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Phagemid-Display

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Wenn ich einen Bakteriophagen für die Phagenpräsentation verwende und versuche, Aviditätseffekte durch die Verwendung eines Helferphagen zu vermeiden, was wäre der beste Weg, um eine große Bibliotheksgröße beizubehalten, während alles monomer bleibt? Ich frage nach der Aufrechterhaltung eines angemessenen Infektionsverhältnisses und/oder Phagentricks und -werkzeugen, um diese Stöchiometrie aufrechtzuerhalten.


Ich habe Artikel in der Natur gefunden:

Ein Helferphage zur Verbesserung der Einzelketten-Antikörper-Präsentation im Phagen-Display

Versuchsprotokoll

Standardklonierungsverfahren, Bestimmung von koloniebildenden Einheiten und Plaque-bildenden Einheiten und Immunoblot nach PAGE wurden gemäß Sambrook et al.

Aufbau der Verpackungszelllinie.

DH5alpha/pIII [M13KO7DeltapIII]. Das an den Promotor P/A1/04/03 (Ref. 17) fusionierte M13 pIII-Gen wurde in die multiple Klonierungsstelle des LambdaattP-Plasmids pLDR9 (Ref. 18) eingefügt. Der Replikationsursprung und das Kanamycin-Resistenzgen wurden ausgeschnitten und die verbleibende nicht-replikative LambdaattP-pIII-DNA wurde religiert. Escherichia coli DH5alpha, das das Plasmid pLDR8 (Ref. 18) enthielt, wurde mit der nicht-replizierenden LambdaattP-pIII-DNA transformiert und auf Agarplatten ausplattiert, die 25 tg/ml Ampicillin enthielten. Nach Inkubation über Nacht bei 42°C wurden die erhaltenen Kolonien Replika-plattiert und Ampicillin-resistente Klone wurden identifiziert, die als E. coli DH5alpha/pIII bezeichnet wurden. Anschließend wurden sie mit M13KO7DeltapIII transformiert, was zur Verpackungszellinie E. coli DH5alpha/pIII [M13KO7DeltapIII] führte.

Produktion von Phagen.

Um M13KO7DeltapIII-Helferphagen zu erhalten, wurde M13KO7DeltapIII-DNA in E. coli K802, enthaltend pNDI (Ref. 15), elektrotransfiziert. Um Hyperphagen zu erhalten, wurde M13KO7DeltapIII-DNA in E. coli DH5alpha/pIII elektrotransfiziert. Phagen wurden durch Kultivieren in Gegenwart von 0,5 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) bei 30°C für 24 h unter Schütteln bei 200 Upm hergestellt. Escherichia coli Top10F' oder E. coli X11blue, die das pSEXphOx(Yol)-Phagemid bzw. eine scFv-Bibliothek in pSEX81 trugen, wurden mit einem Helferphagenpräparat bei einer OD600 von 0,1 bei einer Infektionsmultiplizität von 20 wie beschrieben infiziert.

Phagenquantifizierung durch ELISA.

Verdünnungsreihen von Phagen wurden in 100 mM NaHCO3, pH 8,6, in MaxiSorb ELISA-Platten (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland) für 16 h bei 4°C beschichtet. Die Blockierung erfolgte mit 2% Magermilchpulver in PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,3) für 2 h bei Raumtemperatur. Phagen wurden mit dem monoklonalen Maus-Antikörper B62-FE2 (Progen, Heidelberg, Deutschland) nachgewiesen, der spezifisch ein Epitop auf dem pVIII-Haupthüllprotein des M13-Phagen bindet. Zur Standardisierung wurden M13KO7-Phagen bekannter koloniebildender Einheiten verwendet.

Immunblot.

Ungefähr 1010 Phagen wurden pro Spur auf ein 10 % Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Blockierung erfolgte mit 2% Magermilchpulver in PBS für 2 h bei Raumtemperatur. Die Immunfärbung erfolgte mit dem Maus-mAb anti-g3p (MoBiTec, Göttingen, Deutschland), der das pIII-Hüllprotein von M13KO7 erkennt, sichtbar gemacht mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenziden (TMB)-Substrat (Promega, Madison, WI).

Antigen-bindender Phagen-ELISA.

Verdünnungsreihen von BSA-phOx-Antigen in 100 mM NaHCO3, pH 8,6, wurden in MaxiSorb ELISA-Platten (Life Technologies) für 16 h bei 4°C beschichtet. Nach Blockierung der unspezifischen Bindung mit 2% Magermilchpulver in PBS für 2 h bei Raumtemperatur wurden 2 mal 109 einkettige Phagen verdünnt in 2% Magermilchpulver in PBS für 1 h bei Raumtemperatur auf jede Vertiefung aufgetragen. Nach sechsmaligem Waschen mit 400 ul PBS pro Vertiefung wurden die gebundenen Phagen mit mAb B62-FE2 wie oben beschrieben nachgewiesen.

Schwenken.

Eine menschliche scFv-Fragmentbibliothek in pSEX81 mit einer berechneten maximalen Komplexität von 2 mal 107 wurde wie beschrieben aus peripheren Lymphozytenpräparationen erzeugt21. Tetanustoxin, das von Virotech (Rüsselsheim, Deutschland) erhalten wurde, wurde auf sechs ELISA-Vertiefungen (Life Technologies) in einer Konzentration von 0,1 ug/ml in 100 mM NaHCO 3 , pH 8,6, 16 h bei 4°C aufgetragen. Die Wells wurden mit 2% Magermilch in PBS 2 h bei Raumtemperatur blockiert, wonach 1011 Phagen der Bibliothek auf jedes Well aufgebracht und über Nacht bei 4°C inkubiert wurden. Nach fünf Waschungen mit PBS/0,1% Tween und fünf mit PBS wurden gebundene Phagen mit 1 Tasse/ml Trypsin (Life Technologies) in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur eluiert. Eluierte Phagen wurden für die Infektion von 20 ml E. coli XL1blue bei einer OD600 von 0,4 verwendet. Infizierte Bakterien wurden auf Luria-Bertani-Agarplatten, die Glucose und Ampicillin enthielten, gezüchtet, von den Platten abgekratzt und zur Produktion von Antikörper-Phagen für die nächste Panning-Runde, wie zuvor beschrieben, verwendet.


Der erste beschriebene Fall von Phage Display trat 1985 auf, als George P. Smith ein Peptid mit einem Gen III eines filamentösen Phagen fusionierte. Im selben Jahr reichte er ein Patent ein, das den Prozess der Generierung von Phagen-Display-Bibliotheken detailliert beschreibt. Schließlich führte die Weiterentwicklung der Phage Display-Technologie unter der Leitung verschiedener Gruppen des MRC Laboratory of Molecular Biology sowie des Scripps Research Institute zu der Möglichkeit, Proteine ​​zum Zwecke des therapeutischen Protein-Engineerings anzuzeigen. Die Technik wurde kontinuierlich verbessert, um riesige Sammlungen von Proteinen zu screenen und zu amplifizieren, um die Verbindung von Phänotyp und Genotyp besser zu zeigen.

Ein filamentöser Phagen hat einen Durchmesser von etwa 6,5 ​​Nanometern, wobei die Länge von der Größe seines Genoms abhängt. Es stammt aus einer großen Familie von Bakterienviren, die auch andere Bakterienarten infizieren. Es enthält ein kleines Genom mit einer intergenen Region, die die notwendigen Sequenzen für die Replikation und Verkapselung von DNA enthält.

Ein Phagenpartikel besteht aus fünf Hüllproteinen. Das Partikel hat eine hohle Röhre, die so viele Kopien des primären Hüllproteins beherbergt. Es gibt auch Bindungswechselwirkungen zwischen den hydrophoben Mittelteilen der benachbarten Untereinheiten. Ein Ende des Partikels ist stumpf, das andere scharf. Das stumpfe Ende enthält viele Kopien der beiden kleinsten ribosomal translatierten Proteine, während das scharfe Ende nur etwa 5 Kopien der pIII- und pVI-Gene enthält, die für die Ablösung des Phagen von der Zellmembran notwendig sind.


Inhalt

Phagen-Display wurde erstmals 1985 von George P. Smith beschrieben, als er die Präsentation von Peptiden auf filamentösen Phagen demonstrierte, indem er eine Fusion des Kapsidproteins des Virus mit einer Bibliothek von Peptidsequenzen herstellte. Ώ] Dies zeigte die Peptide auf der viralen Oberfläche, wo diejenigen mit der höchsten Bindungsaffinität selektiert werden konnten. 1988 beschrieben Stephen Parmley und George Smith Biopanning für die Affinitätsselektion und zeigten, dass rekursive Selektionsrunden Klone mit einer Menge von 1 zu einer Milliarde oder weniger anreichern könnten. Γ] Im Jahr 1990 beschrieben Jamie Scott und George Smith die Erstellung großer zufälliger Peptidbibliotheken, die auf filamentösen Phagen präsentiert werden. Δ] Die Phage-Display-Technologie wurde von Gruppen am Laboratory of Molecular Biology mit Greg Winter und John McCafferty, The Scripps Research Institute mit Lerner und Barbas und dem Deutschen Krebsforschungszentrum mit Breitling und Dübel für die Darstellung von Proteinen weiterentwickelt und verbessert wie Antikörper für das therapeutische Protein-Engineering. Smith und Winter erhielten für ihren Beitrag zur Entwicklung des Phagen-Displays den halben Anteil des Chemie-Nobelpreises 2018. Ε] Ein Patent von George Pieczenik mit Priorität aus dem Jahr 1985 beschreibt auch die Generierung von Peptidbibliotheken. Ζ]


Was ist ein Phagemid (Phasmid)?

Phagemid, auch als bezeichnet Phasmid, ist auch eine Art Hybridvektor. Phagemid enthält einen speziellen Replikationsursprung, der als f1-Replikationsursprung bezeichnet wird. Der f1-Replikationsursprung extrahiert aus einem f1-Phagen.

Phagemid kann sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA replizieren. Die Replikation kann entweder als Plasmid während einer unabhängigen Replikation erfolgen oder in Phagenpartikel verpackt werden und schließlich den bakteriellen Wirt infizieren E coli. Bei der Ansteckung E coli Zellen benötigt der f1-Phage die Anwesenheit eines Pilus. Daher sind die Sex-Pili wichtig während in vitro Verpackung von Phagemiden.


DISKUSSION

Trotz der enormen Aufmerksamkeit, die dem pIII- und pVIII-vermittelten Phagen-Display gewidmet wurde, existierten keine veröffentlichten Berichte für pVII und pIX. Wie hierin beschrieben, wurde gezeigt, dass pVII und pIX zur Präsentation des Flag-Peptids verwendet werden können, wenn sie an die N-Termini der beiden Hüllproteine ​​fusioniert sind. Von größerer Bedeutung zeigten wir dann, dass an pVII und pIX fusionierte variable Antikörperregionen eine dynamische Interaktion eingehen, um einen funktionellen Fv-Antikörper zu präsentieren, ein repräsentatives heterodimeres Motiv.

Die pIII-, pVI-, pVIII-, pVII- und pIX-Hüllproteine ​​sind vor dem Zusammenbau integrale innere Membranproteine ​​(24). Mit dem Aufkommen unserer Ergebnisse wurden nun alle fünf zur Darstellung von Proteinen auf der Phagenoberfläche verwendet. Andere Forscher zeigten, dass pVII und pIX als fünf Moleküle am selben Ende des Phagenpartikels vorhanden waren, die zuerst aus der Zelle austraten und für die Initiierung des Zusammenbaus durch Interaktion mit dem Verpackungssignal des Phagengenoms erforderlich waren (11). Das Fehlen von pVII und pIX führte zu einer extrem geringen Phagenproduktion. Obwohl zuvor vermutet wurde, dass pVII und pIX mit einem anderen Protein, das an ihre N-Termini fusioniert ist, nicht funktionsfähig sind (24), zeigte unsere Untersuchung, dass solche Fusionen lebensfähig waren. Die möglichen Gründe für unseren Erfolg waren, dass (ich) wurde eine Leadersequenz eingebaut, die die Fusionsproteine ​​auf die innere Membran lenkte und eine Akkumulation im Zytoplasma verhinderte und (ii) wurden die Wildtyp-pVII und pIX von Helferphagen verwendet, um mit den pVII- und pIX-Fusionsproteinen zu konkurrieren. Mit dem Erfolg unserer Arbeit sollten pVII und pIX leicht auf kombinatorische Phagen-Display-Protokolle anwendbar sein, die sehr unterschiedliche Proteinsequenzen verwenden.

Die durch Elektronenmikroskopie bestimmte spezifische Goldmarkierung von Phagen Fv zeigte deutlich die Anwesenheit von Gold an einem Ende des Phagenpartikels. Interessanterweise wurden Phagen beobachtet, die entweder eine oder zwei Goldmarkierungen trugen. Wir vermuten, dass letzteres eher auf die bivalente Präsentation von Fv-Fragmenten als auf die mehrfache Goldmarkierung von PCP-BSA zurückzuführen ist. Ungefähr 20 % der Phagen waren mit Gold markiert und zeigten daher einen funktionellen Fv-Antikörper. Eine kinetische Analyse zeigte jedoch, dass die Aktivität von 150 nM 21H3-Phagen Fv der Aktivität von 50 nM 21H3-IgG entsprach. Die Daten zusammengenommen, zusammen mit der Annahme, dass die spezifischen Aktivitäten von Fv und IgG vergleichbar waren, legten nahe, dass einige Phagenpartikel gleichzeitig mehr als ein Fv-Fragment zeigten. Eine multivalente Präsentation von Fv-Fragmenten am C-Terminus von pIII wurde zuvor gezeigt (23). Darüber hinaus führte die Modulation der Wachstumsbedingungen zu veränderten Valenzen des Antikörper-Displays (25), und daher könnte unsere Induktion mit 1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid die Möglichkeit der Multivalenz erhöhen.

Fv-Fragmente sind Heterodimere aus Vh und VL Domänen und sind die kleinsten Antikörperfragmente, die alle für die spezifische Antigenbindung notwendigen Informationen enthalten. Die nichtkovalent assoziierten Ketten in einem isolierten Fv-Fragment sind jedoch nicht sehr stabil und neigen zur Dissoziation (26). Bekannte Methoden zur Stabilisierung von Fv-Fragmenten sind als Einzelketten-Fvs (scFvs) (1, 27, 28) und als Disulfid-stabilisierte Fvs (dsFvs) (29–31). scFvs sind jedoch immer noch oft instabil (29, 32, 33) und können im Vergleich zu Fabs und ganzem IgG geringere Affinitäten aufweisen, da der Linker die Bindung stört oder das Heterodimer nicht ausreichend stabilisiert (30, 34, 35). Obwohl die dsFvs im Allgemeinen stabiler sind und keinen Linker aufweisen, erfordern sie den Einbau eines Disulfids in die Bibliothekskonstruktion. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass dsFv-Bibliotheken eine voreingenommene Antikörperuntergruppe abdecken, in der das Zwischenkettendisulfid die Antigenbindung nicht stört (35). Der von pVII und pIX in unserem Format präsentierte Fv-Antikörper kann als ein Phagen-stabilisierter Fv (psFv) angesehen werden, der die natürliche Antikörperstruktur ohne die Nachteile von scFvs und dsFvs nachahmt. Unsere Fvs behalten ihre Affinität und sind robust, da jede Kette unabhängig an der Phagenhülle verankert ist.

Vor allem wäre unser neues Format besonders nützlich für die kombinatorische Darstellung von heterodimeren Arrays. Darüber hinaus scheint dieses Format, obwohl die Gründe noch nicht klar sind, eine besonders starke Bereicherung während der Panning-Protokolle zu ergeben. pVII und pIX liegen offenbar nahe genug bei Fusionsproteinen mit dem Vh und VL eines Antikörpers, um ein funktionelles Heterodimer zu bilden. Wir gehen davon aus, dass der Ansatz auf die Präsentation verschiedener Polypeptide zur Herstellung künstlicher Antikörper ausgedehnt werden kann. Die Fähigkeit, ein großes Repertoire an neuartigen dimeren Bindungsdomänen darzustellen, die nicht durch die spezifische Programmierung der Antikörperstruktur eingeschränkt sind, wird unser Verständnis von Protein-Protein-Wechselwirkungen verbessern und möglicherweise zur Entdeckung einzigartiger biologischer Aktivitäten führen.


Ein Phagen-Display-Vektor, der für die Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken von humanen Antikörpern und die molekulare Klonierung monoklonaler Antikörperfragmente optimiert ist

Ein neuer Phagemid-Vektor namens pCM wurde für die Klonierung und Präsentation von Antikörperfragment-(Fab)-Bibliotheken auf der Oberfläche von filamentösen Phagen optimiert. Dieser Vektor enthält zwei lange DNA-"Stuffer"-Fragmente zur leichteren Unterscheidung der korrekt geschnittenen Formen des Vektors. Darüber hinaus enthält in pCM das Fragment an der Klonierungsstelle der schweren Kette ein für saure Phosphatase kodierendes Gen, das eine leichte Unterscheidung der Escherichia coli-Zellen, die die unmodifizierte Form des Phagemids enthalten, gegenüber der für das Fragment der schweren Kette kodierenden cDNA ermöglicht. In pCM wird die Transkription von Fd/Gen III der schweren Kette und der leichten Kette von einem einzelnen lacZ-Promotor angetrieben. Die leichte Kette wird vom ompA-Signalpeptid zum Periplasma geleitet, während das Fd/Hüllprotein III der schweren Kette vom pelB-Signalpeptid transportiert wird. Das Phagemid pCM wurde verwendet, um eine humane kombinatorische Phagen-Display-Antikörperbibliothek zu erzeugen, die die Selektion eines monoklonalen Fab-Fragment-Antikörpers ermöglichte, der gegen das Nukleoprotein (NP) des Influenza-A-Virus gerichtet war.


Materialen und Methoden

Bakterienstämme, Wachstumsbedingungen und Helferphagen

E coli Stamm TG1 (supE thi-1 (lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5 (rK - mK - ) [F' traD36 proAB lacI Q ZΔM15]) wurde verwendet, um den Phagemid-Vektor pDJ01 und die Phagen-Display-Bibliothek zu konstruieren. E coli Zellen wurden in Hefeextrakt-Trypton-Brühe (2xYT) inkubiert und E coli Transformanten in 2xYT mit 20 µg ml -1 Chloramphenicol (Cm) bei 37 °C unter Belüftung. Fester Nährboden für das Wachstum von E coli Transformanten enthielten auch 1,5% (w/v) Agar. L. rhamnosus Stamm HN001 wurde vom Fonterra Research Center erhalten und in Man-Rogosa-Sharpe (MRS)-Brühe (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) bei 37°C vermehrt. Bestände des Helferphagen VCSM13d3 mit deletiertem gIII wurden durch Infektion von komplementierenden E coli Stamm K1976 (TG1, transformiert mit Plasmid pJARA112, enthaltend volle Länge gIII unter der Kontrolle des durch eine Phageninfektion induzierbaren Promotors psp [49]). Helferphage VCSM13 (gIII + Stratagene, Cedar Creek, Texas, USA) wurde auf dem Stamm TG1 vermehrt.

Isolierung chromosomaler DNA aus L. rhamnosusHN001

Zur Konstruktion der Bibliothek wurde chromosomale DNA aus einer Übernachtkultur von . isoliert L. rhamnosus HN001 unter Verwendung einer Modifikation des zuvor beschriebenen Verfahrens [102]. Kurz gesagt wurde eine Übernachtkultur 1:100 in 80 ml MRS-Brühe verdünnt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 5.500 × g für 10 Minuten geerntet, in 80 ml MRS-Brühe resuspendiert und für weitere 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal in 16 ml 30 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA gewaschen und in 2 ml des gleichen Puffers, enthaltend 25 % (Gew./Vol.) Saccharose, 20 mg ml -1 Lysozym ( Sigma-Aldrich, Castle Hill, New South Wells, Australien) und 20 µg ml -1 Mutanolysin (Sigma). Die Suspension wurde 1 h bei 37 °C inkubiert. Eine weitere Lyse der Zellen wurde durch Zugabe von 2 ml 0,25 M EDTA, 800 &mgr;l 20 % (w/v) SDS erreicht. Nach Zugabe von SDS wurde die Suspension sorgfältig gemischt und 15 Minuten bei 65 °C inkubiert. Als nächstes wurde RNase A (Roche, Basel, Schweiz) bis zu einer Endkonzentration von 100 &mgr;g ml –1 zugegeben und die Inkubation wurde 30 Minuten bei 37 °C fortgesetzt. Proteinase K (Roche) wurde bis zu einer Endkonzentration von 200 &mgr;g ml –1 zugegeben und die Suspension wurde 15 Minuten bei 65 °C inkubiert. Schließlich wurde die DNA nach Phenol- und Chloroformextraktionen durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen 95 % (v/v) Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation pelletiert, mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in einem geeigneten Volumen von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendiert.

Konstruktion des neuen Phagemidvektors pDJ01

Primer pDJ01F01 (5'-GGCCCGGAAGAGCTGCAGCATGATGAAATTC-3', enthaltend ein OhrI-Stelle (unterstrichen) am 5'-Ende) und pDJ01R01 (5'-GGGGAATTC TCTAGA CCCGGG GCATGCATTGTCCTCTTG-3', enthält, vom 5'-Ende, ÖkoRI (erste unterstrichene Sequenz), XbaI (erste fette Sequenz), SmaI (zweite unterstrichene Sequenz) und SphI (zweite fett gedruckte Sequenz) Restriktionsschnittstellen) und Matrize pJARA144 (unveröffentlicht) wurden verwendet, um ein PCR-Produkt zu erzeugen, das die psp Promotor gefolgt von einer ribosomalen Bindungsstelle und einer multiplen Klonierungsstelle. Das Produkt wurde gespalten mit OhrIch und ÖkoRI und ligiert in OhrICH-ÖkoRI-verdautes Phagemid pAK100 [73]. Die Ligatur platzierte die psp Promotor, ribosomale Bindungsstelle und die multiple Klonierungsstelle direkt stromaufwärts einer Sequenz, die für das Peptid-Tag C-myc kodiert, gefolgt von unterdrückbarem Bernstein (TAG) Stopcodon und eine kodierende Sequenz für die Carboxy-terminale Domäne von pIII (Fig. 1). Das Plasmid wurde pDJ01 genannt.

Konstruktion des Phagemids mit dem SOF von S. pyogenes

Primer pSOF22F01 (5'-CCGCCGATGCATTGACAAATTGTAAG-3', enthaltend ein NsiI-Stelle (unterstrichen)) und pSOF22R01 (5'-CCGCCGGAATTCCTCGTTATCAAAGTG-3', enthaltend ein ÖkoRI-Stelle (unterstrichen)) und die Matrize, gereinigte DNA eines λEMBL4-Klons des sof22 von S. pyogenes Stamm D734 (M22-Serotyp The Rockefeller University Collection) wurden verwendet, um ein PCR-Produkt zu erzeugen, das für das SOF des M22-Stamms kodiert, einschließlich der Signalsequenz, jedoch ausschließlich der Zellwand- und Membranankersequenzen (963 Reste). 27 Zyklen wurden verwendet, um zu amplifizieren sof22. Das Thermocycling-Protokoll begann mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt für 2 Minuten bei 94 °C, gefolgt von 10 Zyklen mit: einem Denaturierungsschritt (94 °C für 15 s), einem Annealing-Schritt (59 °C für 30 s) und einem Verlängerungsschritt (72°C für 2,5 Minuten). Anschließend wurden 17 Zyklen mit den gleichen Denaturierungs- und Annealing-Schritten durchgeführt, aber der Elongationsschritt wurde in jedem Zyklus um 2 s verlängert. Der Verlängerungsschritt im letzten Zyklus wurde auf sieben Minuten verlängert, um sicherzustellen, dass alle Produkte vollständig synthetisiert wurden. Das PCR-Produkt wurde mit gespalten NsiIch und ÖkoRI und ligiert an die NsiICH-ÖkoRI-gespaltener Vektor pDJ01. Dieses Phagemid wurde pSOF22 genannt.

Produktion und funktionelle Assays der SOF-präsentierenden Phagemid-Partikel

Die Phagemid-Partikel wurden durch Infektion von 100 ml exponentiell wachsender Kulturen von TG1(pSOF22) mit Helfer-Phagenvorräten bei einer Infektionsmultiplizität von 50 Phagen pro Bakterium erzeugt. Die Helferphagen VCSM13 und VCSM13d3 wurden für die Produktion von Phagemidpartikeln des pSOF22 (bezeichnet als pSOF22 PP/wt bzw. pSOF PP/d3) und VCSM13 nur für die Produktion von pDJ01 (negative Phagemidpartikelkontrolle genannt pDJ01 PP/wt) verwendet. Der VCSM13d3-Helferphage wurde wegen des Fehlens von funktionellem pIII nicht für die Produktion von pDJ01-Phagemidpartikeln verwendet. Infizierte Zellen wurden 4 h bei 37 °C unter Belüftung inkubiert. Die Wirtszellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und Phagemid-Partikel im Überstand gesammelt. Die Phagemid-Partikel wurden durch Präzipitation in 5% (Gew./Vol.) PEG, 500 mM NaCl gereinigt und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS 125 mM NaCl, 1,5 mM KH .) resuspendiert2Bestellung4, 8 mM Na2HPO4 und 2,5 mM KCl, pH 7,6). Die Phagemidpartikel wurden basierend auf der Menge an Phagemid-DNA nach dem Aufbrechen der Virionen bei 70 °C in 1% (w/v) SDS wie zuvor beschrieben quantifiziert [33].

Der Serumopazitätsassay wurde durch Mischen von 1 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum mit 10 11 Phagemidpartikeln durchgeführt, die die SOF (pSOF22 PP/wt pSOF22/d3) oder Negativkontrolle (pDJ01 PP/wt) in Gegenwart von Natriumazid zeigten. Die Reaktionen wurden bei 37ºC inkubiert und der zeitliche Verlauf der Zunahme der optischen Dichte über die Zeit wurde durch Messen der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 405 nm überwacht.

Der Fibronektin-Bindungsassay wurde mittels Phagen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA [103]) durchgeführt. Die Mikrotiter-Wells (Nunc-Immuno MaxySorp TM , Roskilde, Dänemark) wurden mit Plasmafibronectin in einer Endkonzentration von 20 µg ml -1 , 100 µl pro Well in PBS (pH 7,2) für 1 h bei 37 °C beschichtet. Die Wells wurden einmal mit 300 µl PBS, 0,05 % Tween 20 Puffer (PBST) gewaschen und dann mit 1 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 2 h bei Raumtemperatur blockiert. Die Wells wurden dann (dreimal) mit 300 &mgr;l PBST-Puffer gewaschen. Phagemid-Partikel (2 × 10 8 ) in 100 &mgr;l PBS wurden in die Vertiefungen gegeben. Negative Pufferkontrollen waren TE (10 mM Tris, 1 mM, EDTA, pH 8,0), PBS und 0,05% (w/v) BSA in PBS, und die negative Phagemid-Partikelkontrolle war pDJ01 PP/wt, erzeugt wie oben beschrieben. Die Platten wurden 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die ungebundenen Phagemid-Partikel wurden durch Waschen mit PBST (siebenmal) entfernt. Um gebundene Phagemid-Partikel nachzuweisen, wurden 100 µl Maus-Anti-pVIII (monoklonaler Antikörper gegen M13, fd und f1, Progen Biotechnik, Heidelberg, Deutschland) mit 0,1 µg ml -1 in 0,1% (w/v) BSA/PBS zugegeben und inkubiert 1 h bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Wells mit 300 µl PBST-Puffer (fünfmal) gewaschen und 100 µl sekundärer HRP-konjugierter Anti-Maus-Antikörper in einer Verdünnung von 1:2000 zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde siebenmal mit PBST-Puffer gewaschen und unter Verwendung des ImmunoPure TMB-Substratkits (Pierce, Rockford, Illinois, USA) entwickelt. Die Extinktion wurde bei 450 nm abgelesen. Die Phagemidpartikel wurden wie oben beschrieben quantifiziert.

Aufbau der gesamten Genombibliothek

Die Bibliothek wurde aus mechanisch (Vernebelung) gescherten L. rhamnosus HN001-DNA und in den Phagemid-Vektor pDJ01 kloniert. Ein medizinischer Einwegzerstäuber, der 1,5 ml einer gepufferten chromosomalen DNA (ungefähr 20 &mgr;g) und 25 % (Vol./Vol.) Glycerin enthielt, wurde 90 s lang Stickstoffgas bei einem Druck von 10 psi ausgesetzt. Die erhaltenen Fragmente variierten in der Größe zwischen 0,3 und 4 kb, wobei die Mehrheit zwischen 0,5 und 1,6 kb lag. Stumpfe Enden wurden durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase (Roche), Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (Roche) und OptiKinase TM (USB Corporation, Cleveland, Ohio, USA) erreicht. Um Fragmente unter 0,3 kb zu eliminieren, wurde Sepharose CL-4B 200 (Sigma) Größenausschlussharz verwendet. Der Phagemidvektor pDJ01 wurde mit dem Restriktionsenzym verdaut SmaI (Roche) und mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche) dephosphoryliert. Die DNA-Manipulationen wurden nach Standardmethoden durchgeführt [104].

Etwa 10 µg der genomischen Fragmente wurden mit T4-Ligase (Roche) an 3 µg des Vektors pDJ01 ligiert. Nach Phenol- und Chloroform-Extraktion wurde die ligierte DNA mit Ethanol präzipitiert, mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen und in 25 µl H . gelöst2O. Der Ligationsmix wurde umgewandelt in E coli TG1 durch Elektroporation (2,5 kV, 25 μF, 400 Ω) in Küvetten mit 2 mm Spalt. Die transformierten Zellen wurden in 50 ml 2xYT überführt und 1 h bei 37 °C unter Rotationsbewegung inkubiert. Nach der Inkubation wurde ein 2-ml-Aliquot entnommen, um die Anzahl der Transformanten durch Ausplattieren auf 2xYT-Agar mit 20 µg ml -1 Chloramphenicol zu bestimmen. Die verbleibenden Bakterien wurden über Nacht bei 37 °C unter Belüftung amplifiziert.

Direkte Auswahl der Sekretom-Phagen-Display-Bibliothek

Ein 1 ml-Aliquot der Übernachtkultur, die die gesamte Genombibliothek enthielt, wurde verwendet, um 25 ml 2 × YT-Cm anzuimpfen. Die exponentiell wachsende Kultur (OD600 ca. 0,2) wurde 1 h mit dem Helferphagen VCSM13d3 (Infektionsmultiplizität = 50) infiziert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 3.200 × g für 10 Minuten geerntet, das Pellet wurde in 1 ml 2xYT resuspendiert, mit 10 ml Weichagar (2xYT-Brühe mit 0,5% (w/v) Agarose) vermischt und über vier Platten. Sowohl der Weichagar als auch die Platten enthielten Agarose von molekularbiologischer Qualität anstelle von bakteriologischem Agar. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert, dann wurden die Phagemid-Partikel aus den Platten extrahiert, indem 5 ml 2 × YT auf jede Platte gegeben wurden, gefolgt von langsamer Rotationsbewegung bei Raumtemperatur für 4 Stunden. Extrahierte Phagemid-Partikel wurden mit 5% (w/v) PEG, 0,5 M NaCl präzipitiert und in TN-Puffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) resuspendiert. Um instabile (defekte) Phagemid-Partikel zu eliminieren, wurde das Präzipitat mit Sarcosyl in einer Endkonzentration von 0,1% (w/v) behandelt. Die von defekten Phagemid-Partikeln freigesetzte ssDNA wurde durch DNase I (100 µg ml -1 ) in Gegenwart von 5 mM MgCl . entfernt2. DNase I wurde dann durch EDTA (20 mM) inaktiviert. Die ssDNA wurde dann aus den Sarcosyl-resistenten Virionen extrahiert. Zuerst wurde die ssDNA von den Phagemid-Partikeln durch Inkubation bei 70°C für 10 Minuten in Gegenwart von 1,2% (w/v) SDS freigesetzt. Eine weitere Reinigung der ssDNA wurde unter Verwendung eines Plasmid-Mini-Prep-Kits (Roche) durchgeführt. Um die Sekretombibliothek vom Plasmid-Replikationsursprung zu amplifizieren, E coli Stamm TG1 wurde mit gereinigter ssDNA transformiert.

Sequenzanalyse ausgewählter L. rhamnosusHN001-Klone

Nach der Transformation wurden 491 Klone zufällig zur Analyse ausgewählt. Die Phagemid-DNA dieser Klone wurde unter Verwendung des 96-easy Mini-prep Kits (V-Gene Biotechnology, Hangzhou City, China) gereinigt. Die Inserts wurden mit dem Primer pDJ01R02 (5'-CCGGAAACGTCACCAATGAA) und dem BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) sequenziert und auf einem ABI3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) bei AWC Genome Services analysiert (Massey-Universität). Alle Inserts wurden vom 3'-Ende sequenziert, da sich unser Interesse auf ORFs in Fusion mit . konzentrierte gIII. Sequenzierung und Sequenzanalyse wurden in Chargen von 96 Klonen durchgeführt. Nach der Sequenzanalyse der ersten 192 Klone wurden die Klone, deren Sequenzen mehr als fünfmal nachgewiesen wurden, von der weiteren Sequenzierung mittels Dot-Blot-Hybridisierung ausgeschlossen. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Vector NTI-Software (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) und GLIMMER Version 3.02 unter Verwendung eines Trainingssatzes analysiert, der gegen die L. rhamnosus HN001-Genomsequenzentwurf, eine Positionsgewichtsmatrix, die Ribosomenbindungsstellen für HN001-Gene darstellt, und ein iterativer Ansatz, wie in der Softwaredokumentation beschrieben, um die ORFs vorherzusagen [105]. Wurde das 5'-Ende des ORF nicht erreicht, wurde eine Sequenzierungsreaktion unter Verwendung des Vorwärtsvektor-komplementären Primers pDJF03 (5'-ATGTTGCTGTTGATTCTTCA-3') durchgeführt.

SignalP 3.0 [106] und TMHMM 2.0 [107] wurden zur Vorhersage der Signalsequenz bzw. Transmembranhelices unter Verwendung der Standardeinstellungen (für Gram-positive Bakterien) und Cut-off-Werten verwendet [14, 50]. Aminoterminal lokalisierte Transmembranhelices, die in der SignalP 3.0-Analyse einen Score für die Signalpeptidase-Spaltungsstelle (C-Score) von unter 0,52 zeigten, wurden als Aminoterminale Membrananker angesehen. Das Vorhandensein einer Transmembranhelix wurde mit dem TMHMM-Vorhersageprogramm bestätigt [108]. Lipoprotein-Signalsequenzen wurden vom LipPred-Server [109] unter Verwendung der Standardeinstellungen und Cut-off-Werte [53] vorhergesagt. TATFIND 1.4 wurde zur Vorhersage von Tat-Signalsequenzen verwendet [110].

Alle übersetzten Insertsequenzen wurden mit BlastP [111] auf der NCBI-Website [112] mit Standardeinstellungen untersucht, um Ähnlichkeiten mit anderen bakteriellen Proteinen zu identifizieren. Ein e-Wert kleiner als e -10 wurde als Grenzwert für bemerkenswerte Ähnlichkeit verwendet. Darüber hinaus wurden konservierte Domänen in unseren Abfragesequenzen durch die Engine des Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART) im Zuge der Suche identifiziert ] Datenbanken.


Phagemid

Phagemid
Ein Plasmid, das einen Teil eines Phagengenoms enthält. Bei Koinfektion des Wirts mit einem Helferphagen kann das Plasmid in Phagenpartikel verpackt werden. Eine häufig verwendete Art von Phagemid wird als ssDNA in Phagen-M13-Partikel verpackt.

Phagemid: Ein Plasmidtyp, der in seiner Sequenz einen Bakteriophagen-Replikationsursprung trägt. Wenn das Wirtsbakterium mit "Helfer"-Phagen infiziert ist, Phagemid wird zusammen mit der Phagen-DNA repliziert und in Phagenkapside verpackt.
.

[12] Das zu mutierende DNA-Fragment wird in a Phagemid wie M13mp18/19 und wird dann in einen E. coli-Stamm transformiert, dem zwei Enzyme fehlen, dUTPase (dut) und Uracil-Deglycosidase (ung).

Klonierungsvektor - absichtlich entworfenes künstliches DNA-Konstrukt, das von Molekularbiologen verwendet wird, um ausgewählte DNA-Stücke zu amplifizieren, die in das Konstrukt eingefügt wurden Beispiele umfassen Plasmid, Phagen,

&lambda-Phagen - Lysogen
T4-Phagen (169 bis 170 kbp, 200 nm lang)
T7-Phagen
R17-Phagen
M13-Phagen -


Phagemid-Vektoren

Unser Partner Antibody Design Labs bietet eine große Auswahl an Phagen- und Phagemid-Vektoren, um die Herausforderung des Phagen-Displays zu meistern. Die Auswahl von Bindemitteln ist ein komplexer Prozess, der von mehreren Variablen und experimentellen Bedingungen abhängt, was Zeit und Ressourcen zu den wichtigsten limitierenden Faktoren für erfolgreiche Biopannings macht.

Wir bieten derzeit verschiedene Optionen für die Darstellung auf der N-terminalen Seite des Volllängen-Gen-III-Proteins mit dem PelB-Leader-Peptid entweder unter Verwendung eines Phagemid-Systems oder Phagenvektoren an.


Phagenvektoren (siehe Link unten) erzeugen ein multivalentes Display und eignen sich am besten für Peptide und scFv.

Die Phagemide eignen sich am besten für die Präsentation von Antikörpern wie scFv- und Fab-Fragmenten, können aber auch verwendet werden, um Peptide mit niedriger Valenz zu präsentieren.

pADL™-100 Maximaler Phagemid-Anzeigevektor:


Anwendungen:
• Phagen-Display an der N-terminalen Seite des Gen-III-Proteins des filamentösen Bakteriophagen
• Polypeptid-Display
• Phagen-Display-Peptidbibliotheken


pADL™-20c / 22c / 23c Phagemid-Vektor-Serie mit hohem Display:


Anwendungen:
• Phagen-Display an der N-terminalen Seite des Gen-III-Proteins des filamentösen Bakteriophagen
• scFv- und Fab-Anzeige
• Freier scFv- oder Fab-Ausdruck

pADL™-10 Phagemid-Vektor mit niedriger Anzeige:


Anwendungen:
• Phagen-Display an der N-terminalen Seite des Gen-III-Proteins des filamentösen Bakteriophagen
• scFv-Anzeige ähnliche Links


Phagemid-Display - Biologie

Ein umfassender Überblick über die Phagen-Display-Technologie zur Herstellung rekombinanter monoklonaler Antikörper.

Monoklonale Antikörper haben in verschiedenen Bereichen wie der Molekularbiologie, der pharmazeutischen und medizinischen Forschung einen wesentlichen Beitrag geleistet und auch bei der Behandlung von Krankheiten wie Krebs und Infektionskrankheiten geholfen [1-3]. Rekombinante Antikörper (rAbs) haben sich als wertvolles und praktisches Mittel für die Forschung, Diagnose verschiedener Krankheiten und als eine der am schnellsten wachsenden Klassen therapeutischer Proteine ​​erwiesen. Eine Vielzahl von Systemen zur schnellen Produktion rekombinanter Antikörper im großen Maßstab wurde verwendet, um die steigende Nachfrage nach Antikörpern zu befriedigen. The benefit of huge amount and consistent quality of the in vitro antibody production methods have interested researchers to make improvements and try various production systems, viz. Gram-negative and Gram-positive bacteria, yeast (for example Adimab platform [4] ) and filamentous fungi, insect / mammalian cell lines, or more recently in transgenic plants and animals [5-7] for economic and large-scale production of rAbs. The other advantages offered by the rAbs include improvements in intrinsic properties such as immunogenicity, affinity, specificity, and stability of antibodies by a variety of mutagenesis techniques [8-10]. Libraries of antibody gene fragments can be cloned into expression vectors and displayed as a single-chain variable fragment or Fab-fragment antibodies on the surface of filamentous bacteriophage [11]. This technique, known as phage display, has helped enormously to study molecular biology mechanisms involving protein-protein [12] or protein-nonprotein interactions [13]. There are many excellent and comprehensive reviews on this topic, and one of the most recent ones is by the Bio-Rad group [14]. Phage display with pre-selected antibodies has also been exploited to enable barcoding of antibodies and thus highly multiplexed and quantitative cell-surface protein profiling [15]. Phage display can also be used to identify other types of protein affinity reagents such as Ras-binding domains [16].

The technique was initially demonstrated by George P. Smith in 1985 [17]. McCafferty and colleagues, in 1990, confirmed its use for the production of recombinant antibodies with desired specificities [18]. Since then, many research groups have contributed towards essential improvements and modifications of the technique for its potential applications in basic and applied biological sciences. Phage display technology allows the isolation of human antibodies against almost any antigen through the clonal selection of antibody fragments in a prokaryotic system, thus facilitating both immunotherapy and in vivo diagnosis. The range of antibodies from antibody libraries is limited by the initial calculated complexity of the antibody fragment gene library. Because the antigen-binding fragment is a heterodimer, the library complexity is increased by the random combination of heavy- and light-chain sub-libraries.

As previously mentioned, phage display technology refers to the use of phages for display of random peptides, foreign proteins or protein domains, as fusion proteins, on their surface [19]. Phages are viruses which infect bacterial cells. Mostly, the vectors used in recombinant DNA technology, are bacteriophages which infect Escherichia coli, the standard recombinant DNA host. An essential feature of such recombinant DNA vectors is that they can contain stretches of foreign DNA, which gets expressed in the host cell when the vector replicates. A phagemid vector, termed so for its phage origin genome, provides such features and enables expression of the foreign DNA, purposely introduced in the vector in such a way that it is expressed in conjunction with a phage protein, as a fusion protein, for display on the phage surface [19]. A variety of bacteriophages, viz. Ff filamentous phage, Lambda and T7 [20, 21] have been utilized in phage display with the most common being the Ff phage family (e.g., M13, fd-phage). These have been preferred, amounting to their potential as excellent cloning vehicles and simplicity for correct assembly of longer phage particles [21]. The PIII or PVIII surface proteins of the phage are used for display of recombinant peptides. Several options aid in avoiding the limitations of the conventional display system [22]. M13 filamentous phage-based libraries like Ph.D.TM-7, Ph.D.TM-12, Ph.D.TMC7C from New England Biolabs, or spherical T7 phage, T7Select® from Merck are available.

The most productive phage in nature is the filamentous phage which infects Escherichia coli. It generates titers of up to 10 13 per ml of bacterial culture. These bacteriophages infect a range of Gram-negative bacteria using the bacterial pili as a receptor. The best characterized of these phages (M13, fl, and fd) are collectively referred to as the Ff phage. These infect E.coli containing the F conjugative plasmid. The first phage display libraries of peptides and antibodies were published in 1990-1991 [23-26], after which the technique underwent numerous improvements for its varied applications.

The vectors designed by combining portions of plasmid and phage genome, for cloning and expression of fusion proteins are known as phagemid vectors. These vectors enclose an M13 phage origin of replication and packaging signal along with an origin of replication and the expression system of the plasmid. Usually, the expression plasmids are composed of multiple cloning sites, an antibiotic resistance marker, epitope tags such as a hexahistidine tag or a c-myc tag [27], and a lacZ promoter [28]. The phagemids habitually contain a gene sequence which codes for coat protein which will be fused to the foreign DNA that is to be expressed [23, 29], and a stop codon (usually amber), to permit host specific expression of the pIII fusion protein or a soluble fusion partner [30]. Phagemids can uphold themselves as plasmids, allowing the expression of the desired protein in the bacterial cell, but they do not have the other genes necessary for phage assembly. Therefore, infection of the phagemid-transformed host cells, with a helper phage becomes essential for the production of viable phage particles. The helper phage is the bacteriophage itself, which is engineered to provide the proteins essential for phage assembly. The phage-foreign fusion proteins can be displayed as either N-terminal fusions with pIII, pVII, pVIII, or pIX, for large proteins [31, 32] or C-terminal fusions with pIII, pVI, or pVIII proteins of the phage [33, 34]. The phage particles can be used in binding selections, and the binding clones can be multiplied through infection of E. coli host.

A drawback of the phagemid system is the reduction in the number of recombinant fusion proteins displayed on each phage particle due to competition between the wild-type coat protein and a fusion coat protein for integration into the phage particle [11]. Because of this problem, a modified helper phage, known as the hyperphage, was designed [35] which reportedly enhanced the yields of recombinant phages displaying the recombinant antibodies by more than two orders of magnitude. Hyperphages have a wild-type pIII phenotype and are therefore able to infect F+ E. coli cells with high efficiency however, they lack a functional pIII gene which renders these particles non-functional and thus require the phagemid-encoded pIII–antibody fusion for complete phage assembly (Figure 1). The outcome is a significant rise in the proportion of recombinant antibody displaying phages. It was reported that the antigen-binding activity also got affected by the use of the hyperphage. As a result, the hyperphage was found to be valuable in cases of selecting antibodies against rare epitopes.

Apart from this, specific mutations were also introduced in the coat proteins for the development of a hybrid phage display system [27], in which, two copies of the gene encoding coat protein exist: one with the scFv fusion and the other coding the natural non-fusion protein. Finally, the amount of recombinant proteins displayed is determined by more than a few factors, viz., type of coat protein chosen for fusion (pIII or pVIII), display system chosen for expression (phage or phagemid), and the choice of helper phage in case a phagemid system is used.

Some of the most widely used and commercially available phage display vector systems include, pSEX81 [36, 37], pCANTAB 5E [38-40], pCOMB3 [41] or its derivates, for example, pComb3XSS (Addgene 63890) [42, 43].

The phagemid vector, pSEX81, has been engineered for expression of functional single-chain Fv antibody-pIII fusion proteins on the surface of M13 bacteriophages. The phagemid was constructed explicitly for cloning of immunoglobulin heavy and light chain gene fragments isolated from human or mouse antibody libraries. The cassette vector, pSEX81, was designed for the convenient insertion of heavy and light chain variable domain coding regions and the production of a functional single chain of M13 bacteriophages. The corresponding DNA fragments of human or mouse origin can be amplified by PCR using the degenerate IgG/IgM, or IgG primer sets respectively, available from the same company. The amplified gene fragments encoding variable heavy or light domain are cloned in-frame between a signal peptide sequence of bacterial pectate lyase (pelB) for secretion of the fusion protein into periplasmic space and pIII gene of M13 bacteriophage.

The VH and VL genes are joined by a DNA fragment coding for a flexible 18 amino acid residue linker containing first six amino acids of CH1 constant region domain and the hydrophilic pig brain alpha tubulin peptide sequence "EEGEFSEAR". Vector backbone further provides a strong promoter, the T7 terminator, ColE1 origin of replication, intergenic region of phage F1 and an ampicillin resistance marker for selection. In pSEX81 the recognition sites of restriction endonucleases Nco I and Hind III allow insertion of VH gene fragments. For the insertion of a VL gene fragment, sites of restriction endonucleases Mlu I and Not I are present.

The systems for phage display can be categorized along the lines of the arrangement of the phage genes coding for coat proteins [44, 45]. A ‘type 3’ vector, consists of a single phage chromosome (genome) containing a single gene III for expression of foreign DNA and a single type of pIII protein molecule. In theory, the foreign peptide encoded by the insert gets displayed on all the five pIII molecules on a virion (though practically the host proteolytic enzymes remove the foreign peptide from some or even most of the pIII copies, especially if the foreign peptide is large). Likewise, the ‘type 8’ and ‘type 6’ vectors display foreign peptides on every copy of pVIII and pVI, respectively [46-48]. In a ‘type 88’ vector, the phage genome bears two VIII genes, which encodes for two different types of pVIII molecules, a recombinant one, bearing the foreign DNA and the wild-type one. This system allows the display of larger proteins on the phage surface. In the same way, the ‘type 33’ vector bears two genes III. A ‘type 8+8’ system is different in the manner that the two VIII genes are on separate genomes. The wild-type being on a phage (helper phage), while the recombinant one on the phagemid [28, 49]. The ‘type 3+3’ and the ‘type 6+6’ systems are reminiscent of ‘type 8+8’ systems.

Production of large quantities of antibodies becomes challenging due to the high complexity of the immunoglobulin molecules. The immunoglobulin G is a heterotetramer, consisting of two different polypeptide chains joined by the inter-chain disulfide bonds. The antibody light chain and heavy chain consist of several domains known as “immunoglobulin folds”, each of which requires intra-domains disulfide bond for stabilization. An oxidizing environment along with the complex apparatus is much needed for efficient and correct conformation of a large number of disulfide bonds together with folding and assembly of four chains to one IgG molecule. The in vitro hosts for the production or selection of antibodies, generally have less optimal conditions for expression of a correct and complete immunoglobulin molecule. Thus, many researchers opted for other smaller sized formats of antibodies, which retained the antigen-specificity and also provided significant advantages.

By far, the ‘Fv’ fragment is the smallest antigen-binding fragment of immunoglobulin retaining complete antigen binding site and consists of only the variable fragments of an antibody structure. A single-chain variable fragment (scFv) is a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of immunoglobulins (Figure 2), connected with a short linker peptide often to about 25 amino acids, which helps to improve the stability of the short antibody. The flexibility and solubility of the linker are due to the glycine and serine or threonine amino acid residues, respectively. The linker can either connect the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite the removal of the constant regions and the introduction of the linker. These molecules were created to facilitate phage display, where it is highly convenient to express the antigen-binding domain as a single peptide. As an alternative, scFv can be constructed directly from a sub-cloned heavy and light chains derived from a hybridoma. Since the scFvs are only half the size of a Fab fragment and still retain the original specificity of the parent immunoglobulin, they have significant applications in techniques, such as flow cytometry, immune-histochemistry, and as antigen-binding domains of artificial T cell receptors, etc. Unlike monoclonal antibodies, which are often produced in mammalian cell cultures, scFvs are more often produced in bacteria cell cultures such as E. coli, allowing an easy and faster production of antibodies in massive amounts.

The fragment antigen-binding (Fab fragment) is the antigen-binding region on an antibody, which is composed of a constant and a variable domain. The domains form the paratope — the antigen-binding site — at the amino-terminal portion of the monomer. The two variable domains facilitate binding with specific antigens. For example, Tao Y et al selected for Fabs against Wnt receptors from a phage-displayed synthetic library F [50]. Slezak T et al developed a modular antibody platform based on the phage display of Fab fragments [51].

A diabody comprises two scFvs which are connected with linker peptides, too short for the two variable regions to fold together (about five amino acids), forcing dimerization of the scFvs. Diabodies have a much higher affinity to their target, due to much lower dissociation constants.

Another recombinant antibody format, called as scFv-zipper, consists of two scFv antibodies, with same or different antigen specificities, linked with leucine zippers.

Thus, the phage-displayed recombinant antibodies (rAbs), which provide a direct link between the genotype and phenotype of the antibody to be displayed [52], have been displayed as functional binding molecules in different formats of antibody fragments [18, 30]. At present, the most widely used and applicable formats are scFv and Fab fragments, particularly expressed in eukaryotes.

Various types of libraries have been utilized for selection of specific antibodies: (1) antigen- or pathogen-specific library sourced from immunized animals, for example, leukocytes from an immunized llama [42, 53], (2) a single-pot or universal library without any specificity, (3) mutant libraries generated from mutated DNA sequences of a monoclonal hybridoma line or single phage clone [54, 55]. The single-pot universal libraries are extremely assorted and allow the selection of antibody fragments with binding affinities to a wide range of antigens [21] due to the size of their repertoire [56].

Polymerase chain reaction (PCR) has enormously simplified the cloning of variable region genes. The cDNA synthesized from mRNA isolated from B-lymphocyte population is used as a template for PCR- based amplification of VL and VH immunoglobulin genes. The mRNA can also be isolated from hybridoma cell lines, single clones obtained from the primary library. PCR amplification requires oligonucleotide primers complementary to the antibody gene sequences. Degenerate primer sets have been used to amplify almost all the possible sequences for the variable light or variable heavy chain genes for the generation of a library. Many of the primer sets have been reported with various target sequences for primer annealing [57-60].

A set of downstream primers analogous to sequences encoding parts of CH1 and CL chains have been used for amplification of the variable genes from antibodies of different subclasses. Assembly of the two variable domains into a single gene can be made possible by a DNA linker either in the VH-linker-VL format or the VL-linker-VH type [61, 62]. It has been noted that the expression level of scFv in N-termini-VL domain-linker-VH domain C-termini orientation was relatively high in comparison to the other format. Hence, to obtain high yields of the antibodies, insertion of the gene sequence coding for them should be in the desired frame in the phagemid vector. The most significant advantage offered by phagemid vectors is their small size (3–5 kb) and high efficiency for transformation in bacterial cells. In general, the recombinant phagemid is introduced into competent E. coli, followed by infection of the bacterial host cells with a helper phage (M13VCS or K07) to yield a recombinant phage that displays antibody fragments as fusions to one of the phage coat proteins.

Solemani Zadeh et al published a detailed protocol for efficient construction and screening of synthetic domain phage variable libraries (with 50-fold improvement of elution efficiency) [63]. Ferrara F et al combined phage and yeast display to identify monoclonal antibodies with desired binding properties [64].

Phage display based in vitro affinity selection of antibodies resembles the clonal selection of antibodies in vivo [65]. The target antigen is immobilized on surfaces based on the choice of the researcher, and the library is applied onto it, enabling affinity-based selection of highly reactive antibodies. The non-specific phage particles get eliminated during washing steps, and those which remain bound to the immobilized antigen, are eluted by addition of appropriate elution reagents. The antigen-specific phages can then be amplified in a proper strain of E. coli for their downstream applications or the next selection cycle facilitating further enrichment. This affinity selection process is known as bio-panning, and the final round of it can be determined by assessment of no more additional rise in the yield of eluted phages [65].

Bio-panning includes recurring rounds of phage binding to the target, washing to remove non-binding phage and elution steps to get binding phage and re-amplification of the phage pool enriched for specific binding phage. Any other methods which help in separation of specific from non-binding clones can be employed as selection methods. Most commonly in vitro selection method, such as bio-panning on immobilized antigen coated onto paramagnetic beads [66], plastic tubes or Petri dishes [54], columns with an antigen-activated matrix [18], or specifically coated BIAcore sensor chips [56], selection using biotinylated antigen [55] or direct selection on fixed prokaryotic cells respectively mammalian cells [67] have been reported.

A large fraction of non-specific phages get washed, and the phage clones bearing antibodies with specific binding properties to the matrix are eluted by using appropriate elution reagents. The fact that the M13 phage is stable at extremes of temperature and pH has been utilized successfully in experimenting with the choice of elution reagents. Acidic solutions, like HCl, glycine buffers [56, 68], basic solutions, like triethylamine [54], or even reducing agents have been used. In other cases, a competition elution by an excess concentration of antigen [24] or antibodies to the antigen has also been reported. Another gentle strategy has been the use of enzymes for cleavage of a protease site engineered between the antibody and pIII protein of the phage [21].

An in vivo selection involves the introduction of phage particles directly into animals of choice followed by the collection of target tissues. Such a method has helped in the research studies on cellular receptors and identification of peptides or antibodies with specificity for them [69, 70]. For a further selection of monoclonal antibodies, the phage clones obtained after final round are propagated individually and characterized for desired binding specificities [21].

Alfaleh et al, for example, used cell-based biopanning to isolate anti-CD117 antibodies, which were evaluated by flow cytometry and immunohistochemistry [71]. Kim et al panned a Fab phage display library against the spike protein of Middle East respiratory syndrome-coronavirus and generated highly specific Fab fragments and monoclonal antibodies, with the potential as diagnostic agents [72]. D Wrapp et al developed a VHH phage library against the S proteins of MERS-CoV and SARS-CoV-1 viruses using the pMECS vector [73].

The antibodies generated through recombinant methods hold superiority than the hybridoma produced [74], as the former can be improved for its qualities and modified as per the desired applications. Affinity maturation of rAbs has been reported [24, 75]. High-affinity antibodies against a broad spectrum of antigens have been derived from various immunized animals, such as llamas [53, 76], mice [77], chickens [78], rabbits [79], and also from sheep [80] and nonhuman primates [75].

Very high volumetric yields have been reported for cytoplasmic expression of rAbs in E. coli. Production of smaller antibody fragments has been reported up to grams per liter amounts in bacteria [81]. Expression of a functional rAb in E. coli was first reported by Skerra and Plückthun in 1988 [82], where both V chains were translocated into the periplasmic space of the bacterial cells. The oxidizing environment in the compartment allowed correct conformation of the functional Fv fragment by the formation of appropriate disulfide bonds. The approach was also utilized for the expression of first time functional Fab fragments in E. coli [83]. The expression of recombinant antibodies in reducing cytoplasm more often than not results in non-functional aggregates [84].

On the other hand, expression of functional antibody fragments in cytoplasm most of the times requires complete denaturation and refolding [85]. However, successful production of functional scFvs in the cytoplasm of E. coli, not requiring refolding has also been reported [86-88]. The type of host strain and the specificity of the antibodies are known to affect the expression of functional rAbs in E. coli. A good number of rAbs have been produced in the periplasm of E. coli using N-terminal leader sequences targeting the periplasmic Sec pathway [89-91]. Following the expression of the rAbs, the molecules are isolated from the periplasmic fraction [92, 93], or culture supernatants [94, 95]. The expression, periplasmic transport, accurate folding and assembly of two different polypeptide chains is highly necessary for the expression of rAbs in the Fab format. The bi-cistronic vectors with the first cistron encoding the light chain and the second cistron encoding the Fd fragment (consisting of VH and CH1) were found to be optimal for such requirements [92]. Production of a full size glycosylated IgG in E. coli has also been reported [96], only after the fine-tuning of the translation strength of both IgG chains, by the introduction of silent mutations into the translation initiation region of the leader sequence which facilitated optimal periplasmic transport [96].

  • Origin, diversity, and parallel selection: A variety of sources can be used for generation of large diversity antibody libraries. High diversity allows the selection of antibodies against multiple targets simultaneously, thereby saving considerable time, efforts and costs associated with monoclonal antibody (mAb) generation.
  • Ease of development: The time required for construction of libraries, the selection of mAbs with desired specificities, and optimization of assays based on mAbs are much less than the conventional fusion methods.
  • Specificity/ affinity: Direct relation of the genotype to the phenotype of the developed antibody.
  • Formats: Different variants can be generated depending upon the downstream applications of mAbs.
  • Scope of improvement: Molecular methods allow the scope of perfection for the mAbs either before or after development. Affinity maturation strengthens the binding efficacy of antibodies to the target antigen, providing mAbs a higher affinity, and specificity towards the target. The recombinant mAbs can be conjugated to reporter enzymes for direct detection.
  • Stability: The phage display libraries are very stable, even for an indefinite period, and can be revived after long-term storage, by infection of bacterial cells.
  • Concentration: The large diversity libraries often contain displayed antibodies at low molarities.
  • Library complexity: The number of antibody display clones is less than the recombinants, which may at times interfere with the selection of mAbs directed towards rare targets.
  • Selection bias: Biological selection is reported to be biased against cysteine residues in odd numbers, positive charged or specific residues at fixed positions. Further, the selection is limited to the interaction of target antigen and the antibody.
  • Biological efficacy: The application of monoclonal antibodies is limited for use as therapeutics in organisms different than their origin.

Hence, high yield expression of rAbs in E. coli can be achieved only after addressing various issues like host toxicity, vector mutation, and plasmid loss. Such decisive constraints can be addressed by the promoter system, plasmid copy number, etc. [97]. One modification is the growth of bacterial cells between the temperature range 20 to 30°C rather than at 37°C to steer clear of the overloading of E. coli’s secretory pathway. Nevertheless, very high yields of antibody fragments in E. coli can be facilitated by high cell density fermentation in bioreactors. Cell-wall-less L-forms of the Gram-negative bacterium Proteus mirabilis have also been experimented for the production of miniAbs and scFvs [98, 99], to obtain high yields of functional scFvs [99].

The expression of recombinant antibody fragments (scFv, Fab) has been reported in numerous microorganisms, especially in selected strains of E. coli. The choice for E. coli host strains such as BL21 and their derivatives amounts to the fact that the antibodies can be produced economically in bulk amounts. The soluble antibody fragments can be expressed in the culture supernatant, bacterial periplasm, and/or inside the bacterial cytoplasm [100-102]. Though the secretion of the rAbs in the periplasm and the media provide a less overall yield, the oxidative environment outside the cell cytoplasm confers proper formation of disulfide bonds required for natural folding of antibody domains.

Antibodies expressed into the periplasmic space are extracted by osmotic shock. RAbs expressed in considerable amounts in the cell cytoplasm frequently results in extensive aggregation and formation of inclusion bodies, which can be purified from the other cellular components. The aggregated antibody mass can be made soluble by adding strong denaturants for instance urea or guanidium hydrochloride including some oxido-reduction system. The native antibody fragments are recovered by refolding upon removal of the denaturants. Guidelines for antibody refolding have been extensively reviewed [103].

Apart from E. coli host cells, the rAbs have been expressed in mammalian systems [104, 105], insect cells [106, 107], yeasts like Saccharomyces cerevisiae [108], Schizosaccharomyces pombe [109], Hansenula polymorpha [110], and also in Pichia pastoris [111] and in bacterial host strains such as Bacillus brevis [112]. Generally, the choice of expression hosts (bacteria, yeast, plants, insect or mammalian cells) must be reliable as per the final application of the antibody molecule.


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