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Wie verursacht Formaldehyd die Protein-DNA-Vernetzung?

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Wie verursacht Formaldehyd eine Protein-DNA-Vernetzung? Ich würde vermuten, dass das daran liegt, dass das stark polare Wassermolekül stark mit polaren Resten auf einem Protein-DNA-Komplex interagiert und das Hinzufügen eines weniger polaren Lösungsmittels dazu führt, dass DNA und Protein enger aneinander ziehen als ihr Zug am Lösungsmittel, aber ich habe habe im Internet keine Antwort gefunden.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2866014/

In dieser Arbeit stellen sie fest, dass die Formaldehyd-Vernetzung durch die Bildung eines Methyloladdukts (aufgrund des nukleophilen Angriffs durch N oder S im Fall von Proteinen) im Protein erfolgt, das dann die DNA angreift oder umgekehrt. Die letzte Vernetzung erfolgt durch eine Methylenbrücke

Formaldehyd kann mit Aminogruppen in Nukleotiden und Proteinen reagieren und eine Schiffsche Base bilden, aber ich habe keine Ahnung, wie dies an der Vernetzung beteiligt ist


Wie verursacht Formaldehyd eine Protein-DNA-Vernetzung? - Biologie


Kendric C. Smith 1 und Martin D. Shetlar 2

1 Emeritierter Professor, Radioonkologie (Strahlenbiologie)
Medizinische Fakultät der Stanford University
800 Blossom Hill Road, Einheit R169, Los Gatos, CA 95032
[email protected]
web.stanford.edu/

2 Emeritierter Professor für Chemie und Pharmazeutische Chemie
Pharmazieschule, Raum S-822
Universität von Kalifornien, Box 0912
Parnassus-Allee 513
San Francisco, CA 94143-0912
[email protected]

Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist in lebenden Zellen mit einer Vielzahl von Proteinen verbunden. Daher ist es logisch anzunehmen, dass die ultraviolette (UV) Bestrahlung von Zellen zu reaktiven Wechselwirkungen zwischen DNA und den mit ihr in Kontakt stehenden Proteinen führen könnte. Eine solche Reaktion, die man sich vorstellen kann, besteht darin, dass die Aminosäuren in diesen assoziierten Proteinen mit den Basen in der DNA vernetzt werden können. Tatsächlich treten solche Reaktionen auf und scheinen wichtige Prozesse zu sein, die photoangeregte DNA durchläuft in vivo, sowie in DNA-Protein-Komplexen in vitro. [siehe unten]

Das erste Beispiel einer UV-induzierten Vernetzung von DNA und Proteinen in einem lebenden System (Escherichia coli) wurde 1962 berichtet (Smith, 1962). In derselben Studie wurde festgestellt, dass die Behandlung von E coli mit Acridinorange und sichtbarem Licht führte ebenfalls zu einer DNA-Protein-Vernetzung. Tatsächlich wurde auf der Grundlage der Strahlungsdosis, die erforderlich ist, um die gleiche Verringerung der Koloniebildung zu bewirken, festgestellt, dass sichtbares Licht plus Farbstoff einen größeren Prozentsatz der DNA vernetzte als UV-Strahlung. Andererseits erzeugte die Röntgenbestrahlung wenig, wenn überhaupt, eine Vernetzung (siehe unten) (Smith, 1962). Seit diesen frühen Studien wurde eine photoinduzierte DNA-Protein-Vernetzung in anderen zellulären Systemen sowie in isolierten DNA-Protein-Komplexen beobachtet. Zu den letzteren zählen die Vernetzung von Histonen mit DNA in eukaryontischen Nukleosomen, die Vernetzung von RNA-Polymerase und DNA-Polymerasen mit DNA und die Vernetzung des Gen-5-"schmelzenden" Proteins vom fd-Phagen zu einzelsträngiger DNA. (Für Übersichten und Referenzen siehe Smith, 1976, Shetlar, 1980, Saito und Sugiyama, 1990).

Nachweis von DNA-Protein-Crosslinks

Zum Nachweis von DNA-Protein-Quervernetzungen wurde eine Reihe von Verfahren entwickelt (Übersicht in Shetlar, 1980). Das erste verwendete Verfahren beruhte auf der Extraktion proteinfreier DNA aus Zellen nach UV-Bestrahlung. DNA kann isoliert werden aus E coli frei von Protein unter Verwendung eines Detergenz-(Natriumdodecylsulfat)-Extraktionsverfahrens (Smith und Kaplan, 1961 Smith, 1962).

UV-induzierte Vernetzungen. Mit zunehmender UV-Strahlung nimmt die Menge an freier DNA, die extrahiert werden kann, linear ab und die Menge an DNA, die mit denaturierten Proteinen assoziiert bleibt (Abbildung 1).

Beachten Sie, dass 30 % der DNA siebenmal empfindlicher gegenüber der Vernetzung mit Protein sind als der Rest (siehe unten). Bei einer UV-Dosis, die 99 % der Zellen abtötet, waren etwa 10 % der DNA mit Proteinen vernetzt (Smith, 1962).

Wie man vorhersagen könnte, ist es der replizierende Teil des DNA-Chromosoms, der gegenüber UV-induzierter Vernetzung mit Protein empfindlicher ist (Smith, 1964a). Dies wurde durch Pulsmarkierung einer Log-Phasen-Kultur von . getestet E coli mit tritiiertem Thymin und dann Ersetzen des radioaktiven Thymins durch nicht-radioaktives Thymin und Ermöglichen eines exponentiellen Wachstums der Kultur. Über 2 Generationen hinweg wurden zu unterschiedlichen Zeiten Proben entnommen, bestrahlt und analysiert (Abbildung 2).

Dieses Experiment legt nahe, dass die Replikationsproteine ​​am empfindlichsten für die DNA-Protein-Vernetzung sind, d. h. die DNA-Protein-Vernetzung war unmittelbar nach der Pulsmarkierung am größten und wiederum eine und zwei Generationen nach der Pulsmarkierung.

Photosensibilisierte Crosslinks. Wenn Bakterienzellen mit Acridinorange oder Methylenblau vorbehandelt und dann intensivem sichtbarem Licht ausgesetzt wurden, ging das Überleben merklich zurück, und ein großer Teil ihrer DNA war mit Proteinen vernetzt. Es besteht eine Korrelation zwischen der relativen Abtötungseffizienz der beiden Farbstoffe und der relativen Produktion von DNA-Protein-Crosslinks (Abbildung 3).

Röntgeninduzierte Crosslinks. Nach einer Röntgenaufnahme von 1 krad gab es einen Verlust von etwa 5 % in der Extrahierbarkeit der DNA aus E coli B, aber Dosen bis zu 40 krad änderten diesen Wert nicht (Smith, 1962). Diese Ergebnisse können durch die Tatsache erklärt werden, dass Röntgenstrahlen eine signifikante Menge an Einzel- und Doppelstrangbrüchen in der DNA erzeugen, und die Tatsache, dass der Assay von der selektiven Präzipitation von DNA mit hohem Molekulargewicht, die mit Protein vernetzt ist, abhängt.

Röntgeninduzierte Quervernetzungen werden jedoch beobachtet, wenn Zellen unter Stickstoff bestrahlt werden (Barker et al., 2005). Unter Stickstoff werden dreimal weniger DNA-Doppelstrangbrüche gebildet, als wenn Zellen unter Sauerstoff bestrahlt werden (Bonura et al., 1975). Durch Röntgenstrahlen induzierte DNA-Additionsreaktionen sind jedoch üblich, einschließlich DNA-DNA-Crosslinks (Myers, 1976).


Photoreaktionen von Nukleobasen und Nukleosiden mit Aminosäuren und verwandten Verbindungen

Die erste Aminosäure, von der gezeigt wurde, dass sie sich photochemisch an Uracil addiert, war Cystein, um 5-S-Cysteinyl-6-hydrouracil zu bilden (Smith und Aplin, 1966). Die chemische Struktur des gemischten Photoprodukts aus Thymin und Cystein wurde ebenfalls bestimmt (Smith, 1970) (Abbildung 4). Spätere Arbeiten zeigten, dass diese Verbindung photochemisch in zwei diastereomeren Formen hergestellt wird und dass zwei andere Verbindungen, nämlich 5-S-Cysteinylmethyluracil (Varghese, 1973) und 5-S-Cysteinyl-5,6-dihydrothymin (Shetlar und Hom, 1987) ) werden auch produziert, wenn Thymin in Gegenwart von Cystein bestrahlt wird.


Die Photoreaktivität verschiedener Polynukleotide für die Anlagerung von [ 35 S]Cystein wurde ebenfalls untersucht. Die Geschwindigkeitskonstanten für diese Reaktion wurden gemessen poly rU erwies sich als am reaktivsten (k=21.8), gefolgt von poly rC (k=8.1), poly dT (k=5.4) und poly rA (k=0.6). Ribonukleinsäure zeigte eine biphasische Reaktion mit k=21,8 und k=4,8 (Smith und Meun, 1968).

Zusätzlich zu den Produkten der Photoreaktionen von Thymin und Uracil mit Cystein wurden Photoprodukte in einer Reihe anderer Systeme charakterisiert, die Nukleobasen (oder Nukleoside) und Aminosäuren (oder Aminosäureanaloga) enthalten (Übersicht in Saito und Sugiyama, 1990). . Beispielsweise führt die Reaktion von Thymin mit dem in N-Acetyltyrosin enthaltenen phenolischen Ringsystem zu einer Verbindung mit der in Abbildung 4 gezeigten Struktur (Shaw et al., 1998), während die Reaktion von Thymidin mit Lysin ein Photoprodukt einer sehr unterschiedlicher Natur (Abbildung 5) (Saito et al., 1981, 1983a). Die Herstellung dieser Verbindung beinhaltet den Angriff der ε-Aminoeinheit des Lysins auf die Carbonylgruppe in der 2-Position von Thymidin. Es gibt Hinweise darauf, dass Cytosin und 5-Methylcytosin (eine untergeordnete Nukleobase, die in eukaryotischer DNA gefunden wird) mit Lysin unter Bildung von Addukten ähnlicher Natur photoreagieren (Dorwin et al., 1988).

Interessanterweise reagiert 5-Methylcytosin auch mit Cystein-Analoga (z. B. 3-Mercaptopropionsäure) unter Bildung eines 5-Methylcytosin-Produkts mit einer Struktur, die der des in Abbildung 5 gezeigten Lysinaddukts analog ist (dh NHR2 wird durch eine SR2-Einheit ersetzt und R1 = H) (Shetlar und Chung, 2013).

Andere neuere Arbeiten (Shetlar et al., 2013) zeigen, dass 2'-Desoxycytidin-Photohydrate (sowie 2'-Desoxyuridin- und Uridin-Hydrate) mit Alkylaminen (und Polyaminen) in einer sekundären Dunkelreaktion bei nahezu neutralem pH reagieren, um ein Desoxycytidin zu bilden Addukt (Desoxyuridin-Addukt, Uridin-Addukt), analog zu dem in Abbildung 5 gezeigten, bei dem die angelagerte Amineinheit als NR1 und die Zuckereinheit als NHR2 angehängt wird. Frühe Arbeiten (Janion und Shugar, 1967) zeigten, dass Dihydrocytosine im Dunkeln Transaminierungsreaktionen eingehen können, bei denen aliphatische Amine die 4-Aminogruppe der Dihydroverbindung verdrängen, um "transaminierte" Dihydrocytosine zu bilden. Der gleiche Reaktionstyp tritt auch bei Cytosinnukleosid-Photohydraten auf, bei denen die 5,6-Bindung gesättigt ist. Insbesondere wurde gezeigt, dass diese Reaktion bei Bestrahlung des RNA-Bakteriophagen MS2 auftritt, was zu einer Quervernetzung von Lysinresten im Hüllprotein mit der genomischen Nukleinsäure führt (Budowsky et al., 1976). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sekundäre Dunkelreaktionen nach der Bildung von primären Photoprodukten in der DNA eine Rolle bei der DNA-Protein-Vernetzung spielen können. Die Bestimmung der Beiträge verschiedener sekundärer Vernetzungsreaktionen zur gesamten Photochemie der DNA in ihrer zellulären Umgebung kann ein fruchtbares Feld für weitere Studien sein.


Andere Aminosäuren sind auch mit Nukleobasen und Polynukleotiden reaktiv. Die erste durchgeführte Untersuchung bestimmte die Fähigkeit der 22 gängigen Aminosäuren, sich photochemisch (254 nm) an Uracil zu addieren. Die 11 reaktiven Aminosäuren waren Glycin, Serin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystin, Cystein, Methionin, Histidin, Arginin und Lysin. Die reaktivsten Aminosäuren waren Phenylalanin, Tyrosin und Cystein. Daher scheint die photochemische Addition von Aminosäuren an Uracil ein ziemlich häufiges Phänomen zu sein (Smith, 1969). Eine spätere Untersuchung der Photoreaktivität von Polyuridylsäure zeigte, dass alle 20 Aminosäuren sowie eine Vielzahl von Glycylpeptiden und anderen Peptiden reaktiv waren (Shetlar et al., 1984c).

Wenn Thymin in ähnlicher Weise auf photochemische Reaktivität mit 22 gängigen Aminosäuren untersucht wurde, bildeten nur Lysin, Arginin, Cystein und Cystin nach Expositionszeiten ähnlich denen für Uracil Heteroaddukte. Thymin war im Allgemeinen weniger reaktiv als Uracil mit Aminosäuren, wenn es UV-Strahlung ausgesetzt wurde (Schott und Shetlar, 1974). Dies kann auf die Abschirmung von Kohlenstoff-5 in Thymin durch die Methylgruppe an dieser Position zurückzuführen sein.

In einer anderen Studie wurde ein Fluoreszenz-Assay-Verfahren verwendet, um die Photoreaktivität von DNA und Polynukleotiden für die Zugabe verschiedener Aminosäuren und Peptide zu bewerten. Die Reaktivitäten der 20 üblicherweise in Proteinen vorkommenden Aminosäuren wurden für ihre photochemische Addition an denaturierte Kalbsthymus-DNA bei pH 7 bestimmt. Fünfzehn Aminosäuren waren reaktiv, wobei Cystein, Lysin, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin die reaktivsten waren. Alanin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin und Threonin waren nicht reaktiv (Shetlar et al., 1984a). Entsprechende Quantenausbeuten wurden auch für viele der Glycyldipeptide (z. B. Glycylserin) derselben Aminosäuren bestimmt. Es zeigte sich, dass von den untersuchten Peptiden diejenigen am reaktivsten waren, die Lysin, Cystin, Prolin, Histidin und die verschiedenen aromatischen Säuren (Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan) enthielten (Glycylcystein wurde nicht untersucht). Interessanterweise zeigten alle untersuchten Aminosäuren in Peptidform ein gewisses Maß an Reaktivität. In fast allen Fällen zeigten in Peptide eingebaute Aminosäuren bei gleicher Konzentration eine höhere Reaktivität gegenüber Photoaddition als die entsprechenden carboxyterminalen Aminosäuren.

Ähnliche Messungen wie bei der DNA-Photoreaktivität wurden an der photochemischen Reaktivität von vier Polyribonukleotiden, nämlich poly rA, poly rC, poly rG und poly rT, gegenüber der Addition von Glycin und den üblicherweise in Proteinen vorkommenden L-Aminosäuren, mit Ausnahme von Prolin, durchgeführt (Shetlar et al., 1984b). Poly rA war mit elf der zwanzig getesteten Aminosäuren reaktiv, wobei Phenylalanin, Tyrosin, Glutamin, Lysin und Asparagin die reaktivsten waren. Poly rG reagierte mit sechzehn Aminosäuren Phenylalanin, Arginin, Cystein, Tyrosin und Lysin und zeigte die größten Quantenausbeuten. Poly rC zeigte Photoreaktivität mit fünfzehn Aminosäuren, wobei Phenylalanin, Lysin, Cystein, Tyrosin und Arginin die höchsten Reaktivitäten aufwiesen. Poly rT war mit 15 von 19 untersuchten Aminosäuren reaktiv und zeigte die höchsten Quantenausbeuten für Cystein, Phenylalanin, Tyrosin, Lysin und Asparagin. Keines der Polynukleotide reagierte mit Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Studien zur Photoaddition verschiedener Glycyldipeptide mit jedem der Polynukleotide zeigten, dass diese oft reaktiver waren als die Aminosäuren selbst. Im Allgemeinen war poly rT das reaktivste Polynukleotid gegenüber der Photoaddition für die meisten der untersuchten Aminosäuren und Peptide. Beispielsweise lagen die Quantenausbeuten für die Photoaddition von Phenylalanin an poly rT, poly rC, poly rA und poly rG im Verhältnis 80:4:5:3.

Brom- und iodsubstituierte Uracile und Cytosine sind auch zur Photoreaktion mit Aminosäuren befähigt. Zum Beispiel 5-Bromuracil-Photopaare mit Tyrosin, Tryptophan und Histidin (Dietz und Koch, 1987) sowie Peptidbindungen (Dietz et al., 1987). 5-Bromuracil reagiert auch mit Ethylamin (Shetlar et al., 1991), einem Lysin-Analogon, um eine Verbindung zu bilden, die der bei der Reaktion von Thymin mit Lysin gebildeten analog ist (Fig. 5).

Zellen von E coli deren Thymin durch 5-Bromuracil ersetzt wurde, sind gegenüber der Abtötung durch UV-Bestrahlung empfindlicher als unsubstituierte Zellen (Greer, 1960, Kaplan et al., 1962), und sie zeigen eine 5-fach höhere Empfindlichkeit gegenüber UV-induzierter DNA-Protein-Vernetzung als unsubstituierte Zellen (Smith, 1964b).


Photoinduzierte Crosslinks in DNA-Protein und verwandten Systemen

In verschiedenen UV-bestrahlten DNA-Proteinen und verwandten Systemen wurde eine Reihe von Nukleobasen-Aminosäure-Quervernetzungen identifiziert. Beispielsweise wurden Thymin-Lysin-Konjugate als Teilnehmer an der Vernetzung in DNA-Histon-Systemen identifiziert (Saito et al., 1983b, Kurochkina et al., 1987). Es wurde gezeigt, dass Thymin-Cystein-Konjugate bei der UV-induzierten Quervernetzung des Gen-5-Proteins des fd-Phagen mit seiner entsprechenden DNA produziert werden (Paradiso und Königsberg, 1982). Auf der Ebene eines Nukleosid-Peptid-Systems wurde das einzelne Tyrosin, das in Angiotensin I enthalten ist, mit Thymidin vernetzt, wenn eine Lösung, die diese beiden Komponenten enthielt, bestrahlt wurde (Shaw et al., 1992). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Thymidin, Thymidin-5'-phosphat und Thymidylyl-[3'-5']-2'-desoxyadenosin in Gegenwart der Tyrosin-haltigen Heptad-Repeat-Peptideinheit bestrahlt wurden, die sich in der größten Untereinheit der Eukaryonten befindet RNA-Polymerase II-Multiproteinkomplex (Connor et al., 1998a).


Photocrosslinking als Werkzeug für Strukturstudien von DNA-Protein-Komplexen

Die DNA-Protein-Vernetzung ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Struktur von DNA-Protein-Komplexen. Da die einzigen Aminosäuren und Nukleobasen, die an der Vernetzung teilnehmen können, diejenigen sind, die in DNA-Protein-Komplexen in Kontakt stehen, kann die Vernetzung möglicherweise verwendet werden, um Aminosäuren (oder Peptide) und Nukleobasen in diesen Regionen zu identifizieren, die an der Bindung von Protein an DNA beteiligt sind. Während in vielen Studien stationäre UV-Bestrahlung verwendet wurde, bietet die Verwendung von gepulsten Lasern in Verbindung mit Massenspektrometrie einen leistungsstarken alternativen Ansatz zur Untersuchung der Vernetzung, insbesondere zur Untersuchung von Kontakten in nativen DNA-Protein-Komplexen. Diese Kombination von Techniken wurde beispielsweise verwendet, um sechs vernetzte Peptide in dem Komplex zu identifizieren, der zwischen der einzelsträngigen DNA-Bindungsdomäne der Ratten-DNA-Polymerase ß und dem Oligonukleotid d(ATATATA) gebildet wird (Connor et al., 1998b) . [Experimentelle Aspekte der Verwendung von Crosslinking zur Untersuchung der Struktur von Nukleinsäure-Protein-Komplexen werden von Williams und Konigsberg (1992) (durch UV-induziertes Crosslinking im stationären Zustand) und von Hockensmith et al. (1992) (durch laserpulsinduzierte Vernetzung). Übersichten von Meisenheimer und Koch (1997) sowie Steen und Jensen (2002) liefern Informationen und Verweise auf eine Reihe von Studien, in denen die UV-induzierte Vernetzung von Nukleinsäure-Protein-Komplexen verwendet wurde, um strukturelle Informationen über solche Komplexe.]

DNA-Protein-Komplexe, in denen die DNA-Komponente so modifiziert wurde, dass sie 5-halogenierte Uracile oder Cytosine enthält, wurden auch unter Verwendung von Laservernetzungs-Massenspektrometrie-Ansätzen untersucht. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Tryptophane 54 und 88 in der Reihenfolge der E coli einzelsträngiges DNA-bindendes Protein kann an ein DNA-Oligomer gebunden werden, in dem Thymine durch 5-Ioduracil-Einheiten ersetzt sind (Steen et al., 2001). Nukleinsäure-Protein-Komplexe, in denen Thymin durch 5-Bromuracil oder Cytosin durch 5-Iodocytosin ersetzt wurde, haben auch Verwendung in photochemischen Experimenten gefunden, die entworfen wurden, um Kontaktregionen in diesen Komplexen zu untersuchen. [Übersichten siehe Meisenheimer und Koch, 1997, Steen und Jensen, 2002]


Biologische Bedeutung und Reparatur von DNA-Protein-Crosslinks

Da die Vernetzung von DNA und Protein durch UV-Strahlung analytisch um ein Vielfaches empfindlicher ist als die Thymin-Dimer-Bildung, wurde vermutet, dass DNA-Protein-Crosslinks bei der Inaktivierung von Bakterien durch UV-Strahlung eine bedeutende Rolle spielen können (Smith, 1962).

Diese Hypothese wurde später durch wachsende E coli Mutanten unter verschiedenen Bedingungen, die die Zellempfindlichkeit gegenüber UV-Strahlung beeinflussen. Es wurde eine direkte Korrelation zwischen der Menge an DNA, die durch eine gegebene Dosis von UV-Strahlung mit Protein vernetzt wurde, und der intrinsischen Empfindlichkeit gegenüber dem Abtöten durch UV-Strahlung unter den verschiedenen untersuchten Wachstumsbedingungen beobachtet (Smith et al., 1966).

Darüber hinaus ist die erhöhte Empfindlichkeit von E coli zum Abtöten durch UV-Bestrahlung beim Einfrieren, und die Variation dieser Empfindlichkeit als Funktion der Temperatur während der Bestrahlung korreliert mit Änderungen der DNA-Menge, die durch UV-Bestrahlung mit Protein quervernetzt wurde. Diese Variationen in der Empfindlichkeit gegenüber dem Töten korrelierten nicht mit der Produktion von Thymindimeren (Smith und O'Leary, 1967).

Diese Ergebnisse zur biologischen Bedeutung von durch UV-Strahlung induzierten DNA-Protein-Crosslinks stimmen mit der Tatsache überein, dass nur etwa 60 % der Überlebenden von E coli nach UV-Bestrahlung kann photoreaktiviert werden (siehe Modul zur Phototreaktivierung), d. h. 40% der Letalität müssen auf andere Läsionen als Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere zurückzuführen sein.DNA-Protein-Crosslinks können nicht photoreaktiviert werden (Smith, 1964b).

DNA-Protein-Crosslinks werden durch Reparatur nach der Replikation repariert und verursachen eine längere Verzögerung der DNA-Synthese als Pyrimidin-Dimere (Smith und Hamelin, 1977). [Siehe Modul zur rekombinatorischen DNA-Reparatur]

Es sollte beachtet werden, dass die Bildung von DNA-Protein-Vernetzungen in zellulären Systemen durch andere Belastungen als die Absorption von Strahlung induziert wird (z. B. chemisch induzierte Reaktionen und durch reaktive Sauerstoffspezies vermittelte Vernetzung). Beschreibungen relevanter früher Arbeiten zu anderen Arten von Nukleinsäure-Protein-Crosslinks finden sich in Smith (1976), während ein neuerer Überblick über die Bildung einiger dieser Arten von Läsionen sowie ihre Reparatur und biologischen Folgen von Barkeret al. (2005).


Zusammenfassung und Fazit

DNA-Protein-Crosslinks sind wichtige tödliche Läsionen in Zellen, die UV-Strahlung ausgesetzt sind. Crosslinks sind besonders störend, da sie meist im Bereich des sich replizierenden Chromosoms auftreten. Die Strukturen einer Reihe von Addukten, die potentiell für Quervernetzungen verantwortlich sind, die in UV-bestrahlten DNA-Protein-Komplexen gebildet werden, wurden bestimmt. Untersuchungen zur Reaktivität von Thymin und Uracil sowie Polynukleotiden der DNA- und RNA-Nukleobasen gegenüber der Photoaddition von Aminosäuren wurden durchgeführt. Photocrosslinking ist ein nützliches Werkzeug, um DNA-Protein-Kontakte in DNA-Protein-Komplexen zu kartieren.

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[HINWEIS: Die hier zitierten Arbeiten von Kendric Smith sind als PDF-Dateien verfügbar.]
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Reaktive Gruppen für die Proteinvernetzung

Zur Vernetzung/Kennzeichnung stehen folgende Funktionsgruppen zur Verfügung:

  • Primäre Amine (–NH2): Diese Gruppe existiert am N-Terminus jeder Polypeptidkette (als Alpha-Amin bezeichnet) und in der Seitenkette von Lysin-Resten (Lys, K) (als Epsilon-Amin bezeichnet). Aufgrund ihrer positiven Ladung unter physiologischen Bedingungen liegen primäre Amine normalerweise nach außen (d. h. auf der äußeren Oberfläche) von Proteinen, so dass sie normalerweise für die Konjugation ohne Denaturierung der Proteinstruktur zugänglich sind.
  • Carboxyle (–COOH): Diese Gruppe existiert am C-Terminus jeder Polypeptidkette und in den Seitenketten von Asparaginsäure (Asp, D) und Glutaminsäure (Glu, E). Wie primäre Amine befinden sich Carboxyle normalerweise auf der Oberfläche der Proteinstruktur.
  • Sulfhydryle (–SH): Diese Gruppe existiert in der Seitenkette von Cystein (Cys, C). Oft sind Cysteine ​​als Teil der Sekundär- oder Tertiärstruktur eines Proteins zwischen ihren Seitenketten über Disulfidbrücken (–S–S–) miteinander verbunden. Diese müssen zu Sulfhydrylen reduziert werden, um sie für die Vernetzung durch die meisten Arten von reaktiven Gruppen verfügbar zu machen.
  • Carbonyle (–CHO): Keton- oder Aldehydgruppen können in Glykoproteinen durch Oxidation der posttranslationalen Modifikationen des Polysaccharids (Glykosylierung) mit Natriummetaperiodat erzeugt werden.

Eine Reihe von chemisch reaktiven Gruppen wurde charakterisiert und verwendet, um die Hauptarten von funktionellen Proteingruppen anzusteuern. Einige der beliebtesten Gruppen sind wie folgt:

  • Carboxyl-zu-Amin-reaktive Gruppen: Carbodiimid
  • Aminreaktive Gruppen: NHS-Ester, Imidoester
  • Reaktive Sulfhydrylgruppen: Maleinimid, Haloacetyl, Pyridyldisulfid
  • Aldehydreaktive Gruppen: Hydrazid, Alkoxyamin
  • Photoreaktive (d. h. nichtselektive, zufällige Insertion) Gruppen: Diazirin, Arylazide
  • Hydroxyl-reaktive Gruppen: Isocyanat

EDC und andere Carbodiimide sind Null-Länge-Vernetzer. Sie bewirken eine direkte Konjugation von Carboxylaten (–COOH) an primäre Amine (–NH2), ohne Teil der endgültigen Vernetzung (Amidbindung) zwischen Zielmolekülen zu werden. EDC-Vernetzungsreaktionen müssen unter Bedingungen durchgeführt werden, die frei von fremden Carboxylen und Aminen sind. Da Peptide und Proteine ​​mehrere Carboxyle und Amine enthalten, verursacht die direkte EDC-vermittelte Vernetzung normalerweise eine zufällige Polymerisation von Polypeptiden. Nichtsdestotrotz wird diese Reaktionschemie bei Immobilisierungsverfahren (z. B. Anheften von Proteinen an eine carboxylierte Oberfläche) und bei der Immunogenpräparation (z. B. Anheften eines kleinen Peptids an ein großes Trägerprotein) weit verbreitet verwendet.

NHS-Ester sind reaktive Gruppen, die durch EDC-Aktivierung von Carboxylatmolekülen gebildet werden. NHS-esteraktivierte Vernetzer und Markierungsverbindungen reagieren mit primären Aminen unter leicht alkalischen Bedingungen (pH 7,2-8,5) unter Bildung stabiler Amidbindungen. Die Reaktion setzt N-Hydroxysuccinimid (MG 115) frei, das leicht durch Dialyse oder Entsalzung entfernt werden kann. Primäre Aminpuffer wie Tris oder TBS sind nicht kompatibel, da sie um die Reaktion konkurrieren. Bei einigen Verfahren ist es jedoch nützlich, Tris- oder Glycinpuffer am Ende eines Konjugationsverfahrens zuzugeben, um die Reaktion abzuschrecken (zu stoppen).

Sulfo-NHS-Ester sind mit NHS-Estern identisch, außer dass sie eine Sulfonatgruppe (–SO3) am N-Hydroxysuccinimid-Ring enthalten. Diese geladene Gruppe hat keine Auswirkung auf die Reaktionschemie, neigt jedoch dazu, die Wasserlöslichkeit von sie enthaltenden Vernetzern zu erhöhen. Darüber hinaus verhindert die geladene Gruppe, dass Sulfo-NHS-Vernetzer die Zellmembranen durchdringen, wodurch sie für Verfahren zur Vernetzung von Zelloberflächen verwendet werden können.

Imidoester-Vernetzer reagieren mit primären Aminen, um Amidinbindungen zu bilden. Um die Spezifität für primäre Amine sicherzustellen, werden Imidoester-Reaktionen am besten unter aminfreien, alkalischen Bedingungen (pH 10) durchgeführt, z. B. mit Boratpuffer.

Da die resultierende Amidinbindung protoniert ist, hat die Vernetzung bei physiologischem pH eine positive Ladung, ähnlich wie das primäre Amin, das sie ersetzt hat. Aus diesem Grund wurden Imidoester-Crosslinker verwendet, um Proteinstruktur und molekulare Assoziationen in Membranen zu untersuchen und Proteine ​​auf Festphasenträgern zu immobilisieren, während der isoelektrische Punkt (pI) des nativen Proteins erhalten blieb. Die stabileren und effizienteren NHS-Ester-Vernetzer haben sie jedoch in den meisten Anwendungen stetig ersetzt.

Maleimid-aktivierte Vernetzer und Markierungsreagenzien reagieren spezifisch mit Sulfhydrylgruppen (–SH) unter nahezu neutralen Bedingungen (pH 6,5–7,5) unter Bildung stabiler Thioetherbindungen. Disulfidbindungen in Proteinstrukturen (z. B. zwischen Cysteinen) müssen zu freien Thiolen (Sulfhydrylen) reduziert werden, um mit Maleimidreagenzien zu reagieren. Fremde Thiole (die meisten Reduktionsmittel) müssen aus Maleimid-Reaktionspuffern ausgeschlossen werden, da sie um Kupplungsstellen konkurrieren.

Kurze homobifunktionelle Maleimid-Crosslinker ermöglichen die Umwandlung von Disulfidbrücken in Proteinstrukturen in permanente, irreduzible Bindungen zwischen Cysteinen. Häufiger wird die Maleimid-Chemie in Kombination mit Amin-reaktiver NHS-Ester-Chemie in Form von heterobifunktionellen Crosslinkern verwendet, die eine kontrollierte, zweistufige Konjugation von gereinigten Peptiden und/oder Proteinen ermöglichen.

Die meisten Halogenacetyl-Crosslinker enthalten eine Jodacetyl- oder eine Bromacetylgruppe. Haloacetyle reagieren mit Sulfhydrylgruppen unter physiologischen bis alkalischen Bedingungen (pH 7,2 bis 9), was zu stabilen Thioetherbindungen führt. Um die Bildung von freiem Jod zu begrenzen, das das Potenzial hat, mit Tyrosin-, Histidin- und Tryptophanresten zu reagieren, führen Sie Jodacetylreaktionen im Dunkeln durch.

Pyridyldisulfide reagieren mit Sulfhydrylgruppen über einen breiten pH-Bereich unter Bildung von Disulfidbindungen. Konjugate, die unter Verwendung dieser Vernetzungsmittel hergestellt werden, sind als solche mit typischen Disulfid-Reduktionsmitteln, wie Dithiothreitol (DTT), spaltbar.

Während der Reaktion findet ein Disulfidaustausch zwischen der –SH-Gruppe des Zielmoleküls und der 2-Pyridyldithiol-Gruppe des Vernetzers statt. Als Nebenprodukt wird Pyridin-2-thion (MG 111 max 343 nm) freigesetzt, das spektrophotometrisch verfolgt und durch Dialyse oder Entsalzung aus Proteinkonjugaten entfernt werden kann.

Carbonyle (Aldehyde und Ketone) können in Glykoproteinen und anderen polysaccharidhaltigen Molekülen durch milde Oxidation bestimmter Zuckerglykole unter Verwendung von Natriummetaperiodat hergestellt werden. Hydrazid-aktivierte Vernetzer und Markierungsverbindungen konjugieren dann mit diesen Carbonylen bei pH 5 bis 7, was zur Bildung von Hydrazonbindungen führt.

Die Hydrazidchemie ist zum Markieren, Immobilisieren oder Konjugieren von Glykoproteinen durch Glykosylierungsstellen nützlich, die sich oft (wie bei den meisten polyklonalen Antikörpern) an Domänen entfernt von den Schlüsselbindungsstellen befinden, deren Funktion man erhalten möchte.

Obwohl sie derzeit nicht so beliebt oder verbreitet sind wie Hydrazidreagenzien, konjugieren Alkoxyaminverbindungen mit Carbonylen (Aldehyden und Ketonen) in ähnlicher Weise wie Hydrazide.

Photoreaktive Reagenzien sind chemisch inerte Verbindungen, die reaktiv werden, wenn sie ultraviolettem oder sichtbarem Licht ausgesetzt werden. Historisch gesehen waren Arylazide (auch Phenylazide genannt) die beliebteste photoreaktive chemische Gruppe, die in Vernetzungs- und Markierungsreagenzien verwendet wird.

Wenn eine Arylazidverbindung UV-Licht ausgesetzt wird, bildet sie eine Nitrengruppe, die Additionsreaktionen mit Doppelbindungen oder Insertion in C-H- und N-H-Stellen einleiten oder eine Ringerweiterung durchlaufen kann, um mit einem Nukleophil (z. B. einem primären Amin) zu reagieren. Reaktionen können in einer Vielzahl von aminfreien Pufferbedingungen durchgeführt werden, um Proteine ​​oder sogar Moleküle zu konjugieren, denen die üblichen funktionellen Gruppen-"Griffe" fehlen.

Photoreaktive Reagenzien werden am häufigsten als heterobifunktionelle Crosslinker verwendet, um Bindungspartner-Wechselwirkungen einzufangen. Ein gereinigtes Köderprotein wird mit dem Crosslinker unter Verwendung des Amin- oder Sulfhydryl-reaktiven Endes markiert. Dann wird dieses markierte Protein zu einer Lysatprobe hinzugefügt und kann seinen Interaktor binden. Schließlich initiiert die Photoaktivierung mit UV-Licht die Konjugation über die Phenylazidgruppe.

Diazirine sind eine neuere Klasse photoaktivierbarer chemischer Gruppen, die in Vernetzungs- und Markierungsreagenzien eingebaut werden. Die Diazirin(azipentanoat)-Einheit hat eine bessere Photostabilität als Phenylazidgruppen und wird leichter und effizienter mit langwelligem UV-Licht (330-370 nm) aktiviert.

Die Photoaktivierung von Diazirin erzeugt reaktive Carben-Zwischenprodukte. Solche Zwischenprodukte können kovalente Bindungen durch Additionsreaktionen mit jeder Aminosäureseitenkette oder Peptidrückgrat in Abständen bilden, die den Spacerarmlängen des jeweiligen Reagens entsprechen. Diazirin-Analoga von Aminosäuren können durch Translation in Proteinstrukturen eingebaut werden, wodurch spezifische rekombinante Proteine ​​als Crosslinker aktiviert werden können.


Optimierung der Formaldehyd-Vernetzung für die Protein-Interaktionsanalyse von nicht-markiertem Integrin

Die Formaldehyd-Vernetzung von Proteinkomplexen in Kombination mit Immunpräzipitation und Massenspektrometrie-Analyse ist eine vielversprechende Technik zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich solcher vorübergehender Natur.Hier haben wir Integrin 1 als Modell verwendet, um die Anwendung der Formaldehyd-Vernetzung im Detail zu beschreiben, wobei wir uns insbesondere auf die optimalen Parameter für die Vernetzung, den Nachweis von Formaldehyd-vernetzten Komplexen, die Nützlichkeit von Antikörpern und die Identifizierung von Bindungen konzentrierten Partner. Integrin 1 wurde nach Formaldehyd-Vernetzung in einem Komplex mit hohem Molekulargewicht gefunden. Acht verschiedene Anti-Integrin-1-Antikörper wurden für Pull-Down-Experimente verwendet und es wurde kein Verlust der Präzipitationseffizienz nach der Vernetzung beobachtet. Jedoch konnten zwei der Antikörper den Komplex nicht präzipitieren, wahrscheinlich aufgrund versteckter Epitope. Es wurde festgestellt, dass vernetzte Formaldehyd-Komplexe, die aus Jurkat-Zellen oder menschlichen Blutplättchen ausgefällt und durch Massenspektrometrie analysiert wurden, aus Integrin 1 bestehen.

4 und 6 bzw. 1, 6, 2 und 5.

1. Einleitung

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind die Grundlage für die meisten zellulären Prozesse, einschließlich der Signalübertragung, der Proteinsynthese und des Stoffwechsels. Um Krankheiten besser verstehen und adäquate Therapien entwickeln zu können, sind detaillierte Kenntnisse dieser Proteinnetzwerke erforderlich. Derzeit werden Protein-Protein-Wechselwirkungen üblicherweise durch Hefe-Zwei-Hybrid-Ansätze untersucht [1] und durch in vitro verbindliche Studien [2]. Diese Ansätze sind jedoch anfällig für falsch positive Identifizierungen, da sie die zeitlichen und lokalen Trennungen, die in einem lebenden System auftreten, nicht berücksichtigen. Ein Werkzeug zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in einem physiologischen Kontext ist die Affinitätsanreicherung des interessierenden Proteins, gefolgt von der Detektion seiner Bindungspartner entweder mit Immundetektionsmethoden oder Massenspektrometrie [3]. Dieses klassische Immunpräzipitationsverfahren hat jedoch zwei Nachteile. Schwache Wechselwirkungen könnten übersehen werden, wenn strenge Waschbedingungen angewendet werden. Im Gegensatz dazu können nicht-stringente Bedingungen die Identifizierung von mehr Proteinen ermöglichen, aber viele davon könnten falsch-positive Ergebnisse sein, die nur das Köderprotein während der Probenvorbereitung binden.

Ein Ansatz zur Lösung dieses Problems besteht darin, kovalente Vernetzungen auf intakte Zellen anzuwenden und dadurch Protein-Protein-Wechselwirkungen, auch sehr schwache und transiente, zu stabilisieren [3]. Nach diesem Fixierungsschritt können während der Zelllyse und der Affinitätsanreicherung sehr strenge Bedingungen verwendet werden, wodurch das Risiko der Identifizierung falsch positiver Ergebnisse minimiert wird. Mehrere Quervernetzer mit unterschiedlichen Spacerarmlängen, Reaktionsgruppen und anderen Eigenschaften sind im Handel erhältlich. Einer der kürzesten verfügbaren Crosslinker ist Formaldehyd (2,3–2,7 ), das seit langem in der Histologie und Pathologie verwendet wird, um den nativen Zustand von Geweben und Zellen „einzufrieren“ [4]. Die in diesen Anwendungen verwendeten experimentellen Bedingungen führen zu einem sehr engen Netzwerk von Quervernetzungen, das die Ausfällung eines interessierenden Proteins, wie es für Protein-Protein-Interaktionsstudien erforderlich ist, verhindert. Niedrigere Formaldehydkonzentrationen (0,4–2% statt 4%) und vor allem kürzere Reaktionszeiten (Minuten statt Stunden) ermöglichen jedoch den Einsatz von Formaldehyd als Crosslinker zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, wie von uns und anderen gezeigt [5 –8].

Die Anwendung von Formaldehyd als Vernetzer hat mehrere Vorteile. Aufgrund der geringen Größe von Formaldehyd können nur eng verbundene Proteine ​​vernetzt werden. Darüber hinaus ermöglicht seine hohe Permeabilität gegenüber Zellmembranen eine Vernetzung in der intakten Zelle, ohne Zugabe von organischen Lösungsmitteln wie Dimethylsulfoxid, wie sie für andere Vernetzer erforderlich sind. Es wird auch angenommen, dass Formaldehyd eine sehr schnelle Vernetzung und die Stabilisierung transienter Wechselwirkungen ermöglicht [4]. Schließlich ist Formaldehyd in fast jedem Labor zu Kosten erhältlich, die nur einen Bruchteil anderer Vernetzer betragen. Die Formaldehyd-Vernetzung ist jedoch noch kein etabliertes Standardverfahren und es bleiben viele Fragen bezüglich der optimalen experimentellen Bedingungen und der Verwendbarkeit von Antikörpern zum Pull-Down von Proteinen nach Formaldehydbehandlung. Beispielsweise könnten Epitope, die von Antikörpern gegen körpereigene Proteine ​​erkannt werden, durch Formaldehyd-Modifikation zerstört werden, was ihre Anwendung verhindern würde [9]. In ähnlicher Weise können auch die physiologische Umgebung eines interessierenden Proteins und die Art und das Ausmaß seiner Wechselwirkungen das experimentelle Ergebnis beeinflussen. Daher haben wir uns entschieden, verschiedene Aspekte der Formaldehyd-Vernetzung mit Hilfe des Transmembranproteins Integrin genauer zu untersuchen

Integrine sind membranüberspannende heterodimere Komplexe, die eine wichtige Rolle bei Zelladhäsions- und Migrationsprozessen spielen, indem sie mit Komponenten der extrazellulären Matrix interagieren [10]. Jedes Integrin-Heterodimer besteht aus einem α und eine Untereinheit, die nichtkovalent assoziiert sind. Beim Menschen finden sich 18 Untereinheiten und 8 Untereinheiten, die 24 verschiedene Heterodimere bilden. Die größte Untergruppe mit 12 Mitgliedern wird von Heterodimeren gebildet [11]. Um einen Liganden binden zu können, müssen Integrine durch einen intrazellulären Prozess aktiviert werden, der als Inside-Out-Signaling bezeichnet wird. Beispielsweise löst Thrombin während der Thrombozytenaktivierung die Talinaktivierung über einen Weg aus, an dem die Proteinkinase C, die kleine GTPase Rap1 und das Rap1-Effektor Rap1-interagierende Molekül (RIAM) beteiligt sind [12]. Aktiviertes Talin bindet dann an den intrazellulären Schwanz des Integrins und verursacht eine Konformationsänderung der beiden Integrinketten. Dies ermöglicht die Bindung von extrazellulären Liganden, die den zytoplasmatischen Schwanz des Integrins dazu bringen, zusätzliche Adapterproteine ​​zu binden, eine Verbindung zum Zytoskelett herstellt und zur Abgabe des externen Signals führt (Outside-In-Signaling).

Für Integrine wurden trotz der Kürze des intrazellulären Schwanzes von Integrinen, der zwischen 40 und 60 Aminosäuren variiert, mehrere intrazelluläre Interaktionspartner beschrieben. Für Integrin wurden 25 Adapterproteine ​​berichtet, darunter Talin, Tensin, Filamin und Kindlin [13]. Diese Interaktionen können jedoch nicht gleichzeitig stattfinden, sondern hängen vom Aktivierungsstatus der Zelle und des Integrins ab. Die detaillierten Bindungsverfahren sowie die dadurch ausgelösten Signalisierungsprozesse sind nicht vollständig verstanden. Zum Beispiel interagieren Talin und Kindlin beide mit Integrin, und es wird ein Übersprechen zwischen ihnen angenommen. Es bleibt jedoch unklar, ob sich beide Proteine ​​gleichzeitig mit dem Integrin verbinden oder nacheinander binden [14]. Die Untersuchung der Interaktionspartner von Integrinen mit Hilfe des Formaldehyd-Crosslinking-Ansatzes, der in der Lage sein soll, transiente und indirekte Interaktionspartner von Proteinen zu identifizieren, könnte mehr Aufschluss über diese Prozesse geben und wäre daher sehr wertvoll.

In der vorliegenden Studie berichten wir über die Optimierung eines Protokolls unter Anwendung von Formaldehyd-Vernetzung in Kombination mit Immunpräzipitation und Massenspektrometrie (Abbildung 1(a)) zur Analyse des Interaktionsnetzwerks von Integrin.


Formaldehyd-Vernetzung. (a) Arbeitsablauf der Formaldehyd-Vernetzung. Zellen werden mit Formaldehyd behandelt, lysiert und Proteinkomplexe (ovale Formen) werden durch Antikörper ausgefällt (

-förmig). Querverbindungen werden durch schwarze Dreiecke angezeigt. Nur Antikörper, deren Epitope bei der Formaldehydmodifikation nicht zerstört werden, können den Komplex ausfällen. (b) Reaktionsschema der Formaldehydmodifikation, Vernetzung und Vernetzungsumkehr. (c) und (d) Formaldehyd-abgeleitete Vernetzungen bleiben erhalten, wenn die Proben nur bei . inkubiert werden

C, während die meisten Querverbindungen bei umgekehrt sind

C. (c) Schematisches Modell. Proteine ​​werden als ovale Formen dargestellt, Formaldehyd-Vernetzungen als schwarze Dreiecke. (d) Anti-Integrin

2. Materialien und Methoden

2.1. Zellen und Reagenzien

Jurkat-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Medium (GIBCO, hoher Glucosegehalt) mit 10 % fötalem Rinderserum (GIBCO), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin gezüchtet. Humane Blutplättchen wurden von gesunden menschlichen Freiwilligen isoliert, wie zuvor beschrieben [15]. Dies wurde vom Research Ethics Board der University of British Columbia genehmigt und von den Spendern nach Aufklärung zugestimmt. Kurz gesagt, wurde Vollblut aus der Antekubitalvene in 0,15% (Vol./Vol.) Säure-Citrat-Dextrose-Antikoagulans gezogen. Die Blutplättchen wurden durch Zentrifugation isoliert und in physiologischem Puffer gewaschen. Alle Anti-Integrin-Antikörper waren monoklonale Maus-Anti-Mensch-Antikörper, die von John Wilkins (Manitoba) bereitgestellt wurden. Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 680 wurde von Molecular Probes erhalten und Ziegen-Anti-Maus HRP wurde von BioRad erhalten.

2.2. Modellierung der Integrinstruktur

Die Integrinstruktur wurde der Struktur des menschlichen Integrins nachempfunden

[16] mit SWISS MODEL [17, 18] und die Visualisierung erfolgte mit dem Swiss-Pdb Viewer Deep View (http://spdbv.vital-it.ch).

2.3. Formaldehyd-Vernetzung

Formaldehydlösung wurde durch Auflösen von 0,4% bis 4% Paraformaldehyd (Fisher Scientific) in PBS für 2 h bei . erhalten

C. Die Lösung wurde filtriert (0,22

m), im Dunkeln bei RT gelagert und nach 4 Wochen verworfen. Zur Vernetzung wurden Jurkat-Zellen in ein 50 ml Reaktionsröhrchen pelletiert, in PBS resuspendiert und gezählt. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert und zu resuspendiert

Zellen/ml in Formaldehydlösung. Die Zellen wurden 7 min bei RT unter leichter Bewegung inkubiert und dann 3 min bei 1800 g und RT pelletiert, was zu einer 10 minütigen Formaldehyd-Exposition führte. Der Überstand wurde entfernt und die Reaktion mit 0,5 ml eiskaltem 1,25 M Glycin/PBS gequencht. Die Zellen wurden in ein kleineres Röhrchen überführt, zentrifugiert, einmal in 1,25 M Glycin/PBS gewaschen und in 1 ml RIPA-Puffer (50 mM Tris HCl, pH 8,0, 150 mM Natriumchlorid, 1 % NP40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 %) lysiert. SDB, 1 mM EDTA, Protease-Inhibitoren (Complete mini, EDTA-frei, Roche Diagnostics)) per

Zellen für 60 Minuten auf Eis. Nach 30 Minuten wurden Zelllysate mit 50 Hüben unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators behandelt. Lysate wurden 30 Minuten bei 20000 g zentrifugiert und

C, um unlösliche Rückstände zu entfernen. Der Überstand wurde entweder direkt verwendet oder bei –8 °C gelagert. Kontrollzellen wurden genauso behandelt, außer dass sie in PBS anstelle von Formaldehydlösung resuspendiert wurden. Wenn Thrombozyten zur Vernetzung verwendet wurden,

Zellen wurden in 10 ml Formaldehydlösung resuspendiert und in 1 ml RIPA-Puffer lysiert.

2.4. Immunpräzipitation, Western Blot-Analyse und Silberfärbung von SDS PAGE

Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines BCA-Assays (Pierce) bestimmt. Die angegebenen Mengen an Antikörpern und Lysaten wurden 1 h inkubiert, danach wurden 10 bis 25 l Protein G Agarose Beads (Immobilized Protein G, Pierce) zugegeben und über Nacht eine Immunpräzipitation durchgeführt. Alle Schritte wurden unter leichtem Rühren bei C durchgeführt. Für die massenspektrometrische Analyse wurden Lysate durch Inkubation mit der gleichen Menge an Kügelchen für 2 h vorgeklärt, bevor der Antikörper zugegeben wurde. Die Überstände der Immunpräzipitationen wurden zur Analyse aufbewahrt und die Kügelchen wurden entweder zweimal mit PBS für die Western-Blot-Analyse oder dreimal mit RIPA-Puffer für die massenspektrometrische Analyse gewaschen. 4x reduzierender SDS Loading Dye (500 mM Tris HCl, pH 6,8, 8% SDS, 40% Glycerin, 20% β-Mercaptoethanol, 5 mg/ml Bromphenolblau) wurde sowohl zu den Beads als auch zu den Lysaten zugegeben und die Überstände und Proben wurden entweder bei C oder C für 5 min bzw. 10–20 min inkubiert, bevor sie durch SDS getrennt wurden PAGE mit einem 8%igen Laemmli-Gel [19]. Für die Western-Blot-Analyse wurden Proteine ​​über ein halbtrockenes Verfahren auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (Pall Corporation) übertragen, 1 h bei RT mit 5 % Milchpulver in PBST (PBS, 0,1 % Tween 20) blockiert und mit JB1A (0,1 g/ml) über Nacht bei C. Membranen wurden entweder mit Anti-Maus-HRP oder Anti-Maus-Alexa Fluor 680 (beide 1 : 10000) für 1 h bei RT inkubiert. Mit Anti-Maus Alexa Fluor 680 behandelte Membranen wurden mit einem Fluoreszenzscanner (Odyssey, LICOR) bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 700 und 800 nm gescannt, während Signale auf Anti-Maus-HRP-inkubierten Membranen mit Chemilumineszenzlösung (ECL, GE Healthcare ). Die Quantifizierung der Immunoblot-Analyse erfolgte mit der Software ImageJ [20]. Die Silberfärbung wurde unter Verwendung eines modifizierten Protokolls von Gharahdaghi et al. [21]. Kurz gesagt, Gele wurden mit 10 % Essigsäure/10 % Methanol fixiert, mit Wasser gewaschen und mit 1 g/ml Dithiothreitol für 15 Minuten sensibilisiert. Die Gele wurden in 0,1% (w/v) Silbernitrat für 15 min inkubiert und mit 0,02% (w/v) Paraformaldehyd in 3% (w/v) Kaliumcarbonat entwickelt, bis die gewünschte Färbung aufgetreten war. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Essigsäure gestoppt.

2.5. In Gelaufschluss und LC-MS/MS-Analyse

Interessierende Banden in silbergefärbten Gelen wurden wie beschrieben ausgeschnitten und entfärbt [21]. Kurz gesagt, Gelbanden wurden in einer frisch zubereiteten Entfärbungslösung (15 mM Kaliumferricyanid/50 mM Natriumthiosulfat) inkubiert, bis die Farbe verschwand, mehrmals mit Wasser und Ammoniumbicarbonat (pH 8,0) gewaschen und in kleinere Stücke zerhackt. Der In-Gel-Verdau wurde nach Standardverfahren durchgeführt [22]. Kurz gesagt wurden Proben mit Dithiothreitol reduziert, mit Iodacetamid alkyliert und mit Trypsin (Promega) in Ammoniumbicarbonat über Nacht verdaut. Peptide wurden zweimal aus den Gelstücken extrahiert, in einer Vakuumzentrifuge getrocknet, in 5% Ameisensäure rekonstituiert und STAGE-tip gereinigt [23]. Die Trennung und Identifizierung der Peptide erfolgte durch Nano-HPLC MS/MS auf einem Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA), gekoppelt mit einem FT-ICR (LTQ-FT, Thermo Electron Corporation, Waltham, MA) unter Verwendung eines 15 cm langen , 75 m ID Quarzglassäule gepackt mit 3 m Partikelgröße Umkehrphase (

) Beads (Dr. Maisch GmbH, Deutschland) mit Wasser:Acetonitril:Ameisensäure als mobile Phase mit Gradientenelution. Proteine ​​wurden identifiziert, indem die Dateien im Mascot Generic Format (MGF) aus den MS-Daten mit DTA Super Charge (Teil des MSQuant Open-Source-Projekts (http://msquant.sourceforge.net/)) extrahiert und mit der ENSEMBL-Datenbank abgeglichen wurden der X!Tandem-Algorithmus, eingebettet in die Global Proteome Machine (http://www.thegpm.org/). Der Protein-Erwartungs-Score (log(e)) gibt die Wahrscheinlichkeit einer falschen Zuordnung eines Proteins an: log(e) = −1 entspricht einer 1 zu 10, log(2) = −2 einer 1 zu 100 Wahrscheinlichkeit einer Stochastik Proteinzuordnung. Bekannte Kontaminanten wie Keratin wurden aus den Proteinlisten gestrichen.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Formaldehyd-Vernetzungsbedingungen

Die Verwendung von Formaldehyd als Vernetzungsreagenz muss evaluiert werden, um das optimale Gleichgewicht zwischen höchster Ausbeute an Komplexbildung und niedrigster Artefakterzeugung zu bestimmen [4]. Die Optimierung muss für jedes interessierende Protein durchgeführt werden, da sie von der physiologischen Umgebung des Proteins selbst abhängt und beispielsweise zwischen zytosolischen und Membranproteinen variieren kann. Bei der Formaldehydvernetzung spielen drei Hauptparameter eine entscheidende Rolle: die Reaktionstemperatur, die Inkubationszeit und die Formaldehydkonzentration. Die Temperaturabhängigkeit wurde zuvor in unserem Labor untersucht und ein Unterschied zwischen Inkubation bei C und

C konnte nicht nachgewiesen werden (unveröffentlichte Ergebnisse). Raumtemperatur ist vorteilhaft, da sie die bequemste und einfachste Vorgehensweise ergibt. Darüber hinaus haben wir uns entschieden, die Inkubationszeit nicht auf mehr als 10 Minuten zu erhöhen, da der Vorteil der Verwendung von Formaldehyd als Vernetzer in der kurzen Reaktionszeit liegt, die die Bildung unspezifischer Vernetzungen minimiert und die Fixierung von vorübergehende Wechselwirkungen. Darüber hinaus hatten Modellstudien an Peptiden gezeigt, dass Inkubationszeit und Formaldehydkonzentration komplementär sind [24]. Daher haben wir uns entschieden, unsere Studie auf die Verwendung verschiedener Konzentrationen von Formaldehyd in Bezug auf unseren Modellprotein-Integrin-Komplex zu beschränken.

Jurkat-Zellen wurden für die Untersuchung von Integrin-Interaktionen ausgewählt, da diese humanen

Zelllinie exprimiert hohe Mengen dieses Integrins und wurde bereits ausgiebig für ihre Untersuchung verwendet [25]. Zur Vernetzung von Jurkat-Zellen wurden unterschiedliche Konzentrationen von Formaldehyd (0,4% bis 2%) verwendet. Die niedrigste Konzentration wurde gewählt, da sich bereits früher gezeigt hatte, dass sie die beste Balance zwischen Proteinverlust und Vernetzungsausbeute ergab [4], die höchste war doppelt so hoch wie zuvor gezeigte Formaldehydkonzentrationen [5]. Die Zellen wurden unter stringenten Bedingungen unter Verwendung von RIPA-Puffer lysiert, um schwache und nichtkovalente Wechselwirkungen zu zerstören, und die Proteinmengen wurden bestimmt. Lysate von mit Formaldehyd behandelten Zellen enthielten geringere Proteinmengen als unbehandelte Zellen. Dies kann durch die Bildung unlöslicher Komplexe erklärt werden, beispielsweise durch Vernetzung von Kernproteinen mit DNA, die während der Lyse ausgefällt und im unlöslichen Pellet entfernt wurden. Dieser Effekt war während der Probenerzeugung sichtbar: Die Lyse unbehandelter Zellen mit dem stringenten RIPA-Puffer führte zur Freisetzung von DNA, die einen trüben Niederschlag bildete und leicht entfernt werden konnte. Im Gegensatz dazu wurde während der Lyse von mit Formaldehyd behandelten Zellen eine trübe Suspension erzeugt und das Pellet hatte eine andere Konsistenz, was eine längere Zentrifugationszeit erforderte, um getrennt zu werden. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung wurden nukleäre Proteine ​​im Lysat durch Immunoblot-Analyse nicht nachgewiesen. Membranproteine ​​waren jedoch aufgrund des Verlusts von Kernproteinen überrepräsentiert (Daten nicht gezeigt). Wir empfehlen, diesen Unterschied im Aussehen als frühzeitigen Hinweis auf eine erfolgreiche Vernetzung zu verwenden.

3.2. Nachweis von Formaldehyd-vernetzten Integrinkomplexen

Die Optimierung des Formaldehyd-Vernetzungsprotokolls unter Einbeziehung von Integrin erforderte ein Auslesen der Vernetzungseffizienz, beispielsweise den Nachweis eines das Integrin enthaltenden Komplexes. Formaldehyd-Quervernetzungen sind während der Standardprobenvorbereitung für die SDS-PAGE-Analyse (Abbildung 1(b)), die das Kochen in reduzierendem Laemmli-Puffer beinhaltet [19], reversibel, daher würden vernetzte Komplexe unter diesen Bedingungen nicht nachgewiesen werden [8]. Durch Reduzierung der Inkubationstemperatur auf C werden jedoch vernetzte Komplexe nicht vollständig zerstört und bleiben nachweisbar (Abbildung 1(c)) [5]. Gelelektrophorese-Untersuchungen von Membranproteinen werden oft bei noch niedrigeren Temperaturen (37–4 °C) durchgeführt. Anfängliche Immunpräzipitationsexperimente, die wir durchgeführt hatten, zeigten, dass bei C die für Pulldowns verwendeten Antikörper nicht in ihre schweren und leichten Ketten dissoziieren würden (Daten nicht gezeigt). Stattdessen würden die intakten Antikörper während der Gelelektrophorese bei Molekulargewichten wandern, die mit den vernetzten Komplexen überlappen und daher ihren Nachweis stören würden. Daher haben wir uns entschieden, in unseren Experimenten keine Temperaturen unter C zu verwenden.

Mit 2% Formaldehyd behandelte Jurkat-Zellen wurden verwendet, um den Nachweis vernetzter Komplexe zu bestätigen. Lysate wurden bei C bzw. C inkubiert und mittels Western-Blot unter Verwendung des Antikörpers JB1A analysiert, der zum Nachweis von Integrin . verwendet wurde β1 in früheren Studien [26].In Proben, die 5 min bei C behandelt wurden, konnten wir einen Komplex mit höherem Molekulargewicht erkennen, der Integrin enthielt, während diese Bande nach 10-minütigem Kochen bei C fast nicht nachweisbar war (Abbildung 1(d)). Daher kamen wir zu dem Schluss, dass wir einen vernetzten Komplex visualisieren, der Integrin enthält. Integrin wurde jedoch auch in der monomeren Form bei ca. 150 kDa nach Inkubation bei C. Dies könnte auf eine unvollständige Vernetzung zurückzuführen sein, da die während der Formaldehyd-Vernetzung angewendeten Bedingungen nicht zu einer hohen Proteinvernetzung führen und ein großer Anteil an unvernetztem Integrin zurückbleibt. Alternativ kann eine Inkubation bei C sogar bei einer niedrigeren Temperatur zu einer teilweisen Umkehrung der Formaldehyd-Quervernetzungen und zur Freisetzung von Integrin führen.

3.3. Balance von Vernetzungseffizienz und Proteinverlust

Die gleiche Menge an Lysaten der Proben, die unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von Formaldehyd erzeugt wurden, wurden durch Immunblotting analysiert (Abbildung 2(a)). In der Kontrolle, in der Zellen unter Vernetzungsbedingungen aber ohne Formaldehyd behandelt wurden, wurde kein Komplex nachgewiesen. Bei 0,4 % Formaldehyd wurde eine geringe Komplexmenge nachgewiesen, die mit höheren Formaldehydkonzentrationen zunahm. Bei 0,8% Formaldehyd war viel komplexer sichtbar. Bei höheren Formaldehydkonzentrationen stieg die Menge leicht an, setzte sich dann aber ohne erkennbaren Unterschied zwischen 1,2 und 2 % ab. Die Signalintensitäten des monomeren Integrins und des Komplexes wurden quantifiziert, die Werte bei 2% Formaldehyd auf 100% gesetzt und relative Intensitäten berechnet. Diese wurden zusammen mit den Gesamtproteinkonzentrationen der Lysate aufgetragen, um die optimalen Vernetzungsparameter zu bestimmen (Abbildung 2(b)). Die Menge an monomerem Integrin variierte zwischen den verschiedenen Formaldehydkonzentrationen nicht signifikant, obwohl die Menge des Komplexes zunahm (Abbildung 2(b)). Dieser scheinbare Widerspruch kann durch die oben erwähnte Beobachtung erklärt werden, dass Membranproteine ​​während der Formaldehydbehandlung relativ zu anderen zellulären Komponenten angereichert werden. Somit wurden durch Beladen gleicher Gesamtproteinmengen in jeder Spur zunehmend höhere Mengen an Gesamtintegran aufgebracht. Leider kann diese Variation nicht durch Beladungskontrollen ausgeglichen werden, da die genaue Menge jedes vernetzten Proteins nicht vorhergesagt werden kann. Die Abnahme der Proteinkonzentration aufgrund der Formaldehyd-Modifikation war zwischen 0% und 0,4% Formaldehydbehandlung am ausgeprägtesten, nahm bei 0,8% zu, stabilisierte sich jedoch bei höheren Formaldehydkonzentrationen (Abbildung 2(b)). Ein Vergleich des Proteinverlustes mit dem Gewinn des Integrinkomplexes (Abbildung 2(b)) implizierte, dass die Verwendung einer Formaldehydkonzentration zwischen 1 und 2% zu der besten Vernetzungseffizienz/Proteinverlustbilanz ohne größere Unterschiede in diesem Bereich führen sollte. Eine Erhöhung des Vernetzungsgrades kann jedoch auch zur Bildung größerer Komplexe führen, indem Proteine ​​einbezogen werden, die nicht direkt an Integrin binden, einschließlich des Zytoskeletts. Dies würde zur Bildung umfangreicherer, heterogener vernetzter Komplexe führen, die eine größere Oberfläche bereitstellen würden, an die unspezifische Proteine ​​während der Probenverarbeitung binden können. Als Ergebnis würde eine zunehmende Menge an reichlich vorhandenen Zytoskelettproteinen und häufigen Kontaminanten identifiziert, die nicht als spezifische Interaktoren angesehen würden. Um eine solche offensichtliche Artefakterzeugung zu minimieren, haben wir uns daher entschlossen, die folgenden Untersuchungen unter strengeren Bedingungen durchzuführen, indem 0,4% Formaldehyd aufgetragen wurde. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass spezifische Interaktoren mit geringer Häufigkeit und Wechselwirkungen mit niedriger Stöchiometrie nicht identifiziert werden. Obwohl höhere Formaldehydkonzentrationen diesem Effekt entgegenwirken würden, würden sie auch zu mehr Artefakten führen, daher wäre eine Differenzialanalyse mit mehreren Formaldehydkonzentrationen immer noch nicht in der Lage, zwischen spezifischen Interaktoren und Artefakten zu unterscheiden. Stattdessen wären individuelle Folgeexperimente für jedes identifizierte Protein erforderlich, um seine Spezifität zu bestimmen. Da der Fokus dieser Studie nicht darauf lag, eine umfassende Liste von mutmaßlichen Interaktoren zu erstellen, sondern die allgemeine Gültigkeit des Ansatzes zu demonstrieren, wählten wir niedrigere Formaldehydkonzentrationen und eine hohe Stringenz. Benutzer, die daran interessiert sind, die Anzahl der eingefangenen Proteine ​​zu maximieren, sollten stattdessen die Verwendung höherer Formaldehydkonzentrationen in Betracht ziehen.


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Abstrakt

Die Formaldehyd-Vernetzung ist ein wichtiger Bestandteil vieler Technologien, einschließlich der Chromatin-Immunpräzipitation und des Einfangens der Chromosomenkonformation. Das Verfahren bleibt jedoch trotz einer langen Geschichte seines Einsatzes in der Forschung empirisch und wenig charakterisiert. Über die Spezifität von ist wenig bekannt in vivo Vernetzung, ihre Effizienz und durch das Verfahren induzierte chemische Addukte. Es ist an der Zeit, diese Blackbox zu durchsuchen.

Wir halten es für dringend geboten, auf die Unsicherheit aufmerksam zu machen, die bei Ergebnissen von ChIP und anderen auf Formaldehyd-Fixierung basierenden Ansätzen dadurch entsteht, dass die Vernetzungseffizienz verschiedener Proteine ​​mit DNA und untereinander drastisch unterschiedlich ist und im Fall von in vivo Vernetzung, kann von lokalen Bedingungen in verschiedenen Zellkompartimenten abhängen.

Die aktuelle Chromatinforschung zeichnet sich durch die schnelle Ansammlung genomweiter Daten zur Verteilung verschiedener regulatorischer Proteine ​​entlang der Chromosomen aus. Diese Daten sind über verschiedene Datenbanken leicht zugänglich, und es wurden viele Anstrengungen unternommen, um immer mehr Daten in den Topf zu gießen. Überraschenderweise sind jedoch nicht viele Wissenschaftler besorgt über die Gültigkeit des Chromatin-Immunopräzipitations-(ChIP)-Ansatzes. Das ChIP-Verfahren wurde vor >15 Jahren entwickelt [1] und im Wesentlichen wird das ursprüngliche Protokoll immer noch verwendet, ohne seine inhärenten Probleme zu berücksichtigen, obwohl man seit langem das Gefühl hat, dass „der Teufel im ChIP-Detail steckt“. Der problematischste Schritt ist die Formaldehydfixierung. Es wird allgemein angenommen, dass Formaldehyd jeden DNA-Protein-Komplex fixieren kann. Diese Annahme ist jedoch noch lange nicht allgemein bestätigt. Beispielsweise kann der lac-Repressor nicht durch Formaldehyd an DNA fixiert werden, obwohl seine DNA-bindende Domäne eine Reihe basischer Aminosäurereste enthält [2]. Das gleiche wurde für NF-κB berichtet [3]. Für Fachleute auf diesem Gebiet gibt es sprichwörtlich schwer zu vernetzende Chromatinkomponenten, und es wurden in einigen Einzelfällen spezifische Protokolle ausgearbeitet, um dieses Problem hauptsächlich empirisch zu lösen (siehe z. B. [ 4]). Es wurde festgestellt, dass es eine zeitliche Schwelle für Vernetzungsreaktionen gibt, bei der ein Protein, sobald die Verweilzeit auf <5 s sinkt, für die Formaldehyd-Vernetzung „unsichtbar“ wird [ 5]. Das Verfahren der Formaldehydfixierung bleibt in der Tat empirisch, und über die Spezifität von in vivo Vernetzung, ihre Effizienz und die durch dieses Verfahren induzierten chemischen Addukte. Daher fliegen Wissenschaftler, die Vernetzungsexperimente durchführen, tatsächlich im Blindflug, was zu großen Problemen bei der Dateninterpretation führen kann [ 6, 7].

In den letzten Jahren wurden Methoden (3C, 4C, Hi-C, ChIA-PET usw.) auf der Grundlage des Verfahrens zum Einfangen der Chromosomenkonformation (3C) [ 8] häufig verwendet, um Promotor-Enhancer-Wechselwirkungen und andere Fragen im Zusammenhang mit dem 3D-Architektur des Genoms [ 9]. Das 3C-Protokoll basiert auf der Annahme, dass in lebenden Zellen assemblierte DNA-Protein-Komplexe durch Formaldehyd fixiert werden können und dann nach DNA-Spaltung durch Restriktionsenzyme die Komplexe mit entfernten regulatorischen Sequenzen, die durch Proteinbrücken verbunden sind, solubilisiert und verschiedenen Behandlungen in Lösung. Jüngste Studien unserer Gruppen haben gezeigt, dass dies nicht der Fall ist. Stattdessen erzeugt die Formaldehydfixierung ein starres Netzwerk von Chromatinfasern, das die Behandlung mit Natriumdodecylsulfat und Restriktionsenzymen überlebt. Obwohl dieses vernetzte Chromatinnetzwerk durch Beschallung zerstört werden kann, scheinen viele ansonsten nachweisbare Kontakte zwischen DNA-regulatorischen Elementen, wie Promotoren und Enchancern von Beta-Globin-Genen, nach einer solchen Behandlung verloren zu gehen [ 10–12]. Diese Ergebnisse argumentieren, dass in lebenden Zellen die Vernetzung genomischer Elemente über Brücken, die von regulatorischen Proteinen hergestellt werden, im Vergleich zur Vernetzung von Chromatinfasern über Histone ein relativ seltenes Ereignis sein kann. Dies kann sowohl das seltene Nebeneinander von Verstärkern und Promotoren als auch die Ineffizienz der Formaldehyd-Vernetzung widerspiegeln. Tatsächlich gibt es bekannte Beispiele, die zeigen, dass durch 3C-Methoden erfasste Enhancer-Promotor-Wechselwirkungen nicht mit der Kolokalisierung dieser Elemente korrelieren in vivo mikroskopisch untersucht [13]. Andererseits wurde berichtet, dass Formaldehyd bei der Vernetzung von Proteinen, die nicht direkt an DNA gebunden sind, wie Transkriptions-Koaktivatoren und -Corepressoren, ineffizient ist [ 14, 15].

Diese Beobachtungen werfen weitere Fragen auf: „Gibt es Unterschiede zwischen der Effizienz der Vernetzung in Euchromatin und Heterochromatin, und wenn ja, wie korrelieren sie mit genomweiten 3C-Daten?“ Zum Beispiel Sanyal et al. berichteten über eine höhere 5C-Kontakthäufigkeit in offenen Chromatinregionen [16], aber es ist unklar, ob dieses Ergebnis teilweise auf technische Grenzen der 3C-Technologie zurückzuführen ist, die die Vernetzung von offenem Chromatin begünstigt. In einer anderen Studie desselben Labors wurde gezeigt, dass bei mitotischen Chromosomen sowohl die großräumige räumliche Segregation als auch die topologisch assoziierenden Domänen verloren gingen [17] ineffiziente Formaldehyd-Vernetzung des hochkondensierten Chromatins mitotischer Chromosomen. Andererseits scheint die Fähigkeit, 3C-Kontakte zu erkennen, von der Erhaltung der Architektur unlysierter Kerne abhängig zu sein [10]. Da es in der Mitose keinen Kern gibt, kann das Fehlen dieser Architektur/Kernkompartimente der Abwesenheit von 3C-Kontakten in der Mitose zugrunde liegen. Noch besorgniserregendere Ergebnisse lieferte die ChIP-seq-Analyse der Verteilung des Silent Information Regulator (Sir)-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae. Die Autoren dieser Studie entdeckten eine artefaktische Anreicherung mehrerer nicht verwandter Proteine, einschließlich des gesamten Silencing-Komplexes, an stark exprimierten Genen, was die Ergebnisse einiger zuvor veröffentlichter ChIP-Studien in Frage stellt [6]. Das beobachtete Phänomen hängt höchstwahrscheinlich mit der Existenz sogenannter High-occupancy-Zielregionen oder „Hotspots“ zusammen, an denen viele DNA-bindende Proteine ​​trotz Abwesenheit von an . ein Anreicherungssignal zeigen in vitro Bindungsstelle in der zugrunde liegenden DNA-Sequenz [18].

Die Chemie der Formaldehyd-Vernetzung ist gut bekannt [ 1, 19], aber es ist die in vivo Aspekte der Technik, die im Dunkeln bleiben. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Formaldehydfixierung eine Reaktion auf DNA-Schäden und eine massive Poly(ADP-Ribosyl)ierung von Kernproteinen auslöst, wodurch die Chromatinzusammensetzung verändert und ein Bias in die ChIP-Analyse eingeführt wird [7]. Die durch die Formaldehydbehandlung gebildeten Quervernetzungen sind durch Erhitzen und pH-Abfall vollständig und leicht reversibel, was weitere Analysen von Proteinen und DNA ermöglicht. Gleichzeitig wirft die Temperatur- und pH-Abhängigkeit der Vernetzungsreaktion die Frage nach der Stabilität von DNA-Protein-Komplexen auf, die unter verschiedenen Bedingungen in verschiedenen Anwendungen erhalten werden. Es ist möglich, dass geringfügige Variationen der Bedingungen, unter denen die Vernetzung durchgeführt wird, die Wirksamkeit der Vernetzung und/oder die Stabilität der vernetzten Produkte wesentlich beeinflussen können. Dies kann nicht nur für ganze Zellen gelten, sondern auch für lokale Kompartimente innerhalb von Zellen, die in verschiedene physikalisch-chemische Mikroumgebungen im Nanobereich von Chromosomendomänen eingebettet sein können. Es ist daher nicht klar, inwieweit ChIP-Profile die Verteilung des untersuchten Proteins und inwieweit die lokalen Vernetzungsbedingungen widerspiegeln. Die Forschungsgeschichte zeigt bemerkenswerte Beispiele für gegensätzliche Schlussfolgerungen, die auf der Grundlage der Ergebnisse von Cross-Linking auf leicht unterschiedliche Weise durchgeführt wurden [ 20].

Wir möchten daher die Aufmerksamkeit der Forscher auf die Notwendigkeit lenken, die grundlegenden Schritte häufig verwendeter experimenteller Protokolle zu überdenken. So weit wie in vivo Formaldehyd-Vernetzung betrifft, ist es sicherlich an der Zeit, einige allgemein akzeptierte Annahmen umzukehren. Alle Beweise zeigen, dass die Formaldehyd-Vernetzung nicht mehr als das Allheilmittel der Molekularbiologie verwendet werden kann. Es ist an der Zeit, diese Blackbox zu durchsuchen: Untersuchen Sie ihre in vivo Molekularbiologie, ihre Konsequenzen für die Datensammlung in ChIP-seq- und „C“-Technologien, ihre Grenzen sowie die Erforschung möglicher Verbesserungen und Alternativen.

Die Formaldehyd-Vernetzung wird häufig verwendet, um die Chromatinstruktur zu untersuchen, bleibt jedoch eine kaum verstandene „Black-Box“-Technologie.


Enzyme und Nukleinsäuren

(d) Formaldehyd.

Formaldehyd reagiert mit freien Aminogruppen von Nukleosidbasen unter Bildung von Methylol- oder Schiffschen Basenderivaten und denaturiert folglich dsDNA. Formaldehyd-behandelte, immobilisierte DNA kann mit Oligonukleotidsonden mit einer 5- bis 10-fach höheren Effizienz als unbehandelte DNA hybridisiert werden. Formaldehyd reagiert zunächst mit DNA an den einzelsträngigen Bereichen, die beim „Atmen“ der Doppelhelix entstehen. Mit fortschreitender chemischer Modifikation, optimalerweise bei 6× SSC, 10 % HCHO und 60 °C für 20–30 min mit freien DNAs, kollabiert die Doppelhelix schließlich, was die DNA-HCHO-Reaktion weiter beschleunigt. Formaldehyd-Addukte sind in neutralen Puffern in Gegenwart von Formaldehyd stabil und verhindern eine DNA-Reassoziation. Die Entfernung des Reagenzes aus dem Puffer während der (Vor-)Hybridisierungsschritte führt zur Regeneration der Aminogruppen, wodurch eine ungehinderte, effiziente Hybridisierung ermöglicht wird. Formaldehyd kann auf ähnliche Weise auf RNA verwendet werden, um temporär aufzubrechen und/oder Sekundärstrukturen zu verhindern.


Abstrakt

Die Regulation der Gentranskription ist grundlegend für die Existenz komplexer vielzelliger Organismen wie des Menschen. Obwohl allgemein anerkannt ist, dass ein Großteil der Genregulation durch genspezifische Protein-DNA-Interaktionen gesteuert wird, gibt es derzeit wenig Werkzeuge zur Identifizierung von Proteinen, die mit dem Genom an interessierenden Stellen interagieren. Wir haben eine neuartige Strategie entwickelt, um dieses Problem anzugehen, die wir als GENECAPP, zum global Exonuclease-basiert EBereicherung von CChromatin-EINverbunden Proteins für Proteomik. Bei diesem Ansatz wird eine Formaldehyd-Vernetzung verwendet, um DNA kovalent an ihre assoziierten Proteine ​​zu binden, anschließende Fragmentierung der DNA, gefolgt von Exonuklease-Verdau, erzeugt eine einzelsträngige Region der DNA, die ein sequenzspezifisches Hybridisierungs-Capture der Protein-DNA ermöglicht komplex auf einer soliden Unterlage. Die massenspektrometrische (MS) Analyse der eingefangenen Proteine ​​wird dann zu ihrer Identifizierung und/oder Quantifizierung verwendet. Wir zeigen hier die Entwicklung und Optimierung von GENECAPP für eine in vitro Modellsystem, bestehend aus der Promotorregion des murine insulin-like growth factor-binding protein 1 (IGFBP1) und FoxO1, einem Mitglied der Forkhead Rhabdomyosarkom (FoxO) Unterfamilie von Transkriptionsfaktoren, die spezifisch an den IGFBP1-Promotor bindet. Diese neuartige Strategie bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für Studien von Protein-DNA- und Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Zitat: Wu C-H, Chen S., Shortreed MR, Kreitinger GM, Yuan Y, Frey BL, et al. (2011)Sequenzspezifisches Einfangen von Protein-DNA-Komplexen für die massenspektrometrische Proteinidentifizierung. PLoS ONE 6(10): e26217. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026217

Editor: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de Câncer, Brasilien

Empfangen: 4. August 2011 Akzeptiert: 22. September 2011 Veröffentlicht: 20. Oktober 2011

Urheberrechte ©: © 2011 Wu et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde vom Wisconsin Center of Excellence in Genomics Science durch das National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health [1P50HG004952] unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.


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DNA-Protein-Crosslinks

DPCs entstehen, wenn Proteine ​​durch physikalische oder chemische Einwirkungen wie UV-Licht bzw. Aldehyde (nicht-enzymatische DPCs) oder durch fehlerhafte enzymatische Reaktionen (enzymatische DPCs) 8 mit der DNA vernetzt werden 8 . Enzymatische DPCs werden durch Topoisomerase-1- und Topoisomerase-2-Spaltungskomplexe (Topo-1ccs, Topo-2ccs) gut veranschaulicht. Während der physiologischen Reaktion der Topoisomerase auf DNA bildet sich zwischen dem katalytischen Tyrosinrest und der DNA-Phosphatgruppe (Phosphotyrosylbindung) ein vorübergehendes, kovalentes Zwischenprodukt (d. h. ein Spaltungskomplex). Die Stabilisierung des Spaltungskomplexes (und die Bildung eines DPC) kann spontan erfolgen, wenn die DNA beschädigt ist, wird jedoch in Gegenwart von Giften verstärkt, B. Camptothecin (CPT) oder Etoposid, für Topo-1 bzw. Topo-2 9,10. Bemerkenswert ist, dass Topo-1/2-Gifte bei der Chemotherapie von Krebs weit verbreitet sind 2,11 . Enzymatische DPCs umfassen auch Crosslinks von DNMT1 (DNA-Methyltransferase 1) zum DNA-Methylierungsinhibitor 5-Aza-2'-desoxycytidin (5azadC), der in die DNA eingebaut ist 12,13, und von HMCES (5-Hydroxymethylcytosin-Bindung, ES-zellspezifisch) zu abasischen Stellen in einzelsträngiger DNA 14 .

Bei nicht-enzymatischen DPCs kann praktisch jedes Protein – unterschiedlicher Größe, Struktur und Natur – in der Nähe der DNA vernetzt werden. Einer der stärksten Crosslinker, Formaldehyd (FA), ist in der Umwelt stark vorhanden und wird endogen durch Prozesse wie Lipidperoxidation und DNA-, RNA- oder Histon-Demethylierung 15,16,17,18,19 produziert. Daher kann die Freisetzung von FA in der Umgebung der DNA erfolgen, was bedeutet, dass sich DPCs kontinuierlich bilden und die Zellen die DPC-induzierte Toxizität ständig überwinden müssen.

Eine defekte DPC-Reparatur führt zu Empfindlichkeit gegenüber Vernetzungsmitteln, fehlerhafter DNA-Replikation und Zellzyklusanomalien, die den Weg für chromosomale Instabilität und Karzinogenese bei Menschen und Mäusen ebnen 20 . Daher arbeiten mehrere Wege, um eine angemessene Reaktion auf diese Beleidigungen sicherzustellen.Nuklease-abhängige Mechanismen, wie Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und homologe Rekombination, funktionieren sowohl in Bakterien als auch in eukaryotischen Zellen, indem sie die DNA, die das DPC 21,22,23,24,25 flankiert, ausschneiden. NER scheint jedoch eine ziemlich begrenzte Rolle bei der gesamten DPC-Reparatur zu spielen, da es nur kleine DPCs entfernen kann (Größe 8–10 kDa in Säugerzellen) 5,23,26 . Topo-1/2ccs können durch dedizierte Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterasen, TDP1 und TDP2, ausgeschnitten werden, die die Phosphotyrosyl-Verknüpfung 27 spalten, die normalerweise abgeschirmt ist und nach teilweiser Proteolyse oder strukturellen Veränderungen der Topoisomerasen 28,29,30,31 für TDPs zugänglich wird. 32.

Ein viel biegsamerer, weniger differenzierter Weg, DPCs zu verarbeiten, ist die Proteolyse der Proteinkomponente, die von spezialisierten DPC-Proteasen betrieben wird, nämlich die DPC-Proteolyse-Reparatur.


Aktuelle Adresse: State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, Innovation Center for Cell Signaling Network, School of Life Sciences, Xiamen University, 361005, Xiamen, Fujian, China

Derzeitige Adresse: Chongqing Key Laboratory of Natural Product Synthesis and Drug Research, School of Pharmaceutical Sciences, Chongqing University, 401331, Chongqing, China

Derzeitige Adresse: Chinesisches Institut für Hirnforschung, 102206, Peking, China

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Rongfeng Zhu, Gong Zhang.

Mitgliedschaften

Synthetic and Functional Biomolecules Center, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, 100871, Beijing, China

Rongfeng Zhu, Gong Zhang, Yu Han, Jiaofeng Li, Jingyi Zhao und Peng R. Chen

Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, 100871, Peking, China

Miao Jing, Yulong Li und Peng R. Chen

State Key Laboratory of Membrane Biology, PKU-IDG/McGovern Institute for Brain Research, School of Life Sciences, Peking University, 100871, Peking, China

Schlüssellabor für bioorganische Chemie und Molekulartechnik des Bildungsministeriums, Universität Peking, 100871, Peking, China


Schau das Video: Schadstoffe in der Wohnung - was tun gegen Formaldehyd und Lösungsmittel? NDR (Oktober 2022).