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Wie kann derselbe Transkriptionsfaktor sowohl Aktivator als auch Suppressor desselben Gens sein?

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Zum Beispiel ist Buckliger in moderaten Konzentrationen ein Aktivator von Kruppel, aber ein Unterdrücker von Kruppel in großen Konzentrationen.

Nach dem, was ich in der Literatur gesehen habe, liegt das daran, dass der Kruppel-Enhancer mehrere Bindungsstellen für den Buckligen hat: einige sind für die Aktivierung verantwortlich, während andere für die Unterdrückung verantwortlich sind. Aber warum binden Bucklige in moderaten Konzentrationen nur an Aktivierungsstellen und warum würden höhere Konzentrationen "seine Präferenzen ändern"? Welcher chemische Mechanismus ist für diese Präferenz verantwortlich?

PS Als Beispiel nenne ich Bucklige und Kruppel, aber dies ist eine allgemeine Frage: Wie könnte derselbe Transkriptionsfaktor sowohl Aktivator als auch Suppressor desselben Gens sein?


Wie kann derselbe Transkriptionsfaktor sowohl Aktivator als auch Suppressor desselben Gens sein? - Biologie

Cyclin F ist ein nicht-kanonisches Cyclin, das Proteine ​​für die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau über die SCF-Familie der E3-Ligasen angreift.

Transkriptionsaktivatoren E2F1, E2F2 und E2F3 sind Substrate des SCF Cyclin F.

Transkriptionelle Repressoren E2F7 und E2F8 sind Substrate sowohl von SCF Cyclin F als auch von APC/C Cdh1.

E2F1 und E2F7/8 und SCF Cyclin F und APC/C Cdh1 regulieren sich gegenseitig über negatives Feedback, was einen komplexen Schaltkreis hervorhebt, der die Transkription des Zellzyklus reguliert.

Die E2F-Familie von Transkriptionsregulatoren sitzt im Zentrum der Zellzyklus-Genexpression und spielt eine wichtige Rolle in normalen und Krebszellzyklen. Während die Kontrolle von E2Fs durch die Retinoblastom-Proteinfamilie gut etabliert ist, ist viel weniger über ihre Regulation durch Ubiquitin-Signalwege bekannt. Jüngste Studien haben die Skp1-Cul1-F-Box-Protein (SCF)-Familie von E3-Ubiquitin-Ligasen mit dem F-Box-Protein Cyclin F im Zentrum der E2F-Regulation, was die zeitliche Proteolyse von Aktivator- und atypischen Repressor-E2Fs demonstriert. Wichtig ist, dass diese E2F-Mitglieder, insbesondere der Aktivator E2F1 und die Repressoren E2F7 und E2F8, einen Rückkopplungskreis an der Kreuzung von Zellzyklus und Zelltod bilden. Darüber hinaus arbeitet Cyclin F in einem reziproken Kreislauf mit der Zellzyklus-E3-Ligase einnaphase-Pherumlaufend CKomplex/Cyclosom (APC/C), das auch E2F7 und E2F8 kontrolliert. Dieser Aufsatz konzentriert sich auf die komplexen Rückkopplungskonturen innerhalb dieser Schaltung und hebt das tiefe Übersprechen zwischen E2F, SCF-Cyclin F und APC/C bei der Regulierung des Oszillators hervor, der menschlichen Zellzyklen zugrunde liegt.


DNA-sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren

Philip E. Auron, in Measurement Immunity, 2005

PRÄZIS

Transkriptionsfaktoren, insbesondere solche, die an spezifische DNA-Sequenzen binden, werden schnell zu einer wichtigen Quelle von Markern für immunologische Prozesse. Obwohl sich Studien zur Hämatopoese traditionell auf die unterschiedliche Expression und Aktivitäten dieser Proteine ​​konzentriert haben, profitieren andere Aspekte der Immunologie und werden von Messungen dieser Moleküle profitieren. Insbesondere die Bedeutung dieser Proteine ​​und der allgemeinen Transkriptionsfaktoren, an denen sie physisch beteiligt sind, sind der Schlüssel zum Verständnis sowohl der normalen biologischen Prozesse als auch der pharmakogenomischen Veränderungen, die als Folge von Krankheiten und therapeutischen Eingriffen auftreten. Es muss jedoch betont werden, dass ein vereinfachter Ansatz zur Messung dieser Faktoren möglicherweise nicht angemessen ist, da viele über die einfache Geninduktion hinaus auf verschiedenen Ebenen reguliert werden.


Nukleare Transkriptionsfaktoren als direkte Regulatoren der mitochondrialen Genexpression

Die nuklearen Transkriptionsfaktoren, die am besten als direkte Regulatoren der mitochondrialen Genexpression in Säugetieren charakterisiert werden, sind die T3 Rezeptor p43, CREB, der Tumorsuppressor p53, Signalwandler und Aktivator der Transkription 3 (Stat3) und der Östrogenrezeptor. p43 und CREB sind Transkriptionsfaktoren, die mitochondriale DNA binden können, um die Genexpression zu regulieren. p53, Stat3 und möglicherweise der Östrogenrezeptor wirken als Co-Regulatoren und beeinflussen die mitochondriale Genexpression durch Protein-Protein-Interaktionen.

Das T3Rezeptor

Das Schilddrüsenhormon T3 ist ein primärer Regulator der mitochondrialen Biogenese von Säugetieren [19] und kann die mitochondriale Funktion sowohl indirekt als auch direkt beeinflussen. In seiner indirekten Rolle bindet es an Mitglieder der nuklearen Rezeptor-Superfamilie von Transkriptionsfaktoren, die als T . bekannt sind3 Rezeptor α und β (T3Rα und T3Rβ), um die nukleäre Gentranskription zu regulieren [20] (Abbildung 3). Zu den nuklearen Transkriptionszielen dieser Rezeptoren gehören Gene, die die mitochondriale Biogenese stimulieren, wie etwa solche, die den Transkriptionsfaktor Nuclear Respiratory Factor 1 (NRF-1) und den Cofaktor PGC-1α kodieren [21, 22] sowie den mitochondrialen basalen Transkriptionsfaktor Tfam [ 23, 24].

Regulierung der mitochondrialen Funktion durch ein Schilddrüsenhormon. Indirekte Regulation: Bindung des Schilddrüsenhormons Trijodthyronin (T3) zum T3 Rezeptor (T3R) führt zur Hochregulierung von Transkriptionsregulatoren der mitochondrialen Biogenese, wie NRF-1 und PGC-1α. NRF-1 und PGC-1α können dann die Transkription der nuklear-kodierten mitochondrialen basalen Transkriptionsmaschinerie (Tfam, Polrmt) hochregulieren, die die mitochondriale DNA (mtDNA)-Replikation und mitochondriale Biogenese stimuliert. Direkte Regulation: Schilddrüsenhormon bindet direkt an zwei mitochondriale Proteine, den Adeninnukleotidtransporter (AdNT) der inneren Mitochondrienmembran und eine verkürzte Version von T3R befindet sich in der mitochondrialen Matrix. T3 reguliert die Expression aus dem mitochondrialen Genom über T3R, das direkt an die mitochondriale DNA binden kann.

T3 reguliert auch die mitochondriale Funktion direkt über zwei Wege: die Regulierung des Nukleotidtransports durch die innere Membran über ein T3-bindender Adeninnukleotidtransporter (AdNT) [25, 26] und Kontrolle der mitochondrialen Transkription über das mitochondrial lokalisierte T3Rα1-Isoform, bekannt als p43 (Abbildung 3 in [27, 28], siehe auch [10]). Die meisten Proteine ​​werden ATP-abhängig in Mitochondrien über den Protein-Translokator-Kanal TOM importiert, der ein aminoterminales mitochondriales Lokalisierungssignal erkennt, das dann beim Import gespalten wird. p43 wird jedoch über einen anderen Weg in die Mitochondrien der Rattenleber importiert, der zuvor für den mitochondrialen Transkriptionsfaktor MTF1 der Hefe [15] gezeigt wurde, der sowohl von TOM- als auch von mitochondrialen ATP-Spiegeln unabhängig ist und nicht zur Spaltung des importierten Proteins führt.

Ein möglicher Mechanismus, durch den Transkriptionsfaktoren genau zwischen verschiedenen Zellkompartimenten sortiert werden könnten, wird bei Betrachtung der T3 Rezeptoren. Es wurde festgestellt, dass ein Proteinkonstrukt, das ein T . nachahmt,3Die Rβ-Isoform mit einem verkürzten Aminoterminus (die in den meisten Nicht-Säugetieren-Vertebraten vorhanden ist) wird spezifisch in isolierte Rattenmitochondrien importiert, was auf eine Rolle für die aminoterminale Verkürzung beim mitochondrialen Import hindeutet [15]. p43 ist selbst eine verkürzte Form des nukleären Volllängen-Transkriptionsfaktors T3Rα und wird von einer alternativen Startstelle im T . übersetzt3Rα-mRNA [15, 29]. Die Expression von p43 wird jedoch unabhängig vom Volllängen-T . reguliert3Rα und zeigt ein ausgeprägtes gewebespezifisches Expressionsmuster [29].

T3 Rezeptoren assoziieren sequenzspezifisch über T . mit nuklearer DNA3-Response-Elemente (T3REs), DNA-Motive, die zuerst in den Promotoren von T . erkannt wurden3-responsive Gene. Im mitochondrialen Genom der Maus wurden mehrere T3REs identifiziert, die in nuklearen Reporterassays eine Reaktion auf Schilddrüsenhormone verleihen, und p43 bindet an diese Sequenzen in vitro in EMSA. Diese Techniken beantworten jedoch nicht die Frage, ob p43 mitochondriale DNA bindet in vivo unter physiologischen Bedingungen. Dies wurde teilweise in einer Reihe von Studien an Ratten mit induzierter Hypothyreose behandelt, in denen physiologische T3 Es wurde festgestellt, dass die Konzentrationen die mitochondriale Genexpression direkt regulieren in vivo. Mitochondrien, die aus den Lebern dieser Ratten isoliert wurden, zeigten, dass Veränderungen der physiologischen Schilddrüsenhormonspiegel die relativen Spiegel von mitochondrialer mRNA und rRNA veränderten, was mit einer veränderten Proteinbesetzung der mitochondrialen D-Schleife korrelierte, wie durch DNA-Fußabdruck bestimmt [30]. Die Unabhängigkeit dieser direkten mitochondrialen Rolle für T3 von der gut charakterisierten indirekten Rolle wurde gezeigt, wenn isolierte Mitochondrien aus hypothyreoten Ratten mit T . behandelt wurden3 und das mitochondriale mRNA:rRNA-Verhältnis und das Muster des DNA-Fußabdrucks kehrten zu dem normaler Ratten zurück [30]. Dies deutete darauf hin, dass T3 reguliert die Mitochondrien direkt und weist darauf hin, dass dieser Weg ein mitochondriales T . beinhalten könnte3 Rezeptor mit ähnlichen Bindungspräferenzen wie die Kernform.

Die Rolle von p43 in T3-vermittelte Regulation der mitochondrialen Transkription wurde unter Verwendung derselben bestätigt im organello System von Ratten mit induzierter Hypothyreose, um zu zeigen, dass die Zugabe von p43 (übersetzt) in vitro um eine mögliche Kontamination durch zelluläre Komponenten zu vermeiden) stimulierte mitochondriale Gentranskription in Gegenwart von T3 [15], während T3 Behandlung in Abwesenheit von p43 stimulierte die mitochondriale Genexpression nicht [15]. Zur Validierung der mitochondrialen Rolle von p43 in vivo, zeigten Mäuse, die p43 unter der Kontrolle eines muskelspezifischen Promotors überexprimierten, eine erhöhte mitochondriale Genexpression und mitochondriale Biogenese im Muskel und hatten einen erhöhten oxidativen Metabolismus, wobei die Körpertemperatur 0,8 °C höher war als bei Kontrollmäusen [31].

Die direkte Regulation der mitochondrialen Transkription durch T3 ist komplex und sehr gewebespezifisch. Im Organello Studien, die die Reaktionsfähigkeit der mitochondrialen Transkription der Leber auf T . zeigen3 zeigen auch, dass Mitochondrien aus dem Herzen nicht auf diese Weise reguliert werden. Vielmehr ist T3 Die Regulierung von Mitochondrien aus den Herzen der Ratten mit induzierter Hypothyreose erfolgt indirekt - über den Zellkern - und hauptsächlich auf der Ebene der Regulierung der mitochondrialen DNA-Kopienzahl [32]. Diese Komplexität wird wahrscheinlich von anderen Transkriptionsfaktoren mit direkter mitochondrialer Aktivität geteilt und könnte erklären, warum frühe Arbeiten keine direkte Bindung eines Proteins an die vorgeschlagenen mitochondrialen T3REs nachgewiesen haben [30], obwohl eine DNA-bindende Domäne in p43 für die beobachtete mitochondriale Funktion [15]. Ungeachtet dieser herausragenden Debatte über den Ort der p43-Bindung an mitochondriale DNA sind die Beweise überwältigend, dass p43 in den Mitochondrien der Rattenleber lokalisiert ist, wo es an das mitochondriale Genom bindet und die mitochondriale Transkription reguliert. In Bezug auf p43 in Mitochondrien muss noch viel untersucht werden – zum Beispiel ist nicht klar, ob dieser Regulationsweg bei Säugetieren konserviert ist oder in welchen anderen Geweben er genutzt wird. Dennoch waren die Studien zu Schilddrüsenhormon und Schilddrüsenhormonrezeptor die erste direkte Illustration, dass die mitochondriale Genexpression unabhängig von der nuklearen Genexpression reguliert wird und stellten ein Schlüsselmodellsystem für die Untersuchung nuklearer Transkriptionsfaktoren in Mitochondrien dar.

Cyclic-AMP-Response-Element-Bindungsprotein (CREB)

Der Transkriptionsfaktor CREB reguliert die nukleäre Genexpression als Reaktion auf verschiedenste Reize [33, 34]. CREB wird durch Phosphorylierung aktiviert, entweder durch die auf zyklisches AMP reagierende Proteinkinase A (PKA) oder durch andere Kinasen, einschließlich Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) und Ca 2+ /Calmodulin-abhängige Kinasen (CaMKs) [35]. In Mitochondrien existiert ein eigenständiger CREB-Weg, der PKA [36], zyklisches AMP [37] und CREB [38] umfasst. Bei Stimulation induziert dieser Weg die Bindung von phosphoryliertem CREB an cyclische-AMP-Response-Elemente (CREs) in der mitochondrialen DNA-D-Schleife und die Regulierung der mitochondrialen Genexpression [39, 40] (Abbildung 1).

CREB wurde zuerst durch subzelluläre Fraktionierung, gefolgt von Immunelektronenmikroskopie, in den Mitochondrien des Rattenhirns lokalisiert [38]. Obwohl kein klassisches mitochondriales Lokalisierungssignal vorhanden ist, hängt der Transport von markiertem CREB in isolierte Rattenlebermitochondrien vom mitochondrialen Translokator TOM ab, dem Importweg für die meisten Proteine ​​in die Mitochondrien [39]. Der mitochondriale Pool von CREB kann mit dem Chaperonprotein mtHSP70 co-immunpräzipitieren [40], was auf einen Mechanismus der Ansteuerung der Mitochondrien hindeutet, der eher von Chaperonproteinen als von einem mitochondrialen Lokalisierungssignal abhängig ist, wie für p53 gezeigt wurde [41]. In den Mitochondrien wird CREB durch Phosphorylierung als Reaktion auf die gleichen Reize wie im Zellkern reguliert, und in vitro können Oligonukleotide binden, die die Konsensus-CRE-Sequenz tragen [38]. Die Bindung von CREB an die mitochondriale D-Schleife (Abbildung 1) wurde nachgewiesen in vivo unter Verwendung von ChIP [36] und DNase-Footprinting und ist abhängig von der mitochondrialen PKA-Aktivität [40, 41]. Im Gegensatz zu p43 wurde die mitochondriale Lokalisation von CREB in mehreren Säugetierarten und -geweben identifiziert [36, 38, 39].

Ein Überexpressionskonstrukt, das die CREB-Spiegel in Mitochondrien selektiv erhöht, wurde verwendet, um die nuklearen und mitochondrialen regulatorischen Rollen von CREB in primär kultivierten Neuronen vom Rattenhirn zu unterscheiden [40]. Diese Zunahmen des mitochondrialen CREB störten die mitochondriale Genexpression, ohne die Expressionsniveaus des nuklearen Ziels von CREB zu verändern, c-fos [40]. Die mRNAs der mitochondrial kodierten NADH-Dehydrogenase-Untereinheiten 2, 4 und 5 (Abbildung 1) wurden dagegen spezifisch hochreguliert, diese mRNAs wurden bei Behandlung mit einer dominant-negativen Form von CREB in den Mitochondrien herunterreguliert [40].

Tumorsuppressorprotein p53

Das Tumorsuppressorprotein p53 ist ein bekanntes Beispiel für einen nuklearen Transkriptionsfaktor mit einer Rolle in Mitochondrien [42]. Zuerst durch seine transkriptionale Regulationsfunktion identifiziert [43], hat p53 auch nicht-transkriptionelle Funktionen und wurde mit Apoptose [44], Seneszenz [45], Autophagie [46], DNA-Schadensreparatur und Zellzyklusarrest in Verbindung gebracht [47 ].

In Mitochondrien reguliert p53 direkt die Apoptose über Protein-Protein-Interaktionen an der äußeren Membran, und diese Funktion wurde an anderer Stelle gründlich untersucht [48, 49]. Es gibt jedoch erhebliche Hinweise auf eine zweite mitochondriale Rolle von p53, bei der mitochondrialen DNA-Erhaltung und bei der mitochondrialen DNA-Schadensreparatur. Die Co-Immunpräzipitation von p53 mit der mitochondrionspezifischen Transkription und dem mitochondrialen DNA-Packungsfaktor Tfam legt nahe, dass p53 die Reparatur von DNA-Schäden in Mitochondrien [50] regulieren kann, ebenso wie im Zellkern [51, 52]. In KB-Epidermoid-Krebszellen und in HCT116-Adenokarzinomzellen interagiert p53 physikalisch mit Tfam, mit der Wirkung, die Bindung von Tfam an Cisplatin-geschädigte DNA auf Kosten oxidierter DNA zu verstärken, was das normale Bindungsmuster von Tfam umkehrt [50] .

p53 scheint auch eine Rolle bei der mitochondrialen Basenexzisionsreparatur zu spielen. In einem kernfreien in vitro aus den Mitochondrien der Mausleber abgeleitetes System kann p53 die lückenfüllende Funktion der mitochondrialen DNA-Polymerase mtPOLγ stimulieren [53]. Eine physikalische Wechselwirkung zwischen p53 und mtPOLγ in vivo wurde in HCT116-Zellen nachgewiesen [54], wo p53 die Replikationsfunktion von mtPOLγ verstärkt und mit dem mitochondrialen Genom interagiert. Die beobachtete Bindung von p53 an das mitochondriale Genom wurde durch DNA-Schädigung stimuliert, aber nicht davon abhängig, was darauf hindeutet, dass die Rolle von p53 an der mitochondrialen DNA möglicherweise nicht auf die DNA-Schadensantwort beschränkt ist. Darüber hinaus scheint in Studien, in denen Mitochondrien aus p53-defizienten Zelllinien mit denen aus isogenen p53-positiven Linien verglichen wurden, p53 eine endogene Korrekturlesefunktion für mtPOLγ während der mitochondrialen DNA-Replikation bereitzustellen [55].

Trotz der klaren Lokalisierung von p53 in der mitochondrialen Matrix und einer Reihe direkter Assoziationen mit mitochondrialer DNA bleibt der Beweis, dass p53 sequenzspezifisch binden kann, um die Expression von mitochondrial kodierten Genen zu regulieren, schwer fassbar. Sequenzen aus dem mitochondrialen Genom der Maus, die dem nuklearen Bindungsmotiv von p53 ähneln, verleihen p53-Reaktionsfähigkeit in nuklearen Reporterassays [56], aber es gibt keinen Hinweis darauf, dass p53 die Transkription aus dem mitochondrialen Genom reguliert. Unabhängig davon, ob p53 die mitochondriale Transkription direkt reguliert, spielt es wichtige mitochondriale Rollen bei der Apoptose, der DNA-Integrität und der Reaktion auf Stress.

Signalgeber und Aktivator der Transkription 3 (Stat3)

Stat3 wurde erstmals in Mitochondrien aufgrund seiner funktionellen Assoziation mit GRIM-19 nachgewiesen, einer Untereinheit der respiratorischen Elektronentransportkette NADH Dehydrogenase (Komplex I), die beim Transfer von Elektronen von NADH zur Atmungskette fungiert [57, 58]. Im Zellkern vermittelt Stat3 die Transkriptionsantwort auf Wachstumsfaktoren wie Interleukin-6 und Epithelwachstumsfaktor [59]. Unterschiede zwischen der Funktion von Stat3 in den Mitochondrien und im Zellkern werden durch die Tatsache veranschaulicht, dass der mitochondriale Pool von Stat3 die onkogene Transformation durch die kleine GTPase H-Ras vermittelt, ein Prozess, der sich mechanistisch davon unterscheidet, wie nukleäres Stat3 die onkogene Transformation durch das virale Onkogen v- Src [60]. Sowohl Stat3-Knockdown-Zelllinien als auch Stat3-Knockout-Mäuse zeigen eine gestörte Elektronentransportkettenfunktion [61], was darauf hindeutet, dass Stat3 die mitochondriale Funktion über seine Auswirkungen auf die Elektronentransportkette direkt reguliert. Gentechnisch veränderte mutierte Stat3-Proteine ​​haben gezeigt, dass die nukleare Rolle und die mitochondriale Rolle funktionell isoliert werden können [61].

Der Östrogenrezeptor

Der Östrogenrezeptor lokalisierte sich erstmals 2001 in den Mitochondrien von Kaninchenuterus und -eierstock [62]. Dieser Rezeptor reguliert die Genexpression durch Bindung an Östrogen-Response-Elemente (EREs) in Genpromotoren nach der Bindung des Steroidhormons Östrogen an den Rezeptor [63]. Nukleare Ziele umfassen NRF-1, das, wie bereits erwähnt, einen Transkriptionsfaktor kodiert, der die mitochondriale Biogenese stimuliert und ein Transkriptionsregulator von Genen ist, die für die mitochondriale basale Transkriptionsmaschinerie kodieren [64] (Abbildung 2). Die indirekte Regulation der mitochondrialen Funktion durch die Wirkung des Östrogenrezeptors wurde an anderer Stelle untersucht [65, 66].

Es gibt Hinweise darauf, dass Östrogen auf zwei Wegen direkt in den Mitochondrien wirkt: einer unter Nutzung des Rezeptors und der andere unabhängig davon [27, 67, 68]. Das Vorhandensein des Östrogenrezeptors in Mitochondrien ist gut etabliert, beide Isoformen, ERα und ERβ, lokalisieren an Mitochondrien in verschiedenen Zelllinien und Geweben, doch ihre Funktionen bleiben umstritten. EMSAs legen nahe, dass ERβ direkt an die D-Schleife des mitochondrialen Genoms in MCF-7-Brustkrebszellen binden könnte (Abbildung 1). Diese Bindung wurde durch Behandlung der Zellen mit Östrogen stimuliert und durch Behandlung mit ERβ-spezifischen Antikörpern gehemmt [69]. Es wurde jedoch nicht gezeigt, dass isolierte Mitochondrien auf eine Östrogenbehandlung ansprechen, indem sie die Genexpression in einer ERβ-abhängigen Weise verändern.

Andere mutmaßliche Funktionen des mitochondrialen Östrogenrezeptors haben sich auf Protein-Protein-Interaktionen konzentriert, die unter Verwendung eines bakteriellen Zwei-Hybrid-Screens identifiziert wurden. Dieser Screen zeigte, dass ERα stabil und reproduzierbar mit dem mitochondrialen Protein 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 10 interagieren kann, was auf eine Rolle des mitochondrialen ERα bei der Regulierung des zellulären Steroidmetabolismus und der Reaktion hinweist [70].

Da Krebs zum Teil eine Stoffwechselerkrankung ist [71] und sowohl in Primärtumoren als auch in Krebszelllinien veränderte mitochondriale DNA-Sequenz und Transkriptionsniveaus beobachtet wurden [72, 73], wäre eine mitochondriale Rolle des Östrogenrezeptors für beide relevant Östrogenrezeptorbiologie und die Erforschung von hormonsensitivem Brustkrebs. Wie bei anderen nuklearen Faktoren ist jedoch die indirekte Wirkung des Östrogenrezeptors auf die mitochondriale Genexpression ein Störfaktor, der die Untersuchung erschwert. Darüber hinaus scheint Östrogen, wie oben erwähnt, die Mitochondrien direkt zu regulieren, selbst in Abwesenheit seines Rezeptors [68]. Die Uneinigkeit über die Rolle der mitochondrialen Östrogenrezeptoren könnte teilweise auf zellspezifische Funktionen zurückzuführen sein. Dennoch sind Mitochondrien eindeutig ein wichtiges Ziel der Östrogenhormonwirkung.

Andere Transkriptionsfaktoren

Obwohl nur eine kleine Anzahl von nuklearen Transkriptionsfaktoren eine mitochondriale Rolle validiert hat, entweder in einem nukleusfreien im organello -System oder durch Nachweis der Bindung an das mitochondriale Genom gibt es eine Reihe von nuklearen Transkriptionsfaktoren, die in Mitochondrien lokalisiert sind, deren mitochondriale Rolle jedoch noch zu wenig erforscht ist. Der Glucocorticoid-Rezeptor [74], der heterodimere Transkriptionsfaktor AP-1 [75] und der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor γ (PPARγ) [76] wurden alle in Mitochondrien von Säugetieren nachgewiesen, und es gibt einige Hinweise auf den Glucocorticoid-Rezeptor [ 77] und AP-1 [78] binden an das mitochondriale Genom, um möglicherweise die Genexpression zu regulieren.


Wie kann derselbe Transkriptionsfaktor sowohl Aktivator als auch Suppressor desselben Gens sein? - Biologie

Zelluläre Signalantwortwege weisen oft eine Bow-Tie-Topologie auf 1, 2: Mehrere stromaufwärts gelegene Stresssignale konvergieren auf einem einzigen gemeinsamen Transkriptionsfaktor, von dem angenommen wird, dass er verschiedene stromabwärts gelegene Genexpressionsprogramme induziert (Abbildung 1A). Wenn jedoch mehrere verschiedene Signale denselben Transkriptionsfaktor aktivieren, kann dann jedes Signal eine spezifische Genexpressionsantwort induzieren? Eine wachsende Zahl von Literatur unterstützt eine temporale Kodierungstheorie, bei der Informationen über Umweltsignale zumindest teilweise in der zeitlichen Dynamik des gemeinsamen Transkriptionsfaktors 1, 2 kodiert werden können. Im Fall des knospenden Hefetranskriptionsfaktors Msn2 beispielsweise verschiedene Belastungen induzieren unterschiedliche Msn2-Aktivierungsdynamiken: Msn2 zeigt eine pulsierende Kernaktivierung mit dosisabhängiger Frequenz unter Glukoselimitierung, aber anhaltende Kernaktivierung mit dosisabhängiger Amplitude unter oxidativem Stress [3]. Diese dynamischen Muster können dann zu unterschiedlichen Genexpressionsreaktionen führen 3, 4, 5, aber es ist nicht bekannt, wie viel Spezifität erreicht werden kann. Daher ist eine Hauptfrage dieser temporalen Kodierungstheorie, wie viele Genantwortprogramme oder zelluläre Funktionen durch dynamische Kontrolle eines einzelnen Transkriptionsfaktors robust kodiert werden können. Hier liefern wir den ersten direkten Beweis dafür, dass es möglich ist, einfach durch die Regulierung der Aktivierungsdynamik eines einzelnen Transkriptionsfaktors bevorzugt vier verschiedene Genexpressionsprogramme zu induzieren.


Transkriptionsfaktor

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Transkriptionsfaktor, Molekül, das die Aktivität eines Gens steuert, indem es bestimmt, ob die DNA (Desoxyribonukleinsäure) des Gens in RNA (Ribonukleinsäure) transkribiert wird. Das Enzym RNA-Polymerase katalysiert die chemischen Reaktionen, die RNA synthetisieren, wobei die DNA des Gens als Vorlage verwendet wird. Transkriptionsfaktoren steuern, wann, wo und wie effizient RNA-Polymerasen funktionieren.

Transkriptionsfaktoren sind für die normale Entwicklung eines Organismus sowie für routinemäßige Zellfunktionen und die Reaktion auf Krankheiten von entscheidender Bedeutung. Transkriptionsfaktoren sind eine sehr vielfältige Familie von Proteinen und wirken im Allgemeinen in Proteinkomplexen mit mehreren Untereinheiten. Sie können direkt an spezielle „Promotor“-Regionen der DNA binden, die stromaufwärts der kodierenden Region in einem Gen liegen, oder direkt an das RNA-Polymerase-Molekül. Transkriptionsfaktoren können die Transkription eines Gens aktivieren oder unterdrücken, was im Allgemeinen ein Schlüsselfaktor dafür ist, ob das Gen zu einem bestimmten Zeitpunkt funktioniert.

Basale oder allgemeine Transkriptionsfaktoren sind für die Funktion der RNA-Polymerase an einer Transkriptionsstelle in Eukaryoten notwendig. Sie gelten als die grundlegendsten Proteine, die zur Aktivierung der Gentranskription benötigt werden, und sie umfassen eine Reihe von Proteinen, wie unter anderem TFIIA (Transkriptionsfaktor II A) und TFIIB (Transkriptionsfaktor II B). Bei der Definition der Rollen, die jedes der Proteine ​​spielt, die den basalen Transkriptionsfaktorkomplex bilden, wurden wesentliche Fortschritte erzielt.

Während der Entwicklung vielzelliger Organismen sind Transkriptionsfaktoren dafür verantwortlich, das Schicksal einzelner Zellen zu bestimmen. Zum Beispiel kontrollieren homöotische Gene das Muster der Körperbildung, und diese Gene kodieren Transkriptionsfaktoren, die Zellen anweisen, verschiedene Teile des Körpers zu bilden. Ein homöotisches Protein kann ein Gen aktivieren, aber ein anderes unterdrücken, was komplementäre und für die geordnete Entwicklung eines Organismus notwendige Wirkungen hervorruft. Tritt eine Mutation in einem der homöotischen Transkriptionsfaktoren auf, entwickelt sich ein Organismus nicht richtig. Zum Beispiel bei Fruchtfliegen (Drosophila) führt die Mutation eines bestimmten homöotischen Gens zu einer veränderten Transkription, die zum Wachstum von Beinen am Kopf anstelle von Antennen führt. Dies wird als Antennapedia-Mutation bezeichnet.

Transkriptionsfaktoren sind ein üblicher Weg, mit dem Zellen auf extrazelluläre Informationen wie Umweltreize und Signale von anderen Zellen reagieren. Transkriptionsfaktoren können bei Krebs eine wichtige Rolle spielen, wenn sie die Aktivität von Genen beeinflussen, die am Zellzyklus (oder Zellteilungszyklus) beteiligt sind. Darüber hinaus können Transkriptionsfaktoren Produkte von Onkogenen (Genen, die Krebs verursachen können) oder Tumorsuppressorgenen (Genen, die Krebs in Schach halten) sein.


Transkriptionsfaktor-Stöchiometrie bei der Bestimmung des Zellschicksals

Transkriptionsfaktoren spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Bestimmung des Zellschicksals. Es gibt viele zellspezifische Transkriptionsfaktoren, die bei ektopischer Expression zu einer Umwandlung oder Transdifferenzierung des Zellschicksals führen können. Viele dieser Transkriptionsfaktoren funktionieren je nach Niveau und Stöchiometrie unterschiedlich. Viele verschiedene Typen von differenzierten Zellen wurden aus anderen differenzierten Zelltypen durch Expression unterschiedlicher Spiegel und Stöchiometrie von Reprogrammierungsfaktoren erzeugt. Viele Methoden wurden für eine effiziente Umwandlung des Zellschicksals entwickelt, indem die Spiegel und die Stöchiometrie von Transkriptionsfaktoren in einem bestimmten Cocktail mit therapeutischen Werten reguliert werden. Ein Ansatz namens phänotypische Aktivierung, der die Überexpression von mutmaßlichen Transkriptionsfaktoren beinhaltet, wurde als Werkzeug entwickelt, um neue Transkriptionsfaktoren und ihre Ziele zu entdecken. Die Überexpression des Transkriptionsfaktors kann auch toxische Wirkungen haben, wobei unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen und „Squelching“ zur Hemmung vieler Gene führen können. Veränderte Werte von Transkriptionsfaktoren können katastrophale Folgen wie Krebs haben. Jüngste Entwicklungen wie das Design künstlicher Transkriptionsfaktoren, nanotechnologiebasierter Transkriptionstools und CRISPR-basierter Transkriptionsmodule mit Fähigkeiten zur präzisen Regulation von Genexpressionsmustern bergen ein enormes Potenzial im Bereich der Transkriptionstherapeutika.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


Materialen und Methoden

Zelllinien und Plasmide

Der LS174T/W4, LS174T/dnTCF4, LS174T/siβCAT, SW480/ADH, HCT8/S11 und HCT116-SMAD4 -/- wurden freundlicherweise von anderen Forschern zur Verfügung gestellt, wie in den Ergänzenden Methoden beschrieben. Andere in dieser Studie verwendete Zelllinien (LIM2405, HCT116, RKO, SK-CO-1, SW837 und HEK293T) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) erhalten. Alle verwendeten Plasmide sind in den Supplementary Methods beschrieben.

Luciferase-Reporter-Assays

Renilla Luciferase (pRL-TK Promega, Madison, WI, USA) wurde als Kontrolle für die Transfektionseffizienz in Luciferase-Reporterassays unter Verwendung des Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) verwendet.

Western Blot und RHOA Aktivitätsbestimmung

Die GTP-gebundenen RHOA-Spiegel und Western-Blotting wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Rodrigues et al., 2014). Die verwendeten Antikörper sind in den Ergänzenden Methoden beschrieben.

CpG-Insel-Methylierungsassays und Microarray-Analyse

Der DNA-Methylierungsstatus in der 1145 bp CpG-Insel, die sich im Promotor von befindet RHOA wurde an Dickdarmkrebszelllinien durch methylierungsspezifische PCR (MSP-PCR), Bisulfit-Sequenzierung und HumanMethylation27 Beadchips (Illumina, San Diego, CA, USA) untersucht. Die relativen mRNA-Spiegel wurden durch Microarray-Analyse (HG-U133 Plus 2.0 Chips Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) bestimmt, wie bereits berichtet (Bazzocco et al, 2015).

Tierversuche

C57BL/6J-Apc Mindest /J-Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Stock No: 002020, Bar Harbor, ME, USA) erhalten. Alle Tierversuche wurden nach Protokollen durchgeführt, die von der Ethikkommission für Tierversuche von Vall d’Hebron genehmigt wurden.

Immunhistochemie und quantitative RT-PCR

Über die Expression von RHOA und SMAD4 in kolorektalen Dukes-C-Tumoren wurde bereits früher berichtet (Alazzouzi et al., 2005 Arango et al., 2005). Die Gesamt-RNA wurde revers transkribiert und die relativen Mengen der angegebenen Gene wurden durch Echtzeit-PCR unter Verwendung von SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) bestimmt. Alle verwendeten Primer sind in den Ergänzenden Methoden aufgeführt.

ChIP-Assay

Die RKO-Zellen wurden 24 h mit 1 . behandelt μ M JQ1 (oder Vehikel DMSO) und mit Formaldehyd fixiert (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Zellpellets wurden in Nuklei-Lyse-Puffer resuspendiert und mit einem Bioruptor-Instrument (Diagenode, Lüttich, Belgien) beschallt. Dann 200 μg des geklärten Überstands wurden mit anti-SP1-Antikörper (Millipore 07-645, Burlington, MA, USA) oder unspezifischem Kaninchen-IgG immunpräzipitiert. Nach dem Waschen wurden die Proben mit Proteinase K behandelt und DNA gewonnen (Qiagen PCR-Produktreinigungskit, Hilden, Deutschland). Relatives Niveau von RHOA, p21 und eine Negativkontrolle (Genwüste auf Chromosom 12) wurden durch Real-Time-PCR quantifiziert, wie in den Ergänzenden Methoden beschrieben.


Abstrakt

Es wird allgemein angenommen, dass Veränderungen in den Mustern der Genexpression vielen der phänotypischen Unterschiede innerhalb und zwischen Arten zugrunde liegen. Obwohl viel Wert auf Veränderungen der Transkriptionsregulation gelegt wurde, wird die Genexpression auf vielen Ebenen reguliert, die letztendlich alle zusammen untersucht werden müssen, um ein vollständiges Bild der Evolution der Genexpression zu erhalten. Hier vergleichen wir die Evolution der transkriptionalen Regulation und der posttranskriptionalen Regulation, die durch microRNAs vermittelt wird, eine große Klasse kleiner, nicht-kodierender RNAs in Pflanzen und Tieren, wobei wir uns auf die Evolution der einzelnen Regulatoren und ihrer Bindungsstellen konzentrieren. Als ersten Schritt zur Integration dieser Mechanismen in ein einheitliches Gerüst schlagen wir ein einfaches Modell vor, das die transkriptionelle Regulation neuer microRNA-Gene beschreibt.


Identifizierung von Schlüsselgenmodulen und Transkriptionsfaktoren für die menschliche Arthrose durch gewichtete Gen-Co-Expression-Netzwerkanalyse

Urheberrecht: &Kopie Gao et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird.

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Abstrakt

Einführung

Osteoarthritis (OA) ist eine der häufigsten Gelenkerkrankungen und wird bis 2040 als die häufigste Ursache für Behinderungen bei Patienten im Alter von über 40 Jahren vorhergesagt (1). Eine Studie hat gezeigt, dass die wirtschaftliche und humanistische Belastung durch OA weltweit hoch ist (2). Ein Patient mit OA präsentiert sich typischerweise mit Knorpeldegeneration und Synovialentzündung (3). Klinisch ist die Arthrose durch Schmerzen, Schwellungen, Gelenkdeformitäten und Behinderungen gekennzeichnet (4). Die häufigsten pharmakologischen Therapien der OA sind neben der operativen Behandlung schmerzstillende und nichtsteroidale Antirheumatika (5). Although a considerable amount of studies investigating OA have been published (6), a systematic understanding of the pathogenesis of OA and its potential therapeutic targets would be of great clinical significance.

With the development of high-throughput genomics technology, gene expression profiles obtained from microarrays have been extensively used to explore and examine genes associated with the progression of various diseases, including the pathogenesis of OA (7,8). However, these studies may have been more relevant if they had considered the correlation of the expression between multiple genes, rather than just focused on the screening of differentially expressed genes (DEGs). Based on the idea that genes with similar expression patterns may be functionally associated, a novel biological methodology, weighted gene co-expression network analysis (WGCNA), has been developed (9). Based on WGCNA, complex microarray data may be simplified into several functional modules, which are composed of co-expressed genes. Subsequently, hub modules may be identified through the associations between modules and clinical traits. Due to the limited access to normal cartilage to serve as control groups, the majority of Bioinformatics studies are focused on knee synovial tissue. However, to the best of our knowledge, WGCNA has not been previously applied to analyze the cartilaginous expression profiles of OA.

The primary objective of the present study was to obtain data which will aid in providing a more detailed understanding of the pathogenesis of OA. The methodological approach taken in the present study is a mixed methodology based on WGCNA and the screening of DEGs. Microarray data with the accession number GSE114007 were downloaded in the present study, which were subjected to Bioinformatics analysis with the attempt to identify hub genes from a protein-protein interaction (PPI) network, and construct a co-expression network through WGCNA in order to identify hub modules associated with the pathogenesis of OA. Considering that the co-expressed genes in the same module may participate in the same biological function or signaling pathway, and from the point of view of co-expressed genes having the potential to be regulated by the same transcription factors (TFs), the present study attempted to identify key TFs involved in the pathogenesis of OA (10,11).

Materialen und Methoden

Datensammlung

The dataset GSE114007 [deposited by Fisch et al (11)], which is based on the Illumina HiSeq 2000 and Illumina HiSeq 500 platforms (Illumina, Inc.), was downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) (12). The GSE114007 dataset was selected for analysis as it contained the complete information comprising gene expression data and detailed clinical data in this database. RNA-sequencing (RNA-seq) was performed on 18 normal and 20 OA human knee cartilage tissues. Subsequently, the gene expression data were subjected to identical processing using the Robust Multichip Average function within the limma R package (version 3.24.15) (13) for background correction, log2 transformation, quantile normalization and median polish algorithm summarization. The microarray data probe was transformed to gene symbols with Bioconductor Annotation Data software packages (version 1.20.0) (14). In the case that 1 single gene symbol was captured by several probes, the final gene expression level was calculated from the average value of those probes. When one probe was mapped to multiple gene sets, information about the probe was deleted. A principal component analysis (PCA) of normalized data was performed in the present study using the prcomp algorithm in R software. PCA was used for unsupervised multivariate analyses in order to determine the directions of maximum covariance without referring to class labels (Normal/OA).

Identification of DEGs

The DEGs between OA and normal samples were identified through the limma R package using the Student's t-test (13). A |Log 2 (fold change)|>1 and adjusted P-value of <0.05 were set as the cut-off criteria. To control the false discovery rate, adjusted P-values were computed for multiple testing corrections of the raw P-value through the Benjamini-Hochberg (BH) method (15). Volcano plots were also constructed to visually display the DEGs. DEGs were counted in the respective hub modules.

Weighted co-expression network construction

WGCNA is a widely used systems biology method, which may be used to construct a scale-free network from gene expression data. Based on the dataset GSE114007, which is comprised of 18 normal and 20 OA samples, a gene co-expression network was constructed through the WGCNA R package (version 1.68) (9). In order to determine whether there were any outlier samples, the present study performed sample clustering according to the distance between different samples in Pearson's correlation matrices. The correlation coefficient between genes ‘m’ and ‘n’ was defined as s m,n =|cor(m,n)|, with the gene expression correlation matrix being S=[s mn ]. The correlation matrix was subsequently translated into an adjacency matrix, A=[a mn ], through a power function a mn =|s mn | β . β was defined as the soft threshold parameter. The β-value was selected as long as scale-free topology fit index (R 2 ) reached 0.9. The adjacency matrix was then transformed into a topological overlap matrix (TOM) through the following algorithm:

l mn indicates the product sums of the adjacency coefficients of the nodes connected to both m and n. αmn indicates the correlation coefficient between m and n. km indicates the sum of the adjacency coefficients of the nodes only connected to m. kn indicates the sum of the adjacency coefficients of the nodes only connected to n. Co-expressed gene modules were identified by the dynamic tree cut method, which performs adaptive branch pruning based on various criteria, including a minimum cluster size of 30 genes and a cut height of 0.25. Modules with highly correlated genes were detected and genes exhibiting weaker connectivity were left unassigned. Hierarchical clustering was used to produce a dendrogram of genes based on the corresponding dissimilarity of TOM, and to classify genes with similar expression patterns into gene modules. The module eigengene (ME) was calculated using the MEs function in the ‘WGCNA’ R package. Finally, hub modules were detected based on the correlation between ME and clinical traits. The correlation values >0.6 were set as cutoff criteria.

PPI network construction and identification of hub genes

The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes (STRING) database (http://www.string-db.org/ version 11.0) was used for the construction of the protein-protein interaction (PPI) network for DEGs and hub modules using default parameters in the STRING database. The types of connection included the following items: Textmining, Experiments, Databases, Co-expression, Neighborhood, Gene fusion and Co-occurrence. To extract valid interactions, a confidence score of >0.4 was set as the cut-off criterion. The nodes in the PPI network with the highest degrees of interactions were considered as hub proteins. The present study also used the Cytoscape plugin CytoHubba to calculate the degree of each node in the PPI network (version 1.5) (16). The top 10 genes in each module and top 10 DEGs were defined as hub genes. In addition, OA-associated genes were downloaded from Junior Doc (http://www.drwang.top/). By entering ‘OA’ in the search tool, 520 OA-associated genes were listed and downloaded. Finally, OA-associated genes were counted in the respective hub modules.

Functional enrichment analysis of DEGs and hub modules

To determine the DEGs and hub modules involved in BP terms and pathways, Gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analyses were performed using the ClusterProfiler R package (version 3.8.1) (17). An adjusted P-value <0.01 (to control the false discovery rate, adjusted P-values were computed for multiple testing corrections of the raw P-value through the BH method) was set as the cutoff criterion for the functional enrichment analysis.

Identification of key TFs

CisTargetX may be used to predict TFs involved in the regulation of co-expressed genes (18,19). Based on CisTargetX, the present study further explored the potential TFs for each hub module. CisTargetX was used with the following parameters: Mapping of genes in regions, ‘10 kb upstream, transcription start site, 10 kb downstream’ minimum fraction of overlap, ‘0.4’ normalized enrichment score threshold, ‘4’ receiver operating characteristic threshold for area under the curve calculation, ‘0.005’. Key TFs of each hub module were defined as predicted TFs, which were also DEGs in the present study. Common elements in DEGs and predicted TFs were compared using Microsoft Excel (version 14.5.1 Microsoft Corporation). By comparing the genes targeted by key TFs with DEGs, the DEGs that were targeted by the key TFs were counted and extracted for further study.

Identification of pivotal signaling pathways

To provide a deeper understanding of changes in gene regulation underlying OA, information on key TFs likely involved in regulating these DEGs was extracted. KEGG analysis was subsequently performed for key TFs and their target DEGs in order to identify pivotal signaling pathways. Based on STRING database and the pheatmap R package (https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html version 1.0.12), a PPI network (confidence score >0.4 set as the cut-off criterion) and heatmap were constructed for key TFs and their target DEGs that were involved in key signaling pathways. The transcriptional regulatory network was visualized by Cytoscape.

Ergebnisse

Identification of DEGs

To estimate false-positives, the procedure was performed using randomized versions of the sample labels and the outcomes were compared with the original results based on PCA (Fig. 1A) (20). PCA revealed clear differences between the normal and OA samples. Sample clustering revealed that no samples required removal from subsequent analysis due to outliers (Fig. 1B). With an adjusted P-value <0.05 and |log2fold change|>1 as the cut-off criteria, a total of 1,898 genes were identified to be differentially expressed between OA samples and normal samples, of which 966 were upregulated (Table SI) and 932 were downregulated (Table SII). The DEGs are highlighted in the volcano plot (Fig. S1). As illustrated in Fig. S2, unsupervised hierarchical clustering analysis of the obtained DEGs was able to distinctly classify all samples into normal and OA groups.

Abbildung 1.

PCA and sample clustering. (A) PCA based on PC1 (proportion of contribution, 59.3%) and of PC2 (proportion of contribution, 23.1%) indicated a different distribution of normal and osteoarthritis samples. (B) Sample clustering indicated that no outliers were present that required removal from the subsequent analysis. FC, fold change PCA, principal component analysis.

Weighted co-expression network construction

A weighted co-expression network was constructed using the ‘WGCNA’ R package. Construction of an appropriate scale-free network required an optimal soft-thresholding power to which co-expression similarity was raised to calculate adjacency. The analysis of network topology was performed for various soft-thresholding powers in order to obtain a relatively balanced scale independence and mean connectivity of the WGCNA (9). In Fig. 2A, the scale-free topology fitting index (R 2 , y-axis) is presented as a function of the soft-thresholding power (x-axis) in the left panel, while the right panel displays the mean connectivity (degree, y-axis) as a function of the soft-thresholding power (x-axis). Red Arabic numbers in the panels denote different soft-thresholds. The red line in the left panel indicates R 2 =0.9. There was a trade-off between maximization of the scale-free topology model fitting index (R 2 ) and maintenance of a high mean number of connections. Thus, β was set as 9. Subsequently, co-expressed gene modules were identified by the dynamic tree cut method, and each of the modules was marked by a color, indicated in the color band below the dendrogram (Fig. 2B). Genes that were not assigned to any of the modules were colored in grey. A total of 24 modules were identified in the GSE114007 dataset (Fig. 3), of which 5 modules were identified as hub modules based on the correlation coefficients between the ME and traits (>0.6). The genes in each module are listed in Table SIII. The purple, salmon, black, brown and magenta modules were close to ‘OA’ traits. Among them, the purple, black and brown modules were also close to ‘age’ traits. Previous studies have concluded that females are more susceptible to OA than males (21). However, the present study did not identify any modules that were closely associated with ‘sex’ traits. Detailed information of hub modules is listed in Table I.

Figur 2.

Weighted gene co-expression network construction. (A) Analysis of the scale free topology module fit and the mean connectivity for different soft-thresholding powers (β). The red line in the left panel indicates R2=0.9. (B) Gene dendrogram obtained from hierarchical clustering. The row of colored bars below the dendrogram represents the module assignment identified by the dynamic tree cut.

Figur 3.

Module-trait matrixes were identified based on the correlation between clinical traits and ME. The number on the left of each cell illustrates the corresponding correlation coefficient and the number in bracket on the right is the P-value. High correlation coefficients were colored in red and low correlation coefficients in blue. The cutoff value for age was set as 60 years. ME, module eigengene OA, osteoarthritis.

Table I.

Detailed information of hub modules.

Table I.

Detailed information of hub modules.

Module name Trait Gene count Module association to trait OA associated genes count DEG count Key TFs
Braun OA/Age 1,741 0.79/0.62 77 594 BCL6, MYEF2
Violett OA/Age 307 −0.94/−0.72 14 180 JUN, ATF3, CEBPG, NFIL3, FOSL2, FOSL1, FOS, MYC, JUND
Lachs OA 202 −0.67 5 47 TFCP2L1, RELA, SOX3
Schwarz OA/Age 920 0.71/0.61 22 316 ETS2, SOX9, SOX10
Magenta OA 328 0.64 18 159 IRF4, REL

[i] OA, osteoarthritis TFs, transcription factors DEG, differentially expressed gene.

GO enrichment function and pathway analysis

To further investigate the DEGs and hub modules involved in BP terms and signaling pathways, respective GO and KEGG analyses were performed using the clusterProfiler R package (Fig. 4). The results demonstrated that the DEGs were significantly enriched in key processes, including skeletal system development, ossification, extracellular structure organization, osteoblast differentiation, response to corticosteroid, focal adhesion, the Wnt signaling pathway, complement and coagulation cascades, extracellular matrix (ECM)-receptor interactions and rheumatoid arthritis (Fig. 4A). Fig. 4B-G presents the results obtained from the enrichment analysis of hub modules, which suggest that these BP terms and pathways may exert pivotal functions in the pathogenesis of OA.

Figur 4.

Functional enrichment analysis for DEGs and hub modules. (A) Enrichment analysis for all DEGs. (B-F) Enrichment analysis for individual modules. (B) Purple, (C) black, (D) brown, (E) magenta and (F) salmon module. Triangles represent GO terms and circles represent KEGG pathways. DEG, differentially expressed gene KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes BP, biological process ECM, extracellular matrix Fox, forkhead box.

PPI network analysis of DEGs and hub modules

A PPI network for the DEGs at the protein level was constructed using the STRING analysis tool. A total of 537 nodes and 1,218 edges were contained in the PPI network. Based on the plugin CytoHubba, the hub genes were defined as the genes with the top 10 with the highest degree of connectivity in the entire PPI network (Table II), including Jun Proto-Oncogene (JUN), Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGFA), Fos Proto-Oncogene (FOS), DNA Topoisomerase IIα and Matrix Metallopeptidase 9. A PPI network of hub modules was constructed using the same method, and genes with the top 10 connectivity in the hub modules were defined as the hub genes (Table II), including Cell Division Cycle 42 (CDC42), PH Domain and Leucine Rich Repeat Protein Phosphatase 1 (PHLPP1), Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type C (PTPRC), JUN and Ribosome Production Factor 2 (RPF2).

Table II.

Top 10 hub genes in protein-protein interaction network of DEGs and hub modules.

Table II.

Top 10 hub genes in protein-protein interaction network of DEGs and hub modules.

DEGs/Modules Top 10 hub genes
DEGs JUN VEGFA FOS TOP2A MMP9 CDK1 BIRC5 PTPRC KIT KIF23
Schwarz CDC42 CDK2 ACTC1 EHHADH CDK5 INSR DLG4 ACSL4 ACE E2F4
Braun PHLPP1 EGF MYC CALM1 CCND1 CDC20 IGF1 AURKA NOTCH1 APP
Magenta PTPRC CDK1 KIF15 TOP2A BUB1 CSF1R TYROBP ITGAM MELK BUB1B
Violett JUN FOS VEGFA ATF3 EGR1 CDKN1A DUSP1 YARS JUNB FOSB
Lachs RPF2 NGDN RCL1 RSL24D1 AEN TRMT11 ZNRD1 PAN2 SRSF7 DDX39A

[i] DEG, differentially expressed gene.

Identification of key TFs for hub modules

Transcriptional regulation is a fundamental and pivotal process involved in the pathogenesis of various diseases (22). Co-expressed genes in each hub module may be involved in the same biological functions and regulated by the same TFs. Therefore, the present study further explored the potential TFs for hub modules based on CisTargetX (Table SIV). The results demonstrated that B-Cell Lymphoma 6 (BCL6), Myelin Gene Expression Factor 2 (MYEF2), Activating Transcription Factor 3 (ATF3), CCAAT Enhancer Binding Protein γ (CEBPG), Nuclear Factor Interleukin-3-Regulated (NFIL3), FOS Like Antigen-2 (FOSL2), FOS-Like Antigen-1 (FOSL1), Fos Proto-Oncogene (FOS), JunD Proto-Oncogene (JUND), Transcription Factor CP2 Like 1 (TFCP2L1), RELA proto-oncogene NF-kB subunit (RELA), SRY-box transcription factor 3, V-Ets Avian Erythroblastosis Virus E26 Oncogene Homolog 2, Interferon Regulatory Factor 4 (IRF4) and REL proto-oncogene NF-kB subunit (REL) were the potential regulators involved in managing hub modules (Table I). Detailed information of key TFs is listed in Table SV. These TFs may serve a key role in regulating the network of hub modules, and potentially affect the initiation and progression of OA.

Identification of pivotal signaling pathways

The key TFs that target the largest number of DEGs were in the purple, brown and magenta modules (Fig. 5A), and were therefore further investigated. Fig. 5B provides a heat map on 19 key TFs. KEGG analysis was subsequently performed for key TFs and their target DEGs in the purple, brown and magenta modules (Fig. 5C). Based on the results of this enrichment analysis, it was indicated that osteoclast differentiation (purple and magenta modules), forkhead box (Fox)O signaling pathway (brown and purple modules), mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway (purple module) and PI3K/Akt signaling pathway (brown module) are imperative for the pathogenesis of OA. Based on analysis using the STRING database and the pheatmap R package, a PPI network and heatmap were respectively constructed for key TFs and their target DEGs that were involved in the pivotal signaling pathways (Fig. 6). This analysis highlights that these key TFs and DEGs serve a central role in the pivotal signaling pathways. It was also observed that the 4 pivotal signaling pathways are tightly linked through 4 key TFs, including FOS, JUN, JUND and MYC, as well as 4 DEGs, including VEGFA, GADD45A, GADD45B and CCND1. In addition to these 8 genes, the present study also revealed that BCL6 is the key TF that targets the largest number of DEGs, and that BCL6 is also involved in the FoxO signaling pathway. These results suggest that FOS, JUN, JUND, MYC, VEGFA, CCND1, GADD45A, GADD45B and BCL6 serve important roles in the pathogenesis of OA.

Abbildung 5.

Identification of key TFs for hub modules. (A) Number of DEGs targeted by predicted TFss in each hub module. (B) Heatmap of predicted TFs based on the GSE114007 dataset between OA and normal samples. (C) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis for key TFs and their target DEGs. DEG, differentially expressed gene OA, osteoarthritis Fox, forkhead box IL, interleukin MAPK, mitogen-activated protein kinase TF, transcription factor.

Abbildung 6.

Identification of pivotal signaling pathways. (A) Protein-protein interaction network of key TFs and their target DEGs involved in the pivotal signaling pathways. The node size indicates the degree of interaction. (B) Heatmap of key TFs and their target DEGs involved in the pivotal signaling pathways. TF, transcription factor DEG, differentially expressed gene Fox, forkhead box IL, interleukin MAPK, mitogen-activated protein kinase OA, osteoarthritis.

Diskussion

OA is a common chronic joint disease among aging individuals, and is characterized by articular cartilage degeneration, thickening of synovial lining, subchondral bone sclerosis and the formation of osteophytes at the joint margin (23). However, there is currently no efficient treatment for OA. Therefore, it is imperative to understand the underlying molecular mechanisms and pathological processes governing OA. Due to the limited access to normal cartilage to serve as a control group, microarray data in the GEO database containing normal cartilage tissues are relatively sparse, and the sample size is frequently insufficient. For the present study, a total of 64 articles were screened out from the Pubmed database based on the following search terms applied to title and abstract only: ‘Osteoarthritis’ AND (‘co-expression’ OR ‘coexpression’ OR ‘networks’) AND gene expression. The abstract of these 64 studies was carefully read and these articles are summarized in Table SVI. As indicated in this table, the samples in most of the studies are from knee synovial tissue, while three studies investigated the microarray data containing samples of human knee articular cartilage (11,24,25). The GSE114007 dataset contained 18 normal and 20 OA human knee cartilage tissues. The cartilage tissues were obtained from the weight-bearing regions on medial and lateral femoral condyles. The samples for the normal group were collected from joints that had no macroscopic or microscopic evidence of cartilage damage, so that the differences between normal and OA samples are obvious. Another two datasets in the GEO database are worth mentioning, namely GSE117999 and GSE113825, which contain data on human knee cartilage tissues. Degenerative OA tends to be initiated in weight-bearing regions. Therefore, the major drawback of GSE117999 is that the healthy-appearing cartilage was garnered from the non-weight-bearing site of the knee joint. The dataset GSE113825 is restricted by the amount of samples. On the basis of the above, it was we concluded that GSE114007 is a valuable microarray dataset, and is worthy of further in-depth analysis based on WGCNA. To the best of our knowledge, the WGCNA has not been previously applied to analyze the expression profiles of cartilaginous OA. The results of the present study revealed that there were a total of 1,898 DEGs, including 966 upregulated and 932 downregulated DEGs in human knee cartilage tissues of OA. In addition, 5 hub modules were identified to be closely associated with OA based on WGCNA. A PPI network was constructed in order to identify hub genes among DEGs and hub modules. Functional enrichment analysis was also performed for the DEGs and hub modules in order to identify significant BP terms and signaling pathways. It is well-accepted that co-expressed genes are more likely to be co-regulated (26), and transcriptional regulation is a basic and critical BP in eukaryotes (22). Therefore, the further analysis focused on TFs, and 19 potential key TFs were identified, which may be involved in the regulation of hub modules based on CisTargetX. Finally, 4 pivotal signaling pathways that may largely contribute to the molecular processes of OA were identified via KEGG enrichment analysis. These signaling pathways are i) Osteoclast differentiation ii) FoxO signaling pathway iii) the MAPK signaling pathway, and iv) the PI3K/Akt signaling pathway.

Based on the WGCNA performed in the present study, 5 hub modules with highly relevant expression patterns that were closely associated with OA were identified. GO BP and KEGG analyses were subsequently performed to identify significant BP terms and pathways in each hub module. The genes in the black module were primarily enriched in monocarboxylic acid biosynthetic process, signal transduction by p53 class mediator, cell cycle, insulin signaling pathway and FoxO signaling pathway. Monocarboxylate transporter 4 is a potential therapeutic target for inflammatory arthritis (27) and Zhu et al (28) reported that p53 genes are correlated with the disease grade of knee OA. The brown module was primarily enriched in skeletal system development, extracellular structure organization, ECM organization, ossification, chondrocyte differentiation, collagen catabolic process, PI3K/Akt signaling pathway, Hippo signaling pathway and FoxO signaling pathway. It has previously been reported that the chondrocyte ECM serves an important role in cartilage function (29), and that the dynamic equilibrium between matrix synthesis and degradation maintains the stability and integrity of cartilage tissue (30). A recent study has reported that the Hippo signaling pathway and ECM-receptor pathway are involved in the process of osteoarthritic chondrocyte apoptosis (31). In addition, the results of the present study revealed that the purple module was primarily enriched in response to extracellular stimulus, FoxO signaling pathway and human T-cell leukemia virus 1 infection. Andriacchi et al (32) reported that a mechanical stimulus at the baseline may enhance the sensitivity of a biomarker to predict cartilage thinning in a 5-year follow-up in patients with knee OA through a systems model of OA. In addition, the magenta module was typically enriched in neutrophil-mediated immunity and neutrophil activation involved in immune response. The magenta module is principally associated with the immune response. A previous study has suggested that the innate immune response is a potentially modifiable process, which may subsequently augment the pathological changes observed in OA (33).

The pathogenesis of OA is multifactorial and intricate, and is influenced by inflammation and oxidative stress (34). Due to its complex mechanism, numerous genes are differentially expressed in OA. In order to efficiently identify the crucial candidate genes, the present study primarily focused on the TFs likely involved in the pathogenesis of OA. A holistic approach was utilized, in which hub genes, key TFs and pivotal signaling pathways were integrated to identify more effective targets, which may be assessed in subsequent research. This analysis identified 8 key TFs and 1 hub gene (JUN, JUND, FOS, FOSL1, FOSL2, MYC, BCL6, ATF3 and VEGFA) that exert major functions in regulating hub modules and pivotal signaling pathways. Among these genes, JUN, FOS, MYC, ATF3 and VEGFA are also the hub genes in the PPI network of DEGs and the hub modules (Table II). JUN, JUND, FOS, FOSL1 and FOSL2 are subunits of activator protein 1 (AP-1) (35). Previous studies have suggested that AP-1 is involved in the differentiation, hypertrophy and expression of matrix metalloproteinase (MMP)13 in chondrocytes (36–38). In addition, Papachristou et al (39) identified that AP-1 is involved in the signal transduction pathway of mechanical loading in condylar chondrocytes. The results of the present study indicate that JUN, JUND, FOS, FOSL1 and FOSL2 are involved in osteoclast differentiation. In addition, previous research has suggested that AP-1 proteins are important inflammatory regulators in skin disease (40) and are hypothesized to be involved in regulating reactive oxygen species (ROS) in macrophages (41). There is evidence to suggest that C-myc suppresses apoptosis and promotes the proliferation of chondrocytes to prevent the occurrence and subsequent progression of OA via inactivating the MAPK signaling pathway (42). Consistent with the literature, the present study identified that MYC participates in the MAPK signaling pathway and is downregulated in OA samples. Lemos et al (43) demonstrated that inhibition of MYC in vivo as well as in human kidney organoids in vitro abrogated inflammation and fibrosis. The results of Anderton et al (44) suggest that MYC may serve a role in regulating a major anti-oxidant pathway downstream of glutamine. The present study identified BCL6 as the key TF that targeted the largest number of DEGs in the brown module. The precise association between OA and BCL6 has remained to be determined. However, a previous study reported that BCL6 attenuates lipopolysaccharide-induced inflammation in HK-2 cells via negative regulation of NLRP3 transcription (45). Iezaki et al (46) argued that ATF3 modulates the expression of MMP13 in human chondrocytes and indicated that ATF3 is implicated in the pathogenesis of OA through the modulation of inflammatory cytokine expression in chondrocytes, which may serve as a novel therapeutic target for the treatment of OA. ATF3 has been reported to be involved in regulating the inflammatory process in renal ischemia-reperfusion injury (47) and the central nervous system (48). With increasing severity of OA, greater vascular invasion into articular cartilage has been observed (49), and VEGFA has a fundamental role in angiogenesis (50). The present study observed that VEGFA is an integral DEG and in the center of a regulatory network (Fig. 6). CCND1 is an important cell cycle regulator, and CCND1 silencing may promote interleukin (IL)-1β-induced apoptosis in rat chondrocytes (51). SOX9, a TF known to regulate type II collagen and aggrecan, is a critical factor in the OA-associated downregulation of ECM molecules (52). According to a recent Bioinformatics study, VEGFA, JUN, ATF3, JUN and MYC were also significantly dysregulated in synovial membranes between the normal and OA group (53). These results suggest that dysregulation of these TFs and hub DEGs may participate in chondrocyte homeostasis and the pathogenesis of OA. Fisch et al (11) systematically analyzed the dataset GSE114007 based on a set of methods (identification of DEGs, TF enrichment analysis and network analysis), and obtained numerous significant results. They identified eight TFs (JUN, EGR1, JUND, FOSL2, MYC, KLF4, RELA and FOS) and 3 pivotal signaling pathways (hypoxia-inducible factor-1 signaling, pathways in cancer and FoxO signaling) that have a central role in the pathogenesis of OA. The present study used a different method, WGCNA, to further analyze the dataset GSE114007. The present analysis confirmed several of the key TFs identified by Fisch et al (11), including JUN, JUND, FOS, FOSL1, FOSL2, MYC and RELA, and suggested further key genes that may be involved in the pathogenesis of OA, including ATF3, BCL6, SOX9, VEGFA, CCND1, GADD45A and GADD45B. In addition to FoxO signaling, 3 further pivotal signaling pathways were identified (osteoclast differentiation, MAPK and PI3K/Akt signaling pathway).

In addition to the genes that have already been discussed, there are still other key TFs that target large numbers of DEGs and hub genes with high connectivity in PPI networks identified at present study that require further investigation, including GADD45A, GADD45B, CDC42, CEBPG, NFIL3, MYEF2, IRF4, REL, PHLPP1, PTPRC, RPF2. GADD45A and GADD45B, members of the GADD45 family, have been implicated in numerous basic processes, and have been demonstrated to be associated with aging and age-associated diseases (54). GADD45A and GADD45B have been reported to interact with AP-1, ATF3 and MYC, which have been identified as key TFs in the present study (55). However, to the best of our knowledge, the roles of GADD45s in the pathogenesis of OA have not been previously assessed, and therefore, further studies are required in order to investigate this. Previous studies have demonstrated that CDC42 is closely associated with the chondrocyte phenotype (56) and age-associated OA (57). A previous study has also indicated that C/EBPβ represses the transcriptional activity of Col2A1 directly and indirectly in ATDC5 cells (58). However, there is currently no evidence that C/EBPγ directly correlates with OA.

REL, also termed C-Rel, is a subunit of NF-κB, and it is well established that NF-κB serves a key role in OA (59). Morrovati et al (60) demonstrated that treatment of chondrocytes with IL-1β resulted in a significant increase in the expression level of C-Rel. However, there is still uncertainty as to whether C-Rel may serve as a therapeutic target for OA. Bradley et al (61) reported that Phlpp1 controls chondrogenesis via multiple mechanisms and that Phlpp1 inhibition may be a strategy to promote cartilage regeneration and repair. However, no previous study has investigated other genes, including NFIL3, MYEF2, IRF4, PTPRC and RPF2, in articular cartilage, and the results of the present study suggest that they deserve further investigation. The degradation and loss of articular cartilage is a central feature in OA (29). Therefore, the present study utilized the GSE114007 dataset, in which samples were obtained from cartilage tissue. Subchondral bone has received particular attention in recent years (62). In one study, WGCNA, the same method as that used in the present study, was applied to analyze the dataset GSE51588, whose samples were obtained from subchondral bone. They identified another set of core genes, including COL6A3, COL6A1, ITGA11, BAMBI and HCK, to be associated with the pathological processes of subchondral bone in OA (63). However, these results are inconsistent with those obtained by the present study, which indicated that different pathological mechanisms may exist between cartilage tissue and subchondral bone in OA. As summarized by Loeser et al (62), it is indicated that each event (osteophyte formation, subchondral bone sclerosis and cartilage degeneration) is regulated by different mediators.

In addition to the key TFs and hub DEGs discussed above, the present study also identified 4 pivotal signaling pathways in the pathogenesis of OA, including osteoclast differentiation, FoxO, MAPK and the PI3K-Akt signaling pathway. It was also identified that GADD45A and GADD45B participated in the MAPK and FoxO signaling pathways, and that the PI3K/Akt and MAPK signaling pathways are closely associated with MYC and VEGFA. Furthermore, FOS, JUN and JUND were indicated to be involved in osteoclast differentiation and MAPK signaling pathways. It is now well established that in OA, the balance between osteoclast-induced bone resorption and osteoblast-induced remodeling is being progressively deregulated (34). A study by Durand et al (64), by comparing the osteoclastogenic capacity of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with OA to that of PBMCs from normal individuals, revealed that monocytes from patients with OA have increased osteoclastogenesis and bone resorption. In fact, numerous studies on OA have suggested that enhanced osteoclast-mediated bone resorption is a potential pathological mechanism for OA (65,66). The FoxO signaling pathway has been reported to be a regulator of the pathological processes of OA (67) and the function is perhaps realized by autophagy (68,69). A recent study revealed that FoxO as essential TFs regulating postnatal articular cartilage growth and homeostasis (68). Activation of the MAPK signaling pathway increases the expression of MMPs in chondrocytes (70). In addition, the MAPK signaling pathway is involved in the apoptosis and expression of pro-inflammatory cytokines in human OA chondrocytes (71). Therefore, MAPK signaling is closely associated with the pathological changes of OA, and is a potential therapeutic target for OA. The PI3K signaling pathway is paramount for cell growth and survival (72), with a previous study revealing that the influence of the PI3K/Akt signaling pathway on OA is realized by autophagy (73). The PI3K/Akt pathway may be suppressed by elevated levels of ROS in OA chondrocytes so that inflammatory processes are promoted (74). Furthermore, oxidative stress may cause chondrocyte senescence by activating MAPK and PI3K/Akt signaling pathways. In general, there is a close association between abnormal regulation of pivotal signaling pathways and the disequilibrium of cellular homeostasis and cartilage degeneration.

In summary, the present study identified the hub genes and 5 hub modules associated with OA based on WGCNA. In addition, the present study was the first to identify key TFs through co-expressed gene modules. Although there have been a multitude of academic theses on the pathogenic mechanism of OA, the pathogenesis of OA has remained to be completely elucidated. Novel potential targets and 4 pivotal signaling pathways for therapeutic intervention. The present study provides an important opportunity to advance the understanding of OA. However, the present results are based on a Bioinformatics analysis and further validation is required in order to verify the potential key roles of these genes in the development of OA in vitro and in vivo .


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