffusion in den Großteil des Cytosols geleitet werden (Srere, 1987). Solche Komplexe sind jedoch locker und viele der beteiligten Enzyme können operativ löslich sein. Die Komplexe ermöglichen eine effiziente Kontrolle des Stoffwechselflusses und schützen instabile Zwischenprodukte vor einem unproduktiven Abbau oder dem Zugang zu Enzymen über potenziell konkurrierende Wege. Solche Komplexe können direkte physikalische Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Enzymen beinhalten, wie kürzlich für Enzyme der Flavonoid-Biosynthese in gezeigt wurde Arabidopsis (Winkel-Shirley, 1999) oder kann mit der Kolokalisation von Enzymen auf Membranen oder anderen Oberflächen in Verbindung gebracht werden (Liu und Dixon, 2001). In beiden Fällen kann die Kanalbildung durch Doppelmarkierungs- oder Isotopenverdünnungsexperimente nachgewiesen werden, bei denen exogen aufgebrachte Zwischenprodukte weniger effiziente Vorläufer von Downstream-Produkten sind als ihre Upstream-Substrate. Solche Kriterien haben die Kanalisierung zwischen PAL und C4H am Eintrittspunkt in den Phenylpropanoid-Weg (Czichi und Kindl, 1975 Hrazdina und Jensen, 1992 Hrazdina und Wagner, 1985 Rasmussen und Dixon, 1999) und zwischen Isoflavonsynthase (IFS) und IOMT at . bestätigt der Eintrittspunkt in den Isoflavonoid-Phytoalexin-Weg (Liu und Dixon, 2001). In beiden Fällen sollte die Beteiligung eines membranassoziierten Cytochrom-P450-Enzyms (C4H oder IFS) beachtet werden, das den Komplex am endoplasmatischen Retikulum „verankern“ könnte.

Metabolic Channeling kann die Abwehrreaktionen von Pflanzen auf zwei Arten beeinflussen. Erstens ist es möglich, dass Zwischenprodukte, die ein bestimmtes Stoffwechselendprodukt werden sollen, wie ein von Phenylpropanoid abgeleitetes Phytoalexin, so kanalisiert werden, dass sie andere „Pools“ von Stoffwechselenzymen nutzen als andere Produkte, die einen Teil der gleiche Biosyntheseschritte. Dies könnte durch die Verwendung unterschiedlicher isoenzymatischer Formen der verschiedenen Stoffwechselwegenzyme in unterschiedlichen Komplexen erreicht werden. Ein solches Modell würde vorhersagen, dass die multiplen Gene für viele der unten beschriebenen Stoffwechselenzyme sowohl unterschiedliche als auch überlappende Funktionen haben könnten, eine Hypothese, die noch getestet werden muss. Wenn dies der Fall wäre, könnte die Messung von Veränderungen in Gentranskripten unter Verwendung von Sonden, die nicht zwischen allen möglichen Formen des kodierten Enzyms unterscheiden, zu Ergebnissen führen, die nicht mit dem Abwehrstoffwechsel korrelieren, wie dies bei der Flavonoid-/Isoflavonoid-Abwehr bei bakteriell infizierten Luzerne beobachtet wird (Sallaud et al., 1997). Zweitens stellt metabolisches Channeling, obwohl es die Effizienz induzierter Abwehrmechanismen verbessern könnte, auch eine potenzielle Barriere für ein effizientes metabolisches Engineering dar, da kanalisierte Zwischenprodukte für die Enzymprodukte von Transgenen, die eingeführt werden, um einen Weg zur Bildung von a . umzuleiten, möglicherweise nicht zugänglich sind neuartige bioaktive Verbindung.


Informationen zum Autor

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Jin-Quan Huang, Xin Fang.

Mitgliedschaften

State Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, University of CAS, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China

Jin-Quan Huang, Xiu Tian, ​​Ping Chen, Jia-Ling Lin, Xiao-Xiang Guo, Jian-Xu Li, Zhen Fan, Wei-Meng Song, Fang-Yan Chen, Ruzha Ahati, Ling-Jian Wang & Xiao-Ya Chen

State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming, China

School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, Shanghai, China

Shanghai Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Resources, Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai Chenshan Plant Science Research Center, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China


1. Einleitung

Die Prenylierung kleiner aromatischer Moleküle ist ein zentraler Schritt in der Biosynthese vieler Naturstoffe. Die Verknüpfung von Isoprenoid-Vorläufern, die aus dem Mevalonat- oder Methylerythritphosphat-Weg stammen, mit aromatischen Vorläufern, die meist aus dem Polyketid- oder Shikimat-Weg stammen, hat die Grundlage für die Evolution einer beeindruckenden Vielfalt von Sekundärmetaboliten in Bakterien, Pilzen und Pflanzen geschaffen.

Vor kurzem wurde eine neue Klasse von Enzymen entdeckt, die die Prenylierung aromatischer Verbindungen katalysieren, in Streptomy-cetes, gram-positiven Bodenbakterien, die produktive Produzenten wichtiger Naturstoffe sind [1]. Diese Enzymklasse umfasst CloQ und NovQ, die eine Dimethylallyl-Seitenkette an C-3 von 4-Hydroxyphenylpyruvat in der Aminocumarin-Antibiotika-Biosynthese anhängen [2], und Orf2 der Naphterpin-Biosynthese, das eine Geranyl-Seitenkette an verschiedene phenolische Verbindungen bindet [3]. Das echte Substrat von Orf2 ist noch unbekannt.

Röntgenkristallographische Untersuchungen zeigten, dass die Enzyme dieser Klasse eine neuartige antiparallele β,α Fassfaltung aufweisen. Im Gegensatz zum TIM-Fass weist das Prenyltranferase-Fass 10 antiparallele (statt parallele) β-Stränge auf, die ein zentrales, lösungsmittelgefülltes Fass bilden, das die Bindungsstellen für die aromatischen und isoprenoiden Substrate enthält [3,4]. Modellierungsstudien legten nahe, dass ein zuvor hypothetisches Protein von Streptomyces coelicolor A3(2), als HypSc bezeichnet, weist die gleiche Proteinstruktur auf, und für dieses Protein konnte tatsächlich eine Prenyltransferase-Aktivität nachgewiesen werden [3]. Die Mitglieder dieser Enzymklasse sind lösliche, monomere Biokatalysatoren, die eine ungewöhnliche Promiskuität für ihre aromatischen Substrate aufweisen. Es wurde darauf hingewiesen, dass die Entdeckung dieser Klasse einen erheblichen Einfluss auf die Synthese prenylierter aromatischer Verbindungen haben kann, da diese Enzyme verwendet werden können, um Bibliotheken prenylierter aromatischer Verbindungen für die Arzneimittelentwicklung zu erstellen [5,6].

Wir berichten hier über ein neues Enzym dieser Klasse, Fnq26, das C- und Ö-Prenylierungen verschiedener phenolischer Substrate. Im Gegensatz zu Orf2 der Naphterpin-Biosynthese ist die Fnq26-Reaktion unabhängig von Mg 2+ -Ionen, und als erster Vertreter dieser Klasse ist Fnq26 in der Lage, eine ‘‘reverse’’ Prenylierung, dh die Anlagerung von C-3 statt C-1 von Geranyldiphosphat an das aromatische Substrat. Eine solche umgekehrte Prenylierung stimmt mit der vermuteten Rolle von Fnq26 bei der Biosynthese von Furanonaphthochinon I (FNQ I) (Abb. 1) überein, einem Naturstoff gemischten Isoprenoid/Polyketid-Ursprungs aus Streptomyces cinnamonensis DSM1042 [7].

Biosynthese von FNQ I und Naphterpin.


SW und XZ haben die Experimente konzipiert und gestaltet. SW führte Experimente durch, analysierte die experimentellen Daten und verfasste das Manuskript. CF, KL und JC halfen bei der experimentellen Arbeit und beim Schreiben von Manuskripten. HH und WW steuerten Reagenzien & Materialien bei. XZ hat das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben an der Abschlussarbeit mitgewirkt.

Diese Arbeit wurde von den National Key Science Research Projects (Grant No. 2019YFA09004302) und der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31670033) finanziert.


Abstrakt

Verschiedene Tiere sind mit spezifischen endosymbiotischen Mikroorganismen assoziiert, die dem Wirt lebenswichtige Nährstoffe liefern oder Schutz vor natürlichen Feinden bieten. Genomanalysen der vielen Endosymbiosen, die in Pflanzensaft-fressenden Hemipteren-Insekten gefunden werden, haben unabhängige Erwerbe – und gelegentliche Ersetzungen – von Endosymbionten gezeigt, so dass viele dieser Endosymbiosen zwei oder mehr mikrobielle Partner umfassen. In diesem Aufsatz diskutiere ich, wie die Aufteilung der genetischen Kapazität für metabolische Funktionen zwischen verschiedenen Endosymbionten die Ernährungsfunktion in Multipartner-Endosymbiosen aufrechterhält und wie die phänotypischen Merkmale dieser Endosymbionten durch koevolutionäre Interaktionen mit beiden gleichzeitig vorkommenden mikrobiellen Taxa und des Wirts, die oft über lange evolutionäre Zeitskalen operieren.


Resultate und Diskussionen

Der anabole Shikimisäure-Weg besteht aus sieben Schritten [unterstützende Information (SI) Schema 1], die durch sieben verschiedene Polypeptide oder durch weniger multifunktionelle Polypeptide katalysiert werden können (22). Die Enzyme für fünf der Biosyntheseschritte sind in allen Organismen, die den Stoffwechselweg besitzen, homolog. Für zwei der Schritte sind jeweils zwei verschiedene Enzyme bekannt, und jeder Organismus, der den Stoffwechselweg exprimiert, hat ein Homolog zu einem dieser Enzyme. Darüber hinaus gibt es zwei zusätzliche Überlegungen beim Nachweis von Genen, die für Enzyme des Shikimisäure-Wegs in kodieren N. vectensis: (ich) der evolutionäre Ursprung der Gene ungewiss wäre, so dass die Sequenzen möglicherweise erheblich von den verwendeten Vergleichssequenzen abweichen könnten und (ii) kann die genomische Sequenz Introns enthalten.

Um die größte Sensitivität der Abfrage zu erhalten, wurde die HMMER-Programmsuite (23) verwendet, um unter Verwendung von Hidden-Markov-Modellprofilen nach Konsensus-Proteinsequenzen zu suchen. Dieses Verfahren verleiht evolutionär konservierten Resten ein größeres Gewicht, und lokale Profile zeigen die Proteinfragmente in kodierenden Exons. Die Genomsequenz von N. vectensis wurde in allen sechs Leserastern translatiert und unter Verwendung von neun Profilen durchsucht, die alle sieben Enzyme des Shikimisäure-Wegs abdecken, die aus der Pfam-Datenbank erhalten wurden (24). In großen Gerüsten wurden mit HMMER zwei Ausrichtungen („Treffer“) gefunden, wobei die aroA und aroB Profile (SI-Datensatz 1). Die aroA Treffer trat in scaffold_33 auf (1,4 Mbp). Wenn die vorhergesagte Proteinsequenz für eine BLAST-Suche verwendet wurde, wurde sie mit der murA Genprodukt einer Vielzahl von Bakterien mit ≈40% Aminosäureidentität. Dieses bakterielle Gen kodiert UDP-n-Acetylglucosamin-1-Carboxyvinyltransferase (SI Dataset 2), ein Enzym, das mit aroA (3-Phosphoshikimat-1-carboxyvinyltransferase), während das Enzym MurA an der Biosynthese der Peptidoglycan-Zellwand beteiligt ist. Dieser Befund deutete zunächst darauf hin, dass die ausgerichtete Sequenz von einer bakteriellen Kontamination stammen könnte. Eine genaue Untersuchung der HMMER-Ergebnisse zeigte jedoch, dass dem vorhergesagten Protein ~20 konservierte Aminosäuren am C-Terminus fehlten und dass die fehlende Aminosäuresequenz ~1 kb stromabwärts im Gerüst lokalisiert war. Ein visueller Vergleich der genomischen Sequenz mit Konsensussequenzen für Vertebraten-Introns ergab plausible Spleißstellen (AGGTRA bzw. AGG), die mRNA produzieren würden, die für ein Volllängen- . kodiert murA Homolog mit einer engen Übereinstimmung mit dem Suchprofil. Die Anwesenheit von Introns eliminiert somit die Frage nach bakteriellen Kontaminanten oder Symbionten als proximale Quelle dieses Gens.

Das 1,4-Mbit/s-Gerüst mit dem aroA-ähnliches Homolog wurde in alle sechs Leserahmen übersetzt und unter Verwendung von HMMER mit der gesamten Pfam-Bibliothek gescannt. Dieser Prozess zeigte das Vorhandensein einer Vielzahl typischer eukaryotischer Domänen, einschließlich reverser Transkriptase, EGF, kalziumbindender EGF-Domäne, Defensin-ähnlichem Peptid, Aktin und der Gabelkopfdomäne, was wiederum die Idee unterstützt, dass die aroA-ähnliches Homolog ist in der enthalten N. vectensis Genom selbst. Die Sequenz des vorhergesagten Proteins wurde verwendet, um einen phylogenetischen Baum zu konstruieren, um ihn mit den nächsten bakteriellen Sequenzen zu vergleichen, die in der BLAST-Suche gefunden wurden, und mit Tenacibaculum sp. MED152 und Escherichia coli W3110 (Abb. 1). Die aroA-ähnliche Abfolge von N. vectensis Cluster mit Homologen aus keiner der getesteten Bakteriengruppen, zeigten jedoch eine Sequenzdivergenz von bakteriellen Sequenzen, die mit denen von . vergleichbar ist murA Gene zwischen verschiedenen Bakteriengruppen. Ob dieses Gen in N. vectensis die Biosynthese von Peptidoglycan- oder Shikimat-Zwischenprodukten steuert, ist noch unbekannt.

Phylogenetischer Baum, der die Beziehung der vorhergesagten Proteinsequenz der N. vectensis aroA-wie Gen zum vorhergesagten murA Proteinsequenzen der sieben besten Treffer in einer BLAST-Analyse und zu denen in E coli und Tenacibaculum. Die Entfernungen wurden aus einem CLUSTAL W-Alignment unter Verwendung der Jones-Taylor-Thornton-Matrix berechnet und der Baum wurde unter Verwendung des Neighbor-Joining-Algorithmus in Programmen des PHYLIP-Pakets (Version 3.63) konstruiert. Der Abstand ist der Anteil der Aminosäuresubstitutionen.

Die zweite Ausrichtung, bezogen auf aroB, war auf Gerüst-85 (0,8 Mbp) vorhanden. Wenn die vorhergesagte Proteinsequenz für eine BLAST-Suche verwendet wurde (SI-Datensatz 3), war die beste Übereinstimmung mit den Dinoflagellaten Oxyrrhis-Marina (66% Aminosäuresequenzidentität). In dieser Dinoflagellate, die aroB Enzym (3-Dehydrochinat-Synthase) liegt im Chloroplasten vor und ist mit einem Ö-Methyltransferase (25). Wenn die komplette Fusionsproteinsequenz aus O. Marina wurde in einer BLAST-Suche gegen die translatierte DNA von N. vectensis, war offensichtlich, dass auch in ein Fusionsprotein-Gen vorhanden war N. vectensis (SI-Datensatz 4). Dieses Gen enthält fünf Introns. Wenn das aroB Segment des Gens wurde verwendet, um einen phylogenetischen Baum mit den nächsten BLAST-Treffern zu konstruieren (Abb. 2) N. vectensis Es stellte sich heraus, dass die Sequenz derjenigen von zwei Dinoflagellaten am nächsten war (O. Marina und Heterocapsa triquetra), die jeweils das komplette Fusionsgen besitzen. Auch hier könnte dieses Gen an der Synthese von Vorläufern beteiligt sein, die zu sekundären Metaboliten, die vom Shikimat-Weg abgeleitet sind, führen, insbesondere 3-Dehydroquinat, der mutmaßliche Zwischenzweig der MAA-Biosynthese (5).

Phylogenetischer Baum, der die Verwandtschaft der abgeleiteten Proteinsequenz der aroB Teil des AroB-Ö-Methyltransferase-Protein von N. vectensis zu homologen Dinoflagellatenproteinen. Die Sequenzen wurden mit CLUSTALW ausgerichtet und der Baum wurde unter Verwendung des Neighbor-Joining-Algorithmus mit Entfernungen konstruiert, die aus dem Jones-Taylor-Thornton-Modell (unter Verwendung von PHYLIP Version 3.63) abgeleitet wurden. Der Baum wurde verwurzelt mit Anabaena variabilis als Außengruppe. Die Abstände sind der Anteil der Aminosäuresubstitutionen, und die Bootstrap-Werte basierend auf 100 Proben sind gezeigt.

Da endosymbiotische Dinoflagellaten häufig mit Nesseltieren in Verbindung gebracht werden, musste die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass ein unentdeckter Dinoflagellat die N. vectensis Reihenfolge. Die vorhergesagten Proteinsequenzen stammen von den benachbarten Genen auf beiden Seiten des aroB-ähnliches Homolog [das ein RuvB-ähnliches Protein bzw. eine wahrscheinliche Malatsynthase (MS) codiert] wurden für BLAST-Suchen verwendet. Die engsten Ausrichtungen waren mit verschiedenen Wirbeltieren und mit Sequenzen aus dem Seeigel Strongylocentrotus purpuratus, was es unwahrscheinlich macht, dass diese Gene des Shikimatwegs im Genom des Wirtsmetazoen von einer Kontamination durch das Genom eines assoziierten Dinoflagellaten stammen (SI Dataset 5). Darüber hinaus wurden drei mutmaßliche Proteinsequenzen [β-Tubulin, Hitzeschockprotein 90 (HSP-90) und proliferierendes Zellkernantigen (PCNA)] aus O. Marina wurden für BLAST-Suchen gegen . verwendet N. vectensis. Die besten Treffer wurden verwendet, um einen phylogenetischen Baum zu erstellen, und in keinem Fall wurden die N. vectensis und O. Marina eng verwandte Sequenzen (Abb. 3). Es muss jedoch betont werden, dass zusätzliche Evidenz erforderlich ist, um die angenommene Funktion dieser Gene zu bestimmen und ihren Erwerb durch horizontalen Gentransfer (HGT) nachzuweisen in N. vectensis, insbesondere weil Nesseltiere angeblich konservierte Gene haben, die sie von nichtmetazoischen Vorfahren geerbt haben (26). Obwohl die Bedeutung von HGT in der eukaryotischen Evolution umstritten bleibt, gibt es unabhängige Beweise für das Auftreten eines weiteren HGT-Ereignisses in N. vectensis. Eine vergleichende genomische Untersuchung von Enzymen des Glyoxylat-Zyklus hat den wahrscheinlichen Transfer einer bifunktionellen Isocitrat-Lyase (ICL) und einer MS, die durch ein fusioniertes ICL-MS-Gen kodiert wird, von einem bakteriellen Vorläufer auf die N. vectensis Genom (27). Unsere Ergebnisse ähneln denen anderer, die Beweise für einen Gentransfer auf Süßwasser-Nesseltiere berichten (Hydra) Arten von mehreren eukaryotischen Vorfahren (18, 28).

Phylogenetischer Baum von PCNA-Proteinsequenzen. Die Sequenz des PCNA-Proteins von O. Marina wurde für eine BLAST-Suche gegen die translatierten genomischen Sequenzen von N. vectensis. Die BLAST-Alignments wurden verwendet, um die Proteinsequenz aus N. vectensis. Die Sequenzen der beiden Arten wurden für BLAST-Suchen von GenBank verwendet, und eine Auswahl der besten Treffer für jede Art wurde verwendet, um einen phylogenetischen Baum unter Verwendung des Neighbor-Joining-Algorithmus in Programmen des PHYLIP-Pakets (Version 3.63) zu erstellen. Der Abstand ist der Anteil der Nukleotid-Substitutionen.

Unser genomisches Mining von N. vectensis enthüllte eine weitere Überraschung, die über den Transfer von Genen aus einem Bakterium und einem Dinoflagellaten auf das Genom des Nesseltiers hinausging. Wir fanden sieben gute Sequenz-Alignments, die fünf potentiellen Genen des Shikimisäure-Wegs entsprechen. Darunter waren vier sehr starke Ausrichtungen, die den Genen entsprachen aroA, aroB, aroC, und aroE von E coli (SI-Datensatz 6). Die vorhergesagten Proteinsequenzen dieser Gene wurden in BLAST-Suchanfragen (29) gegen die GenBank-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) verwendet, um verwandte Sequenzen aufzudecken. In allen vier Fällen waren die besten Übereinstimmungen mit den Genen des Shikimisäure-Wegs in Flavobakterien mit ≈70% Aminosäureidentität (SI-Datensatz 7). In den meisten Fällen Tenacibaculum sp. MED152, dessen Genom sequenziert wird (www.moore.org/marine-micro.aspx), war die beste Übereinstimmung, obwohl eine strikte Ähnlichkeit durch Datenbankfehler für dieses Bakterium beeinflusst werden kann. Ein fünftes Gen in N. vectensis entsprach dem aroF-H Gene von E coli, die Isoenzyme für 3-Desoxy-d-arabinoheptulosonat-7-phosphat-Synthase (DAHPS) kodieren. BLAST-Suchen zeigten jedoch, dass die besten Treffer (90 % Aminosäureidentität) die kdsA Gene von Flavobakterien kodieren diese für andere Isoenzyme der DAHPS-Familie, die an der Lipopolysaccharid-Synthese beteiligt sind.

Die hohe Ähnlichkeit der N. vectensis Gensequenzen zu denen des bakteriellen Shikimatwegs könnten entweder durch ein kürzlich aufgetretenes HGT-Ereignis oder eine bakterielle DNA-Kontamination im N. vectensis Genomsequenzen. Die Codon-Verwendung war ähnlich zu Tenacibaculum eher, als N. vectensis. Es wurden zwei Sequenzen identifiziert, die signifikante Fragmente bakterieller 16S-rRNA-Gene zu sein schienen. Eine 16S rRNA-Sequenz (985 bp SI Dataset 8ein ) zeigte die größte Ähnlichkeit zu Pseudomonas Sequenzen. Da es jedoch nicht zu einem Gerüst mit anderen Bakteriensequenzen gehörte und es keine anderen gab Pseudomonas-ähnliche genomische Sequenzen nachgewiesen wurden, ist es wahrscheinlich, dass sie von einer Sequenzierungsverunreinigung abgeleitet sind. Da uns die originalen Shotgun-Sequenzierungsdaten nicht zur Verfügung standen, konnten wir sie nicht analysieren N. vectensis Genoms mithilfe einer kürzlich veröffentlichten Version des Glimmer-Genannotationstools (http://cbcb.umd.edu/software/glimmer ref. 30), das eine nützliche Methode gewesen wäre, den Prozentsatz des auf kleinen Gerüsten kodierten Hologenoms zu quantifizieren und wahrscheinlich daher von lebenden Bakterien.

Die andere 16S-rRNA-Sequenz gehörte zu einem Gerüst, das auch 23S-rRNA-Sequenzen in einer für rRNA-Operone typischen Anordnung enthielt (720 bp SI Dataset 8B ) und ein phylogenetischer Baum des 16S-rRNA-Abschnitts (Fig. 4) zeigte, dass er von einem Flavobakterium stammte, aber keiner bekannten Gattung zugeordnet werden konnte. Phylogenetische Bäume wurden auch für die aroA, aroB, aroC, und aroE Sequenzen mit ähnlichen Ergebnissen. Eine weitere Überlegung war, dass ein Großteil des Genoms von N. vectensis wurde in großen Gerüsten organisiert, während diese 16S-rRNA-Fragmente in kleinen Gerüsten vorhanden waren, aus denen kurze Contigs sequenziert wurden, so dass nur unvollständige Gensequenzen aufgedeckt wurden. Dieses Ergebnis gab den ersten Hinweis darauf, dass diese 16S-rRNA-Fragmente eher von einer bakteriellen Kontamination als von genomischer DNA von . stammen könnten N. vectensis im engeren Sinne. Die Tenacibaculum Genom-Projekt hat die meisten seiner Gene identifiziert, und die 2.679 vorhergesagten Proteinsequenzen aus der genomischen Annotation wurden für eine BLAST-Suche gegen translatierte . verwendet N. vectensis DNA. Wenn ein stringenter Erwartungswert von <10 -30 verwendet wurde, waren 509 der Tenacibaculum Sequenzen (19%) ergaben positive Treffer. Ein weniger strenger Cutoff (10 -10 ) ergab jedoch 1.563 (58%) Treffer. In vielen dieser Fälle waren höhere Erwartungswerte mit Teilsequenzen verbunden, da die Treffer in kleineren Gerüsten mit kleinen Contigs erfolgten und viele Basen in den Gerüsten nicht bestimmt wurden. Tatsächlich ist die aroE und kdsA Gene befanden sich an den Enden von Contigs, so dass ihre Sequenzen abgeschnitten waren und die letzten 40 bzw. 25 aa fehlten. Obwohl eine versehentliche Kontamination des Originals N. vectensis Template nicht ausgeschlossen werden kann, ist eine spannende Möglichkeit, dass die Sequenzen von einem zuvor ungeahnten flavobakteriellen Assoziat ähnlich wie . stammen Tenacibakulum.

Phylogenetischer Baum, der die Verwandtschaft der 16S-rRNA-Gensequenz zeigt, die in der N. vectensis Genomsequenz (720-bp-Fragment in Eintrag c429301624.Contig1 von StellaBase, http://evodevo.bu.edu/stellabase SI Dataset 8ein ) zu den Sequenzen der Stämme des nächsten Typs in Ribosomal Data Base Project II (Version 9.52 http://rdp.cme.msu.edu). Die Distanzen wurden aus einem CLUSTAL W-Alignment unter Verwendung des F84-Modells berechnet und der Baum wurde wie in Abb. 3 konstruiert.

Es gibt unabhängige Unterstützung für unsere Behauptung, dass die vorstehenden Sequenzen im veröffentlichten Genom für N. vectensis kann von Bakterien stammen, die mit den frühen Entwicklungsstadien der Anemone in Verbindung stehen. Die Autoren des berichteten Nematostella vectensis Genom (20) haben in ihrem unterstützenden Online-Material (Supplement S2 in www.sciencemag.org/cgi/content/full/317/5834/86/DC1) ausdrücklich angegeben, dass sie genomische DNA aus Larven hergestellt haben, um eine Kontamination durch die Kommensale oder Symbionten, die für die Erwachsenen gemeldet wurden, obwohl sie keinen Hinweis auf die letztere Aussage über solche Assoziierten gaben. Despite this precaution, there are separate findings that DNA isolates from embryos and early planula larvae of this sea anemone contain 16S rRNA sequences obtained from PCR amplicons attributed to bacteria, including those of the same groups (Flavobacteria and Pseudomonas) that we report here (H. Marlow and M. Q. Martindale, personal communication).

Bacterial associates of cnidarians have been known for at least 30 years (e.g., refs. 31 and 32), and most recently they have been visualized microscopically as epibionts and endosymbionts in two species of freshwater Hydra (33) and as envelope-wrapped aggregates in caverns between ectodermal cells of the nominally nonsymbiotic sea anemone Metridium senile (34). Such an intimate association with metazoan cells lacking an external physical barrier lends itself to direct host–microbe interactions manifested variously as pathogenicity in corals (35), the development of the immune response in Cnidaria (33), and a close symbiotic integration culminating in HGT from bacteria to host cnidarian as demonstrated here. Virtually nothing is known of the biosynthetic or other metabolic function of bacteria symbiotic with cnidarian hosts, a topic that, like so many others in modern marine microbiology, warrants investigation.

HGT between bacteria and certain metazoans (ecdysozoans, including insects and nematodes) was recently demonstrated by Baldo et al. (36) to be more widespread than suspected. They noted that bacterial sequences have been regarded previously as contamination and systematically excluded by eukaryotic genome sequencing projects, possibly masking the importance of such transfer in diverse invertebrates. Earlier, the genome sequence of the bacterial endosymbiont Carsonella ruddii found in aphids was made public (37, 38). Comparison of this genome sequence with that of another bacterial endosymbiont of aphids, Buchnera aphidicola, showed that both genomes had undergone considerable deletion, including loss of some genes encoding essential metabolic pathways. One such missing pathway leading to the formation of the aromatic amino acid tryptophan in C. ruddii caught our attention. According to dogma (10), precursors for this essential amino acid should be synthesized via the shikimic acid pathway in the commensal bacteria. Again, we searched global sequence alignments for genes encoding enzymes of the shikimic acid pathway in these bacterial genomes. We found one gene encoding a putative 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate phospholyase in C. ruddii (although whether this gene would transcribe a functional product is debatable owing to the large number of stop codons in the sequence), and only three (those encoding shikimate 5-dehydrogenase, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate phospholyase, and 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) of the seven genes for the pathway were apparent in the B. aphidicola genome (SI Dataset 9). Taken together with our findings for the putative Tenacibaculum-like symbiont and its host N. vectensis, this evidence strongly suggests that the loss of essential metabolic function in the endosymbiont is an ongoing process of gene transfer and deletion in the evolution of symbioses that could ultimately lead to extinction of the symbiont by progressive assimilation of its genetic material into the host genome (37, 38).

The elucidation of “shared metabolic adaptations,” where the production of essential metabolites involves input by the partners of a symbiosis (even if one is degenerate), will require further genomic dissection of the unique organization and molecular functioning of invertebrate-microbial symbioses. This is highlighted by our finding that two of the genes for enzymes of the shikimic pathway, classically said to be absent from “animals,” are encoded in the metazoan host's genome. The extent to which such HGT, or the involvement of unsuspected bacterial consorts, may account for the apparent metabolic anomalies in cnidarians described in the Introduction, warrants further investigation. Understanding these processes may additionally provide critical insight into the cause of metabolic dysfunction evoked by climate change and environmental stress, particularly in the fragile symbioses of tropical corals and other marine cnidarians.


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