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Stoffwechselaktivität postmortal

Stoffwechselaktivität postmortal


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Ich habe einige Artikel über Studien zum Stoffwechsel in gelesen Obduktion Gewebe im Menschen, aber ich weiß nicht genau, warum unser Gehirn nach dem Tod weiterhin aktiv ist.


Ihre Frage ist ein wenig vage und wie Christiaan erwähnte, wäre eine Verlinkung zu den Papieren nützlich. Wenn ich es verstehe, willst du wissen warum zellular Stoffwechselaktivität, die nach dem Tod eines Menschen stattfindet?

Wenn dies der Fall ist, lautet die Antwort im Wesentlichen, dass alles, was einen komplexen Organismus im Sinne eines Herzstillstands tötet, nicht sofort dazu führt, dass jede Zelle im Körper im selben Moment aufhört zu funktionieren.

Nun zu einer etwas längeren Antwort… Betrachten Sie jemanden, der einen Herzinfarkt erleidet und stirbt. Das Blut fließt nicht mehr durch ihre Venen und das Aufhören der Atmung bedeutet, dass der Gasaustausch stoppt. Bei Zellen mit extrem empfindlichem Sauerstoff- und Nährstoffbedarf wie Herzzellen beginnt der Zelltod schnell. Andere Zellen weiter unten in der Blut- und Sauerstoffversorgungskette haben eine größere Toleranz gegenüber Störungen der Nährstoffversorgung und haben zumindest einen gewissen Vorrat an Nährstoffen, mit denen sie arbeiten können, nachdem der Blutfluss stoppt. Diese Zellen werden für eine Weile das tun, was sie getan haben; Nährstoffe metabolisieren, Metaboliten transportieren, Gene transkribieren usw.

Nach einiger Zeit werden jedoch auch sie den Sauerstoffmangel spüren. An diesem Punkt werden die meisten Zellen auf anaerobe Atmung umschalten. Der eukaryontische Anteil von Zellen in unserem Körper ist darin nicht besonders gut, kann aber noch ein wenig kämpfen, bis ihnen einfach der Treibstoff ausgeht und sie zu sterben beginnen, hauptsächlich durch Apoptose.

Die Apoptose einiger Zellen wird tatsächlich dazu beitragen, das Leben einiger der Zellen, die den apoptotischen benachbarten Zellen benachbart sind, zu verlängern, ein Effekt, der wahrscheinlich die Evolution der Apoptose förderte. Nach einer Weile wird jedoch zu viel Apoptose aufgetreten sein und ein unkontrollierter Arttod, der als Nekrose bezeichnet wird, beginnt, was zu Kaskaden von Zelltod und Beendigung der zellulären Stoffwechselaktivität führt. Dieser Prozess kann Tage dauern, abhängig von vielen Variablen, die den Tod des Organismus umgeben.

Bisher drehte sich alles um eukaryotische Zellen; Kardiozyten, Adipozyten, Myozyten usw. Dies sind die kleinsten Zellfraktionen in unserem Körper, gemessen an der Zellzahl. Der Rest unseres Körpers besteht aus prokaryotischen oder bakteriellen Zellen. Das ist unser Mikrobiom und hier wird es (für mich) erst richtig interessant.

Obwohl unser Mikrobiom in einer symbiotischen Beziehung mit unserer eukaryotischen Zellfraktion existiert, sind viele Mitglieder des Mikrobioms weniger abhängig von den Nährstoffen in unserem Blutsystem als diese eukaryotischen Zellen. Auch in sauerstoffarmen oder gar anaeroben Umgebungen sind die Zellen unseres Mikrobioms häufig viel besser überlebensfähig. Diese Teile von uns werden noch einige Zeit nach unserem "Sterben" gedeihen.

Einige unserer mikrobiellen Zellen könnten, wenn sie sich selbst überlassen würden, sogar neue Umweltnischen außerhalb unseres Körpers finden und noch lange nach dem Tod von „Wir“ weiterleben. Die Zitate um „sterben“ und „wir“ werden an dieser Stelle notwendig, denn von hier aus verzweigen sich Identitäts- und Lebensfragen ins Philosophische.

Dies wurde eine lange Antwort, aber ich finde es ein wirklich interessantes Thema. Hier ist ein schöner Artikel aus dem Guardian, der sich mit dem postmortalen Zellstoffwechsel und insbesondere unserem Mikrobiom befasst: https://www.theguardian.com/science/neurophilosophy/2015/may/05/life-after-death


Um auf die Kommentare einzugehen - ich denke, die Frage hängt von der Definition von "Tod" ab.

EIN hirntot Person wird betrachtet klinisch tot. Jedoch, Lebensfunktionen wie Atmung und Durchblutung kann künstlich aufrechterhalten werden und das so ziemlich auf unbestimmte Zeit. Unter aktiver Beatmung fühlt sich eine Person in einem hirntoten Zustand warm an und scheint normal zu atmen. Die Person ist jedoch tot (Quelle: WebMD).

Zu Ihrer Frage wage ich zu sagen, dass es nach dem Tod ist nein neuronale Aktivität.

Umgekehrt, wenn noch Gehirnaktivität vorhanden ist, glaube ich nicht, dass die Person für klinisch tot erklärt wird. Beispielsweise kann auf Herz- und Atemstillstand durch Wiederbelebung der Person reagiert werden. Wenn das Gehirn einer solchen Person keine Aktivität mehr zeigt, besteht eine geringe Chance, dass eine solche Person überleben wird.

Referenz
- Goilar & Pawar, Indisches J Crit Care Med; 13(1)

PS: Ich habe das Tag-Wiki bearbeitet, um den menschlichen Tod genauer zu definieren


Lokalisierung von Trypsin-ähnlicher Protease im postmortalen Gewebe von Weißen Garnelen (Litopenäus vannamei) und seine Wirkung bei der Muskelerweichung

Die Trypsin-ähnliche Protease wurde extrahiert, gereinigt und mit FITC markiert. Die Migration von FITC-Trypsin-ähnlicher Protease, die in das Hepatopankreas injiziert wurde, repräsentierte die Bewegung seiner endogenen Trypsin-ähnlichen Protease.

FITC-Trypsin-ähnliche Protease, die in das Hepatopankreas weißer Garnelen injiziert wurde, wurde lokalisiert und während der postmortalen Lagerung verfolgt. Die Ergebnisse zeigten, dass FITC-Trypsin-ähnliche Protease in Gewebe des postmortalen Muskels einwandern kann.

Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Trypsin-ähnliche Protease für die Erweichung des postmortalen Muskels verantwortlich war.


Einführung

Aufgrund ihrer multigenen Natur werden Krebs und andere komplexe Krankheiten oft besser als Versagen von Funktionsmodulen verstanden, die durch verschiedene Kombinationen von gestörten Genaktivitäten verursacht werden, anstatt durch das Versagen eines einzigartigen Gens. 1 Tatsächlich deutet eine zunehmende Anzahl neuerer Beweise darauf hin, dass die Aktivität wohldefinierter funktioneller Module, wie Signalwege, eine bessere Vorhersage komplexer Phänotypen wie Patientenüberleben, 2,3 Arzneimittelwirkung, 4 usw. ermöglicht als die Aktivität von deren konstituierende Gene. Insbesondere die Bedeutung des Stoffwechsels bei Krebs 5 und anderen Krankheiten 6 macht Stoffwechselwege zu einem wesentlichen Vorteil, um Krankheitsmechanismen und Wirkstoff-MoA zu verstehen und nach neuen therapeutischen Zielen zu suchen.

Veränderungen der Genexpression wurden verwendet, um die Aktivität des Signalwegs auf unterschiedliche Weise zu verstehen. Anfänglich wurden konventionelle Genanreicherung 7 und Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) 8 verwendet, um die Aktivität des Signalwegs aus Veränderungen in den Genexpressionsprofilen nachzuweisen. 9 Diese Methoden boten jedoch eine zu einfache Sicht auf die Aktivität komplexer Funktionsmodule, die das komplizierte Beziehungsgeflecht zwischen ihren Komponenten ignorierte. Andere Methoden machten sich Netzwerkstrukturen zunutze, um ein Verständnis der Wirkmechanismen 10 zu erlangen, indem sie massive transkriptomische Daten zu massiven Zellstörungsspeichern nutzten. 11 Neuere Versionen von Anreicherungsmethoden, die speziell für Signalwege entwickelt wurden, berücksichtigten die Verbindungen zwischen den Genen. 12 Dennoch haben solche Ansätze immer noch einen einzigartigen Wert für Wege geschaffen, die multifunktionale Einheiten sind und wichtige Aspekte wie die Integrität der Ereigniskette, die die Zellfunktionen auslöst, nicht berücksichtigen. In jüngerer Zeit konzentrieren sich mechanistische Modelle auf die elementaren Komponenten der Signalwege, die mit funktionellen Reaktionen der Zelle verbunden sind, 3,13 und liefern auf diese Weise ein genaueres Bild der Zellaktivität. 14 Insbesondere im Zusammenhang mit Stoffwechselwegen wurden Constraint-Based-Modelle (CBM) angewendet, um eine Beziehung zwischen verschiedenen Aspekten des Stoffwechsels und dem Phänotyp zu finden. 15 CBM unter Verwendung von transkriptomischen Genexpressionsdaten ermöglichte die Analyse des menschlichen Stoffwechsels in verschiedenen Szenarien mit einer noch nie dagewesenen Komplexität. 16,17 Wie viele mathematische Modelle weisen CBM jedoch einige Probleme auf, wie ihre Abhängigkeit von Anfangsbedingungen oder die Beliebigkeit einiger Annahmen, zusammen mit Schwierigkeiten bei der Konvergenz zu eindeutigen Lösungen. 15,18 Darüber hinaus läuft mit wenigen Ausnahmen 19 die meiste Software, die CBM-Modelle implementiert, nur auf kommerziellen Plattformen wie MatLab, und die Arbeit mit ihnen erfordert Fähigkeiten, die über die Erfahrung experimenteller Forscher hinausgehen.

Trotz der Komplexität des Stoffwechsels wurden Stoffwechselmodule definiert, um eine umfassende kuratierte Zusammenfassung der Hauptaspekte der Stoffwechselaktivität zu bieten und die Produktion der Hauptklassen von Metaboliten (Nukleotide, Kohlenhydrate, Lipide und Aminosäuren) zu berücksichtigen. 20 Hier präsentieren wir ein einfaches Modell, das die Aktivität von Stoffwechselmodulen 20 unter Berücksichtigung der komplexen Beziehungen zwischen ihren Komponenten und der Integrität der Kette biochemischer Reaktionen, die ablaufen müssen, um die Umwandlung von einfachen zu komplexen Metaboliten zu gewährleisten, berücksichtigt. Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens solcher Reaktionen wird aus den Werten der Genexpression im Rahmen von Stoffwechselmodulen abgeleitet. Das Modell wurde in einer Pan-Krebs-Studie verwendet, die eine hohe Präzision bei der Erkennung von Krebsanfälligkeiten gezeigt hat. 21 Um diese Modelle der biomedizinischen Gemeinschaft zugänglich und leicht anwendbar zu machen, haben wir Metabolizer entwickelt, ein interaktives und intuitives Webtool zur Interpretation der Konsequenzen, die Veränderungen der Genexpressionsniveaus innerhalb von Stoffwechselmodulen auf die Produktion von Zellmetaboliten haben können.


Materialen und Methoden

Muskelprobenahme

Für die Studie wurden 3 verschiedene Hühnermuskeln benötigt, um die wichtigsten Energieliefermuster (oxidativ, glykolytisch und intermediär) darzustellen, um die Beziehung zwischen der Menge an histidinhaltigen Verbindungen und dem postmortalen Muskelstoffwechsel zu untersuchen. Muskeln mussten folgende Kriterien erfüllen: Erstens müssen sie angeblich durch einen anderen invivo-Energiestoffwechsel gekennzeichnet sein, sie müssen für den menschlichen Verzehr interessant sein und schließlich für eine einfache postmortale Entnahme leicht zugänglich sein. Wenn man also bedenkt, dass sowohl die Menge an Histidindipeptiden als auch der pHdu eines Muskels irgendwie mit seinem energieerzeugenden Weg in Zusammenhang stehen (Mora etਊl., 2008 Westerblad etਊl., 2010), wurde eine Vorstudie durchgeführt, um 3 Muskeln auszuwählen, die auf der Grundlage ihrer beiden Histidindipeptide ausgewählt wurden und pHdu den besten Kompromiss unter den oben genannten Kriterien darstellen (siehe Ergänzungsmaterial 1). An einer Charge von 10 Hühnermuskeln, die zu verschiedenen anatomischen Regionen gehören, wurden diejenigen, die für das Experiment ausgewählt wurden, um die 3 Hauptmetabolismustypen darzustellen, pectoralis Major (PN Brust) als Muskel vom glykolytischen Typ (pHdu: 5,84 Histidindipeptide: 521,9 mg/100 g Fleisch) Extensor iliotibialis lateralis (EIL Oberschenkel) als Zwischenmuskel (pHdu: 6,38 Histidindipeptide: 269,3 mg/100 g Fleisch) und Gastrocnemius internus (GI Trommelstock) ausgewählt, um einen überwiegend oxidativen Muskeltyp (pHdu: 6,57 Histidindipeptide: 196,2 mg/100 g Fleisch) ( Abbildungਁ ).

Für das Experiment ausgewählte Muskeln und relative anatomische Lage.

Insgesamt wurden 8 Schlachtkörper aus derselben Herde von Masthühnern (Ross 308-Stamm, Weibchen, 49਍ alt, 2,8 kg Körpergewicht bei der Schlachtung), die unter handelsüblichen Bedingungen gehalten und geerntet wurden, gewonnen. Vor der Schlachtung wurden die Tiere insgesamt 8 h Futterentzug unterzogen, einschließlich einer 2 h Liegezeit im Verarbeitungsbetrieb. Die Vögel wurden elektrisch betäubt (150 mA/Vogel, 400 Hz), getötet durch Durchtrennen der Halsschlagader und der Halsschlagader mit einem automatischen Gerät und 180 s lang entblutet. Anschließend wurden die Vögel 215 s lang auf 51ଌ bis 52ଌ verbrüht, gerupft und ausgeweidet. Die Schlachtkörper wurden unmittelbar nach dem Ausnehmen aus der Linie der Verarbeitungsanlage ausgewählt und Fleischproben von etwa 1਌m 3 wurden aus den PM-, EIL- und GI-Muskeln mit Knochen nach 15, 60, 120 und 1.440 min postmortal sofort herausgeschnitten in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Analyse bei �ଌ gelagert. Die Schlachtkörper wurden während der gesamten Versuchsdauer bei 4ଌ ±ਁଌ gelagert und die Muskelinnentemperatur wurde im kranialen Teil der linken Seite überwacht pectoralis Major Muskel durch einen digitalen Temperatursensor (Hanna Instruments, Italien). Vögel wurden gemäß den Grundsätzen der EU-Gesetzgebung zum Schutz von Nutztieren (Europäische Kommission, 2005, 2007, 2009) untergebracht, behandelt, von Hof zu Schlachthof transportiert und geschlachtet.

PH-Messungen und Metabolitenanalyse

Die Proben wurden wie von Matarneh etਊl beschrieben verarbeitet. (2018) mit leichten Modifikationen. Kurz gesagt, gefrorene Fleischproben (n = 8/Muskel/Probenahmezeit) wurden unter flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Mörsers und Pistills pulverisiert. Für die pH-Analyse wurden pulverförmige Proben (0,1 g) 3 min mit einem Multi-Vortexer (Thomas Scientific) in 0,8 mL eiskaltem 5 mM Natriumiodacetat und 150 mM KCl-Lösung (pH&# x000a0=ਇ.0). Nach Zentrifugation bei 17.000 × g für 5 min und Äquilibrierung auf 25ଌ wurde der pH-Wert der Überstände direkt unter Verwendung einer pH-Glaselektrode (Jenway, UK) gemessen. Aliquots von 0,1 g gefrorener Pulverproben für Glucose, Glucose-6-Phosphat (G6P) und Laktatanalyse wurden 3 min mit einem Multi-Vortexer (Thomas Scientific) in 1 mL eiskalter 0,5 M Perchlorsäure homogenisiert und 20 min auf Eis inkubiert. Homogenate wurden bei 17.000 ×  . zentrifugiertg für 5 min, dann wurden die Überstände in neue Röhrchen überführt und mit 2 M KOH neutralisiert. Für die Muskelglykogenanalyse wurde ein weiteres Aliquot der pulverisierten Probe 3 min mit einem Multi-Vortexer (Thomas Scientific) in 1 ml 1,25 M HCl homogenisiert, 2 h auf 90ଌ erhitzt und bei . zentrifugiert 17.000 × g für 5 min. Die Überstände wurden in neue Röhrchen überführt und mit 1,25 M KOH neutralisiert. Glykogen-, Glukose-, G6P- und Laktatkonzentrationen (ausgedrückt als μmol/g) wurden mit enzymatischen Methoden bestimmt, die für eine 96-Well-Platte modifiziert wurden, wie von Hammelman etਊl. (2003). Darüber hinaus ist das glykolytische Potenzial (GP) wurde nach folgender Gleichung berechnet: GP (μmol Laktat/g Muskel) =ਂ ∗ (Glukose + G6P + Glycogen) + Laktat, wie von Scheffler etਊl vorgeschlagen. (2013).

Pufferkapazität

Die Pufferkapazität von Fleischproben wurde gemäß der von Matarneh etਊl vorgeschlagenen Methode bestimmt. (2015) mit leichten Modifikationen. Etwa 2,5 g des 1.440 min postmortalen Fleisches (n = 8/Muskel) wurden mit einem Ultra-Turrax T-25 (IKA-Werke, Deutschland) in 25 mL eiskaltem 5 mM Natriumiodacetat homogenisiert und 150 mM KCl-Lösung (pH =ਇ,0). Nach Äquilibrierung auf 25ଌ wurde das Homogenat in ein Becherglas überführt und der anfängliche pH (pHich) wurde unter Rühren gemessen. Der pH-Wert des Homogenats wurde durch Zugabe von HCl oder NaOH auf 6,0 eingestellt und dann unter Verwendung von 0,5 M NaOH auf 7,0 titriert. Der pH-Wert der Proben wurde mit einer pH-Glaselektrode (Jenway, UK) gemessen und die Pufferkapazität wurde wie folgt berechnet: Pufferkapazität = 㥋/ΔpH, wobei 㥋 der Baseninkrement ist, ausgedrückt als � x003bcmol NaOH/g Gewebe und ΔpH ist die entsprechende pH-Variation nach Zugabe von NaOH.

Histidin-Dipeptide

Die Konzentration von Anserin und Carnosin in Hühnerfleischproben wurde durch Protonenkernspinresonanzspektroskopie ( 1 H-NMR) bestimmt, wie zuvor von Marcolini etਊl. (2015) mit leichten Modifikationen. Kurz gesagt wurden etwa 0,5 g des 1.440 min Leichens (n ​​= 8/Muskel) in 3 ml destilliertem Wasser durch Ultra-Turrax T25 basic (IKA-Werke, Deutschland) homogenisiert (20 sਊt 11.000 U/min). Dann wurde 1 ml Homogenat in ein neues Röhrchen überführt und bei 14.000 U/min 10 minꂾi 4ଌ zentrifugiert. Ein Aliquot (700 μL) des Überstands wurde in ein neues Röhrchen mit 800 μL Chloroform gegeben, gevortext und wie zuvor zentrifugiert. Anschließend wurden 500 μL des Überstands zu 200 μL Kaliumphosphatpuffer (1M, 2 mM Natriumazid pH 7,0) in D . gegeben2O und 10 mM 3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d4-Säure-Natriumsalz. Die Proben wurden 10 min bei 14.000 U/min zentrifugiert und 700 des Überstands wurden in ein NMR-Röhrchen überführt. 1 H-NMR-Spektren wurden dann bei 25ଌ mit einem Bruker Avance III Spektrometer bei 600 MHz, ausgestattet mit einer BBI-z Sonde und einem B-ACS 60 Sampler zur Automatisierung (Bruker BioSpin, Deutschland) aufgenommen. Spektren wurden mit einem 90°-Puls von 14 μs mit einer Leistung von 10 W, einer Relaxationsverzögerung von 5 s und einer Erfassungszeit von 2,28 s aufgenommen.

Statistische Analyse

Daten bezüglich pH und glykolytischer Metaboliten wurden unter Verwendung der ANOVA für wiederholte Messungen unter Verwendung des GLM-Verfahrens der SAS-Software (SAS Institute Inc.) analysiert, wobei der Einfluss der Probenahmezeit (15, 60, 120 und 1.440 min) getestet wurde. Der gleiche Datensatz wurde auch mit der Einweg-ANOVA verarbeitet, um die Hauptwirkung des Muskeltyps (PM-glykolytisch, EIL-intermediär und GI-oxidativ) auf den pH-Wert und die glykolytischen Metaboliten für jeden Probenahmezeitpunkt zu testen. Daten bezüglich Pufferkapazität und Histidindipeptiden wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, wobei der Muskeltyp als Haupteffekt betrachtet wurde. Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden dann mit dem HSD-Test nach Tukey unter Berücksichtigung eines Signifikanzniveaus von . untersucht P < 0,05. Um die Beziehung zwischen der Histidindipeptidkonzentration, der Pufferkapazität und dem glykolytischen Potenzial der Muskeln zu untersuchen, wurden außerdem Korrelationskoeffizienten zwischen den Variablen unter Verwendung der in der SAS-Software (SAS Institute Inc.) vorhandenen Korrelationsoption nach Pearson erzeugt.


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Ohne Titel WR Pa 53 2001

Leichen werden schließlich in ihre Bestandteile zerlegt.

Dekompositionsänderungen sind im forensischen Kontext wichtig, nicht nur, wenn man bedenkt, wie lange ein Individuum tot ist, sondern auch bei der Erkennung von Naturphänomenen, die keinen unnatürlichen Tod implizieren.

Weichgewebe bauen sich im Laufe der Zeit ab und verflüssigen sich, wobei die Geschwindigkeit des Fortschritts temperaturabhängig ist. Je wärmer die Umgebung, in der der Körper liegt, desto schneller erfolgt die Verflüssigung.

In gemäßigten Klimazonen wird die Haut des rechten Unterbauchs (über dem Blinddarm, der reichlich Darmbakterien enthält) nach 3-4 Tagen grün. Bakterien vermehren sich innerhalb des Gefäßsystems und ihre Anwesenheit führt zu Hämolyse und Zersetzung des Blutes in diesen Gefäßen. Dieser Vorgang ist als Verfärbung der Gefäße („Marmorierung“) zu sehen. Die Haut bricht zusammen, was zu Blasenbildung und Hautrutschen führt, und das Bakterienwachstum in den Weichteilen mit Gasbildung führt zu einem „Aufblähen“ des Körpers. Es baut sich ein innerer Druck auf, der Zersetzungsflüssigkeiten aus der Lunge durch Mund und Nase drängt („Purge-Flüssigkeit“). Diese Spülflüssigkeit wird von Laien oft als Blutung durch Verletzungen fehlinterpretiert.

Insekten- und Tierverwüstung erhöhen die Zersetzungsrate eines Körpers und beschleunigen die Rückkehr des Körpers zu Skelettelementen und schließlich zu keinen erkennbaren Überresten.

Es kann kein verlässlicher Zeitplan für solche Änderungen angegeben werden, obwohl viele neuere Forschungen von forensischen Anthropologen (einschließlich derjenigen, die an der Anthropological Research Facility der University of Tennessee durchgeführt wurden) und Entomologen angewiesen wurden, einen solchen Zeitplan bereitzustellen.

Tote Körper zersetzen sich je nach Medium, in das sie gelegt werden, unterschiedlich schnell. Caspers Gesetz besagt traditionell, dass 1 Woche in der Luft = 2 Wochen in Wasser = 8 Wochen in der Erde vergraben.

Bei feuchten Umgebungsbedingungen (z. B. bei Erdverschüttungen) können Körperfette verseifen, was zur Bildung von Fettpolstern führt. Dies ist eine blasse, wachsartige Substanz, die mit der Zeit spröde wird und die Umrisse einer Körperstruktur bewahren kann. Es kann sich in nur 3 Wochen bilden, ist aber normalerweise ein Prozess, der Monate oder Jahre dauert.

Wissenschaftliche amerikanische Animation - Was passiert mit Ihrem Körper nach dem Tod?


Strukturierte Zusammenfassung

EINLEITUNG

Trotz der Komplexität der Letalität von Antibiotika werden kanonische Resistenzmechanismen im Allgemeinen in drei große Kategorien eingeteilt: Zielmodifikation, Wirkstoffinaktivierung und Wirkstofftransport. Obwohl gezeigt wurde, dass der Stoffwechsel aktiv zur Antibiotikaletalität beiträgt, werden Antibiotikaresistenzmutationen in Stoffwechselgenen selten identifiziert, und metabolische Dysregulation ist kein häufig genannter Mechanismus der Antibiotikaresistenz. Eine Erklärung dafür ist, dass bisherige Ansätze einen begrenzten Überblick über die Antibiotikaresistenzlandschaft bieten. Tatsächlich heben Laborentwicklungen gepaart mit Sequenzierungskandidatengenen und/oder einer kleinen Anzahl klonaler Isolate pro Erkrankung Mutationen hervor, die entweder erwartet werden oder mit hoher Häufigkeit wiederholt auftreten. Darüber hinaus beinhalten Antibiotika-vermittelte Wirkungen auf den bakteriellen Stoffwechsel zahlreiche, komplexe und koordinierte biomolekulare Netzwerke, was es schwierig macht, Kandidaten mit wahrscheinlicher Resistenz a priori vorherzusagen. Darüber hinaus erhöht die Vielfalt der beteiligten Signalwege die Anzahl möglicher evolutionärer Ergebnisse, was die Wahrscheinlichkeit für konvergente Mutationen verringert und daher mit früheren Methoden leicht übersehen würde. Infolgedessen sind genetische Mechanismen der Antibiotikaresistenz im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel erheblich zu wenig erforscht.

BEGRÜNDUNG

Die Bedeutung von Analysen auf Bevölkerungsebene für das Verständnis der evolutionären Landschaft als Reaktion auf die medikamentöse Behandlung wird zunehmend anerkannt. Niederfrequente Mutanten machen die meiste genetische Vielfalt innerhalb einer Population aus, und in vielen Fällen können nützliche Mutationen ausgestorben sein, bevor sie sich etabliert haben. Dies ist besonders relevant für Gene, die am Zellstoffwechsel beteiligt sind, bei denen die vielfältigen Stoffwechselwege im Vergleich zu kanonischen Wirkstoffzielen zu einer Vielzahl potenzieller evolutionärer Ergebnisse führen können. Daher haben wir versucht, eine umfassendere Sichtweise zu verwenden, die sowohl durch Populations- als auch durch Klonanalysen ermöglicht wird, um metabolische Aspekte der Antibiotikaresistenz aufzuklären. Darüber hinaus sind unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen typische Laborevolutionsprotokolle und ihre Analysemethoden nicht optimiert, um Mutationen in stoffwechselbezogenen Genen zu erkennen. Eine ständige Antibiotika-Exposition erzwingt eine wachstumsabhängige Selektion, und ein Fehlen eines stoffwechselspezifischen Selektionsdrucks minimiert weiter die Wahrscheinlichkeit einer Anreicherung für stoffwechselspezifische Wege und Prozesse. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass die Maximierung der metabolischen statt der Wachstumsanpassung es uns ermöglichen würde, diese Dynamik zu verschieben und antibiotikaspezifische Stoffwechselvarianten weiter herauszuarbeiten.

ERGEBNISSE

Wir haben sequenziert und analysiert Escherichia coli angepasst an drei repräsentative Antibiotika bei zunehmend erhöhten Stoffwechselzuständen. Dabei wurden eine Vielzahl von unterschätzten nicht-kanonischen Genen entdeckt, wie zum Beispiel diejenigen, die mit dem zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in Verbindung stehen und die an der Antibiotikaresistenz beteiligt sind. Diese Mutationen in Stoffwechselgenen entstanden oft in mehreren unabhängigen Populationen und/oder als Reaktion auf mehr als ein Medikament. Mehrere der identifizierten stoffwechselspezifischen Mutationen sind in den Genomen von >3500 klinisch überrepräsentiert E coli Krankheitserreger in ähnlichen und in einigen Fällen höheren Konzentrationen als bekannte Resistenzmutationen, was auf ihre klinische Relevanz hindeutet. Um zu evaluieren, ob diese metabolischen Mutationen Resistenzen verleihen, haben wir eine repräsentative Untergruppe sowohl der Gene, die mit dem Metabolismus in Verbindung stehen, als auch der klassischen Resistenz aufgrund ihrer Prävalenz und klinischer Bedeutung ausgewählt. Wir exprimierten die Wildtyp- und Mutantenvarianten jedes Gens aus einem Plasmid mittlerer Kopienzahl, das in den entsprechenden chromosomalen Knockout-Stamm eingeführt wurde. In allen Fällen erhöhten metabolische Mutationen die minimale Hemmkonzentration auf mindestens eines und in vielen Fällen mehr als eines der Antibiotika. Schließlich liefern phänotypische und genotypische Analysen einer repräsentativen Mutation im Enzym 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase (sucA) ein erstes Bild davon, wie ein veränderter Metabolismus zu Antibiotikaresistenzen führt: Eine niedrigere Basalatmung verhindert die antibiotikavermittelte Induktion der Aktivität des Tricarbonsäurezyklus und vermeidet so metabolische Toxizität und Minimierung der Letalität.

FAZIT

Unsere Ergebnisse, dass metabolische Mutationen als Reaktion auf eine Antibiotikabehandlung entstehen und dass diese Mutationen Resistenzen verleihen und bei klinischen Krankheitserregern sehr verbreitet sind, legen nahe, dass die drei allgemeinen Kategorien von Antibiotikaresistenzen möglicherweise nicht so repräsentativ und die Mechanismen nicht so umfassend sind, wie zuvor angenommen. Tatsächlich kann die metabolische Anpassung eine separate Klasse von Resistenzmechanismen darstellen, die über die Übertragung von Toleranz hinausgeht, wobei Zellen auch ihre metabolische Reaktion ändern, um nachgeschaltete toxische Aspekte der Antibiotika-Letalität zu mildern.

Die Zellen wurden hohen Antibiotikakonzentrationen (rot) für kurze Zeit unter inkrementell ansteigenden metabolischen Zuständen (blau) ausgesetzt, getrennt durch Runden von arzneimittelfreiem Wachstum (kleine Fläschchen). Von links nach rechts zeigt die evolutionäre Zeit an. Anfänglich trägt die antibiotikavermittelte metabolische Stimulation teilweise zur Zellletalität (sensitive Zelle) bei. Entwickelte Zellen erwerben eine Resistenz, die durch eine verminderte basale Stoffwechselaktivität verursacht wird, die eine antibiotikavermittelte Stimulation und anschließende Letalität vermeidet (resistente Zelle).


Der Tod eines großen Tieres ist eine Nahrungsquelle für Mikroorganismen. Metcalf et al. überwachte die mikrobielle Aktivität während der Zersetzung von Maus- und menschlichen Kadavern. Unabhängig von Bodentyp, Jahreszeit oder Art war die mikrobielle Abfolge während der Zersetzung ein vorhersagbares Maß für die Zeit seit dem Tod. Eine darüber liegende Leiche saugt Nährstoffe aus, die das Wachstum von Boden- und Insekten-assoziierten Pilzen und Bakterien ermöglichen. Diese Mikroorganismen sind Stoffwechselspezialisten, die Proteine ​​und Lipide in übelriechende Verbindungen wie Cadaverin, Putrescin und Ammoniak umwandeln, deren Signatur noch lange nach der Entfernung einer Leiche im Boden bestehen kann.

Die Zersetzung von Wirbeltieren stellt in den meisten terrestrischen Lebensräumen eine wichtige Stufe im Nährstoffkreislauf dar, doch mikrobiell vermittelte Prozesse sind kaum verstanden. Hier kombinieren wir die Charakterisierung tiefer mikrobieller Gemeinschaften, die metabolische Rekonstruktion auf Gemeinschaftsebene und die biogeochemische Bewertung des Bodens, um die Prinzipien zu verstehen, die die mikrobielle Gemeinschaft während der Zersetzung von Maus- und menschlichen Leichen auf verschiedenen Bodensubstraten bestimmen. Wir finden eine Reihe von Bakterien- und Pilzgruppen, die zum Stickstoffkreislauf beitragen, und ein reproduzierbares Netzwerk von Zersetzern, die in vorhersehbaren Zeitskalen entstehen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Zersetzer-Gemeinschaft hauptsächlich aus Schüttboden stammt, aber Schlüsselzersetzer sind in geringer Häufigkeit allgegenwärtig. Die Bodenart war kein dominierender Faktor für die Entwicklung der Gemeinschaft, und der Zersetzungsprozess ist ausreichend reproduzierbar, um neue Möglichkeiten für forensische Untersuchungen zu bieten.

Der Prozess des Zerfalls und der Zersetzung in Säugetier- und anderen Wirbeltiertaxa ist ein wichtiger Schritt im biologischen Nährstoffkreislauf. Ohne die Wirkung von Vertebraten und wirbellosen Aasfressern, Bakterien, Archaeen, Pilzen und Protisten würde die chemische Zersetzung tierischer Abfälle extrem langsam voranschreiten und zu Reservoirs biochemischer Abfälle führen (1). Es wird erwartet, dass die Koevolution mikrobieller Zersetzer mit der Verfügbarkeit von Wirbeltierleichen in den letzten 400 Millionen Jahren zur Erhaltung wichtiger biochemischer Stoffwechselwege und länderübergreifender ökologischer Interaktionen für ein effizientes Recycling von Nährstoffreserven führt. Obwohl Säugetierleichen wahrscheinlich eine relativ kleine Komponente des Detrituspools darstellen (2, 3) in most ecosystems, their role in nutrient cycling and community dynamics may be disproportionately large relative to input size, owing to the high nutrient content of corpses (3, 4) and their rapid rates of decomposition [e.g., up to three orders of magnitude faster than plant litter (2)]. These qualities make corpses a distinct and potentially critical driver of terrestrial function (5, 6).

When a mammalian body is decomposing, microbial and biochemical activity results in a series of decomposition stages (5) that are associated with a reproducible microbial succession across mice (7), swine (8), and human corpses (9). Yet the microbial metabolism and successional ecology underpinning decomposition are still poorly understood. At present, we do not fully comprehend (i) whether microbial taxa that drive decomposition are ubiquitous across environment, season, and host phylogeny (ii) whether microbes that drive decomposition derive primarily from the host or from the environment and (iii) whether the metabolic succession of microbial decomposition is conserved across the physicochemical context of decay and host phylogeny.

Several questions arise: Are microbial decomposer communities ubiquitous? What is the origin of the microbial decomposer community? How does mammalian decomposition affect the metabolic capacity of microbial communities? To answer these questions, we used mouse corpses in laboratory settings and human donors in outdoor settings (see supplementary materials and methods). We observed mouse decomposition on three different soil types under constant temperature and humidity, with insects excluded. We sampled microbial communities on the skin, abdominal cavity, and gravesoil (soils associated with decomposition) by destructively sampling five mice per soil type per time point every 3 days for the first 2 weeks and less frequently thereafter over 71 days of decomposition (fig. S1). Outdoor experiments on human corpses were conducted at the Sam Houston State University (SHSU) Southeast Texas Applied Forensic Science (STAFS) Facility (a willed-body donation facility), where human bodies were exposed to all natural elements, including invertebrate and vertebrate scavengers. We sampled the skin and gravesoil associated with four decomposing human bodies—two of which were placed in the winter and two in the spring—over 143 days and 82 days, respectively (fig. S1). Human donors were sampled either daily or every other day during the first month and less frequently thereafter. We used high-throughput amplicon-based sequencing of 16S ribosomal RNA (rRNA) genes (archaeal and bacterial community), 18S rRNA genes (microbial eukaryotic community), and internal transcribed spacer regions (fungal community) to characterize the full microbial diversity associated with decomposition (figs. S2 to S5).

A mammalian corpse is a disturbance habitat that selects for a specialized microbial community capable of decomposing a highly concentrated source of proteins and lipids, rather than the plant-derived polysaccharides from which most detritus is derived. Our results show that microbial communities change significantly during decomposition (tables S1 to S12) and become more similar to each other across body sites and gravesoils (supplementary materials). Although mice were decomposed on soils with different chemical properties (table S13), soil type was not a major driver of skin decomposer bacterial structure (Fig. 1A). A Random Forests regression model trained on our microbial data resulted in estimates of the postmortem interval (PMI) with errors

2 to 3 days over first 2 weeks of decomposition (fig. S6). Additionally, estimates of PMI remained accurate when bacterial data associated with one soil type were used to train a regression model and predict PMI for samples associated with other soil types (fig. S7). In our human experiments, we also observed a reproducible succession of microbes across bodies within the same season (Fig. 1B and fig. S8), as well as accurate estimates of PMI across seasons and host species (Fig. 1C and fig. S9). We discovered that important features (i.e., microbes) in our experiment-specific regression models were similar across experiments (Fig. 1D). Together these results confirm that microbial succession was predictable across soil types, seasons, and host species.

(EIN) Results of principal coordinates analysis (PCoA) based on unweighted UniFrac distances for mouse skin bacterial and archaeal communities. Samples are colored by days of decomposition (left) and soil type (right). (B) Log scale heat map of 16S rRNA operational taxonomic units (OTUs) colonizing the skin of human corpses. (C) A 16S rRNA–based Random Forests (RF) model using our winter-season skin-and-soil data set to train the model and predict the PMI of human bodies in the spring. Each point indicates a sample collected at a certain PMI, with RF-predicted PMIs shown in red and randomly guessed PMIs in gray. RMSE, root mean square error. (D) Percentage of top 100 PMI regression features from each environment that were shared (colored lines) versus number of shared features from randomly selected subsets of size 100 (gray lines). ITS, internal transcribed spacer.

The microbial decomposer community may emerge from multiple environments in which decomposer organisms are often rare (low abundance) before decomposition begins. For the mouse experiment, we used dynamic Bayesian inference neural information flow networks, which revealed that soil was significantly more likely to be a source of bacteria and archaea for the colonization of mice (Fig. 2A). To identify the potential sources of decomposer microbial communities, we deeply sequenced 16S rRNA amplicons from samples collected on the first day of each experiment. We searched these deeply sequenced data for decomposers, which we defined as microbes that differentially increased during decomposition, and found that

40% of microbial decomposers were detected at very low relative abundances in soils at the start of experiments (supplementary text) (Fig. 2B). To understand the extent to which the blow fly, a common postmortem scavenger insect, may contribute to the microbial decomposer community, we also sequenced the bacterial and archaeal communities on 79 blow fly tarsi (supplementary materials) and discovered that they were a potential source for microbial decomposers, particularly in the human model experiment that occurred in the spring (fig. S10). Our results show that soil may be the main source of the microbial decomposer community, even though soil type is not important.

(EIN) Dynamic Bayesian inference networks: A neural information flow network of microbial taxa during decomposition shows soils as the most common source of decomposers. (B) Results from deeply sequencing 16S rRNA amplicons from samples collected on the first day of each experiment. Die ja axis indicates the proportion of abdominal, skin, and soil decomposer OTUs (x axis) detected in each environment at the start of the experiment. Bars with standard error are ordered by soil type [desert (d), shortgrass (s), and forest (f)] (left) or season [winter (w) and spring (s)] (right). Decomposers were detected in soils more frequently than in the abdomen in every comparison (Mann-Whitney U Prüfung: P < 0,05).

When a mammal dies, its immune system no longer functions and its internal temperatures change (10), radically altering the environment for microbial colonization and growth. Most endogenous mammalian microbes reside in the gastrointestinal tract, and postmortem changes in the gut microbial community lead to corpse bloating and, eventually, rupture (5). To investigate the microbial community dynamics of the abdominal cavity during decomposition, we used longitudinal data from the mouse abdomen samples to construct a dynamic Bayesian network of interactions between different taxa and several soil environmental factors (as a proxy for the abdominal environment). Nematodes are dependent on the actions of fungi and bacteria, with kinetoplastids (Discicristata) playing a key role in community succession (Fig. 3A). Fungi in the groups Eurotiales and Ascomycota are strong drivers of community structure, whereas fungi in Hypocreales appear to depend on the presence of bacteria for colonization of the abdomen. These shifts in microbial taxa are associated with large shifts in functional gene abundances, as predicted from 16S rRNA data analysis using the PICRUSt (phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved state) software (Fig. 3B) (11), particularly for Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) orthology group “metabolism” (Fig. 3C). We detected predicted increases in genes related to nitrogen cycling and amino acid degradation, including those required for the breakdown of lysine and arginine into the foul-smelling decomposition by-products cadaverine and putrescine (Fig. 3D).

(EIN) Dynamic Bayesian network of interactions between archaea, bacteria, microbial eukaryotes, and environmental abundance measurements during decomposition. Arrows indicate the direction of causality, and the network is arranged hierarchically so that it is a proxy for succession. (B und C) Results of PCoA of cecum, with all of the PICRUSt-predicted KEGG orthologies (KOs) (B) or KOs only classified as “metabolism” in KEGG functional hierarchies (C). (D) PICRUSt-predicted nitrite reductase, lysine decarboxylase, and ornithine decarboxylase enzyme-level genes in the mouse abdominal cavity during decomposition.

After corpse rupture, ammonia-rich fluids permeate the soil, resulting in extreme and significant effects on the nitrogen concentration and pH of gravesoil (Fig. 4A, fig. S11, and table S13). This rich source of nutrients and the marked changes to soil chemistry initiate a clear ecological succession of soil microbial organisms with increased capacity for nitrogen cycling and tolerance for the altered soil chemical environment (Fig. 4B and fig. S12). Predicted functions of bacterial communities increased in relative abundance of genes for amino acid degradation and subsequent ammonia production (Fig. 4C). Surprisingly, although we observed increases in soil nitrate concentrations and processes that consume nitrate (figs. S13 and S14), we did not see genetic signs of increased nitrification rates (figs. S13 and S14). This suggests that nitrification pulses induced by vertebrate decomposition may occur on finer spatial or temporal scales or, alternatively, that the PICRUSt reference database lacks genomes from the vertebrate corpse microbial nitrifier community (e.g., fungal genomes). Taken together, analysis of the full community of predicted metabolism-related functional genes, in association with the PMI and soil chemistry data, revealed marked changes in functional potential during decomposition. The large and rapid taxonomic changes in microbial communities—as well as their subsequent effect on the predicted metabolic capacity of both the corpse (Fig. 3) and its surrounding environment (Fig. 4 and fig. S13) during decomposition—may be part of a microbial strategy to outcompete insects and scavengers for an ephemeral, nutrient-rich resource. The dramatic changes in community structure and function may also reflect the selective pressures applied by the biogeochemical hotspot formed during corpse decomposition (Fig. 4A) (5). As a consequence, microbial succession during decomposition appears to be a predictable process that has implications for biogeochemical cycling and forensic science.

(EIN) pH, ammonium, and nitrate concentrations in mouse gravesoils and control soils. Error bars indicate 1 SD from the mean of five sample measurements. (B) Canonical correspondence analysis (CCA) of gravesoil bacterial predicted gene ontologies during decomposition. PICRUSt-predicted function data are based on KOs, with only genes classified as “metabolism” included in this analysis. (C) Predicted gene abundances of glutamate dehydrogenase and nitrate reductase in soils during decomposition.

These data are important in the context of ecosystem function. Decomposition is a fundamental microbial function spanning terrestrial ecosystems, and though plant inputs are the dominant source of organic matter, vertebrate corpse inputs can be important resources (5, 6). For example, one rain forest in Panama was estimated to receive 750 kg in mammal corpses annually per square kilometer (12). Although this represents less than 1% of the mass of plant litter received by another Panamanian rain forest (13), corpse nutrient sources can be an order of magnitude more concentrated than plant litter (5), and direct comparisons between plant and animal decomposition resources are rare (14). Thus, much is still unclear about the role of corpse inputs in larger-scale biogeochemical cycling (e.g., global carbon and nitrogen cycling) and in supporting specific communities and microbial diversity (14), and our results provide an important microbial perspective.

A societal impact of these results is the value of microbial data as physical evidence in medicolegal death investigation. We show that decomposer microbial communities could potentially serve as temporal (succession-based) and spatial (origin-based) (supplementary text) forms of physical evidence, such as the time elapsed since death (PMI) and the location of death. Our observation that postmortem microbial communities changed in a clock-like manner that provided an estimate of absolute PMI is similar to using the development of fly larvae to estimate PMI. However, the fly larvae PMI proxy is limited by corpse accessibility and season, resulting in PMI estimates in the range of weeks, months, and even years (15). Taken together, our findings demonstrate that postmortem microorganisms can provide both spatial and temporal insight into the events surrounding death.


Autorenbeiträge

GSZ acquired data from the literature and interpreted them, wrote the manuscript, and produced the figures. VMSC collected the data, assisted in their interpretation, and revised the manuscript. JMN assisted in interpreting the data, in elaborating the figures, writing the manuscript and revising the text. DMS contributed to the design of the work, assisted in interpreting the data, writing the manuscript, and revising the text. All four authors revised and approved the final version to be submitted.


Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

Einführung

Metabolites, the intermediates or end products of metabolism, including nucleotides, amino or organic acids, lipids, are key components to biological functions and processes. Metabolomics, the study of metabolites, allows for the exploration of their biochemical interactions and the understanding of their roles in the context of basic, translational, and clinical research. Metabolites are strongly associated with the phenotypes of organisms and provide information on biochemical activities that occur during cellular metabolism 1 . Therefore, in addition to genomics and proteomics, metabolomics has emerged as an important tool in understanding both physiological and pathological conditions. For instance, metabolomics is used in elucidating the mechanisms behind existing drugs as well as their tolerance. In drug development, xenobiotic metabolism is useful in assessing the activity or toxicity of metabolites across species, which later translates to supporting personalized medicine 2 . Despite the broad application of metabolomics, imaging of metabolites can be challenging due to metabolites' chemical reactivity, structural heterogeneity, and broad concentration range 3 . However, the concentrations of labile metabolites including high energy compounds, glucose, lactate, glycolytic, pentose shunt pathway, and TCA cycle intermediates, phospholipids, neurotransmitters, signaling compounds, can change within seconds and progress over minutes when tissue enzymes are active during tissue harvesting procedures, such as postmortem ischemia in brain harvesting 4 , 5 , 6 . To ensure accurate metabolomics data acquisition, appropriate and careful sample preparation is critical 7 , 8 . Current established platforms for measuring metabolites include NMR, enzyme assays, and mass spectrometry (including liquid and gas chromatography), the last of which is discussed further below.

MALDI-MSI is a state-of-the-art technique that allows for the analysis of complex samples through the detection of individual molecular species. MALDI MSI grants the benefit of being able to quickly and reproducibly measure various molecular compounds in biological samples. Mass spectrometry imaging further allows for the production of images that represent tissue biology based on its composite metabolites, and does so while preserving the spatial distribution of the metabolites in the sample 9 . MALDI's ability to detect analytes in a sample without the use of antibody labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, coupled with its ability to monitor hundreds of molecules within a single experiment comprise just a few of the advantages MS imaging grants when it comes to metabolic profiling 10 , 11 . In addition to commonly used matrix such as 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and 9-aminoacridine (9-AA), recently discovered novel matrix N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC), which is well-suited for analyses of various low molecular weight metabolites, has further improved the application of MALDI MSI in metabolic profiling 12 .

Despite the broad application of MALDI MSI, the high cost of the instrument and the complexity of the experimental procedure prevents its wider implementation in individual research laboratories. Therefore, most of the MALDI MSI studies are supported through shared core facilities. The sample preparation, including slide preparation and matrix coating, is the most critical step in MALDI MSI. However, the slide preparation is normally carried out in individual researcher's laboratory, which creates potential variations in later MALDI MSI acquisition. Here we aim to provide a detailed protocol for the sample preparation of biological samples before proceeding to MALDI MSI measurements, and use a metabolomic profiling of developmental mouse brain as an example.

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Protokoll

The protocol follows the guidelines of City University of New York (CUNY) Advanced Science research Center (ASRC)'s institutional animal care and use committee (IACUC).

  1. Prepare the aluminum boat. Prepare a rectangle aluminum 10cm x 20 cm, fold in the middle to make 10 cm double layer square. Label the sample information on one side, and fold the other side to form a boat with bottom surface about 4 cm x 4 cm.
  2. Precool the boat on the liquid nitrogen (LN2) in a Styrofoam box.
    ​NOTE: If the boat is too small, the sample might fall out of the boat and become over frozen by directly contacting LN2, which may result in fragmentation during cryosectioning.
  3. Euthanize the animal by cervical dislocation following institutional IACUC guidelines, immediately dissect out the tissue of interest.
    1. Keep the interval between animal anesthesia and snap freezing as short as possible, to minimize the alteration of metabolites during tissue harvesting, especially the labial metabolites in the brain due to postmortem ischemia.
      NOTE: Perfusion the animal with phosphate-buffered saline (PBS) will increase the duration of ischemia, further altering the concentrations of labile metabolites and exaggerating the artifactual results. Therefore, perfusion or washing the tissue with PBS is not recommended, unless the contamination of blood or body fluid is of more concerned than metabolites deterioration or washout for individual project.

    NOTE: Wear gloves at all times when handling the Indium tinoxide (ITO) slides. Avoid direct breathing onto the slide or wear masks (optional) to prevent the contamination of human saliva onto the tissue section.

    1. Before sectioning the tissue, gather the desired number of MALDI compatible ITO coated glass slides.
    2. Test the conductivity of the slide using a voltmeter set to resistance. Label the side where a resistance measurement is read: this will be the side that the tissue sections adhere to. Always place the slide on a clean paper towel to avoid contamination.
    3. Pre-cool the slides in a cryostat set to -20 °C.
    4. If tissue samples were removed from the -80 °C, let the tissue equilibrate in the cryostat chamber for about 45-60 min depending on the size of the tissue. If samples are removing from dry ice, equilibrate it for about 30 min.
    5. Thoroughly clean the cryostat with 70% ethanol. Pre-cool all the necessary tools including thin-tipped artist brush and forceps in the cryostat chamber.
    6. Set the temperature of the cryostat chamber and specimen head according to the type of the tissue: -14 °C for liver, -20 °C for muscle and -25 °C for skin 9 .
    7. Mount the tissue to the chuck using cryo tissue embedding compound OCT, avoiding OCT from the region of interest.
    8. Place a clean blade in the stage and lock. Adjust the position of the stage and the angle of the specimen to achieve the desired cutting angle.
      NOTE: If different types/genotypes of tissue are to be cut, be sure to either reposition the sample so that a clean part of the blade is used , or change to a new blade before cutting the next sample to prevent cross-contamination.
    9. Continue cutting until the region of interest (e.g., corpus callosum in the brain) is found. Be sure to keep the stage clean by brushing off extra pieces with an artist brush that has been equilibrated in the cryostat.
    10. Once the desired region is revealed, cut smaller sections of 10-12 µm thickness. If the section tends to flake or fall apart easily, raise the temperature of the cryostat, staying in the -22 °C to -11 °C range. We have found that the optimal cutting temperature for brain tissue is -15 °C to - 18 °C.
    11. Once a good section has been cut, adhere it to the ITO slide (operate in the cryostat chamber).
    12. Transfer one section of the tissue onto ITO slides using the tip of artist brush.
    13. Finger-warm the section by placing a finger under the slide to warm up the section to ensure secure mounting. The tissue section will first turn to transparent in 5-10 s and then turn opaque in about 30-60 s.
    14. Carefully set the slide aside in the cryostat.
    15. Repeat steps for other tissue samples, ensuring that each section of the tissue is placed evenly on the slide and is as aligned as possible.
    16. Since the MALDI target can hold up to two slides, place the sections from multiple samples of the same cohort onto a single slide or onto two slides, to ensure they can be analyzed at the same time.
    17. When finished, place ITO slides in a vacuum box and transfer to a desiccator with desiccant. Vacuum-dry the slide for 45-60 min.
      NOTE: If a vacuum desiccator is not available in the lab, keep the slides under -20 °C all the time to avoid metabolites deterioration.
    18. Slide storage and shipping: unless the sample is prepared by the MALDI imaging core facilities to proceed directly to MALDI imaging, store the slides at -80 °C or ship to core facilities or other MALDI research laboratories on dry ice.
    19. To best preserve the samples, place the slides into the slide transporter, fill it with nitrogen (optional), seal with parafilm, place into a zip bag, which is then placed into another zip bag containing desiccant. Label the outer zip bag.
    20. Proceed to storage at -80 °C (up to 6 months) or shipping with adequate dry ice.
    1. Bereiten Sie die Matrix vor.
      ​NOTE: All the reagents must be HPLC grade.
      1. Prepare NEDC at a concentration of 10 mg/mL. Prepare 10 mL of matrix dissolved in a solvent of 70% methanol (100 mg of NEDC, 7 mL of methanol, 3 mL of H2Ö).
      2. Additionally prepare an extra 10 mL of 70% methanol:water solution to flush the sprayer system before filling in the matrix.

      NOTE: There are multiple methods to apply an even layer of matrix in fine crystal size on to the MALDI slide, including sublimation, droplet inkjet printing, automatic matrix sprayer and manual spray using artist airbush 9 . We will use automatic matrix sprayer as an example in this protocol for its high reproducibility.

      1. Start up: Turn on the matrix sprayer unit, being sure that the valve is positioned at LOAD and launch the sprayer software. Check that the exhaust fan is operating well. Do not start the solvent pump if the active venting is not functioning properly.
      2. Confirm on the Comms tab that everything is communicating, and then start the solvent pump at .1 mL/min, with a backpressure of

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      Representative Results

      The representative experiment was performed according to the workflow shown in Abbildung 1. The developmental C57BL wildtype mouse brains of postnatal day 1, 21, 60 (adult) were harvested as described above following CUNY IACUC guidelines and were snap frozen for 2, 5 and 7 min, respectively, on an aluminum boat floating on liquid nitrogen. The frozen tissues were cryosectioned at 10 µm thickness sections at 󔼗 °C set for both specimen head and the chamber. The tissue cryosections were then gently transferred onto the pre-cooled conductive side of ITO-coated glass slides for MALDI imaging. Mounted cryosections on ITO slides were desiccated in vacuum for 45 min at room temperature, followed by matrix deposition using automatic matrix sprayer. Matrix NEDC was used to detect metabolites, and a matrix solution of 10 mg/mL in methanol/water (70/30, v/v) was deposited at a flow rate of 0.1 mL/min and a nozzle temperature of 75 °C for 12 cycles with 5 s drying between each cycle. A spray velocity of 1300 mm/min, track spacing of 2 mm, N2 gas pressure of 10 psi and flow rate of 3 L/min and nozzle height of 40 mm was used.

      MALDI mass spectra were acquired in negative ion mode by MALDI time of flight (TOF) MSI instrument. 0.5-1 µL of red phosphorus (Pn clusters with n = 1 - 90) emulsion in methanol was deposited onto the ITO slides, next to the mounted tissues, and used to calibrate the instrument in the 100 - 1000 m/z mass range by applying quadratic calibration curve 13 . The laser spot diameters were focused to "Medium" modulated beam profile for 50 µm raster width. Spectra within the mass range from m/z 50 to 1000 were acquired at a 1000 Hz for 500 shots. Mass spectra data were recorded, and the imaging was further analyzed using advanced MALDI MSI data analysis software. Ion images were generated with root-mean square (RMS) normalization at a bin width of ۪.25 Da.

      The results in Figur 2 show output images from MALDI MSI data analysis software of m/z spectra selected from every 100 Dalton interval, clearly depicting the utility for identification of spectra from small molecule metabolites to high molecular weight lipids. Each row depicts respective ion heat maps containing both spatial and spectral information of a certain metabolite species across three tissues collected at postnatal day 1, 21, and 60. For each representative m/z, analysis of regional distribution and ion abundances can be used to compare relative amounts of corresponding species between different ages. A strength of the MALDI MSI methodology is the ability to discern the specificity of certain species identified by m/z to developmental milestones or specific anatomical structures. Some metabolites are observed to be enriched in P1 neonates (m/z 320.1), enriched in P60 adults (m/z 846.5), or uniformly distributed across ages (m/z 480.3) other molecular species are specifically enriched in gray matter (m/z 117.1 524.3 765.1), white matter (m/z 673.4 846.5), or CSF/ventricles (m/z 239.0) (Figure 2A). The spatial distribution of representative metabolites including hypoxanthine (m/z 135.0), N-Acetyl-L-aspartic acid (m/z 174.0), Arachidonic acid (m/z 303.2), and several lipids such as lysophosphatidylethanolamine LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), phosphatidylethanolamine PE (44:10) (m/z 838.5), Phosphatidylinositol PI(38:4) (m/z 885.6) are also shown (FigureقB).


      Abbildung 1. Workflow of MALDI- time of flight (TOF) mass spectrometry imaging. The snap frozen tissue is cryrosectioned in cryostat and mounted on ITO slide. → The slide with tissue sections is coated with a fine layer of matrix using automatic matrix sprayer. → Mass spectra is collected by MALDI-TOF MSI instrument at a raster of 20-200um. → The data is analyzed, and the images are generated using advanced MALDI MSI data analysis software. Scale bar: 2 mm. Please click here to view a larger version of this figure.


      Figur 2. Representative output with selected m/z spectra from mass spectrometry acquired at 50 µm lateral resolution. (EIN) A heat map depicts the spatial distribution of specific metabolite species selected from every 100 Dalton m/z interval across the three developmental milestones identified at P1, P21 and P60. (B) The spatial distribution of representative metabolites at P1, P21 and P60, including: hypoxanthine, N-Acetyl-L-aspartic acid, Arachidonic acid, and different lipid species such as lysophosphatidylethanolamine (LPE), phosphatidylethanolamine (PE), Phosphatidylinositol (PI). Scale bar, 500 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

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      Diskussion

      MALDI-Imaging (MALDI-MSI) is a label-free imaging technique that allows researchers to investigate the distribution of various biomolecules and their modifications in tissue, the molecular basis of pathology. Combined use of MALDI-MSI with traditional LC-MS approaches for tissue analysis provides the same molecular depth as traditional Omics workflows but which also retains the spatial relationship of those signals within the cellular network. The sample preparation is the most critical step in MALDI MSI and accounts for the variation in the final read outs of metabolomics studies carried out in different labs 4 . Here we provide a comprehensive yet practical protocol to standardize the sample preparation for metabolomic profiling using MALDI MSI, in the hope that it benefits a broad research community to implement MALDI MSI in their current and future research from basic biology to translational studies.

      One must always bear in mind all precautions to minimize changes in the molecular profiles (both abundances and spatial distribution) during sample preparations and avoid contamination. Firstly, minimize the time between animal euthanasia and tissue harvesting, such as frozen in situ or heated by microwave fixation to inactivate enzymes in the brain to reduce the liability to postmortem ischemia 4 , 5 , 6 . Secondly, the snap freezing condition of the sample is critical. Inadequate freezing will cause the degradation and loss of the metabolites, while over freezing will lead to tissue fragmentation during cryosectioning. The freezing time should always be tested first according to previous reported studies, and the study of developmental mouse brain presented in this paper provides the reference points for rodent brain tissue. Thirdly, cutting of biological tissues and transferring their sections to the ITO slides will require adequate practice. It is important to note that while using the brush to pick up the section from the stage, the brush should be used delicately. Allow the bristles of brush to only come in contact with the edges of the tissue section to decrease the risk of contamination and section fragmentation. Flatten the section on the slide as much as possible, this will prevent the curling of the section during finger-warming. Fourthly, while mounting onto the ITO slide, make sure the entire section is well attached to the ITO slide as different regions of the tissue might require different time of finger-warming. For example, brain tumor tissue requires longer warming time than normal brain tissue. A poor mounting might lead to detachment and fragmentation of the tissue during MALDI-MS scanning. Bear in mind that the finger warming might enable enzyme action and metabolism causing artifactual changes of metabolites. Fifthly, a fine and uniform deposition of MALDI matrix plays an important role in achieving accurate spatial information and strong MALDI-MS signal. It is recommended to test the matrix spraying on a blank slide, and observe the crystal pattern under a microscope to verify proper coverage, before proceeding to the coating of precious specimen slide. And lastly, since an individual researcher executes the tissue harvesting and slide preparation at different speeds, it would be ideal to have one person to handle the sample preparation for the specimen in the same cohort, to minimize the variation.

      The protocol provided above details standard procedures, which can be tailored towards the needs of particular experiments. For example, a cryo-sectioning gel OCT, which is normally used in cryo-sectioning of the sample, can be further utilized as a mounting glue to the tissue chuck (as in the study described above). Prior studies have shown that the polymer component in OCT causes strong ion suppression 14 . However, embedding the sample may be unavoidable in the cases where the tissue is too fragile to be cut without additional support from a polymer gel. In order to combat signal suppression in these cases, the tissues may need to be washed with serial washing in 70% ethanol and 95% ethanol to remove residual OCT for the detection of proteins or lipids, while the washing is not recommended for the detection of small molecular metabolites 9 .

      MALDI MSI has grown increasingly relevant in both the research laboratory and clinical practice setting. For instance, MALDI MSI has recently proved useful in studies of proteomics in order to characterize the phenotypic functional status of an organism 15 , and in acting as an agent for microbial identification and diagnosis of subsequent disease 16 . While MALDI MSI supports a wide range of applications, there are some limitations associated with relying solely on this technique, especially when it comes to differentiating between similar species or metabolites, and the identification of specific targets. Another challenge is the quantification of the metabolites concentration according to MALDI MSI signals. It is often assumed that ion abundances in MALDI MSI spectra and the spatial distribution (or relative abundances) of corresponding molecular species across dissected tissues are well correlated. However, one should always bear in mind that the relationship between ion intensity and the amount of corresponding molecular species is complicated by numerous factors including, but not limited to, effects of ion suppression, changes in tissue structure and ion-molecule reactions 17 . Techniques that make use of internal standards can be implemented for absolute quantification (µmol/g tissue) in MALDI-MSI 18 . These two challenges are typically addressed with the combined workflow of MALDI MSI with liquid chromatography tandem MS(LC-MS/MS) techniques, whereby MALDI-MS allows for the mapping of the region of interest, which is later subjected to microextraction and LC-MS/MS to provide more information for identifying the metabolite 19 .


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