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1.4: DNA-modifizierende Enzyme - Biologie

1.4: DNA-modifizierende Enzyme - Biologie


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Methylasen

So wie die Untersuchung des bakteriellen Restriktions-Modifikationssystems eine Vielzahl spezifischer Endonukleasen zur Verfügung gestellt hat, gibt es auch eine Vielzahl spezifischer DNA-Methylasen.

  • Die Erkennungssequenzen der Methylasen sind die gleichen wie die der assoziierten Endonukleasen (z. B. EcoR1-Methylase erkennt und methyliert an der Sequenz "GAATTC").
  • Alle Methylasen übertragen die Methylgruppe von S-Adenosylmethionin (SAM) auf eine bestimmte Base in der Erkennungssequenz, und SAM ist eine erforderliche Komponente in der Methylierungsreaktion.
  • Die Methylierung von DNA hat normalerweise die Wirkung, die DNA vor der verwandten Restriktionsendonuklease zu schützen. Es gibt jedoch Methylasen mit minimaler Spezifität. Zum Beispiel, Sss I Methylase methyliert Cytosinreste in der Sequenz 5' … CG … 3'. In diesem Fall, die methylierte DNA wird vor einer Vielzahl von Restriktionsendonukleasen geschützt.
  • Einige Restriktionsendonukleasen schneiden DNA nur an ihren Erkennungsstellen, wenn die DNA ist methyliert (z. B. Dpn I).
  • Noch andere Restriktionsendonukleasen schneiden beide methylierte und nicht-methylierte DNA an ihren Erkennungssequenzen (z. B. BamHI).

Damm und dcm Methylierung

  • Die von kodierte Methylase Damm Gen (dam methylase) überträgt eine Methylgruppe von SAM auf das N6 Position der Adeninbase in der Sequenz 5' … GATC … 3'.
  • Die von kodierte Methylase dcm Gen (dcm-Methylase) methyliert die interne Cytosinbase, an der C5 Position, in den Sequenzen 5' … CCAGG … 3' und 5' … CCTGG … 3'.
  • Fast alle Stämme von E coli häufig beim Klonen verwendet haben a Damm+dcm+ Genotyp. Der Punkt ist hier nicht dass wir vor allem wollen, dass unsere DNA methyliert ist, aber das, um a dam-dcm- Host jemand muss die Bakterien mutieren und die richtige Mutante isolieren. Das ist bei vielen Bakterienstämmen offenbar nicht gelungen. Wahrscheinlich weil die Damm und dcm Methylierung betrifft nur eine kleine Untergruppe potenzieller Restriktionsendonukleasen

DNA isoliert aus dam+dcm+ Stämme wird nicht wirklich geschnitten durch eine bescheidene Untermenge verfügbarer Restriktionsendonukleasen:

Erkennungssequenz
Restriktionsenzym
GATC
gmichATC
TGATCA
Bcl I
+
-
GATC
Mbo I
+
-
ATCGAT
Cla I
+
-
TCTAGA
Xba I
+
-
TCGA
Taq I
+
-
GAAGA
Mbo II
+
-
GGTGA
Hph ich
+
-

DNA muss möglicherweise aus E. coli-Stämmen hergestellt werden, die dam-dcm- sind, um von diesen Enzymen geschnitten zu werden.

DNA-Polymerasen

Eine große Vielfalt von Polymerasen wurde charakterisiert und ist im Handel erhältlich. Alle DNA-Polymerasen haben zwei allgemeine Eigenschaften:

  1. Sie fügen Nukleotide hinzu 3'-OH-Ende einer Grundierung
  2. Die Reihenfolge der Nukleotide im entstehenden Polynukleotid ist Vorlage gerichtet

Abbildung 1.4.1: DNA Replikation

Zusätzlich zur 5'->3'-Polymerase-Aktivität können Polymerasen Exonuklease-Aktivität enthalten. Diese Exonukleaseaktivität kann entweder in 5'->3'-Richtung oder in 3'->5'-Richtung verlaufen.

  • Die Exonuklease-Aktivität in der 3'->5'-Richtung ermöglicht es der Polymerase, einen Fehler zu korrigieren, wenn sie ein falsches Nukleotid einbaut (sog.Fehlerkorrekturaktivität"). Es kann auch das 3'-Ende des Primers langsam abbauen.
  • Exonuklease-Aktivität in der 5'->3'-Richtung wird es ihm ermöglichen, jeden anderen hybridisierten Primer abzubauen, auf den es stoßen kann. Ohne 5'->3'-Exonuklease-Aktivität können blockierende Primer physikalisch ersetzt werden oder nicht, abhängig von der verwendeten Polymerase.

Unterschiedliche Polymerasen haben unterschiedliche Fehlerraten des Fehleinbaus und unterschiedliche Polymerisationsraten.

E. coli DNA-Polymerase I
E. coli DNA-Polymerase I - Klenow-Fragment
T4-DNA-Polymerase
T7-DNA-Polymerase
Taq DNA-Polymerase
M-MuLV Reverse Transkriptase
5' -> 3' Exonuklease-Aktivität
*
*
3' -> 5' Exonuklease-Aktivität
*
*
*
*
Fehlerrate (x10-6)
9
40
<1
15
285
Strangverschiebung
*
Hitzeinaktivierung
*
*
*
*

Anwendungen von Polymerasen

Die verschiedenen Aktivitäten der verschiedenen Polymerasen verleihen ihnen eine Vielzahl von Anwendungen. Beispielsweise können Restriktionsendonukleasen DNA-Fragmente mit entweder 3'- oder 5'-Nukleotid-"Überhängen" ergeben.

  • Im Fall von 5'-Überhängen kann die 5'->3'-Polymeraseaktivität diese auffüllen, um stumpfe Enden.
  • Im Fall von 3'-Überhängen kann die 3'->5'-Exonuklease-Aktivität, die in einigen Polymerasen (insbesondere T4-DNA-Polymerase) vorhanden ist, diese Enden "zurückkauen", um auch DNA-Fragmente mit glatten Enden herzustellen.

Abbildung 1.4.2: Polymerase-Aktivität

"Nick-Übersetzung"

Diese Methode wird verwendet, um hochradioaktiv markierte einzelsträngige DNA-Fragmente zu erhalten, die die 5'->3'-Exonuklease-Aktivität einiger Polymerasen (E coli DNA-Polymerase I zum Beispiel).

  • Bei diesem Verfahren wird ein interessierender DNA-Duplex "genickt" (d. h. einer der Stränge wird geschnitten; siehe DNAse I).
  • Dann wird DNA pol I zusammen mit radioaktiv markierten Nukleotiden hinzugefügt. Die 5'->3'-Exonuklease-Aktivität kaut das 5'-Ende an der "Nick"-Stelle weg und die Polymerase-Aktivität baut die radioaktiv markierten Nukleotide ein. Das resultierende Polynukleotid ist hochgradig radioaktiv markiert und hybridisiert an die interessierende DNA-Sequenz.

Abbildung 1.4.3: Nick-Übersetzung

  • Thermostabile Polymerasen haben die Fähigkeit, in Temperaturbereichen funktionsfähig zu bleiben, in denen der DNA-Duplex tatsächlich "schmelzt" und getrennt wird. Dies hat die Entwicklung der "Polymerase Kettenreaktion" Technik (PCR), die einen tiefgreifenden Einfluss auf die moderne Biotechnologie hatte. Wir werden diese Methode zu einem späteren Zeitpunkt besprechen.
  • Der Einbau von Didesoxybasen (d. h. keine Hydroxylgruppen am 2'- oder 3'-Kohlenstoff des Ribosezuckers) führt zu Beendigung der Polymerasereaktion. Dies wird später ausführlicher erörtert. Dieser Kettenabbruch durch Einbau von Didesoxynukleotiden ist jedoch die Grundlage des Sanger-Verfahrens der DNA-Sequenzierung sowie von Therapien, um zu versuchen, die Virusreplikation zu hemmen.

Nukleasen

Nuklease BAL-31

  • Das ist ein exoNuklease (beginnt an den Termini und arbeitet nach innen), die sowohl 3'- als auch 5'-Termini von doppelsträngiger DNA abbaut. Es wird keine internen Spaltungen ("Nicks") vornehmen, jedoch die DNA-Enden an bestehenden internen "Nicks" (die sowohl 3'- als auch 5'-Termini erzeugen) abbauen.
  • Der Abbau von Termini ist nicht koordiniert, d.h. das Produkt ist nicht 100 % stumpfe Enden (auch wenn die ursprüngliche Duplex möglicherweise stumpf endete).
  • Solche "zerlumpten" Enden können durch Auffüllen und Zurückkauen mit einer geeigneten Polymerase (z. B. T4-DNA-Polymerase) stumpf gemacht werden. Die Einheitendefinition von 1 Einheit ist die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 200 Basenpaare von jedem Ende der Duplex-DNA in 10 Minuten bei 30 °C zu entfernen.

Abbildung 1.4.4: Nuclease BAL-31-Aktivität

Exonuklease III

  • Katalysiert die schrittweise Entfernung von Nukleotiden von den 3'-Hydroxyltermini der Duplex-DNA.
  • Das Enzym greift das 3'-Hydroxyl an Duplex-DNA mit stumpfen Enden, mit 5'-Überhängen oder mit internen "Nicks" an.
  • Da Duplex-DNA benötigt wird, ist das Enzym wird nicht das 3'-Ende der Duplex-DNA verdauen, wo die Termini 3'-Überhänge sind.

Abbildung 1.4.5: Exonuklease III-Aktivität

Mungbohnennuklease (isoliert aus Mungbohnensprossen)

  • EIN Einzelstrang-spezifisch DNA- und RNA-Endonuklease, die Einzelstrangverlängerungen von den Enden von DNA und RNA abbaut und stumpfe Enden hinterlässt.
  • Die Einzelstrang-Erweiterungen können entweder 5'- oder 3'-Erweiterungen sein - beide werden entfernt und ein stumpfer Duplex verbleibt.

Abbildung 1.4.6: Mungbohnen-Nuklease-Aktivität

Desoxyribonuklease I (DNAse I) aus Rinderpankrease

  • Dieses Enzym hydrolysiert Duplex- oder einzelne DNA-Stränge bevorzugt an den Phosphodiester-Bindungen 5' nach Pyrimidin Nukleotide
  • In Anwesenheit von Mg2+ Ion greift DNAse I jeden Strang unabhängig voneinander an und erzeugt zufällige Nicks (nützlich für die Nick-Translation)
  • In Gegenwart von Mn2+-Ionen spaltet DNAse I beide DNA-Stränge an ungefähr der gleichen Position (aber hinterlässt "zerlumpte" Enden)

Ligasen

  • Ligasen katalysieren die Formation einer Phosphodiesterbindung zwischen nebeneinander angeordneten 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Termini von Nukleotiden (möglicherweise RNA oder DNA, abhängig von der Ligase).
  • Sie sind gewissermaßen das Gegenteil von Restriktionsendonukleasen, scheinen aber nicht von der lokalen Sequenz beeinflusst zu werden. an sich.
  • Ligasen erfordern entweder rATP oder NAD+ als Cofaktor, und dies steht im Gegensatz zu Restriktionsendonukleasen.

Im Folgenden sind verschiedene Arten von Ligasen und ihre Eigenschaften aufgeführt.

T4-DNA-Ligase

  • Isoliert aus Bakteriophage T4.
  • Ligiert die Enden der Duplex-DNA oder -RNA.
  • Dieses Enzym verbindet stumpfe Enden sowie Enden mit kohäsiven (komplementären) überhängenden Enden (entweder 3'- oder 5'-komplementäre Überhänge).
  • Dieses Enzym repariert auch einzelsträngige Nicks in Duplex-DNA, RNA oder DNA/RNA-Duplexen. Erfordert ATP als Cofaktor.

Taq DNA-Ligase

  • Diese Ligase katalysiert eine Phosphodiesterbindung zwischen zwei benachbarten Oligonukleotiden, die an einen komplementären DNA-Strang hybridisiert sind:

Abbildung 1.4.7: Taq-DNA-Ligase-Aktivität

  • Die Ligation ist nur dann effizient, wenn die Oligonukleotide perfekt mit dem Matrizenstrang hybridisieren.
  • Das Enzym ist bei relativ hohen Temperaturen (45 - 65 °C) aktiv. Erfordert NAD+ als Cofaktor.

T4-RNA-Ligase

  • Katalysiert die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen RNA/RNA-Oligonukleotiden, RNA/DNA-Oligonukleotiden oder DNA/DNA-Oligonukleotiden.
  • Erfordert ATP als Cofaktor.
  • Dieses Enzym benötigt keinen Matrizenstrang.

T4-RNA-Ligase kann für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich der Konstruktion von RNA/DNA-Hybridmolekülen.

Abbildung 1.4.8: T4-RNA-Ligase-Aktivität

DNA-Ligase (E. coli)

  • Katalysiert eine Phosphodiesterbindung zwischen Duplex-DNA mit zusammenhängenden Enden.
  • Es wird nicht Fragmente mit stumpfen Enden effizient ligieren.
  • Erfordert NAD+ als Cofaktor.

Abbildung 1.4.9: DNA-Ligase (E. coli) Aktivität

T4-Polynukleotidkinase

  • Katalysiert die Übertragung und den Austausch einer Phosphatgruppe vom g Position von rATP (Adenin-Ribose-Triphosphat-Nukleotid) zum 5'-Hydroxyl-Terminus von doppelsträngiger und einzelsträngiger DNA oder RNA, und Nukleosid-3'-Monophosphate.
  • Das Enzym entfernt auch 3'-Phosphorylgruppen.
  • Oligonukleotiden, die von automatisierten Synthesizern erhalten werden, fehlt eine 5'-Phosphatgruppe und sie können daher nicht an andere Polynukleotide ligiert werden.

T4-Polynukleotidkinase kann verwendet werden, um das 5'-Ende solcher Polynukleotide zu phosphorylieren:

Abbildung 1.4.10: T4-Polynukleotidkinase-Aktivität

Kälberdarmphosphatase (CIP)

  • Katalysiert die Entfernung von 5'-Phosphatgruppen von RNA, DNA und Ribo- und Desoxyribonukleosidtriphosphaten (z. B. ATP, rATP).
  • CIP-behandelter Duplex DNA kann sich nicht selbst ligieren.
  • Hemi-phosphorylierte Duplexe werden an einem Strang (dem phosphorylierten Strang) ligiert und bleiben am anderen "nicked".

Abbildung 1.4.11: CIP-Aktivität


T4-DNA-Ligase ( MB007 )

Beschreibung: T4-DNA-Ligase ist ein hochreines rekombinantes Enzym, das aus Escherichia coli wird mit einem optimierten 10× Reaktionspuffer geliefert, der ATP enthält. T4-DNA-Ligase katalysiert die Bildung einer Phosphodiester-Bindung zwischen nebeneinander angeordneten 5′-Phosphoryl- und 3′-Hydroxyl-Termini in Duplex-DNA. Es repariert Einzelstrang-Nicks in Duplex-DNA und verbindet sowohl stumpfe als auch kohäsive Restriktionsfragmente von Duplex-DNA oder -RNA. Das Enzym benötigt ATP als Cofaktor.

Merkmale:
– Frei von nachweisbaren unspezifischen Nuklease-, Endonuklease-, RNase- und DNase-Aktivitäten
– Geliefert mit einem optimierten Reaktionspuffer für effiziente Ligationsreaktionen

Anwendungen:
– Klonierung von Restriktionsfragmenten mit stumpfen und klebrigen (kohäsiven) Enden
– Klonen von PCR-Produkten
– Verknüpfung von Linkern und Adaptern mit DNA
– Nick reparieren
– Selbstzirkularisierung von linearer DNA

Spezifikationen:

Enzymkonzentration: 5 U/μl
Quelle: Rekombinant E coli Belastung
Optimale Reaktionstemperatur: 16-20 °C
Hitzeinaktivierung: 65 °C für 10 Minuten
Lagerbedingungen: Bei -20 °C lagern
Versandbedingungen: Versand mit Trockeneis

Komponenten:
– T4-DNA-Ligase (5 U/μl)
– Reaktionspuffer (4x)


Molekulare Zellbiologie. 4. Auflage.

DNA-Moleküle können sich im Raum zusammenrollen und biegen, was zu Veränderungen der Topologie führt, einschließlich der Bildung negativer oder positiver Superspulen. Wie beispielsweise in Kapitel 4 diskutiert, verursacht das lokale Abwickeln eines DNA-Duplexes, dessen Enden fixiert sind, Stress, der durch Supercoiling abgebaut wird. Die Enzyme, die die Topologie der DNA steuern, funktionieren bei mehreren verschiedenen Schritten der Replikation sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen. In diesem Abschnitt beschreiben wir die zwei verschiedenen Klassen von Topoisomerasen und ihre Rolle bei der DNA-Replikation.


DNase I (RNase frei)

Anwendungen:
DNase I wird üblicherweise Zelllysereagenzien zugesetzt, um die durch den DNA-Gehalt in bakteriellen Zelllysaten verursachte Viskosität zu entfernen oder um DNA-Matrizen von RNA zu entfernen, die durch in vitro-Transkription hergestellt wurde.
DNase I entfernt unerwünschte DNA aus Zelllysaten, um die Effizienz der Proteinextraktion zu verbessern.

Beschreibung:
DNase I (RNase-frei), Desoxyribonuklease I ist ein einzelnes, glykosyliertes Polypeptid, das einzel- und doppelsträngige DNA abbaut. Das Enzym arbeitet, indem es DNA in 5'-Phosphodinukleotid- und kleine Oligonukleotid-Fragmente spaltet.
DNase I wird für Anwendungen verwendet, die den Verdau von DNA erfordern, bei denen es entscheidend ist, eine Schädigung der RNA zu vermeiden.

Inhalt:
DNase I (RNase frei)
2 Einheiten/&mgr; DNase I in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2 und 50 % [v/v] Glycerin

DNase I Reaktionspuffer
10 x konz. Reaktionspuffer mit 100 mM Tris-HCl pH 7,6 (25°C), 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2

Reaktionsbedingungen
1x DNase I Reaktionspuffer
Inkubation bei 37 °C
Hohe Mengen an einwertigen Ionen wie Na + und K + (d. h. 100 mM) können die DNase I-Aktivität verringern.

Inaktivierung:
DNase I wird durch Inkubation bei 65 °C für 10 Minuten vollständig inaktiviert.

Aktivität:
> 2500 Einheiten/mg Protein


[1] Die DNase I-Aktivität wird auch in „Degradation Assay Units“ gemessen, definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 1 &mgr;g Plasmid-DNA in 10 Minuten bei 37 °C in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgCl . vollständig abzubauen2 und 13 mM CaCl2.
1 „Degradation Assay Unit“ entspricht 0,3 „Kunitz-Einheiten“.

Produktzitate:
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Ausgewählte Referenzen:
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. New York: Cold Spring Harbor Laborpresse 10.6
Tabor et al. (1997) DNA-abhängige DNA-Polymerasen. In: Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie. Ausubel et al., Hrsg. Wiley & Sons Inc. 3.5.4-6.
Pfanne et al. (1999)Ca2+-abhängige Aktivität von humaner DNase I und ihren hyperaktiven Varianten. Protein Sci. 8:1780.


Auswahltabelle für DNA-Polymerase

DNA-Ligasen bilden Phosphodiester-Bindungen zwischen DNA-Strängen und verbinden sie miteinander. DNA-Ligase ist für die Reparatur von Brüchen in einzel- und doppelsträngiger DNA verantwortlich. In Molekularbiologielabors wird DNA-Ligase häufig für molekulare Klonierungsanwendungen verwendet.

Jede DNA-Ligase hat spezielle Eigenschaften, die sie für bestimmte Anwendungen nützlich machen. Wenn Sie diese Eigenschaften kennen, können Sie die richtige ultrareine DNA-Ligase für Ihre Anwendung auswählen.


Amerika

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T4-DNA-Ligase

Einheitendefinition: Eine Weiss-Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um den Austausch von 1 nmol 32 P von Pyrophosphat zu ATP in Norit-adsorbierbares Material in 20 Minuten bei 37 °C zu katalysieren.

Versand: auf blauem Eis verschickt

Lagerbedingungen: bei -20 °C lagern
Gefrier-/Auftauzyklen vermeiden

Haltbarkeit: 12 Monate

Form: flüssig (Lieferung in 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 &mug/ml BSA und 50 % [v/v] Glycerin)

Konzentration: 2,5 Weiss-Einheiten/&mul (500 CE-Einheiten/&mul)

Beschreibung:
T4-DNA-Ligase katalysiert die Bildung einer Phosphodiester-Bindung zwischen nebeneinander angeordneten 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Termini in Duplex-DNA oder -RNA.

Inhalt:
Standard-Ligationspuffer, 10x konz.
500 mM Tris-HCl pH 7,8 bei 25 °C, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP und 25 &mgr;g/ml BSA

Fast Ligation Buffer, 2x konz.
60 mM Tris-HCl pH 7,8 bei 25 °C, 20 mM MgCl2, 20 mM DTT, 2 mM ATP und 10 % PEG

KomponenteEN-149SEN-149L
T4-DNA-Ligase160 &mul5 x 160 &mul
Standard-Ligationspuffer, 10x konz.1 ml5 x 1 ml
Fast Ligation Buffer, 2x konz.5 ml5 x 5 ml

Hitzeinaktivierung:
Die T4-DNA-Ligase kann durch Inkubation bei 65 °C für 10 Minuten inaktiviert werden.

  • Eine Cohesive-End Ligation Unit (CEU) ist definiert als die Enzymmenge, die für eine 50 %ige Ligation von . erforderlich ist Hind III-Fragmente von λ-DNA (5'-DNA-Termini-Konzentration von 0,12 &mgr;M, 300 &mgr;m/ml) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 &mgr;m in 30 Minuten bei 16°C in 1 × T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer.
  • Eine Weiss-Einheit entspricht ca. 200 CE-Einheiten.
  • T4-DNA-Ligase wird durch NaCl oder KCl stark gehemmt, wenn die Konzentration 200 mM überschreitet.
  • Die Ligation von stumpfendigen und Einzelbasenpaar-Überhangfragmenten erfordert etwa 50-mal so viel Enzym, um das gleiche Ligationsausmaß wie bei DNA-Fragmenten mit kohäsiven Enden zu erreichen. Die Ligation mit stumpfen Enden kann durch Zugabe von PEG 4000 (10% w/v Endkonzentration) oder Hexaminchlorid oder durch Reduzieren der ATP-Konzentration auf 50 &mgr;M verstärkt werden.
  • Zum Verdünnen von T4 DNA Ligase für die anschließende Lagerung bei -20 °C sollte ein Lagerpuffer mit 50 % Glycerin verwendet werden, zum Verdünnen von Ligase für den sofortigen Gebrauch wird 1x Reaktionspuffer empfohlen.


Testaufbau:
Standard-Ligationsassay

Komp.Endbetrag/Konz.20 &mul-Test
Standard-Ligationspuffer, 10x konz.1x2 &mul
Vektor/DNA einfügen100 ng - 1 &becher100 ng - 1 &becher
T4-DNA-Ligase0,1 - 1 Weiss-Einheiten0,04-0,4 &mul
Wasser in PCR-Qualität-auffüllen bis zu 20 &mul

Für eine optimale Ligation 20 - 30 min bei 16 °C inkubieren.

Komp.Endbetrag/Konz.20 &mul-Test
Fast Ligation Buffer, 2x konz.1x10 &mul
Vektor/DNA einfügen100 ng - 1 &becher100 ng - 1 &becher
T4-DNA-Ligase0,1 - 1 Weiss-Einheiten0,04-0,4 &mul
Wasser in PCR-Qualität-auffüllen bis zu 20 &mul

Inkubieren für 5 min für Ligationen mit kohäsiven Enden oder 15 min für Ligationen mit stumpfen Enden bei Umgebungstemperatur (20 - 25 °C).

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Restriktionsenzymverdauung

Die Herstellung von DNA für traditionelle Klonierungsverfahren hängt vom Restriktionsenzymverdau ab, um kompatible Enden zu erzeugen, die miteinander ligiert werden können. Die zu klonierende DNA kann stark variieren, von genomischer DNA, die aus einer reinen Bakterienkultur oder einer gemischten Population extrahiert wurde, bis hin zu einem zuvor klonierten Gen, das von einem Vektor auf einen anderen übertragen werden muss (Subklonierung). Restriktionsenzyme können auch verwendet werden, um kompatible Enden an PCR-Produkten zu erzeugen. In allen Fällen werden ein oder mehrere Restriktionsenzyme verwendet, um die DNA zu verdauen, was entweder zu einer ungerichteten oder gerichteten Insertion in das kompatible Plasmid führt.

Genomische DNA wird unabhängig von der Quelle typischerweise mit Restriktionsenzymen verdaut, die 6-8 aufeinanderfolgende Basen erkennen, da diese Erkennungsstellen im Genom weniger häufig vorkommen als 4-Basen-Stellen und zu größeren DNA-Fragmenten führen. Die gewünschte Insertgröße für die Klonbibliothek bestimmt, welche Enzyme ausgewählt werden, sowie die Verdauungsbedingungen. Am häufigsten wird eine serielle Verdünnung des ausgewählten Restriktionsenzyms bzw. der ausgewählten Restriktionsenzyme verwendet, um das Ausgangsmaterial zu verdauen, und der gewünschte Insert-Größenbereich wird durch Elektrophorese, gefolgt von Gelextraktion der DNA, isoliert. Dieses Herstellungsverfahren liefert DNA-Fragmente der gewünschten Größe mit Enden, die mit der ausgewählten Vektor-DNA kompatibel sind.

Die Subklonierung erfordert die Verwendung von 1-2 Restriktionsenzymen, die unmittelbar außerhalb des Insertfragments schneiden, ohne innerhalb des Inserts selbst zu schneiden. Restriktionsenzyme, die eine Erkennungsstelle innerhalb der multiplen Klonierungsstelle (MCS) aufweisen, werden üblicherweise verwendet, da sie nicht an anderer Stelle in der Vektor-DNA schneiden und typischerweise zwei leicht aufzulösende DNA-Fragmente produzieren. Das interessierende Gen wird am häufigsten in einen Expressionsvektor subkloniert, um die Proteinexpression und/oder die Zugabe eines Reinigungs-Tags zu verbessern. In diesem Fall ist es wichtig, dass das Gen in der richtigen Orientierung und im Leseraster mit dem Transkriptionspromotor eingefügt wird.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird üblicherweise verwendet, um ein interessierendes Gen oder DNA-Fragment aus einer beliebigen zu klonierenden DNA-Quelle zu amplifizieren. Um kompatible Enden zu erzeugen, ist es üblich, dem 5'-Ende beider PCR-Primer Restriktionsstellen hinzuzufügen. Beim Hinzufügen von Restriktionsstellen zu einem PCR-Primer wird empfohlen, 6 Basen zwischen der Erkennungsstelle und dem 5-Ende des Primers einzuschließen. Diese zusätzlichen Basen stellen ausreichend DNA für das Restriktionsenzym bereit, um die Erkennungsstelle zu binden und effizient zu schneiden. Bei der Auswahl einer oder mehrerer Restriktionsstellen zum Hinzufügen zu den Primern ist es wichtig zu bestimmen, welche Stelle(n) mit Ihrem ausgewählten Vektor kompatibel sind, ob eine gerichtete Klonierung erwünscht ist und vor allem zu bestätigen, dass die Erkennungsstelle(n) kommt nicht innerhalb des Gens oder DNA-Fragments vor.


Enzyme, die an der DNA-Replikation beteiligt sind

Dies ist die Liste der Enzyme, die an der DNA-Replikation beteiligt sind. Lassen Sie uns dies im Detail besprechen…

  • Einzelsträngiges Bindungsprotein (SSBP)
  • DNA-Helikasen
  • Topoisomerasen
  • DNA-Primase
  • DNA-Ligase
  • DNA-Polymerasen

1. Einzelsträngiges Bindungsprotein (SSBP)

SSBP bedeutet Einzelsträngige Bindungsproteine. Es spielt eine sehr wichtige Rolle bei der DNA-Replikation in E.Coli.

Einzelsträngige Bindungsproteine ​​binden an einzelsträngige DNA und stabilisieren sie während der DNA-Replikation, bis die einzelsträngige DNA als Matrize für einen neuen Strang zum Binden verwendet werden kann.

Die SSB-Proteine ​​hefteten sich sowohl an den nacheilenden Strang als auch an den führenden Strang, um eine erneute Assoziation der Stränge zu verhindern.

2.DNA-Helikase

  • DNA-Helikase-Enzymfunktionen „Unwinds DNA“.
  • Sie haben ein Molekulargewicht von 300.000, das SECHS identische Untereinheiten enthält.
  • Okazaki-Fragmente“ sind kurze Abschnitte von 1000-2000 Basen, die bei diskontinuierlicher Replikation entstehen und später zu einem kovalent intakten Strang verbunden werden.
  • Die "DNA.B-Helikase" und "DNA.G Primase“ stellen eine funktionelle Einheit innerhalb des Replikationskomplexes dar, die als „PRIMOSOME“ bezeichnet wird.
  • Die DNA wird von der Dna.B-Helikase an der Replikationsgabel umgeben, DNA-Primase verbindet sich gelegentlich mit Dna.B-Helikase und synthetisiert einen kurzen RNA-Primer.
  • Es wird angenommen, dass die "Helikase"- und "Nuklease"-Aktivitäten des Rec B, C, D-Enzyms helfen, die homologe genetische Rekombination in E. coli zu initiieren. Es ist auch an der Reparatur von Doppelstrangbrüchen an der kollabierten Replikationsgabel beteiligt.
  • Eine „Helicase“ ist ein Enzym, das die DNA-Stränge in der Regel durch Hydrolyse von ATP trennt, um die notwendige Energie bereitzustellen.

3. Topoisomerasen

  • Topoisomerase wird auch als „DNA-Gyrase“ bezeichnet.
  • „Topoisomerasen“ ist ein Enzym, das die „Linking Number“ (Lk) verändern kann.
  • Jede Zelle hat Enzyme, die das Ausmaß der DNA-Entwindung erhöhen (oder verringern) werden als "Topoisomerasen" bezeichnet. Die Eigenschaft der DNA, dass sie sich ändern, ist die Verknüpfungszahl.
  • Topoisomerasen“ spielen diese Enzyme eine besonders wichtige Rolle bei Prozessen wie „Replikation“ und „DNA-Verpackung“.
  • Es gibt zwei Klassen von Topoisomerasen.
    • Typ-I-Topoisomerasen
    • Typ-II-Topoisomerasen

    Ein) Typ-I-Topoisomerasen:

    Dies geschieht durch das vorübergehende Brechen eines der beiden DNA-Stränge, das Drehen eines der Enden des ungebrochenen Strangs und das Wiederverbinden der gebrochenen Enden, wobei sie Lk in Schritten von 1 ändern.

    B) Typ-II-Topoisomerasen:

    Das Enzym bricht beide DNA-Stränge und ändert Lk in Schritten von 2.

    Prokaryotische Topoisomerasen

    VIER verschiedene Topoisomerasen (I und IV) kommen in E.Coli vor.

    1) Typ.I (Topoisomerase I und III):

    Der Typ I relaxiert im Allgemeinen die DNA, indem negative Supercoils entfernt werden (Erhöhung von Lk)

    2) Typ.II (Topoisomerase II und IV):

    Die Topoisomerase II wird auch als „DNA-Gyrase“ kann negative Superspulen einführen. (Lk verringern).

    • Es nutzt die Energie von ATP und einen überraschenden Mechanismus, um dies zu erreichen.
    • Der Grad des Supercoilings von bakterieller DNA wird durch Regulierung der Nettoaktivität von Topoisomerase-I und II aufrechterhalten.

    Eukaryontische Topoisomerasen

    Eukaryontische Zellen haben auch Typ-I- und Typ-II-Topoisomerasen. Topoisomerasen-I &. II sind beide vom Typ-I. Die beiden Typ-II-Topoisomerasen, Topoisomerasen IIa und IIb, können DNA nicht abwickeln (negative Supercoils einführen).

    Obwohl beide positive und negative Superspulen entspannen können. Wir betrachten einen wahrscheinlichen Ursprung negativer Supercoils in eukaryontischen Zellen.

    • Das Molekulargewicht der DNA-Gyrase beträgt 400.000, sie enthält VIER Untereinheiten und funktioniert „Supercoiling“.
    • Supercoiled DNA ist eine Struktur höherer Ordnung, die in ringförmigen DNA-Molekülen vorkommt, die um einen Kern gewickelt sind.

    Wie lautet die Verlinkungsnummer?

    Die Verknüpfungszahl (Lk) ist eine topologische Eigenschaft. Lk kann definiert werden als „die Häufigkeit, mit der der zweite Strang die Oberfläche des zweiten Strangs durchsticht“.

    4. DNA-Primase

    Bei der Replikation müssen, bevor DNA-Polymerase iii mit der Synthese von DNA-Primern beginnen kann, auf der Matrize im Allgemeinen kurze RNA-Segmente vorhanden sein, die von einem Enzym namens „Primasen”.

    • DNA-Primase hat ein Molekulargewicht von 60.000 Dalton und enthält nur eine einzige Untereinheit, die zur Synthese von RNA-Primern dient.
    • Die Dna.B-Helikase und die Dna.G-Primase bilden eine funktionelle Einheit innerhalb des Replikationskomplexes, die als „Primosom”.
    • Der RNA-Primer ist typischerweise 15-50 Basen lang. Es synthetisiert Primer, die mit der Sequenz pppAG beginnen, gegenüber der Sequenz 3’-GTC-5’ im Template.

    5. DNA-Ligase

    Ein Enzym, das eine Phosphodiesterbindung zwischen dem 3’-Ende eines DNA-Segments und dem 5’-Ende eines anderen herstellt. Nachdem der RNA-Primer entfernt und ersetzt wurde, müssen die benachbarten Okazaki-Fragmente miteinander verbunden werden. Das 3'-OH-Ende eines Fragments grenzt an das 5'-Phosphat-Ende des vorherigen Fragments. Verantwortlich für die Versiegelung dieser Kerbe ist das Enzym DNA-Ligase. Ligasen sind sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vorhanden.

    Mechanismus der Enzymaktivität:

    Die E.Coli und T4 Ligasen haben die Eigenschaft, Kerben mit 3’'-OH- und 5'-P-Termini zu versiegeln. Beide Enzyme führen eine zweistufige Reaktion durch, an der ein „Enzym-AMP-Komplex“ beteiligt ist.

    Das AMP des Enzymkomplexes wird an das 5’-Phosphat des Nicks gebunden und dann wird eine Phosphodiesterbindung mit dem 3’-OH-Terminus des Nicks gebildet, wodurch das Enzym und das AMP freigesetzt werden.


    Informationen zum Autor

    Mitgliedschaften

    Abteilung für Signalgebung und Genexpression, La Jolla Institute for Immunology, 9420 Athena Circle, La Jolla, CA, 92037, USA

    Atsushi Onodera, Edahí González-Avalos, Chan-Wang Jerry Lio, Romain O. Georges und Anjana Rao

    Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba, 260-8670, Japan

    Atsushi Onodera und Toshinori Nakayama

    Institute for Global Prominent Research, Chiba University, 1-33, Yayoicho, Inage-ku, Chiba, 263-8522, Japan

    Graduiertenprogramm für Bioinformatik und Systembiologie, University of California, San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093, USA

    Derzeitige Adresse: Department of Microbial Infection and Immunity, Ohio State University, 460 W 12th Ave, Columbus, OH, 43210, USA

    Cancer Signalling and Epigenetics Program & Cancer Epigenetics Institute, Fox Chase Cancer Center, 333 Cottman Avenue, Philadelphia, PA, 19111, USA

    AMED-CREST, AMED, 1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba, 260-8670, Japan

    Department of Pharmacology and Moores Cancer Center, University of California, San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093, USA

    Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 2880 Torrey Pines Scenic Drive, La Jolla, CA, 92037, USA

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    Beiträge

    A. O. erfasst, analysiert und interpretiert die Daten. ZB-A. einige der bioinformatischen Analysen durchgeführt. C.-W.L. bereitgestellte CMS-IP-Datensätze in BMDMs. R.O.G. erhalten und gepflegt Tdg fl/fl Mäuse und konzipierte und führte die Zucht für bedingte Tdg Deletion bei Mäusen. A. B. vorausgesetzt die Tdg fl/fl Mäuse und Ratschläge zu einigen Experimenten. T. N. lieferte Ratschläge und wichtige Reagenzien für die T-Zell-Experimente. A. O. und A. R. konzipierte die Experimente, interpretierte die Daten und schrieb das Manuskript. Alle Autoren waren an der Überprüfung und Bearbeitung des Manuskripts beteiligt. Die Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

    Korrespondierender Autor


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