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19.1.6: Arabidopsis Thaliana - Ein Modellorganismus - Biologie

19.1.6: Arabidopsis Thaliana - Ein Modellorganismus - Biologie


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Arabidopsis Thaliana ist in der Pflanzenbiologie was geworden Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans gehören zur Tierbiologie. Arabidopsis ist ein Angiosperm, eine Dikotyle aus der Familie der Senfgewächse (Kohlgewächse). Es ist im Volksmund als Ackerschmalwand oder Mausohrkresse bekannt. Obwohl es keinen kommerziellen Wert hat – tatsächlich wird es als Unkraut betrachtet – hat es sich als idealer Organismus zum Studium der Pflanzenentwicklung erwiesen.

Einige seiner Vorteile als Modellorganismus:

  • Es hat eines der kleinsten Genome im Pflanzenreich: 135 x 106 Basenpaare der DNA, die auf 5 Chromosomen (2n = 10) verteilt sind und von denen fast alle ihre 27.407 Gene kodieren.
  • Transgene Pflanzen können einfach hergestellt werden mit Agrobacterium tumefaciens als Vektor, um fremde Gene einzuführen.
  • Die Pflanze ist klein - eine flache Rosette aus Blättern, aus der ein 6 bis 12 Zoll hoher Blütenstiel wächst.
  • Es kann leicht im Labor auf relativ kleinem Raum gezüchtet werden.
  • Die Entwicklung ist rasant. Von der Samenkeimung bis zur Produktion einer neuen Saat vergehen nur 5–6 Wochen.
  • Es ist ein produktiver Samenproduzent (bis zu 10.000 pro Pflanze), der genetische Studien erleichtert.
  • Mutationen können leicht erzeugt werden (z. B. durch Bestrahlen der Samen oder Behandlung mit mutagenen Chemikalien).
  • Es ist normalerweise selbstbestäubt, so dass rezessive Mutationen schnell homozygot und somit exprimiert werden.

Andere Familienmitglieder können sich nicht selbst bestäuben. Sie haben ein aktives System von Selbstinkompatibilität. Arabidopsis hat jedoch inaktivierende Mutationen in den Genen – SRK und SCR - die die Selbstbestäubung bei anderen Familienmitgliedern verhindern.

  • Arabidopsis kann jedoch leicht fremdbestäubt werden, um eine genetische Kartierung durchzuführen und Stämme mit mehreren Mutationen zu produzieren.

Viele der Erkenntnisse über die Funktionsweise von Pflanzen, die auf diesen Seiten beschrieben werden, stammen aus Studien mit Arabidopsis.


Grundlegender Leucin-Reißverschluss 19

<p>Der Annotations-Score bietet ein heuristisches Maß für den Annotationsinhalt eines UniProtKB-Eintrags oder -Proteoms. Dieser Wert <strong>kann</strong> nicht als Maß für die Genauigkeit der Anmerkung verwendet werden, da wir nicht die 'richtige Anmerkung' für ein bestimmtes Protein definieren können.<p><a href='/help/annotation_score' target='_top'> Mehr. </a></p> - Experimenteller Nachweis auf Transkriptebene i <p>Dies zeigt die Art des Nachweises an, der die Existenz des Proteins unterstützt. Beachten Sie, dass der Nachweis der 'Proteinexistenz' keine Informationen über die Genauigkeit oder Korrektheit der angezeigten Sequenz(en) liefert.<p><a href='/help/protein_existence' target='_top'>Mehr. </a></p>

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Materialen und Methoden

Pflanzenmaterial und Genotypisierung

Die A. thaliana (L.) Heynh. SALK- und SAIL-T-DNA-Insertionslinien im Ökotyp Columbia (Col-0) wurden vom Salk Institute, Genomic Analysis Laboratory 1 (Alonso et al., 2003) und von der Syngenta-Sammlung von T-DNA-Insertionsmutanten (Sessions et al.) erhalten ., 2002) bzw. Die GABI T-DNA Mutanten (GK in Col-0) wurden im Rahmen des GABI-Kat Programms (MPI für Pflanzenzüchtungsforschung, Köln, Deutschland 2 Rosso et al., 2003) generiert. Alle Linien wurden vom Nottingham Arabidopsis Stock Center 3 bereitgestellt.

Die Samen wurden in Erde gekeimt, gefolgt von einer Kultivierung unter Kurztagbedingungen (8 h Licht/16 h Dunkelheit) bei 18ଌ. Nach 1 Monat wurden die Pflanzen in Langtagbedingungen (16 h Licht, 22ଌ/8 h Dunkelheit, 21ଌ) überführt. Genomische DNA wurde aus Rosettenblättern isoliert und für die PCR-basierte Genotypisierung verwendet, um heterozygote und homozygote T-DNA-Insertionsmutanten zu identifizieren. Die für die Genotypisierung verwendeten PCR-Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgelistet und ihre Positionen sind in 1B gezeigt. Das folgende PCR-Programm wurde verwendet: anfängliche Denaturierung für 5 min bei 95ଌ, dann 40 Zyklen mit 15 s Denaturierung bei 95ଌ, 30 s Annealing bei 55ଌ und 60 s Endverlängerung bei 72ଌ.

Die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der genspezifischen Primer-Sets ergab DNA-Fragmente von 𢏁 kb, die die Wildtyp-Allele repräsentieren. Die für das zerstörte Allel spezifischen PCR-Fragmente ergaben PCR-Produkte von 𢏀,5 kb. Die Positionen der T-DNA-Insertion wurden durch Sequenzieren der PCR-amplifizierten T-DNA-Verbindungsfragmente bestätigt (Ergänzungstabelle S2).

Um Doppel-T-DNA-Insertionsmutanten zu erhalten, wurde eine Kreuzbefruchtung durchgeführt.

Brassica-Rapa L.-Pflanzen wurden unter Langtagbedingungen (16 h Licht, 22ଌ/8 h Dunkelheit, 18ଌ) gezüchtet, um Meiozyten für die Immunlokalisierung von NSE4A über spezifische Antikörper zu erhalten.

In silico Analyse von Gen- und Proteinstrukturen und der phylogenetische Baumaufbau

Genstrukturen von NSE4A und NSE4B wurden unter mips.helmholtz-muenchen.de (Version 10 4 , 5 ) vorhergesagt. Die konservierten funktionellen Domänen bekannter mutmaßlicher NSE4-Orthologe höherer Pflanzen (Sequenzen in voller Länge sind verfügbar unter www.ncbi.nlm.nih.gov/) wurden unter Verwendung der Conserved Domain Database 6 identifiziert. Dieselben Sequenzen wurden verwendet, um einen phylogenetischen Baum durch Bayes'sche phylogenetische Inferenz in MrBayes 3.2.6 7 zu erzeugen. Alle Ausrichtungen wurden mit der Clustal Omega 2.1 Software 8 durchgeführt.

Genexpressionsanalyse

Die Gesamt-RNA wurde aus Sämlingen, drei und sechs Wochen alten Blättern, Blütenknospen und Wurzelgeweben unter Verwendung der Trizol-Methode (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Dann wurden die Proben DNase-behandelt, wobei das TURBO DNA-free TM Kit (Thermo Fisher Scientific) verwendet wurde. Die reverse Transkription (RT) wurde unter Verwendung des RevertAid Reverse Transcriptase Kits (Thermo Fisher Scientific) mit Zufallshexamer durchgeführt. Nach 5 min initialer Denaturierung bei 95ଌ, gefolgt von 60 min cDNA-Synthese bei 42ଌ, wurde die Reaktion bei 70ଌ für 5 min beendet.

Die quantitative Echtzeit-PCR mit SYBR Green wurde mit einem QuantStudio 5 flex-Gerät und der QuantStudio TM Real-Time-PCR-Software (v1.1) durchgeführt. Ein Mikroliter cDNA wurde für jede Reaktion mit drei Replikaten und drei unabhängigen biologischen Wiederholungen für jedes Gewebe oder Entwicklungsstadium aufgetragen. Das folgende PCR-Programm wurde verwendet: anfängliche Denaturierung für 5 min bei 95ଌ, dann 40 Zyklen mit 15 s Denaturierung bei 95ଌ, 30 s Annealing bei 60ଌ und 20 s Endverlängerung bei 72ଌ. PP2A (AT1G13320) und RHIP1 (AT4G26410) dienten als Standards (Czechowski et al., 2005). Die Berechnungen basierten auf den Delta-CT-Werten der Referenzgene (Livak und Schmittgen, 2001). Die quantitativen Echtzeit-RT-PCR-Primer, die verwendet wurden, um Transkripte zu amplifizieren, sind in 1B und in der Ergänzungstabelle S3 gezeigt.

Klonen und Transformation

PCR-basierte Amplifikation von cDNA (für 35S::Nse4A::EYFP) und genomische DNA (für PromotorNse4A::gNse4A::GFP) als Matrizen wurden unter Verwendung der KOD Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Merck) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific) in den pJET 1.2-Vektor kloniert. Sequenzbestätigte Inserts wurden in den Gateway ® pENTR TM 1A Dual Selection Vector (Thermo Fisher Scientific) kloniert. Als nächstes wurden die Inserts in die Vektoren pGWG (Komplementationsvektor ohne Promotor und Tag), pGWB642 (35S-Promotor mit EYFP-Tag am N-Term) und pGWB604 (kein Promotor, GFP-Tag am C-Terminus) (Neyagawa-Vektoren) rekloniert , doi.org/10.1271/bbb.100184 Nakamura et al., 2010) mit dem BP Clonase II Kit (Gateway ® Technology, Thermo Fisher Scientific). Die binären Vektoren wurden übertragen in Agrobacterium tumefaciens, und dann verwendet, um zu transformieren A. thaliana Col-0-Wildtyp-Pflanzen über das florale Dip-Verfahren (Clough und Bent, 1998). Samen dieser Pflanzen wurden auf PPT-Medium (16 μg/ml) vermehrt. Positiv selektierte Sämlinge wurden in Erde überführt und auf das Vorhandensein des Konstrukts genotypisiert. In weiteren Studien wurden homozygote F2-Pflanzen verwendet. Für die Klonierung verwendete Primer sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt.

Rekombinante Protein- und Antikörperproduktion

Zur Antikörperproduktion wurde das partielle NSE4A-Peptid (von 49 bis 289 aa) (Ergänzende Abbildung S1) in der E coli BL21 pLysS-Stamm unter Verwendung des pET23a (Novagen)-Vektors. Für die rekombinante Proteinproduktion verwendete Primer sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt. Die rekombinanten Proteine ​​mit 6xHis-Tags wurden unter Verwendung von Dynabeads His-Tag (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. 500 µl geklärter Extrakt wurde mit 500 µl Bindungspuffer (50 mM NaP, pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,01% Tween-20) gemischt und 50 µl gewaschene Dynabeads wurden zugegeben. Nach 10 min Inkubation auf einer Walze wurden die Kügelchen 7 × mit Bindungspuffer und 7 × mit Bindungspuffer, 5 mM Imidazol, gewaschen. Die Elution erfolgte mit Bindungspuffer, 150 mM Imidazol, und die Proteinkonzentration (90 ng/μl) wurde unter Verwendung eines Bradford-Kits (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) (Bradford, 1976) bestimmt.

Die Auftrennung auf SDS-Gelen und die Proteingrößenbestimmung durch Western-Analyse erfolgte wie beschrieben (Conrad et al., 1997 Supplementary Figure S2A).

Zwei Kaninchen wurden mit 1 mg NSE4A-Protein und komplettem Freund’s-Adjuvantien immunisiert. Vier und fünf Wochen später wurden Auffrischungsimmunisierungen mit 0,5 mg NSE4A-Protein bzw. inkomplettem Freund’s-Adjuvantien durchgeführt. Zehn Tage später wurde Blut entnommen, Serum isoliert, in 40% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt, gegen 1 × 7 PBS dialysiert und affinitätsgereinigt.

Das spezifische Bindungsverhalten der Kaninchen-Anti-NSE4-Antikörper wurde mittels kompetitivem ELISA nach Conrad et al. (2011). Die Wells wurden mit 46 ng/100 μl rekombinantem, affinitätsgereinigtem NSE4A in 1 × PBS beschichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Blockierung mit 3% w/v BSA in 1 × PBS-0,05% w/v Tween 20 (1 × PBS-T) für 2 h wurden die bekannten Mengen an affinitätsgereinigten Anti-NSE4A-Antikörpern mit verschiedene Konzentrationen von NSE4A in 1% w/v BSA in 1 × PBS-T, 30 min in einer Masterplatte inkubiert, in die antigenbeschichteten Wells gegeben und 1 h bei 25ଌ inkubiert. An die Platte gebundene Antikörper wurden mit alkalischer Anti-Kaninchen-IgG-Phosphatase, verdünnt in 1 × PBS-T/1% BSA, sichtbar gemacht. Das enzymatische Substrat war pNP-Phosphat, und die Extinktion (405 nm) wurde nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C gemessen (ergänzende Abbildung S2B).

Um die NSE4A-Antikörperspezifität in immunhistologischen Experimenten weiter zu beweisen, wurden Antigenkompetitionsexperimente durchgeführt. NSE4A wurde den Antikörpern in einer Konzentration von 800 nM zugesetzt und auf durchflusssortiertes 8C . aufgetragen A. thaliana Interphase-Kerne. Die Signalreduktion im Vergleich zu den Kontrollkernen ohne Antigenzugabe bestätigte die Spezifität eindeutig (Ergänzende Abbildung S2C).

Ergänzungsassay

Um zu bestätigen, dass die Phänotypen der of Nse4A Mutante GK-768H08 werden in der Tat durch diese Mutation verursacht, wir haben die Mutante durch den genomischen Wildtyp ergänzt Nse4A Gen. Das genomische Intron-Exon enthält Nse4A Gen mit einer 1,7 kbp langen stromaufwärts gelegenen Promotorregion wurde durch PCR unter Verwendung der KOD Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Merck) amplifiziert und dann sequenziert. Als nächstes wurde es in den pBWG-Vektor kloniert (Nakamura et al., 2010) und transformiert in A. tumefaciens. Die Pflanzentransformation wurde durch den Bakterien-vermittelten Vektortransfer über das Blumentauchverfahren (Clough und Bent, 1998) durchgeführt und anschließend unter Langtagbedingungen vermehrt. Die geernteten Samen wurden auf selektivem PPT-Medium (16 & mgr; In weiteren Studien wurden homozygote F2-Pflanzen verwendet.

Fertilitätsbewertung und Alexander-Färbung

Reife trockene Siliken wurden gesammelt, um die Länge der Siliken und die Samenbildung zu bewerten. Die Samen wurden in normal und geschrumpft klassifiziert ( 2 ). Zur Klärung wurden vollständig entwickelte grüne Silikas in einer Ethanol:Essigsäure (9:1)-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur behandelt, dann jeweils 5 Minuten in 70 und 90 % Ethanol gewaschen, gefolgt von der Lagerung in Chloralhydrat:Glycerin:Wasser (8:1:3) Lösung bei 4ଌ.

Beeinträchtigtes Wachstum und Fruchtbarkeit von nse4 Mutanten im Vergleich zum Wildtyp (wt). (EIN) Reduzierte Pflanzengröße der Mutanten GK-768H08 und der Doppelmutante GK-768H08/SAIL_296_F02. Die Mutante SALK_057130 und die komplementierte GK-768H08-Mutante zeigen eine Wildtyp-Gewohnheit. (B) Reduzierter Samensatz pro silique bei den nse4A- und nse4B-Mutanten. (C) Verschrumpelte Samen (Pfeile) der GK-768H08-Mutante. (D) Reduzierte Pollenkörnerzahl und abgebrochene Pollenkörner in einer Anthere der Doppelmutante GK-768H08/SAIL_296_F02.

Um die Form der Antheren und die Lebensfähigkeit der Pollen zu bewerten, wurde eine Alexander-Färbung (Alexander, 1969) durchgeführt. Für die Gesamtpollenzählung (pro Anthere) wurden unbeschädigte Staubbeutel verwendet. Danach wurden die Staubbeutel zerquetscht und die freigesetzten Pollenkörner in zwei Klassen eingeteilt: normal (lebensfähige, rosa runde Körner) und abgebrochen (grau/grüne abnormale Form).

Bilder von Siliques, Samen und Antheren wurden mit einem Nikon SMZ1500 Fernglas und der NIS-Elements AR 3.0 Software aufgenommen.

Bleomycin-Behandlung

Um DNA-DSBs durch Bleomycin-Anwendung zu induzieren A. thaliana Wildtyp- und NSE4A-mutierte Samen wurden 10 min in 70 % Ethanol, dann 15 min in 4 % Na-Hypochlorit + 1 Tropfen Tween-20 sterilisiert, gefolgt von 3 – 5 min Waschen in sterilem Wasser. Die Samen wurden 5 Tage auf nassem Filterpapier zum Keimen gebracht und dann in flüssiges Keimungsmedium (Murashige und Skoog, Duchefa, Art.-Nr. M0231.0025 10 g/l Saccharose, 500 mg/l MES, pH 5,7) ohne und mit Bleomycin (Bleomycinsulfat aus Streptomyces verticillus, Sigma, Kat. Nein. 15361) mit zunehmender Konzentration. Dementsprechend wurden in einem zweiten Versuch die sterilisierten Samen auf Agarplatten (Keimungsmedium + 2 % Agar-Agar Roth, Kat.-Nr. 2266.2) ohne und mit Bleomycin angezogen. Beide Experimente wurden zweimal wiederholt und enthielten zwei Wiederholungen.

Immunfärbung und FISH

Die Fixierung der Blütenknospen, die Vorbereitung des Chromosomen-Objektträgers und FISH gefolgt von der Chiasma-Zählung wurden gemäß Sánchez-Morán et al. (2001). Um einzelne Chromosomen zu identifizieren, wurde 5S und 45S rDNA FISH durchgeführt.

Fluoreszenz vor Ort Hybridisierung mit Telomer- und Zentromer-spezifischen Sonden wurde angewendet, um Chromosomen in der Metaphase I zu identifizieren. Die 180-bp-Centromeric-Repeat-Sonde (pAL) (Martinez-Zapater et al., 1986) wurde durch PCR wie zuvor beschrieben erzeugt (Kawabe und Nasuda, 2005). Die telomerspezifische Sonde wurde durch PCR in Abwesenheit von Template-DNA unter Verwendung der Primer (TAAAACCC) erzeugt.7 und (GGGTTTA)7 (Ijdo et al., 1991).

Immunfärbung von A. thaliana und B. rapa PMCs folgten dem Protokoll von Armstrong und Osman (2013). Die folgenden Primärantikörper wurden aufgebracht: Kaninchen-Anti-NSE4A (1:250) und Ratten-Anti-ZYP1 (1:1000, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Chris Franklin). ZYP1 ist der A. thaliana transversales Filamentprotein des synaptonemalen Komplexes (Higgins et al., 2005). Die primären Antikörper wurden von Esel-anti-Kaninchen-Alexa488 (Dianova, Nr. 711545152) bzw. Ziege-anti-Ratte-DyLight594 (Abcam, Nr. ab98383) als sekundäre Antikörper nachgewiesen.

8C-Blatt-Interphasekerne wurden nach Weisshart et al. (2016) und auch wie oben beschrieben gegen NSE4A immunmarkiert.

Mikroskopie

Um fixierte und lebende Zellpräparationen abzubilden, wurden ein Olympus BX61 Mikroskop (Olympus) bzw. ein konfokales Laser Scanning Mikroskop LSM 780 (Carl Zeiss GmbH) verwendet.

Um die Ultrastruktur von Immunsignalen und Chromatin jenseits der klassischen Abbe/Raleigh-Grenze bei einer lateralen Auflösung von � nm (Superauflösung, erreicht mit einem 488-nm-Laser) zu analysieren, wurde räumlich strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM) mit einem 63 × 1.4NA Oil Plan-Apochromat Objektiv eines Elyra PS.1 Mikroskopsystems und der Software ZEN (Carl Zeiss GmbH). Die Bilder wurden für jedes Fluorochrom separat aufgenommen, wobei die Laserlinien 561, 488 und 405 nm für die Anregung und geeignete Emissionsfilter verwendet wurden (Weisshart et al., 2016).


Ergebnisse

Zwei konserviert Nse4 Gene sind vorhanden und exprimiert in A. thaliana

Nach früheren SMC5/6-Untereinheiten-Vorhersagestudien (Schubert, 2009) A. thaliana kodiert zwei Nse4 Homologe: Nse4A (AT1G51130) und Nse4B (AT3G20760) (Abbildung 1A,B). Beide NSE4-Proteine ​​zeigen ähnliche Längen (NSE4A: 403 AS, NSE4B: 383 AS) und eine hohe Aminosäuresequenzidentität (67,7%) (Ergänzende Abbildung S1). Beide A. thaliana NSE4-Proteine ​​zeigen ähnliche Längen wie die von Knospungshefe (402 AS), Maus (381 AS für NSE4A 375 AS für NSE4B) und Human-NSE4A (385 AS), sind aber länger als die Spalthefe NSE4 (300 AS) und die menschliche NSE4B (333 AS) Proteine ​​(NSE4A 9 NSE4B 10 ).

NSE4A zeigt im Vergleich zu beiden eine relativ hohe Aminosäureähnlichkeit B. rapa mutmaßliche NSE4-Proteine ​​(Ergänzende Abbildung S3) und andere Pflanzenarten (Ergänzende Abbildung S4A). Nicht-pflanzliche Organismen wie Spalthefe, Entamoeba, Dictyostelium, Maus und Mensch zeigen eine geringere Ähnlichkeit (Ergänzungstabelle S5).

Die phylogenetische Analyse der vollständigen Proteinsequenzen von eudikotylen und monokotylen Arten legt auch eine relativ hohe Konservierung von beiden nahe A. thaliana Nse4 Gene (Ergänzende Abbildung S4B).

Laut Uniprot-Datenbanken 11 sind beide A. thaliana NSE4-Proteine ​​besitzen konservierte C-terminale Domänen, die typisch für andere pflanzliche NSE4-Proteine ​​sind ( 1C und ergänzende Abbildungen S1, S3). Die C-terminale Domäne bindet an SMC5 auf ähnliche Weise wie die anderen Kleisinmoleküle mit ihren Kappa-SMC-Partnern interagieren (Palecek et al., 2006 Hassler et al., 2018). Dieses Zusammenspiel ist entscheidend für die Funktion von SMC5/6. Die N-terminale Domäne von NSE4 ist ebenfalls konserviert und bindet an SMC6 (Palecek et al., 2006). In NSE4 von Pilzen und Wirbeltieren wurde neben dem N-terminalen Kleisin-Motiv eine NSE3/MAGE-Bindungsdomäne identifiziert (Guerineau et al., 2012). Basierend auf der Motif-Scan-Analyse 12 kann die SMC6-Bindungsdomäne auch in den NSE4-Proteinen von vorhergesagt werden A. thaliana (Ergänzende Abbildung S1). Um diese identifizierte Region jedoch eindeutig als das SMC6-Bindungsmotiv zu definieren, müssen Protein-Protein-Interaktion, Domänendissektion und Mutagenese-Experimente durchgeführt werden. Darüber hinaus wurden mutmaßliche Abbauregionen und SUMOlisationsstellen mithilfe von Eukaryotic Linear Motif 13-Ressourcen identifiziert (ergänzende Abbildung S1), was darauf hindeutet, dass die zelluläre Menge an NSE4-Proteinen während des Zellzyklus durch ihren proteolytischen Abbau reguliert werden könnte.

In silico Die Analyse zeigt ein ähnliches Expressionsverhalten (mit Spitzen in den jungen Rosetten- und Blühstadien) während der Pflanzenentwicklung der Nse4A Gen und andere Kandidatengene für SMC5/6-Untereinheiten, die eine synchronisierte Aktivität unterstützen (Ergänzende Abbildung S5). Es ist jedoch nicht klar, ob sie einzeln oder als Komplexe mit mehreren Untereinheiten in verschiedenen Untereinheitskombinationen wirken. In silico Analyse zeigte auch eine hohe Co-Expression von Nse4A, unter anderem mit Meiose- und Chromatin-verwandten Genen (Ergänzungstabelle S6).

Die in silico Analyse des relativen Expressionsniveaus von Nse4A und Nse4B in zehn anatomischen Teilen von A. thaliana Sämlinge zeigten, dass der Ausdruck von Nse4B ist auf generatives Gewebe und Samen beschränkt. Eine relativ hohe Expression zeigt sich nur in Samen (Embryo und insbesondere Endosperm) (Ergänzende Abbildung S6).

Durch quantitative Echtzeit-PCR haben wir festgestellt, dass Nse4A wird in Blütenknospen und Wurzeln stark exprimiert, Transkripte sind jedoch auch in Sämlingen, jungen und alten Blättern vorhanden (Ergänzende Abbildung S7). In Übereinstimmung mit früheren Studien (Watanabe et al., 2009) ist die Expression von Nse4B in diesen Geweben ist nicht nachweisbar. Offensichtlich die meisten Nse4B Transkripte sind in bereits gut entwickelten Samen vorhanden, wie auch durch angezeigt wird in silico Analyse (Ergänzende Abbildung S6).

Um herauszufinden, ob die NSE4-Proteine ​​mit den anderen Komponenten des SMC5/6-Komplexes interagieren (Abbildung 1), wurde eine Protein-Protein-Interaktionsanalyse durchgeführt in silico mit dem STRING-Programm 14 . Interessanterweise wurden alle über das STRING-Programm zugänglichen SMC5/6-Untereinheiten mit einem sehr hohen Score von Ϡ.95 als Interaktionspartner der NSE-Proteine ​​identifiziert, was darauf hindeutet, dass sowohl NSE4A als auch NSE4B auch innerhalb des SMC5/6-Komplexes agieren. Darüber hinaus wurden Cohesin- und Condensin-Untereinheiten als Teile desselben Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks mit dem hohen Wert von Ϡ.70 nachgewiesen (Ergänzende Abbildung S8). Eine Interaktion mit Zellzyklusfaktoren konnte bei einem mittleren Score Ϡ,5 nicht identifiziert werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass beide A. thaliana Nse4 Gene hoch konserviert sind und dass die entsprechenden Proteine ​​in Kombination mit anderen SMC5/6-Komplexkomponenten sowie Cohesin und Condensin wirken können. Basierend auf der Ausdrucksebene, Nse4A scheint das essentiellere Gen zu sein, obwohl Nse4B darauf spezialisiert zu sein scheint, während der Samenentwicklung zu wirken.

Selektion und molekulare Charakterisierung von A. thaliana nse4 Mutationen und ihre Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, Fruchtbarkeit und Reparatur von DNA-Schäden

Von dem A. thaliana SALK-, Syngenta-SAIL- und GABI-Kat-Sammlungen, homo- und heterozygote T-DNA-Insertionsmutanten wurden für beide Gene ausgewählt ( 1B und Tabelle 1). Das Vorhandensein und die Positionen entsprechender T-DNA-Insertionen wurden durch PCR unter Verwendung genspezifischer und T-DNA-spezifischer Primer und durch Sequenzieren der PCR-Produkte bestätigt (Ergänzungstabelle S2). Mit Ausnahme der Linie GK-175D11 (Intron-Einfügung in Nse4B), wurden alle anderen T-DNA-Insertionen in Exons gefunden.

Tabelle 1

Charakterisierung der T-DNA-Insertionsmutanten des A. thaliana Nse4 Gene.

GensymbolT-DNA-MutanteZygositätGewohnheitPollenfruchtbarkeit (%)Siliklänge (mm)Samen pro siliqueGeschrumpfte Samen pro silique% mitotische Zellen mit Brücken/Fragmenten% Meiozyten mit Brücken/Fragmenten
Metaphase IAnaphase IAnaphase II
Col-wtwt100 (10790)12.8 (28)44.5 (1468)0.71.5 (417)0 (60)1.2 (67)0 (23)
Nse4ASalk_057130ErKleiner98.2 (3808)11.3 ∗∗ (24)30,3 ∗∗ (726)2.7 ∗∗ 11,9 ∗∗ (242)8,4 ∗ (59)4.2 (47)10.0 (21)
SAIL_71_A08Er
GK-768H08HoKleiner50,2 ∗∗ (6396)10,0 ∗∗ (25)21,0 ∗∗ (525)7.8 ∗∗ 25,7 ∗∗ (175)25,2 ∗∗ (115)40,4 ∗∗ (114)47,4 ∗∗ (19)
GK-768H08 (ergänzt)Howt-ähnlich102 (6270)12.3 ∗ (25)31,8 ∗∗ (795)3.4 ∗∗ 2.6 (373)5,0 ∗∗ (121)19.1 ∗∗ (131)15,0 ∗ (20)
Nse4BSAIL_296_F02Howt-ähnlich97.2 (3770)10,8 ∗∗ (30)30,5 ∗∗ (916)1.62.1 (278)0 (59)5.9 (85)8.3 (12)
GK-175D11Howt-ähnlich64,3 ∗∗ (3206)11,3 ∗∗ (30)34,8 ∗∗ (1080)2.9 ∗∗ 1.7 (178)6.2 ∗∗ (113)17,8 ∗∗ (106)0 (18)
Nse4A/Nse4BGK-768H08/SAIL_294_F02Ho/hoKleiner34,8 ∗∗ (4529)10.2 ∗∗ (30)17,9 ∗∗ (536)5.6 ∗∗ 28,6 ∗∗ (619)30,6 ∗∗ (72)65,0 ∗∗ (172)50,0 ∗∗ (34)

Für die Nse4A Linien Salk_057130 und SAIL_71_A08 konnten nur heterozygote Mutanten selektiert und die Nachkommenschaft in heterozygote und Wildtyp-Pflanzen segregiert werden. Dies weist auf die Anforderung von Nse4A für die Lebensfähigkeit der Pflanzen. Die bestätigten verkürzten Transkripte stromabwärts außerhalb der konservierten Region der homozygoten Linie GK-768H08 ( 1 und ergänzende Abbildung S9) sind offensichtlich in der Lage, zumindest teilweise funktionelle Proteine ​​zu kodieren. Zum Nse4B zwei homozygote Linien, SAIL_296_F02 und GK-175D11, die die T-DNA-Insertion im zweiten Exon bzw. vierten Intron enthalten, wurden identifiziert.

Die ausgewählten Mutanten zeigten eine Wildtyp-Wachstumsgewohnheit mit nur einer leicht reduzierten Pflanzengröße (insbesondere Linie GK-768H08) im Vergleich zum Wildtyp ( 2A und Tabelle 1). Um die Mutationseffekte von zu kombinieren nse4A und nse4B, Linien GK-768H08 und SAIL_296_F02 wurden gekreuzt. Die resultierenden homozygoten Doppelmutanten zeigten ein weiter vermindertes Wachstum. Die Komplementierung der Mutation in der Linie GK-768H08 durch den genomischen Wildtyp Nse4A Konstrukt stellte die Lebensfähigkeit der Pflanze wieder her.

Somit ist der wesentliche Charakter von Nse4A wird bestätigt. Obwohl klopfen aus Nse4B induziert keine offensichtlichen Wachstumseffekte, diese Sekunde Nse4 Homolog ist wahrscheinlich nicht ganz funktionsfrei.

Die ausgewählten T-DNA-Insertionslinien wurden weiter detaillierter analysiert, um den Einfluss der NSE4-Proteine ​​auf Meiose und Fertilität zu untersuchen. Zusätzlich zu der verringerten Pflanzengröße wurden bei den Mutanten eine verringerte Pollenkörnungszahl, Korngröße und Samensatz zusammen mit geschrumpften Samen beobachtet (Tabelle 1, Abbildung 2B – D und ergänzende Abbildung S10). Die abgebrochenen Samen könnten die segregierende homozygote Nachkommenschaft darstellen. Die Komplementierung der Mutation in der Linie GK-768H08 durch das genomische Nse4A-Konstrukt stellte die Pollenfruchtbarkeit und die Samenbildung wieder her.

Um die DNA-Schadensantwort der nse4-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp zu untersuchen, haben wir Bleomycin in verschiedenen Konzentrationen in flüssigem Medium appliziert, um DSBs zu induzieren. Die Behandlung beeinträchtigte deutlich das Keimlingswachstum sowohl des Wildtyps (Col-0) als auch des nse4A und nse4B Mutanten mit steigender Bleomycinkonzentration (Ergänzende Abbildung S11A). Um herauszufinden, ob die nse4-Mutationen die Reparaturkapazität der Pflänzchen beeinflussen, führten wir ein ähnliches Experiment auf Platten mit festem Agarmedium durch und maßen die Wurzellängen der Sämlinge innerhalb von 18 Tagen Wachstum (Ergänzende Abbildung S11B). Laut einer Zwei-Wege-ANOVA wurde ein hochsignifikanter Unterschied zwischen Wildtyp und allen Mutanten bezüglich der Wurzelentwicklung ohne Bleomycin-Behandlung nachgewiesen. Darüber hinaus waren nach Bleomycin-Applikation bei allen Konzentrationen (0,25, 0,5 und 1,0 μg/ml) signifikant verringerte Wurzelwachstumsraten aller drei Mutanten vorhanden (Ergänzende Abbildung S11C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass NSE4A und NSE4B an der Reparatur induzierter DSBs beteiligt sind und dass ihre Mutationen die Reparatureffizienz im Vergleich zu Wildtyp-Proteinen reduzieren können.

NSE4 ist für eine korrekte Meiose unerlässlich

Die reduzierte Anzahl von Pollenkörnern der nse4 Mutanten deuten auf meiotische Störungen hin. Daher färbten wir Meiozyten durch DAPI. Während der Prophase I wurden keine offensichtlichen Veränderungen in der nse4A Mutante GK-768H08 im Vergleich zum Wildtyp. Anaphase-Brücken, Chromosomenfragmente und Mikronuklei erscheinen jedoch in späteren meiotischen Stadien bzw. in Tetradenzellen (Abbildung 3A und ergänzende Abbildung S12). Mikronuklei sind ein mögliches Produkt der Chromosomenfragmentierung. Neben der Linie GK-768H08 wurden alle untersucht nse4 Mutanten zeigten eine Zunahme meiotischer Defekte, mit einem deutlich erhöhten Spiegel in den homozygoten GK-768H08/SAIL_294_F02 Doppelmutanten. Die Komplementierung der Mutation in der Linie GK-768H08 durch das genomische Nse4A Konstrukt beseitigte hauptsächlich die Anhäufung meiotischer Anomalien (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung S13).

Meiotische Defekte im nse4 Mutante GK-768H08. (EIN) Gestörte Meiose (Anaphase-Brücken, Fragmente) im A. thaliana Mutante GK-768H08 im Vergleich zum Wildtyp (wt). (B) Chromosomenfragmentierung in GK-768H08 während der Anaphase I. Telomere und Zentromere wurden durch FISH unter Verwendung von Zentromer- und Telomer-spezifischen Sonden markiert. (C) Gesamtzahl der subtelomeren, perizentromeren und interstitiellen Chromosomenfragmente in 18 meiotischen Zellen der GK-768H08-Mutante. Balken = 10 μm.

Um die meiotischen Anomalien genauer zu untersuchen, wurden FISH-Experimente mit 5S- und 45S-rDNA-Sonden zur Chromosomenidentifizierung durchgeführt (Ergänzende Abbildung S14). Die Analyse der nse4A Mutante GK-768H08 legt nahe, dass das Auftreten von gestreckten Bivalenten, die möglicherweise Chromosomenfragmente verursachen, nicht mit spezifischen Chromosomen zusammenhängt. Dies weist darauf hin, dass die Defekte durch Störung eines allgemeinen meiotischen Prozesses induziert werden können.

Telomer- und Zentromer-spezifische FISH-Sonden wurden verwendet, um den Anteil an pericentromeren, interstitiellen und subtelomeren Fragmenten während der Anaphase I zu bewerten. Die meisten Fragmente waren subtelomeren Ursprungs, gefolgt von interstitiellen Fragmenten ( 3B,C). Offensichtlich sind die Fragmente das Ergebnis einer gestörten Chromatinkondensation entlang von Stäbchen-Bivalenten. Die erhöhte Anzahl von Stäbchen-Bivalenten in den Mutanten scheint die Folge einer reduzierten Rekombination zu sein, die zu weniger Chiasmata führt. Um diese Hypothese zu testen, wird die Chiasma-Frequenz der nse4A Mutante GK-768H08 (n = 43) wurde ausgewertet und erwies sich als nahezu identisch mit �.0 Chiasmata pro Diakinese/Metaphase-I-Zelle und dem Wildtyp (Higgins et al., 2004). Somit scheint die Trunkierung von NSE4A die Anzahl der Chiasmata nicht zu beeinflussen.

Das Auftreten einer gestörten Meiose deutet auf eine Beteiligung von NSE4 an meiotischen Prozessen hin. In der Tat, transgen A. thaliana Meiozyten, die das gNse4A::GFP-Konstrukt unter der Kontrolle des endogenen Promotors exprimieren, zeigten linienartige Signale bei Pachyten, typisch für den synaptonemalen Komplex ( 4A ). Darüber hinaus wurde durch die Anwendung von Anti-GFP-Antikörpern nachgewiesen, dass NSE4A in G2-, Leptotän-, Zygotän- und Pachytänzellen vorhanden ist. Nachdem NSE4A hauptsächlich von Meta- und Anaphase-I-Chromosomen verschwunden war, erholte sich NSE4A in Prophase II, Tetraden und jungen Pollen ( 4B ). Um das Vorhandensein von NSE4A in einer verwandten Spezies zu bestätigen, wurde die Immunmarkierung von B. rapa Meiozyten mit NSE4A-spezifischen Antikörpern und mit ZYP1, die A. thaliana transversales Filamentprotein des synaptonemalen Komplexes an Pachytän, wurde durchgeführt. Die Co-Lokalisierung beider Proteine ​​zeigte die Anwesenheit von NSE4A am synaptonemalen Komplex während der Pachytäne ( 4C ). Die Immunmarkierung von ZYP1 in Pachytän-Meiozyten des nse4A die Mutante GK-768H08 zeigte, dass diese Mutation die synaptonemale Komplexstruktur nicht verändert (ergänzende Abbildung S15).

Lokalisation von NSE4A während der Meiose von A. thaliana (A,B) und die eng verwandten Arten B. rapa (C). (EIN) Linienartige NSE4A-GFP-Signale sind in einem nicht fixierten Meiozyten am Pachytän eines transgenen pnse4A::gNse4A::GFP . nachweisbar A. thaliana Pflanze, Anlage. (B) Dynamik und Lokalisation von NSE4A-GFP-Signalen während der Meiose von pnse4A::gNse4A::GFP transgen A. thaliana Pflanzen, nachgewiesen durch Anti-GFP. Die NSE4A-GFP-Signale sind in G2-, Leptotän-, Zygoten- und Pachytänzellen nachweisbar. Die Signale sind in kondensierten Metaphase-I- bzw. Anaphase-I-Chromosomen schwach oder nicht sichtbar, werden jedoch in Prophase II, Tetraden und jungen Pollen wiedergefunden. (C) Anti-AtNSE4A markiert den synaptonemalen Komplex von B. rapa und kolokalisiert während der Pachytäne zu ZYP1. Die graue Farbe zeigt mit DAPI gegengefärbtes Chromatin an. Balken = 10 μm.

Wir schließen daraus, dass beide NSE4-Proteine, aber NSE4A wiederum stärker als NSE4B, an meiotischen Prozessen beteiligt sind, um eine normale Fruchtbarkeit zu erreichen. Beide Proteine ​​scheinen jedoch die Häufigkeit von Chiasmata nicht zu beeinflussen, obwohl NSE4A während der Prophase I am synaptonemalen Komplex nachgewiesen wurde.

NSE4 ist in Interphase-Kernen von Meristem und differenzierten Zellen vorhanden

Ähnlich wie während der Meiose treten während der Mitose Anomalien in den somatischen Blütenknospenkernen der A. thaliana nse4 Mutanten. Diese mitotischen Defekte treten überwiegend im nse4A Mutanten und weniger prominent in der Nse4B Knock-out-Mutanten (Abbildung 5).

Mitotische Defekte (Anaphase-Brücken, Nachzügler) in somatischen Blütenknospenkernen der A. thaliana nse4 Mutanten (EIN). Das Diagramm (B) gibt die Häufigkeit (%) von Anomalien bei den Mutanten im Vergleich zum Wildtyp an. Der Anteil der Auffälligkeiten ist deutlich erhöht im nse4A Mutanten SALK_057130 und GK-768H08, sowie in der homozygoten Doppelmutante GK-768H08/SAIL_296_F02, die beide repräsentiert nse4A und nse4B Mutationen bzw. Die Komplementierung der Mutation in GK-768H08 verringert deutlich die Anzahl der Anomalien, was darauf hinweist, dass sie durch die Dysfunktion des Nse4A-Gens induziert werden. Die Anzahl der analysierten Zellen ist oberhalb der Diagrammbalken angegeben.

Für die Live-Bildgebung wurden gNSE4A::GFP-Signale durch konfokale Mikroskopie in Wurzelmeristemzellen nachgewiesen. NSE4A was present in interphase nuclei, disappeared mainly during mitosis from the chromosomes and recovered at telophase at chromatin. Only a slight cytoplasm labeling remained during meta- and anaphase ( Figure 6A ). To analyze the distribution of NSE4A at the ultrastructural level, fixed interphase nuclei were stained with anti-GFP, and super-resolution microscopy (3D-SIM) has been performed. Thereby, it became obvious that NSE4A is distributed within euchromatin, but absent from nucleoli and chromocenters. During meta- and anaphase only few NSE4A signals were present within cytoplasm, confirming the live cell investigations ( Figure 6B ).

The localization of NSE4A in root meristem cells. (EIN) Global view of a living A. thaliana root meristem expressing a genomic NseA::GFP construct under the control of the endogenous Nse4A Promoter. The cell undergoing mitosis (in the rectangle) shows that the nuclear NSE4A-GFP signals are present in interphase (0 min), disappear from the chromosomes during metaphase (2� min) and are recovered in telophase at chromatin (26 min). During metaphase a slight cytoplasm labeling is visible. (B) The ultrastructural analysis by super-resolution microscopy (SIM) confirms the presence of NSE4A within euchromatin, and indicates its absence from the nucleolus (n) and heterochromatin (chromocenters, arrows) in root meristem G1 and G2 nuclei. During meta- and anaphase NSE4A mainly disappears from the chromosomes, but stays slightly present within the cytoplasm. In young daughter nuclei (G1 phase) NSA4A becomes recovered. The localization of NSE4A-GFP expressed by pnse4A::gNse4A::GFP transgenic A. thaliana plants was detected by anti-GFP antibodies in fixed roots.

3D-SIM has also been applied to demonstrate the distribution of NSE4A in differentiated nuclei. Similar as in meristematic tissue, somatic flower bud and 8C leaf interphase nuclei display NSE4A exclusively within euchromatin ( Figure 7 ).

The distribution of NSE4A in differentiated somatic flower bud and 8C leaf interphase nuclei analyzed by 3D-SIM. In agreement, both NSE4A antibodies (anti-NSE4A) and NSE4A-EYFP signals detected by anti-GFP antibodies indicate that NSE4A is distributed within euchromatin, but absent from heterochromatin (DAPI-intense chromocenters, arrows). The NSE4A labeling visible in the merged image of the 8C nucleolus (maximum intensity projection) originates from optical sections outside of the nucleolus.

We conclude that, in addition to their meiotic function, NSE4 proteins play also a role in somatic tissue, due to its exclusive presence within the euchromatin of cycling and differentiated interphase nuclei. NSE4A is more prominent than NSE4B also in somatic tissue.


3 Design of Optogenetic Proteins

Protein engineering strategies for optogenetic proteins involve a photosensory domain (e.g., the ones previously discussed) as well as an actuating module. Their covalent connection is usually mediated with protein linkers that need to be optimized in length and structure, depending on the engineering strategy and the requirements for coupling between the modules. [ 101-103 ] The choice of the photosensory domain can be based on structural considerations of the protein itself or unique properties that different photosensory domains contain.

Such structural considerations can involve the homology to sensory domains that are naturally linked to the actuating module, which make protein engineering easier through “domain swapping” of, for example, a small molecule or hormone sensing domain with a photoactivatable domain. In other cases, the actuation module might be incorporated into the structure of a photosensory protein, which sets special structural and sequence requirements. Also, it may be of interest to reduce the size of a photosensory domain, or in other cases, to provoke sterical hindering. Similarly, certain properties of photosensory domains might be crucial for specific applications. For example, if highly dynamic optoproteins are desired, fast kaus rates or light sensors that have an inactivating wavelength should be considered. However, if light-toxicity or light-delivery is problematic, high light-sensitivity and slow dark-reversion might be preferable. Also dark to light state fold-inductions of different photoregulators can be important for certain applications, although such a comparison might be case-specific and cannot always be taken from other studies in the literature. Availability of the chromophore in the used organism or medium could be another consideration.

Usually, the choice of the actuating module is very case-specific and depends on the application that the optoprotein needs to fulfill and the output it should produce, and will therefore not be further discussed. However, this section will extract general principles from successful previous optoprotein engineering efforts. Another important aspect is the screening of the functionality of optoproteins: As the protein engineering efforts might require large libraries, high-throughput methods [ 104 ] for functional screening, such as selection systems or fluorescence readouts, are preferred.

A general aspect of optogenetic proteins is that light-regulation is always based on conformational changes of the photosensory domain. Different classifications for photoactivatable proteins were previously used (e.g., [ 99, 105-108 ] ), however, we chose to classify light-regulated proteins slightly differently: To control the activity of the protein of interest, two general concepts were applied, which are either proximity- or protein-structure-based, and in some cases combined approaches are needed.

3.1 Proximity-Based Activity Control: Intermolecular Light-Control

The distance between proteins is an ubiquitous regulation factor in biology. [ 109 ] For example, assembly of multiple subcomponents is required to initiate transcription at the location of a promoter, and several factors are required to interact for protein transport or degradation. Both soluble and membrane-bound proteins are mostly symmetrical oligomeric complexes with two or more subunits. This makes complexes more stable due to reduced solvent area, provides a form of error control in protein synthesis and regulation, and allows cooperative function such as allosteric regulation and multivalent binding. [ 110 ] Chemicals and external signals can induce oligomerization of proteins, such as receptors, that subsequently initiate signaling and cellular responses. [ 111 ] The underlying regulation mechanism is based on proximity and distance of specific proteins. [ 109 ] Such proximity-based regulation is also the basis of many natural light-sensing modules in which the interaction, and therefore the distance of the interaction partners, is controlled through light. Due to allosteric changes of the photosensitive proteins upon light-induction, an interaction surface is exposed, which either allows for interaction with other identical photosensors (homodimerization or oligomerization), or for interaction with other proteins (heterodimerization). Both concepts can be utilized for proximity-based control. Therefore, proximity-based light control involves at least two fusion proteins.

Activation: inactive protein domains fused to photoactivatable domains which upon a light-input are assembled into an active protein

Recruitment: protein-recruitment of an active protein to a specific location of action

3.1.1 Activation

For the first case, light regulates assembly or release of domains necessary for the function of the protein. Prominent targets for proximity-based protein activation are signaling kinases. These kinases react to a plethora of environmental and cellular cues and control diverse functions of proteins from changing their expression, activity or localization, through altering their phosphorylation with serine, threonine, and tyrosine as their main targets. Such kinases usually show multidomain structures, containing a sensing domain that reacts to external cues often through induced oligomerization and autoactivation. [ 111 ] Light-controlled homodimerization domains were used instead of the sensing domains to implement optogenetic control usually through homodimerization. [ 112-118 ]

Heterodimerization, however, can be used if two different interaction partners are needed for the function of a protein. This is for example the case for synthetic split proteins which hold great potential for implementation of optogenetic regulation. In split protein approaches, a functional enzyme is artificially fragmented into inactive subunits. These inactive subunits are fused to light-inducible dimerization domains which reconstitute the enzyme to the active protein. [ 108, 119-121 ] An example for this is the light-inducible T7 RNA polymerase, [ 120 ] which consists of two inactive split parts that are reconstituted upon light-induced dimerization of photosensory domains (Abbildung 4A left).

3.1.2 Recruitment

In the second case of proximity-based control, light initiates the subcellular localization of a constitutive active protein to a location of action. For example, light-inducible heterodimerization domains were used to recruit transcription activation domains to specific sites of a promoter through promoter-bound DNA-binding proteins to initiate transcription (Figure 4A right). [ 2, 13, 122 ] In a highly similar strategy, DNA and histone modification enzymes such as DNA methyltransferases, histone deacetylases, methyltransferases, and acetyl–transferase inhibitors were used instead of transcription regulators for epigenetic regulation. [ 123, 124 ] Another widely used example is light-induced recruitment of proteins to membranes [ 125 ] where they exhibit their function, such as cAMP-dependent protein kinases which phosphorylate membrane bound substrates. [ 125, 126 ]

In both proximity-based activation and recruitment, the photosensitive domain and the effector domain(s) function independently. Engineering of such regulators mainly requires structural considerations to avoid interfering with the function of the actuator domain and to allow for correct assembly of split proteins [ 120 ] —factors that have to be considered in the choice of the light-inducible domain as well as the type of linker, its length, and its structure. [ 65, 102, 120 ]

3.2 Protein-Conformation-Based-Light Control: Intramolecular Light-Control

While proximity-based light control always involves two separate fusion proteins, allosteric conformation-based approaches only involve one protein which consists of a fusion of the effector domain and the light-inducible domain(s). The transition from the dark- to the light-induced state of photoactivatable proteins initiates a structural rearrangement that is transmitted to the effector domain leading to allosteric protein activity change or steric effects, for example, blocking and release of the active site of the effector domain.

The photoreceptors LOV2 from Avena sativa or from Arabidopsis thaliana are two prominent examples that have been used for such intramolecular light-control. The structural rearrangement upon blue-light stimulation leads to the release of a C-terminal helix (Jα-helix) from the PAS core. [ 127 ] Although this mechanism of LOV2 was also utilized for intermolecular light control, [ 128, 129 ] the dramatic conformational change makes this photosensor attractive for intramolecular light-control approaches.

3.2.1 Allosteric Regulation

Building upon studies that show that domain insertion into enzymes can be used for allosteric regulation, [ 130 ] in a pioneering example, LOV domains were used to implement light-control in a similar manner. [ 131 ] The light-induced conformational change of LOV2 is transmitted to the protein into which it is inserted, changing its activity and/or function. Such an engineering approach requires X-ray or NMR protein structures or homology models and detailed structure–function information to preselect candidate sites for insertion positions, which are usually located in surface exposed flexible loops at not conserved residues of the target protein. [ 132 ] An example are OptoNBs, [ 133 ] in which light-induced conformational changes of photosensory domains are transmitted to nanobodies leading to changes in their binding affinities (Figure 4B left).

3.2.2 Steric Regulation

In contrast to allosteric regulation, steric approaches utilize the light-induced conformational changes of a photosensory domain to change the accessibility of functionally important sites of the regulated protein (e.g., active site, regulator binding, or recognition sites). For example, the Jα-helix of LOV2 was successfully modified to incorporate signal peptides of different functions, which upon light-induction are released from the PAS core and only then fulfil their function, for example, nuclear localization, [ 134 ] protein degradation, [ 135 ] or other functional domains [ 136 ] (Figure 4B right).

Although LOV2 is a prominent example for protein conformation based light control, other photoregulators were also used for this type of control. For example Dronpa mutants were employed for light-inducible steric hindering of active sites. [ 137, 138 ] These mutants are dimeric or tetrameric, monomerize with cyan light and revert by either homodimerizing (Dronpa145K/N) or homotetramerizing (Dronpa145N) with UV light. [ 139 ] N- and C-terminal fusion of Dronpa to a protease was used for steric blockage of interaction sites, which is removed with the light-input and monomerization of the photosensor. [ 139 ]


Arabidopsis Chloroplastic Glutaredoxin C5 as a Model to Explore Molecular Determinants for Iron-Sulfur Cluster Binding into Glutaredoxins*

Unlike thioredoxins, glutaredoxins are involved in iron-sulfur cluster assembly and in reduction of specific disulfides (d.h. protein-glutathione adducts), and thus they are also important redox regulators of chloroplast metabolism. Using GFP fusion, AtGrxC5 isoform, present exclusively in Brassicaceae, was shown to be localized in chloroplasts. A comparison of the biochemical, structural, and spectroscopic properties of Arabidopsis GrxC5 (WCSYC active site) with poplar GrxS12 (WCSYS active site), a chloroplastic paralog, indicated that, contrary to the solely apomonomeric GrxS12 isoform, AtGrxC5 exists as two forms when expressed in Escherichia coli. The monomeric apoprotein possesses deglutathionylation activity mediating the recycling of plastidial methionine sulfoxide reductase B1 and peroxiredoxin IIE, whereas the dimeric holoprotein incorporates a [2Fe-2S] cluster. Site-directed mutagenesis experiments and resolution of the x-ray crystal structure of AtGrxC5 in its holoform revealed that, although not involved in its ligation, the presence of the second active site cysteine (Cys 32 ) is required for cluster formation. In addition, thiol titrations, fluorescence measurements, and mass spectrometry analyses showed that, despite the presence of a dithiol active site, AtGrxC5 does not form any inter- or intramolecular disulfide bond and that its activity exclusively relies on a monothiol mechanism.

The atomic coordinates and structure factors (codes 3RHB und 3RHC) have been deposited in the Protein Data Bank, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, Rutgers University, New Brunswick, NJ (http://www.rcsb.org/).

This work was supported, in whole or in part, by National Institutes of Health Grant GM62524 (to M. K. J.). This work was also supported by the Alexander von Humboldt Foundation (to J. P. J.), Agence Nationale de la Recherche Grant JC07_204825 (to J. C. and N. R.), and Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant Di346-14 (to K. J. D.).


Danksagung

I thank Matthew W. Hahn for suggestions on CAFE analysis Tomislav Domazet-Lošo for suggestions on phylostratigraphy analysis Manyuan Long, Yong Zhang, Jie Guo, and anonymous reviewers for comments about this work and Tina Hu for proofreading and improving the manuscript. Especially, I am very grateful to Detlef Weigel and Song Ge for their long-term support and also valuable comments on this work. This work was supported by 100 talents program of Chinese Academy of Sciences and the Max Planck Society.

Tabelle S1. GO annotation of 41 rapidly evolved gene families.

Tabelle S2. Functional annotation of 41 rapidly evolved gene families.

Tabelle S3. Fixation rate of A. thaliana genes or gene families in each phylostratum (genes/duration of interval or gene families/duration of interval).

Tabelle S4. The fraction of A. thaliana genes in each phylostratum that can be annotated to GO biological process.

Tabelle S5. GO annotation of A. thaliana genes in each phylostratum in terms of proportion of major biological processes (%).

Table S6. Protein sizes of A. thaliana genes in each phylostratum.

Table S7. Ausdruck von A. thaliana genes in each phylostratum.

Table S8. Divergences between A. thaliana genes of each phylostratum and their orthologous genes in A. lyrata.

Table S9. Divergence time of each node on the phylogeny of green plants.

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Abstrakt

AINTEGUMENTA-like (AIL) proteins are members of the APETALA 2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR (AP2/ERF) domain family of transcription factors involved in plant growth, development, and abiotic stress responses. However, the biological functions of AIL members in pumpkin (Cucurbita moschata Duch.) remain unknown. In this study, we identified 12 AIL genes in the pumpkin genome encoding proteins predicted to be localized in the nucleus. Phylogenetic analysis showed that the AIL gene family could be classified into six major subfamilies, with each member encoding two AP2/ERF domains separated by a linker region. CmoAIL genes were expressed at varying levels in the examined tissues, and CmoANT genes showed different expression patterns under auxin (IAA), 1-naphthylphthalamic acid (NPA), and abscisic acid (ABA) treatments. Ectopic overexpression of CmoANT1.2 in Arabidopsis increased organ size and promoted growth of grafted plants by accelerating graft union formation. However, there was no significant difference at the graft junction for WT/WT and WT/ANT under IAA or NPA treatments. Taken together, the results of this study provide critical information about CmoAIL genes and their encoded proteins, and suggest future work should investigate the functions of CmoANT1.2 in the grafting process in pumpkin.


Genome-Wide Identification Analysis of the Auxin Response Factors Family in Nicotiana tabacum and the function of NtARF10 in Leaf Size Regulation

Auxin is well recognized for its involvement in several developmental processes like floral and leaf development and shoot elongation. The transcriptional regulation of auxin-responsive genes is mediated via auxin response factors (ARF). In this study, we identified 46 ARF genes in Nicotiana tabacum, performed phylogenetic analysis and investigated their structure, conserved domains, and motifs. Our results demonstrate that some of NtARF genes are regulated by mi-RNAs and expression in multiple tobacco tissues. Additionally, the leaf NtARFs display a diverse expression pattern in vein and shoot apical meristem in response to exogenous auxin stimulus. Transgen NtARF10-overexpressing Arabidopsis plants exhibit larger leave areas, cell area, and more numerous cell numbers compared to wild-type plants and include several upregulated genes involved in cell division and expansion, including AtCYCD3, AtTCP1, AtTCP20, AtXTH33, und AtARGOS. This suggests NtARF10 might play a role in the regulation of leaf size. Our study contributes to a better understanding of the characteristics of the ARF family in tobacco and provides a basis for further functional research into NtARFs.

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Danksagung

We gratefully acknowledge Annette Thelen and the Genomic Technology Support Facility at Michigan State University for valuable assistance with the Affymetrix microarray analysis, Dr Thomas Whittam (Department of Microbiology, Michigan State University) and Dr Arlette Darfeuille-Michaud (Pathogenie Bacterienne Intestinale, Clermont-Ferrand, France) for providing E coli strains, and Dr Thomas Whittam for providing lab space for work with human pathogenic bacteria. Arabidopsis EST clones used for RNA blot hybridization were obtained from the Arabidopsis Biological Resource Center. This work was supported by research grants from the US Department of Energy (DE-FG02-91ER20021) and National Institutes of Health (1R21AI060761-01) to S.Y.H., a postdoctoral fellowship to R.T. from the US Department of Agriculture, a US Department of Education GAANN Graduate Fellowship and a Michigan State University Plant Science Graduate Fellowship to W.U., and funds from the Center of Microbial Pathogenesis at Michigan State University to S. Y. H. and Thomas Whittam.

Abbildung S1. RNA blot analysis of differentially expressed genes identified by microarray analysis.

Abbildung S2. RNA blot analysis of the PAMP-responsive gene Flagellin-Induced Receptor Kinase 1 (FRK1).

Abbildung S3. In planta multiplication of bacterial flagellin mutants.

Abbildung S4. Mapman 'secondary metabolism' and 'photosynthesis' displays created using COR toxin- and TTSS-regulated genes.

Figure S5. Expression profile of genes involved in tryptophan, glucosinolate, and related biosynthetic pathways.

Figure S6. Expression profile of 44 auxin-related genes.

Figure S7. Expression profile of cytokinin-related genes.

Table S1 Non-redundant list of 2800 differentially-regulated Arabidopsis genes identified by microarray analysis

Tabelle S2 736 PAMP-regulated Arabidopsis genes

Tabelle S3 correlation values for the 1 × 10 8 and 5 × 10 7 bacteria mL -1 comparisons

Tabelle S4 Known and predicted kinases induced by PAMP perception

Tabelle S5 275 TTSS-induced Arabidopsis genes identified from the PST COR - vs. PST COR - hrpS comparison (5 × 10 7 bacteria mL -1 , 10 HPI)

Table S6 COR toxin-regulated Arabidopsis genes

Tabelle S7 TTSS-regulated Arabidopsis genes

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Schau das Video: GWAS in a model organism: Arabidopsis thaliana (Dezember 2022).