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Geeignete Regeneration von StrepTrap HP-Säulen für FPLC

Geeignete Regeneration von StrepTrap HP-Säulen für FPLC


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Meine Frage bezieht sich auf die Proteinreinigung mit einem ÄKTA FPLC. Wir verwendeten StrepTrap HP-Säulen (1 ml Säulenvolumen (CV)) von GE Healthcare Life Sciences, um ein Strep-markiertes Protein zu reinigen. Im ersten Ansatz hat das ganz gut funktioniert. Wir wollten die Spalten wiederverwenden, nachdem wir sie gemäß dem offiziellen Protokoll regeneriert haben. Die enthaltenen Schritte wurden alle mit einer Flussrate von 1 ml/min und mit gefilterten Lösungen durchgeführt:

  1. 3 CV destilliertes Wasser
  2. 3 CV 0,5 M NaOH
  3. 3 CV destilliertes Wasser
  4. 5 CV 20 % EtOH
  5. Lagerung der Säulen in 20 % EtOH bei 4 °C.
  6. Äquilibrieren der Säulen mit Binding Buffer kurz vor der nächsten Verwendung.

Durch die Einhaltung des Protokolls stießen wir bei der nächsten Reinigung auf einige Probleme (es war das gleiche Protein, aber eine neue Probe von Zellextrakt). Die Reinigung funktionierte weniger effektiv und die Menge an gereinigtem Protein war sehr gering.

Wir haben ein etwas anderes Protokoll zur Regeneration ausprobiert, ebenfalls bei einer Flussrate von 1 ml/min und gefilterten Lösungen.

  1. 5 CV destilliertes Wasser
  2. 5 CV 20 % EtOH
  3. 3 CV 6 M Guanidinhydrochlorid (Sol.)
  4. 5 CV 0,5 M NaOH
  5. 3 CV destilliertes Wasser
  6. 5 CV 20 % EtOH
  7. Lagerung in 20 % EtOH bei 4°C
  8. Äquilibrierung mit Bindungspuffer vor der nächsten Verwendung.

Wir haben das Guanidinhydrochlorid gewählt, um alle verbleibenden Proteine ​​aus dem Säulenharz zu denaturieren und die Regeneration dadurch zu unterstützen. Aber auch bei diesem Protokoll stießen wir auf die gleichen Probleme (geringe Reinigungseffizienz).

Es würde mich sehr interessieren, wenn jemand von euch auf die gleichen Probleme gestoßen ist und vielleicht eine Lösung/ein besseres Protokoll für diesen Regenerationsschritt hat.

Vielen Dank für Ihre Vorschläge im Voraus! :)


Strukturbestimmungsprotokoll für Transmembrandomänen-Oligomere

Die Transmembran(TM)-Anker von Zelloberflächenproteinen sind einer der „blinden Flecken“ in der Strukturbiologie, da sie im Allgemeinen sehr hydrophob, manchmal dynamisch und daher schwierige Ziele für die strukturelle Charakterisierung sind. Eine Vielzahl von Beispielen zeigt, dass diese Membrananker nicht nur Anker sind, sondern spezifisch multimerisieren können, um Signalrezeptoren auf der Zelloberfläche zu aktivieren oder Hüllproteine ​​in Viren zu stabilisieren. Durch eine Reihe von Studien der TM-Domänen (TMDs) von Immunrezeptoren und viralen Membranproteinen haben wir ein robustes Protokoll zur Bestimmung atomar aufgelöster Strukturen von TM-Oligomeren durch NMR in Bicellen etabliert, die eine Lipiddoppelschicht nachahmen. Unser Protokoll überwindet Hürden, auf die typischerweise strukturbiologische Techniken wie Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) bei der Untersuchung kleiner TMDs stoßen. Hier stellen wir die Details des Protokolls zur Verfügung, das fünf technische Hauptaspekte abdeckt: (i) eine allgemeine Methode zur Herstellung von isotopenmarkierten TM- oder membranproximalen (MP) Proteinfragmenten, die die Expression des Proteins (das an TrpLE fusioniert ist) in Einschlusskörper und Freisetzung des Zielproteins durch Cyanogenbromid (CNBr)-Spaltung (ii) Bestimmung des oligomeren Zustands von TMDs in Bizellen (iii) Nachweis intermolekularer Kontakte mittels nuklearer Overhauser-Effekt (NOE) Experimente (iv) Strukturbestimmung und (v) paramagnetische Sondentitration (PPT) zur Charakterisierung der Membranverteilung der TM-Oligomere. Dieses Protokoll ist breit anwendbar zum Füllen von strukturellen Lücken vieler Typ-I/II-Membranproteine. Die Verfahren können je nach Komplexität und Stabilität der Proteinprobe 3–6 Monate dauern.


Hintergrund

Die R-Spondin (dachplattenspezifische Spondin) Proteine ​​umfassen eine Familie sezernierter Proteine, die für ihre wichtige Rolle bei der Zellproliferation, -differenzierung und -tod durch Induktion des Wnt-Signalwegs bekannt sind [1, 2]. RSPOs werden in mehreren embryonalen Geweben und im Erwachsenen exprimiert, wobei ausreichende Expressionsniveaus für die Entwicklung des Organismus und die Aufrechterhaltung der Homöostase unerlässlich sind [3, 4]. Mehrere Studien haben die Bedeutung von RSPOs bei der Regulierung mehrerer gewebespezifischer Prozesse wie Knochenbildung, Skelettmuskelgewebeentwicklung, Pankreas-β-Zellen und Darmstammzellen-Proliferation und sogar Krebs gezeigt, wie von Yoon und Lee [5] überprüft. Eine unangemessene Funktion dieser Proteine ​​kann jedoch zu verschiedenen pathologischen Zuständen führen [überprüft von [5, 6], wie zum Beispiel: Umkehr des sexuellen Phänotyps, Hyperkeratose und eine Prädisposition für Plattenepithelkarzinom der Haut [7, 8], kraniofaziale Defekte und Probleme bei der Bildung von Gliedmaßen, Lunge und Haarfollikeln [9,10,11,12], bei der Plazentabildung [13, 14] und bei der Entwicklung von Nägeln (Anonychie) [15,16,17,18]. Daher wird deutlich, dass RSPOs ein großes therapeutisches Potenzial zur Behandlung einer Reihe von Krankheiten aufweisen.

Es wurden vier RSPOs-Proteine ​​(RSPO1 bis 4) beschrieben, die alle charakteristische Domänen aufweisen, die bei Vertebraten konserviert sind, wie: (1) eine Thrombospondin-1-Repeat-(TSR)-Domäne, (2) eine Cystein-reiche Furin-ähnliche ( CR-FU) Domäne, (3) eine basische Aminosäure-reiche (BR) Domäne variabler Länge (Carboxy-terminale Region) und (4) eine hydrophile Signalpeptid (SP) Sequenz [5]. Das Signalpeptid, das an der aminoterminalen Region des Proteins vorhanden ist, gewährleistet seinen Eintritt in den kanonischen Sekretionsweg, adressiert das endoplasmatische Retikulum, den Durchgang durch den Golgi-Apparat-Komplex und die Sekretion in den extrazellulären Raum [4, 19]. Die RSPO CR-FU-Domäne wiederum wird als verantwortlich für die Vermittlung der Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs identifiziert [4, 19, 20, 21], obwohl auch andere Studien darauf hindeuten, dass diese Domäne an der Regulierung des Sekretion dieser Proteine ​​[21]. Andererseits wurde vorgeschlagen, dass die BR- und TSR-Domänen für die Regulierung der Intensität der RSPOs-Aktion bei der kanonischen Wnt-Weg-Induktion verantwortlich sind [20]. Darüber hinaus scheinen die TSR- und BR-Domänen immer noch für die Assoziation von RSPOs an die extrazelluläre Matrix (ECM) verantwortlich zu sein, indem sie an Glykosaminoglykane (GAG) und Proteoglykane binden [4, 19, 22, 23, 24] [überprüft von [ 6]].

Derzeit ist bekannt, dass RSPO-Proteine ​​in der Lage sind, den kanonischen (beta-Catenin-abhängigen) und nicht-kanonischen (beta-Catenin-unabhängigen) Wnt-Weg zu induzieren [überprüft von [5, 6]]. Obwohl mehrere Studien zu den Wirkmechanismen von RSPOs vorliegen, bleiben jedoch noch viele Fragen zu ihren Rezeptoren und den Mechanismen, die an der Signalübertragung durch diese Proteine ​​beteiligt sind. Studien zeigten, dass RSPOs an Leucin-reiche Wiederholungen binden, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 4–6 (Lgr4–6) [25,26,27] enthalten, um den kanonischen Wnt/Beta-Catenin-Signalweg zu induzieren, aber auch andere Studien weisen darauf hin, dass diese Proteine können an Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-verwandte Proteine ​​5–6 (Lrp5–6) [4, 19, 21, 28] und Kremen1 (KRM1) [29] binden. Es ist auch bekannt, dass RSPOs wirken, indem sie das Zink- und Ringfinger-3-Protein (ZNRF3) [30] hemmen und an Frizzled 8 (Fzd8) binden, um den Wnt-Weg zu induzieren [19], obwohl RSPOs anscheinend nur schwach an das FZD . binden Rezeptoren [21, 28]. Ein Teil dieser Kontroverse um RSPOs-Rezeptoren kann jedoch durch Studien erklärt werden, die eine synergistische Wirkung dieser Proteine ​​mit Wnt-Liganden nahelegen [4, 31]. Darüber hinaus wurde in einer neueren Arbeit die Nicht-Äquivalenz der WNT-Proteine ​​und der RSPOs in Bezug auf die Induktion der Selbsterneuerung in LGR5 + -Darmstammzellen beobachtet, aber die Zusammenarbeit zwischen diesen Proteinen wurde hervorgehoben [32]. Im Gegensatz zum kanonischen Wnt-Weg scheint der β-Catenin-unabhängige Weg in der Literatur weniger widersprüchlich zu sein, obwohl er weniger erforscht ist und noch einige Lücken aufweist. Kürzlich wurde festgestellt, dass Syndecane neue RSPOs-Rezeptoren im Wnt-Weg sind [24], aber Studien haben gezeigt, dass nur RSPO2- und RSPO3-Proteine ​​an Syndecane binden.

RSPO1 hebt sich unter den RSPOs-Molekülen hinsichtlich seines potenziellen therapeutischen Einsatzes, insbesondere im Bereich der Regenerativen Medizin, aufgrund seiner mitogenen Aktivität in Stammzellen ab. Dieses Potenzial wurde durch mehrere Studien bestätigt, die die Verwendung von RSPO1 in mehreren Tiermodellen zur Behandlung von: durch Chemotherapie [33] oder Bestrahlung [34] induzierte Darmmukositis, entzündliche Darmerkrankungen (IBD) wie Colitis ulcerosa (UC) gezeigt haben. und Morbus Crohn (CD), bei dem die Entzündungsreaktion zum kontinuierlichen Absterben von Darmepithelzellen führt [31, 35] und Diabetes Mellitus (DM), als zytoprotektives und proliferatives Mittel für β-Zellen, durch Regulierung des kanonischen Wnt-Signalwegs [36 , 37]. Darüber hinaus legen andere Studien seinen Einsatz bei Gelenkerkrankungen wie Arthritis [38] und bei Krebs nahe, möglicherweise als Tumorsuppressorgen bei lymphatischer Leukämie [38, 39].

Das hier produzierte und untersuchte RSPO1-Protein besteht aus 263 Aminosäureresten, die in einer einzelnen 28.959 Da-Polypeptidkette angeordnet sind. Laut der Universal Protein Resource Database (UniProt) wird RSPO1 aus dem RSPO1 Gen, das sich auf Chromosom 1 befindet, Position 38.076.951 bis 38.100.595, das vier Isoformen präsentiert, die durch das Spleißen alternativer Exons entstehen. Die In-silico-Analyse des RSPO1-Proteins zeigte eine dreidimensionale Struktur, die reich an β-Faltblatt-Sekundärstrukturen ohne Alpha-Helix ist. Neuere Studien zeigten das Vorhandensein einer N-Glykosylierung am Asparagin Asn137 der Polypeptidkette, die mit der RSPO1-Sekretion, -Aktivität und -Stabilität zusammenhängt [40, 41], obwohl beide oben erwähnten Artikel widersprüchliche Ergebnisse über die Wirkung der N-Glykosylierung präsentieren über die biologische Aktivität des RSPO1-Proteins.

Hier wurde das rekombinante humane RSPO1 unter Verwendung einer humanen Zelllinie erzeugt, nämlich: HEK293 (Human Embryonic Kidney) Zellen. Säugetierzellen wurden für die Produktion mehrerer rekombinanter Proteine ​​verwendet, insbesondere aufgrund ihrer Fähigkeit, posttranslationale Modifikationen durchzuführen, die für die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion von Proteinen unerlässlich sind. Unter den posttranslationalen Modifikationen verdient die Glykosylierung besondere Aufmerksamkeit bei der Herstellung rekombinanter Proteine ​​in heterologen Systemen, da diese Modifikationen je nach verwendetem Expressionssystem die Proteinfaltung, Aktivität, Stabilität und Reifung stören können [42]. In diesem Zusammenhang wurde die HEK293-Zelllinie aufgrund ihrer Fähigkeit, komplexe Glykosylierungsmuster zu erzeugen, insbesondere durch Zugabe von Sialinsäuren, häufig zur Herstellung rekombinanter Proteine ​​verwendet, da sie die am häufigsten verwendete menschliche Zelllinie bei der Herstellung von Biopharmazeutika ist von Aufsichtsbehörden wie der FDA (Food and Drug Administration) zugelassen [43, 44].

Das Ziel dieser Studie war es, eine stabile Expressionsplattform für die Produktion von rhRSPO1 in menschlichen Zellen zu generieren, um ein gereinigtes, charakterisiertes und biologisch aktives Proteinprodukt zu erhalten. In Zukunft könnte diese Plattform für die Produktion von rhRSPO1 auf effiziente und reproduzierbare Weise für den Einsatz in der Zelltherapie optimiert werden. Zusätzlich zur Erzeugung von rhRSPO1-überproduzierenden Zellklonen wurde ein neues rhRSPO1-Reinigungsprotokoll etabliert, das ein hochreines Proteinprodukt liefert.


Resultate und Diskussionen

Es gibt zwei verschiedene Aspekte des hier vorgestellten Verfahrens. Zuerst wurden mehrere Komponenten der Expressionsmischung einzeln auf eine optimierte Bildung nativer Disulfidbindungen gescreent. Zweitens wird gezeigt, dass diese optimierten Lösungsbedingungen mit GB1 (der B1-Domäne von Protein G aus Streptokokken sp.) Fusion zur verstärkten Expression [[21]]. Der Erfolg dieser Kombination hängt mit feinen Details bei der Herstellung der Reaktionsmischung zusammen.

Aktivität der zellfreien Proteinsynthese unter oxidierenden Bedingungen

Die Translationsmaschinerie im Ausgangs-Expressionssystem für dieses Projekt [ [21] ] wurde aus der reduzierenden Umgebung des E coli Zytoplasma. Daher haben wir zunächst die Proteinsyntheseausbeuten in diesem System unter zunehmend oxidierenden Bedingungen bestimmt. Die Expression des Membranproteins OmpX, das ausschließlich in der unlöslichen Fraktion produziert wird, wurde in kleinem Maßstab in Reaktionsmischungen durchgeführt, die mit variablen Verhältnissen von reduziertem Glutathion (GSH) und GSSG ergänzt wurden (Abb. 1). Die SDS/PAGE-Analyse des unlöslichen Expressionsprodukts zeigte, dass die intrinsische Proteinsynthese durch Zugabe von bis zu 10 m m GSSG auch in Abwesenheit von GSH nicht gehemmt wird ( 1 ). Bei einer Konzentration von 20 m m GSSG nahm die Produktion von OmpX signifikant ab, und bei 30 m m GSSG lieferte das zellfreie System keine messbare Synthese von OmpX mehr. Diese Ergebnisse können durch die Beobachtung erklärt werden, dass Proteinkomponenten des zellfreien Systems bei GSSG-Konzentrationen über 10 mm präzipitierten und so in der unlöslichen Proteinfraktion nachgewiesen werden konnten. Die Zugabe von bis zu 20 m m GSH in Abwesenheit von GSSG hatte keinen messbaren Einfluss auf die Translationseffizienz.

Einfluss von Redoxbedingungen auf die Translationsaktivität des E coli zellfreies Expressionssystem [ [21] ], das als Ausgangspunkt für die vorliegende Studie verwendet wurde. Die zellfreie Expression des Testproteins OmpX in pIVEX2.4 wurde 2 h bei 30 °C in Gegenwart der angegebenen Verhältnisse von GSH und GSSG durchgeführt. Nach der Reaktion wurde die unlösliche Proteinfraktion, die OmpX enthielt, gesammelt und durch SDS/PAGE analysiert. Jede Spur entspricht 3,5 µl Reaktionsmischung. N zeigt die negative Kontrollreaktion ohne Matrizen-DNA an.

Feineinstellung der Redoxbedingungen für die Bildung von Disulfidbrücken im zellfreien System

Um geeignete Redoxbedingungen zu bestimmen, die die Bildung von Disulfidbrücken und die native Faltung begünstigen, ohne die Translationseffizienz zu beeinträchtigen, untersuchten wir die lösliche Produktion von hDpl(24–152)-pIVEX2.4 in zellfreien Reaktionsmedien, ergänzt mit verschiedenen Verhältnissen von GSH und GSSG. Eine Western-Blot-Analyse des Reaktionsüberstands zeigte, dass die höchste lösliche Expression von hDpl(24–152) in Gegenwart von 2 m m GSH und 5–10 m m GSSG erhalten wurde (Abb. 2A). Da die Reaktionsmischung auch 2,1 mm Dithiothreitol (DTT), 2,1 mm β-Mercaptoethanol (2-ME) und 1,5 mm Cystein enthält (Tabelle 1), wurde somit eine hohe lösliche Expression in Gegenwart von etwa 10 mm freien Sulfhydrylgruppen und 5 –10 mm GSSG.

Einfluss variabler Redoxpotentiale und Disulfidbrücken-Isomerasekonzentrationen auf die zellfreie Expression von drei Zielproteinen mit Disulfidbrücken. Gezeigt werden Western Blot (A, B, C) und SDS/PAGE (D) Analysen der löslichen Proteine, die nach zellfreier Expression während 2,5 h bei 30 °C erhalten wurden, entweder mit dem pIVEX2.4 (A, B, D) oder der pCFX1 (C)-Vektor. Für jede Spur in (A), (C) und (D) entspricht das aufgetragene Probenvolumen 2,5 µL Reaktionsmischung und in (B) 1,5 µL. (A) Lösliche Expressionsniveaus von hDpl (24-152) bei verschiedenen Redoxpotentialen, die durch Mischen verschiedener Verhältnisse von GSH und GSSG erreicht werden. (B) Reaktionsmischungen zur Expression von hDpl(24-152), die 2 m m GSH und 5 m m GSSG enthielten, wurden mit steigenden Konzentrationen der Disulfidbrücken-Isomerasen DsbC oder PDI ergänzt. (C) Lösliche zellfreie Expression von GB1–mDpl(24–155) bei variablen Niveaus des Redoxpotentials und der DsbC-Konzentration. (D) Auswirkungen variabler Redoxpotentiale und DsbC-Konzentrationen auf die lösliche Produktion von mIL22 (34–179). Pfeile zeigen die Banden an, die dem Zielprotein entsprechen, und N identifiziert die Spur der negativen Kontrollreaktion ohne Template-Plasmid.

Komponente Konzentration
KOAc 217 m²
Kreatinphosphat 80 m²
HEPES-KOH 58 Mio. m
Mg(OAc)2 11 m²
NaN3 3,8 m²
PEG-8000 3,25% (Gew./Vol.)
2-ME 2,1 Mio. m
DVB-T 2,1 Mio. m
ATP 1,2 m²
GTP 0,86 mm
CTP 0,86 mm
UTP 0,86 mm
cAMP·Na + 0,64 mm
Folinsäure·Ca 2+ 68 μm
E coli tRNA 175 μg·mL -1
Kreatinkinase 5,8 μm
Zielplasmid 10 μg·mL -1
T7-RNA-Polymerase 65 nm
Aminosäuren (jeweils) 1,5 m²
S30 Zellextrakt 30% (Vol./Vol.)

Ergänzung des zellfreien Expressionssystems mit Disulfidbrücken-Katalysatoren

Ein SDS/PAGE-Vergleich sowohl der löslichen als auch der unlöslichen Ausbeuten an hDpl(24–152) zeigte, dass nur etwa 5 % (8 μg·mL −1 ) des gesamten produzierten hDpl (160 μg·mL −1 ) in löslicher Form bei die oben erwähnten optimalen Redoxbedingungen. Um die lösliche Produktion von hDpl(24-152) zu erhöhen, wurde die Reaktionsmischung mit Redoxbedingungen von 2 mm GSH und 5 mm GSSG mit verschiedenen Konzentrationen von Thiol ergänzt: Disulfidaustauschprotein DsbC (DsbC) und Proteindisulfidisomerase ( PDI). Western-Blot-Analysen zeigten, dass eine Ergänzung von 10 μm DsbC oder PDI die lösliche Produktion von hDpl (24–152) signifikant erhöhte (Abb. 2B). Dabei wurden mehr als 50 % (80 μg·mL −1 ) des synthetisierten hDpl(24–152) in löslicher Form erhalten. Die so etablierten Bedingungen für eine optimale Expression von hDpl(24–152) konnten auf GB1–mDpl(24–155) übertragen werden (Abb. 2C).

Für mIL22(34–179) zeigte die SDS/PAGE-Analyse, dass in Abwesenheit enzymatischer Disulfidbindungskatalysatoren die maximale Produktion von löslichem Protein nach Zugabe von 2 m m GSH und 5–10 m m GSSG erreicht wurde. Die Zugabe von 5 μ m DsbC erhöhte die Produktion des löslichen Proteins um das ∼ 2,5-fache (Abb. 2D) und mehr als 80 % (0,2 mg·mL −1 ) des insgesamt synthetisierten mIL22(34–179) (0,25 mg· mL −1 ) wurde in löslicher Form erhalten. Da maximale lösliche Ausbeuten mit 5 μ m DsbC erzielt wurden, gibt es einen Hinweis darauf, dass die native Anordnung der Disulfidbrücken für mIL22(34–179) leichter erreicht wird als für hDpl(24–152) oder für mDpl(24–155). .

Es wurde bereits gezeigt, dass das Disulfidbindungsoxidase Thiol : Disulfidaustauschprotein DsbA (DsbA) die native Faltung von Proteinen verbessert in vitro durch Verstärkung der Disulfidbindungsbildung während des Faltungsprozesses [ [25] ]. Wir untersuchten daher auch die Auswirkungen einer Zugabe von bis zu 25 μm DsbA, hergestellt wie in Doc. S3, zu einer Reaktionsmischung, die auch 2 m m GSH, 5 m m GSSG und 10 µ m DsbC enthielt. Unter diesen Bedingungen erhöhte die Zugabe von DsbA nicht die lösliche Ausbeute an hDpl(24–152). In ähnlicher Weise erhöhte die Zugabe von DsbA in Abwesenheit von DsbC die lösliche Expression nicht, und wir verfolgten das Experimentieren mit DsbA nicht weiter. Insgesamt förderten sowohl das prokaryontische DsbC als auch das eukaryontische PDI die Expression von löslichem Zielprotein, was darauf hinweist, dass sie im vorliegenden Expressionssystem austauschbar verwendet werden können.

Zellfreie Expression mit S30-Zellextrakt aus E coli Origami (DE3) Zellen

E coli Stämme, die Mutationen in den Genen enthalten, die für Thioredoxin-Reduktase kodieren (trxB) und Glutathionreduktase (gor) zeigen eine verstärkte Bildung von Disulfidbrücken im bakteriellen Zytoplasma [ [26] ]. Um das Potenzial von Extrakten aus diesen Stämmen für die zellfreie Produktion von Proteinen mit Disulfidbindungen mit dem für BL21 (DE3) RIPL-Star optimierten Protokoll zu untersuchen, haben wir S30-Extrakt aus dem E coli Origami (DE3)-Stamm (Novagen, Darmstadt, Deutschland). Anschließend verglichen wir die zellfreie Produktion von mIL22(34–179) unter Verwendung von S30-Extrakten, die aus beiden hergestellt wurden E coli Origami (DE3) oder E coli BL21 (DE3) RIPL-Star-Zellen, die mit verschiedenen Verhältnissen von GSH und GSSG ergänzt wurden. Die Analyse durch SDS/PAGE zeigte sehr niedrige Expressionsniveaus von mIL22 (34–179) in Reaktionen mit S30-Extrakt aus Origami-Zellen, und wir haben diesen Extrakt nicht weiter untersucht.

N-terminale GB1-Fusion für erhöhte Expressionsausbeuten

Wir haben kürzlich gezeigt, dass N-terminale Fusionskonstrukte mit der GB1-Domäne die Ausbeuten an zellfreier Expression menschlicher Proteine ​​​​erhöhen [ [21] ]. Hier untersuchen wir die Verwendung der GB1-Fusion mit den oben genannten zellfreien Systemen, die für disulfidhaltige Proteine ​​optimiert wurden. Insgesamt wurde somit festgestellt, dass die GB1-Fusion der Zielproteine ​​weder das optimale GSH/GSSG-Verhältnis noch die optimale Konzentration an Disulfidbindungsisomerase beeinflusst, die für die native Faltung erforderlich ist. Somit wurden 10 mL zellfreie Reaktionen von hDpl(24–152) mit (pCFX1) oder ohne (pIVEX2.4) Fusion mit der GB1-Löslichkeitsdomäne unter optimalen Bedingungen für die Bildung von Disulfidbrücken durchgeführt, dh mit 2 mm GSH, 5 mm GSSG und 10 μm DsbC. Nach der Reinigung zeigte die UV-Absorption bei 280 nm Ausbeuten von 4,2 mg löslichem hDpl(24–152) von pCFX1 und 0,8 mg von pIVEX2.4. Der 5-fache Anstieg für das Fusionskonstrukt mit der GB1-Domäne ist wahrscheinlich sowohl auf eine erhöhte Gesamtproduktion des Proteins durch eine erhöhte Translationseffizienz [[21]] als auch auf eine erhöhte Löslichkeit [[27]] zurückzuführen. SDS/PAGE zeigte, dass die Ausbeute von 4,2 mg 75 % der gesamten hDpl(24–152)-Expression (5,6 mg) entspricht, verglichen mit 2 % des gesamten synthetisierten Proteins ohne disulfidbildende Zusätze.

In weiteren Assays wurden 10 mL Reaktionen von mIL22(34–179) in pIVEX2.4 oder pCFX3 unter Verwendung von [u-15 N]-Aminosäuren unter optimalen Bedingungen für mIL22(34–179) durchgeführt, dh mit Zugabe von 2 mm GSH, 10 mm GSSG und 5 μm DsbC. Wir erhielten 2,0 mg mIL22(34–179) aus der Expression in pIVEX2.4 und 6,6 mg aus der Expression in pCFX3, wobei SDS/PAGE anzeigte, dass mehr als 90 % (6,6 mg) des gesamten N-terminalen Fusionskonstrukts mit dem Die GB1-Domäne (7,3 mg) war löslich. Ohne disulfidfördernde Zusatzstoffe waren nur ∼ 5 % des exprimierten GB1-mIL22-Fusionsproteins löslich. Schließlich ergab eine 10 mL zellfreie Reaktion mit [u-15 N]-markierten Aminosäuren in pCFX1 unter Zugabe von 2m m GSH, 5 mm GSSG und 10 μm DsbC 3,0 mg gereinigtes mDpl(24–155), entsprechend bis ∼ 50 % des gesamten exprimierten Proteins (6 mg). Die geringere Ausbeute an löslichem Protein im Vergleich zu hDpl(24–152) scheint eine erhöhte Schwierigkeit bei der Herstellung des Mausproteins widerzuspiegeln, wie zuvor bei der Expression in beobachtet wurde E coli Zellkulturen [ [23, 24] ]. Die Ausbeute an löslichem GB1-mDpl-Fusionsprotein ohne Disulfid-fördernde Zusätze betrug ∼ 2% des gesamten synthetisierten Proteins.

Strukturvalidierung der disulfidhaltigen Proteine ​​aus zellfreier Produktion und Schlussfolgerungen

Der Gehalt an freiem Sulfhydryl der drei hier untersuchten Proteine ​​wurde mit dem Ellman-Assay unter denaturierenden Bedingungen bestimmt, wie im Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben. Es gab keine Hinweise auf einen messbaren Gehalt an freiem Sulfhydryl, was darauf hindeutet, dass die Disulfidbindungen erfolgreich gebildet wurden.

Um nachzuweisen, dass die durch zellfreie Expression produzierten Proteine ​​nativ gefaltet waren, zeichneten wir 2D [ 15 N, 1 H] heteronukleare Einzelquantenkohärenz(HSQC)-NMR-Spektren auf. Für zellfrei produziertes hDpl(24–152) und mDpl(25–155) zeigte der Vergleich mit den verfügbaren Rückgrat-Amid-Resonanzzuordnungen [ [23, 24] ], dass die native Faltung erhalten wurde (Abb. 3). Dies schließt ein, dass hDpl(24–152) entweder frei exprimiert wurde oder als Fusionskonstrukt mit der GB1-Domäne die native Faltung annahm (Abb. 3A, B). Die Spektren enthalten auch NMR-Signale der N-terminalen Reinigung und Löslichkeits-Tags.

2D [ 15 N, 1 H]-HSQC-Spektren von hDpl(24–152) und mDpl(24–155), hergestellt durch zellfreie Expression mit 15 N-markierten Aminosäuren in Reaktionsmischungen mit 2 mm GSH, 7,5 mm GSSG und 10 μm DsbC. (A) 200 μ m [u- 15 ​​N]-hDpl(24–152), hergestellt aus zwei 10-mL-Reaktionen unter Verwendung des pIVEX2.4-Vektors. (B) 275 μ m [u- 15 ​​N]-GB1–hDpl(24–152), hergestellt aus einer 10 mL zellfreien Reaktion unter Verwendung des pCFX1-Vektors. Die zusätzlichen Signale, die aus der GB1-Domäne stammen [[27]] sind leicht zu erkennen. (C) 140 μ m [u- 15 ​​N]-mDpl(24–155) nach Thrombinspaltung zur Entfernung der N-terminalen GB1-Löslichkeitsdomäne. Das Protein wurde in einer zellfreien Reaktion im Batch-Modus von 10 ml unter Verwendung des pCFX1-Vektors synthetisiert. Alle Proben enthielten 20 m m Natriumacetat bei pH 5,2, 100 µ m EDTA, 10 µ m Natriumazid und 5 % D2O. Die Spektren wurden bei einer 1 H-Resonanzfrequenz von 750 MHz mit T = 20 °C. Rote Kreuze in (A) und (B) zeigen die veröffentlichten Peakpositionen für hDpl(24–152) (BMRB 5145) und diejenigen in (C) die Peakpositionen für mDpl(26–157) (BMRB 4938).

Es wurde gezeigt, dass humanes Interleukin-22 in Lösung selbst bei mikromolaren Konzentrationen Dimere bildet [ [28] ]. Es scheint, dass mIL22(34–179) auch in Lösung dimer ist, da das 2D [ 15 N, 1 H]-HSQC-Spektrum eine geringere Anzahl von Signalen enthält als von der Anzahl der Amidgruppen im Protein erwartet, wobei die meisten Reste vertreten sind durch schwache Peaks (Fig. 4A). Dennoch ist zu erkennen, dass das NMR-Spektrum einem gefalteten globulären Protein entspricht. Für das denaturierte Protein in Harnstoff enthielt das 2D [ 15 N, 1 H]-HSQC-Spektrum eine Reihe von Amidresonanzen, die innerhalb der Genauigkeit der Peakzählung eng mit der von der Primärstruktur erwarteten Zahl übereinstimmten (Abb. 4B). . Das zellfrei produzierte mIL22(34–179) zeigte ein für ein Protein mit hohem Anteil helikaler Sekundärstruktur typisches fern-UV-CD-Spektrum (Abb. 5), und die biologische Aktivität des produzierten Proteins wurde mit IL-22- nachgewiesen. defiziente Mäuse im Labor von B. Becher [ [29] ].

2D [ 15 N, 1 H]-HSQC-Spektren für (A) natives und (B) Harnstoff-entfaltetes [u- 15 ​​N]-mIL22(34–179), exprimiert mit dem Vektor pIVEX2.4 in einem 10 mL zellfreien Reaktionsmischung ergänzt mit 2 mm GSH, 10 mm GSSG und 5 µm DsbC. In (B) wurde das Protein in 8 m Harnstoff und 10 m m DTT denaturiert. Die Spektren wurden bei einer 1 H-Resonanzfrequenz von 750 MHz und bei T = 37 °C.

Fern-UV-CD-Spektrum bei 20 °C von mIL22(34–179), hergestellt durch zellfreie Synthese. Die Probe enthielt 15 µm mIL22(34–179), 3 mm Natriumphosphat bei pH 7,0, 34 mm Natriumchlorid und 1,1 mm Kaliumchlorid.

Insgesamt validiert die vorliegende Dokumentation der nativen Faltung disulfidhaltiger eukaryontischer Proteine, die in Milligramm-Mengen in einem zellfreien System produziert werden, das verwendete zellfreie Expressionsprotokoll, das die Einstellung eines geeigneten Redoxpotentials durch Zugabe geringer Konzentrationen von GSH und GSSG auf S30-Zellextrakt aus dem E coli BL21 (DE3) RIPL-Star-Stamm und Ergänzung dieser Mischung mit einer Disulfidbindungsisomerase, um die korrekte Anordnung von Disulfidbindungen zu erleichtern. Es ist erwähnenswert, dass die besten Ergebnisse in Gegenwart von 10 mm Sulfhydrylgruppen und 5–10 mm GSSG erzielt wurden, was den Redoxbedingungen im endoplasmatischen Retikulum [ [30] ] sehr entspricht, wo typischerweise Disulfidbrücken gebildet werden [ [ 2] ]. Die erneute Beobachtung einer signifikant erhöhten löslichen Expression von N-terminalen Fusionskonstrukten des Zielproteins mit der GB1-Domäne [[21]] deutet darauf hin, dass dieser Ansatz recht breit anwendbar sein könnte, um höhere Ausbeuten bei der zellfreien Expression zu erzielen. Im Hinblick auf die Verwendung dieses Expressionssystems in der Strukturbiologie ist von Interesse, dass die Energieregeneration auf Kreatinphosphat basiert, welches Stoffwechselwege im Zellextrakt nicht aktiviert und somit die Produktion von stabil-isotopenmarkierten Proteinen ermöglicht. Es vermeidet außerdem die Reduktion von GSSG während der zellfreien Reaktion und eliminiert somit die Notwendigkeit einer chemischen Vorbehandlung des S30-Extrakts. Diese Ergebnisse heben unser Expressionssystem von zuvor beschriebenen zellfreien Systemen ab. Diese lieferten entweder Ausbeuten von < 50 μg nativem Protein pro Milliliter Reaktionsansatz [ [9-11, 14] ] oder basierten auf einer Energieregeneration mit Phosphoenolpyruvat [ [14, 16, 17] ], was mit einer stabilen Isotopenmarkierung nicht kompatibel ist und erfordert eine chemische Vorbehandlung des Zellextrakts zur Stabilisierung des Redoxpotentials [ [14-16] ].


Diskussion

Eine systematische Untersuchung der Funktion über Enzymfamilien hinweg wurde erst vor kurzem versucht und wurde bisher nicht auf eine repräsentative Stichprobe einer ganzen Superfamilie in diesem Maßstab angewendet. Eine kleine, nicht charakterisierte Enzymfamilie, DUF849, wurde von Bastard et al. (3) Verwenden einer integrierten Strategie zur Bewertung der funktionalen Vielfalt. Basierend auf dem Screening einer Reihe repräsentativer Enzyme (124 von 900) gegen 17 mutmaßliche Substrate ergab diese Studie, dass die Familie im Allgemeinen die Kondensation einer β-Ketosäure mit Acetyl-CoA katalysiert und Acetoacetat und CoA-Ester produziert. Eine weit verbreitete katalytische Promiskuität wurde in der Metallo-β-Lactamase-Superfamilie durch die Analyse von 24 Enzymen gegen 10 katalytisch unterschiedliche hydrolytische Reaktionen beschrieben, wobei Enzyme durchschnittlich 1,5 Reaktionen zusätzlich zu ihrer nativen Aktivität katalysierten (38). In einer orthogonalen Studie wurde das Screening aller 23 löslichen HADSF-Mitglieder innerhalb einer einzigen Spezies (E coli) wurde mit einem Satz von 80 kommerziell erhältlichen phosphorylierten Substraten (4) durchgeführt. Die Ergebnisse kommentierten die E coli Enzyme und zeigten, dass HADSF-Mitglieder die Fähigkeit besitzen, ein breites Spektrum an phosphorylierten Verbindungen zu hydrolysieren, wobei 19 der 29 getesteten Enzyme ein breites Substratspektrum aufweisen.

Unsere Ergebnisse zeigen durch eine repräsentative Probenahme von prokaryotischen Organismen im HADSF, dass der Grad der Substratmehrdeutigkeit groß und allgegenwärtig ist. Dies führt zu der Frage: Wie kann das Vorhandensein von Enzymen mit breitem Substratspektrum zur Fitness einzelner Organismen und zu komplexen mikrobiellen Gemeinschaften beitragen? Die Akkumulation von Metaboliten kann den Stoffwechselfluss stören oder Metaboliten selbst können sich als toxisch für Organismen erweisen (39). Eine breite Substratüberlappung zwischen HADSF-Mitgliedern kann einen Schutz gegen solche schädlichen metabolischen Wirkungen bieten. Eine Überlappung der Funktion kann dazu dienen, einen ausreichenden Umsatz bereitzustellen (ohne die Effizienz eines einzelnen Enzyms zu optimieren), um große Pools ähnlicher Substrate zu metabolisieren. Substratüberlappung kann auch bei der Entwicklung neuer Stoffwechselfunktionen als Reaktion auf Umweltherausforderungen helfen. Promiskuität erhöht die Flexibilität während der Evolution als Reaktion auf Veränderungen im Substratpool. Wenn während der Evolution eine Variation des Substratpools vorliegt, ist es für Mutationen leichter, das Substratspezifitätsspektrum breiter, überlappender Enzyme zu ändern – d. h. Divergenz vor der Genduplikation (40, 41).

Die Erkenntnis, dass HADSF-Mitglieder mit minimaler oder keiner Cap-Insertion (Typ C0) spezifischer sind als solche mit Domäneninsertionen (Typen C1, C2A oder C2B, Abb. 4 B und C) ist überraschend, da die cap-Domäne die Spezifitätsdeterminanten im HADSF (10) bereitstellt. Es könnte erwartet werden, dass in C0-Mitgliedern nur wenige Enzymreste mit der substratabgangsgruppe interagieren und daher die Abgangsgruppe in Größe, Form und elektrostatischer Oberfläche variieren kann, wodurch ein Enzym mit breiter Spezifität entsteht. Ein alternatives Modell erklärt jedoch die hier gemachte Beobachtung. Die Struktur der substratabgangenden Gruppe kann durch die Notwendigkeit eingeschränkt sein, als Barriere zwischen dem Hauptlösungsmittel und dem Mg 2+ -Cofaktor des aktiven Zentrums, dem nukleophilen Asp und der allgemeinen Asp-Säure/Base als Barriere zu fungieren und die Cap-Domäne in dieser Funktion zu ersetzen. Tatsächlich zeigen die Strukturen der C0-HADSF-Mitglieder Scp-1 (35) und GmhB (42), dass die Anpassung zwischen Enzym und Substrat es einer Sonde von der Größe von Wasser nicht erlaubt, in das aktive Zentrum einzudringen (siehe SI-Anhang, Bild S22). Umgekehrt gibt es in Enzymen mit cap-Domänen ein eingeschlossenes aktives Zentrum und eine Reihe von Enzymresten aus der (den) cap-Spezifitätsschleife(n) stehen zur Verfügung, um Wechselwirkungen mit verschiedenen Substraten einzugehen, was die Entwicklung der Aktivität gegen mehrere Substrate ermöglicht. Außerdem kann die Mobilität der Kappendomäne in Bezug auf die Kerndomäne den Zugang zu unterschiedlichen Substraten unterschiedlicher Größe ermöglichen.

The concept that domain insertions provide the raw material for the evolution of specificity determinants (including the residues that allow substrate ambiguity) is supported by recent findings. The directed evolution and bioinformatics analysis of a lactamase supports the model that enzymes are more capable of catalyzing multiple reactions when the active site is composed of loops juxtaposed to, but separate from, the core scaffold (43). Domain insertion can be considered an extreme example of this observation. The facilitation of substrate ambiguity via domain insertion can be a widespread phenomenon in protein evolution, because it has been estimated that ∼10% of insertion events are domain insertions (44). Overall, our findings are consistent with the concept that domain insertions act to drive the evolution of new functions. The widespread substrate ambiguity in the C1- and C2-type HADSF members observed herein may be a vestige of the evolutionary process. Previous work has shown that in the process of in vitro evolution selection pressure toward increasing one activity results in “generalists” that show multiple activities that were not selected for (45).


Materialen und Methoden

Plants, growth conditions and sampling

The work was carried out using Arabidopsis thaliana L. (Heynh) (ecotypes Lähm, Col-Ö and Ws-2), the NASC <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"N92274","term_id":"1264583","term_text":"N92274">> N92274 (pgi1𠄳), das pgi1𠄲 mutant [28], the aps1::T-DNA mutant (SALK_040155) [31], the pgm::T-DNA mutant (GABI_094D07), the gpt2::T-DNA mutant (GABI_454H06), pgi1𠄳 plants expressing either PGI1 oder PGI1*, das pgi1𠄳/gpt2 und pgi1𠄲/gpt2 double mutants and the pgi1𠄲/sex1 und pgi1𠄳/sex1 Doppelmutanten. Die pgi1𠄲/sex1 und pgi1𠄲/gpt2 double mutants were confirmed by PCR using the oligonucleotide primers listed in S1 Table. Die 35S-PGI1 und 35S-PGI1* plasmid constructs utilized to produce PGI1 oder PGI1* ausdrücken pgi1𠄳 plants were produced as illustrated in S7 Fig. pgi1𠄳 plants expressing GBSS-GFP were produced using the 35S-GBSS-GFP plasmid construct [105] whereas pgi1𠄲 plants expressing GBSS-GFP were produced using the 35S-GBSS-GFP* plasmid construct produced as illustrated in S8 Fig. The plasmid constructs were transferred to Agrobacterium tumefaciens EHA105 cells by electroporation and utilized to transform Arabidopsis plants according to [106]. Transgenic plants were selected on the appropriate antibiotic-containing selection medium.

Unless otherwise indicated plants were cultured in soil in growth chambers under the indicated photoperiodic conditions (light intensity of 90 μmol photons sec -1 m -2 ) and at a constant temperature of 22ଌ. Harvested source leaves were immediately freeze-clamped and ground to a fine powder in liquid nitrogen with a pestle and mortar.

To analyze the effects of exogenously applied CKs on starch content plants were grown in vitro on MS agar plates at a constant temperature of 22ଌ under LD conditions. Three-weeks old plants were then transferred to MS agar plates containing the indicated concentrations of tZ. After two additional days leaves were harvested, and starch content was measured as described below.

Enzyme assays

One g of the frozen powder (see above) was resuspended at 4ଌ in 3 ml of 100 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM EDTA and 2 mM dithiothreitol, 1 mM PMSF and 10 ml/L protease inhibitor cocktail (Sigma P9599), and centrifuged at 14,000 x g for 20 min. The supernatant was desalted by ultrafiltration on Vivaspin 500 centrifugal concentrator (Sartorius) and the protein extract thus obtained was assayed for enzymatic activities. AGP and UGP activities were measured following the two-step assay method described in [48]. PGI and SuSy were measured as described in [24] and [107], respectively. Adenylate kinase was assayed in the two directions of the reaction as described in [108] using an HPLC system (Waters corporation) fitted with a Partisil 10-SAX column. PGM and acid invertase were assayed as described in [29] and [109], respectively. Rubisco activity was measured according to [110]. Amylolytic activities were assayed as described in [111]. PPase and SPS were measured as described in [74]. SS activity was measured in two steps: (1) SS reaction and (2) measurement of ADP produced during the reaction. The SS assay mixture contained 50 mM HEPES (pH 7.5), 6 mM MgCl2, 3 mM dithiothreitol, 1 mM ADPG and 3% glycogen. After 5 min at 37ଌ reactions were stopped by boiling the assay mixture for 2 min. ADP was measured by HPLC on a Waters Associate’s system fitted with a Partisil-10-SAX column. One unit (U) is defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol of product per min.

Non-reducing western blot analyses of AGP

For non-reducing western blots of AGP, 50 mg of the homogenized frozen material (see above) was extracted in cold 16% (w/v) TCA in diethyl ether, mixed, and stored at -20ଌ for at least 2 h as described in [48]. The pellet was collected by centrifugation at 10,000 x g for 5 min at 4ଌ, washed 3 times with ice-cold acetone, dried briefly under vacuum, and resuspended in 1x Laemmli sample buffer containing no reductant. Protein samples were separated on 10% SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose filters, and immunodecorated by using antisera raised against maize AGP as primary antibody [48], and a goat anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate (Sigma) as secondary antibody.

Chromatographic separation of cytPGI and pPGI

Chromatographic separation of the two PGI isoforms was conducted using an AKTA FPLC from Amersham Pharmacia Biotech. Protein extracts of WT and pgi1𠄳 leaves (see above) were loaded onto a HiLoad 16/10 Q-sepharose HP anion exchange column (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 50 mM HEPES (pH 7.5). After washing the column, the adsorbed proteins were eluted with a linear 0𠄰.8 M NaCl gradient in 50 mM HEPES (pH 7.5). The flow rate was 5 ml/min and 2.5 ml fractions were collected. Fractions were analyzed for PGI activity as described above.

Native gel assay for PGI activity

PGI zymograms were performed as described in [29]. Protein extracts (see above) of both WT and pgi1 leaves were loaded onto a 7.5% (w/v) polyacrylamide gel. After electroforesis gels were stained by incubating in darkness at room temperature with 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM F6P, 1 mM NAD + , 4 mM MgCl2, 0.2 mM methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (Sigma M5655) and 0.25 mM phenazine methosulfate (Sigma P9625) and 1 U/mL of G6P dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides (Sigma G8404).

Analytische Verfahren

For determination of metabolites content, fully expanded source leaves of 30 days after germination (DAG) plants were harvested at the indicated illumination period, freeze-clamped and ground to a fine powder in liquid nitrogen with a pestle and mortar. ADPG content was measured by HPLC-MS/MS as described in [55]. For measurement of sucrose, glucose and fructose, a 0.1 g aliquot of the frozen powder was resuspended in 1 mL of 90% ethanol, left at 70ଌ for 90 min and centrifuged at 13,000 x g for 10 min. For measurement of G6P, F6P and G1P 0.5 g aliquot of the frozen powdered tissue was resuspended in 0.4 ml of 1 M HClO4, left at 4ଌ for 2 h and centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The supernatant was neutralized with K2CO3 and centrifuged at 10,000 x g. Sucrose, glucose, fructose, F6P, G6P and G1P from supernatants were determined by HPLC with pulsed amperometric detection on a DX-500 Dionex system. NADP(H) and NAD(H) were measured as described in [112]. Starch was measured by using an amyloglucosydase�sed test kit (Boehringer Mannheim, Germany). For measurement of adenine nucleotides a 0.5 g aliquot of the frozen powder was resuspended in 0.4 ml HClO4, left at 4ଌ for 2 h and centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The supernatant was neutralized with K2CO3 and centrifuged at 10,000 x g. Nucleotides content in the supernatant was measured by HPLC (Waters corporation) fitted with a Partisil 10-SAX column as described in [113]. Recovery experiments were carried out by the addition of known amounts of metabolites standards to the frozen tissue slurry immediately after addition of extraction solutions.

For determination of CKs levels, aliquots of the frozen leaves (see above) were lyophilized and CKs were quantified according to the method described in [114].

Iodine staining

Leaves harvested at the end of the light period were fixed by immersion into 3.7% formaldehyde in phosphate buffer. Leaf pigments were then removed in 96% ethanol. Re-hydrated samples were stained in iodine solution (KI 2% (w/v) I2 1% (w/v)) for 30 min, rinsed briefly in deionized water and photographed.

Gas exchange determinations

Fully expanded apical leaves were enclosed in a LI-COR 6400 gas exchange portable photosynthesis system (LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA). The gas exchange determinations were conducted at 25ଌ with a photosynthetic photon flux density of 350 μmol m -2 s -1 . EINn was calculated using equations developed by [115]. g S values were determined as described in [116]. From the A/Ci curves, Vcmax, TPU and Jmax were calculated according to [117]. To avoid miscalculation of An and Ci due to leakage into the gasket of the gas analyzer, we performed CO2 response curves using an empty chamber. The values obtained for An and Ci in the empty chamber were compared with those of the chamber filled with a leaf and substracted from the values obtained with the empty chamber. ETR values were calculated according to [118] as ΦPSII x PPFD x 0.84 x 0.5, where PPDF is the photosynthetic photon flux density incident on the leaf, 0.5 was used as the fraction of excitation energy distributed to PSII [119] and 0.84 as the fractional light absorbance [120]. The rate of mitochondrial respiration in the dark was determined by measuring the rate of CO2 evolution in the dark.

Quantitative Echtzeit-PCR

Total RNA was extracted from leaves using the trizol method according to the manufacturer’s procedure (Invitrogen). RNA was treated with RNAase free DNAase (Takara). 1.5 μg RNA was reverse transcribed using polyT primers and the Expand Reverse Transcriptase kit (Roche) according to the manufacturer’s instructions. Real time quantitative PCR reaction was performed using a 7900HT sequence detector system (Applied Biosystems) with the SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) according to the manufacturer’s protocol. Each reaction was performed in triplicate with 0.4 μL of the first strand cDNA in a total volume of 20 μL. The specificity of the PCR amplification was checked with a heat dissociation curve (from 60ଌ to 95ଌ). Comparative threshold values were normalized to 18S RNA internal control. The specificity of the obtained RT-PCR products was controlled on 1.8% agarose gels. Primers used for RT-PCRs of PGI1, BAM1, BAM2, BAM3 und BAM5 are listed in S2 Table.

Konfokale Mikroskopie

Subcellular localization of GFP-tagged GBSS was performed using D-Eclipse C1 confocal microscope (NIKON, Japan) equipped with standard Ar 488 laser excitation, BA515/30 filter for green emission and BA650LP filter for red emission.

Light and electron microscopy

Light microscopy and TEM analyses were carried out essentially as described in [105]. Briefly, small pieces (2 mm 2 ) of leaves were immediately fixed by submersion in a solution of 3% glutaraldehyde (v/v) in 0.05 M sodium cacodylate buffer, pH 7.4 (3 h at 4ଌ, under vacuum). After fixing, the specimens were washed in a cacodylate buffer (0.05 M sodium cacodylate, 1% sucrose), three times for 30 min each at 4ଌ, and post-fixed with a solution of 1% osmium tetroxide in the above cacodylate buffer (overnight, 4ଌ). After two washes, 30 min each, at 4ଌ with the same cacodylate buffer, the samples were dehydrated in an ethanol series and progressively embedded in LR White resin (London Resin Co., Reading, UK). Semithin (1 μm) sections were stained with 1% (w/v) toluidine blue in aqueous 1% sodium borate for direct observation with a Zeiss Axiophot photomicroscope (Zeiss, Oberkochen, Germany). Ultrathin (70� nm) sections for TEM were constructed with 2% aqueous uranyl acetate and lead citrate. Observations were performed with a STEM LEO 910 electron microscope (Oberkochen, Germany) at 80 kV, equipped with a Gatan Bioscan 792 camera (Gatan, Pleasanton, CA, USA).


The Bottom Line: Increased Research Productivity

When asked what having the NGC system in his lab will enable his group to do in the future, Fraser summarizes it thus: “Throughput and reliability are extremely important in a lab with many researchers using the same instrument. The NGC system will boost our capacity to purify multiple proteins more quickly. We used to do four runs a day, now we can do five — perhaps a 25% increase in throughput — because it is much quicker to switch between users.” This enhanced capacity promises to relieve a major bottleneck to research productivity in many labs, a sentiment echoed by senior proteomics researchers, who have often cited chronic problems with chromatography systems as a major source of downtime.

Although research at a basic level such as that conducted in the Fraser lab is typically far removed from technological applications, when asked to speculate on the scope of possible uses for the knowledge obtained in their work, Fraser replies that the study of translation mechanisms could have numerous therapeutic uses. For example, “Understanding how viruses hijack ribosomes to translate their mRNA may lead to the development of drugs that can specifically inhibit viral translation (Fraser and Doudna, 2007). Our studies could also help elucidate the role of translational regulation in cancer.” In a world living with an HIV epidemic with no cure in sight and facing increasing cancer mortality, such technologies could be of great benefit to people all across the globe.


Example 3

Objective: Identification of the HMGB1 family in the skin extract and examination of bone marrow mesenchymal stem cell-inducing activity

Method: Whether or not the neonatal mouse skin extract contained the HMGB protein family was confirmed using the Western blot method. Ten μl of the skin extract obtained in [Example 2] was used as a sample and subjected to SDS-PAGE electrophoresis. The proteins separated within the gel were transferred onto a PVDF membrane using a blotting device (ATTO). The membrane was incubated with PBS containing 3% skim milk and 0.1% Tween 20 (S-T-PBS) at room temperature for 1 hour, and then was allowed to react with each of rabbit anti-mouse HMGB1 antibody, rabbit anti-mouse HMGB2 antibody, or rabbit anti-mouse HMGB3 antibody which were diluted 1000-fold with S-T-PBS, at 4° C. for 16 hours. After the reaction, the PVDF membrane was washed with S-T-PBS five times for 5 minutes. Then, the PVDF membrane was incubated with 2000-fold diluted (diluted with S-T-PBS) peroxidase labeled goat anti-rabbit IgG antibody (GE Healthcare) at 25° C. for 1 hour. Further, after washing with S-T-PBS five times for 5 minute, the PVDF membrane was allowed to react with ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare). The ECL film was exposed and developed to detect the presence of HMGB1, HMGB2, and HMGB3 proteins.

RNA was extracted from the skin of neonatal mouse using Trizol (invitrogen), and further cDNA was synthesized using SuperScript III cDNA synthesis kit (Invitrogen). Using this cDNA as a template, cDNAs of HMGB1, HMGB2, and HMGB3 were amplified using the PCR (polymerase chain reaction) method. The cDNAs were inserted into the plasmid vector pCAGGS for expressing proteins in mammalian cells, such that proteins with an additional Flag tag sequence (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys SEQ ID: 18) at the N terminus of the amino acid sequence could be expressed. These plasmid vectors were introduced into HEK293 (Human embryonic kidney derived culture cell line) and cultured for 48 hours to express the proteins. Cells expressing each of the HMGB1, HMGB2, and HMGB3 proteins and the culture supernatant were incubated at 4° C. for 16 hours, which was then centrifuged at 4400 g for 5 minutes to collect the supernatant. 100 μL of the anti-Flag antibody gel (Sigma) was mixed into 50 mL of this supernatant, and was then incubated at 4° C. for 16 hours. Centrifugation was then performed to collect the gel, and washed with PBS five times. Further, the protein was eluted using 3× Flag peptide (final 100 μg/ml). Expressions of recombinant proteins were observed by the Western blot method using 1000-fold diluted (diluted with S-T-PBS) mouse anti-Flag antibody and 2000-fold diluted (diluted with S-T-PBS) peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (GE Healthcare). The mouse bone marrow mesenchymal stem cell migration activity in these purified recombinant proteins was assessed in the same manner as in [Example 2] using a Boyden chamber. Moreover, in order to observe the in vivo drug efficacy of the HMGB family, the dorsal skin of 8-week-old C57BL/6 mice was cut out in a circle having a diameter of 8 μm to prepare cutaneous ulcer models. Purified HMGB1, HMGB2, and HMGB3 (100 ng) were each mixed with the same amount of hyaluronic acid solution having a concentration of 1 g/100 mL of PBS, and 100 μL of it was administered to the ulcer surface. The ulcer surface was covered with a transparent adhesive wound dressing/protective material Tegaderm (3M Healthcare) to avoid drying, and the wound area was measured over time to determine the therapeutic effect.

Further, to examine whether or not the human skin extract and the purified human HMGB1 has an activity to allow migration of human bone marrow mesenchymal stem cells, a Boyden chamber was used in the same manner as in [Example 2] for assessment. A human skin having an area of 1 cm 2 was immersed in 1 ml PBS, and then was incubated at 4° C. for 16 hours and subsequently centrifuged at 440 at 4° C. for 10 minutes. The supernatant alone was collected to be used as a human skin extract. Moreover, human bone marrow mesenchymal stem cells (Cambrex) were used as the cells to be placed in the upper chamber of the Boyden chamber (as a result of surface antigen analysis by flow cytometry, these cells have been confirmed to be CD105-positive, CD166-positive, CD29-positive, CD44-positive, CD34-negative, and CD45-negative. They have also been found to differentiate into adipocytes, chondrocytes, and bone cells by differentiation induction tests). Moreover, 100 ng/well of human HMGB1 (R&D) and human skin extract diluted 10-fold with PBS and were placed in the lower chamber. PBS was used as a control.

Result: As a result of Western blotting, bands of HMGB2 and HMGB3 were detected as well as the HMGB1 band. Therefore, the neonatal mouse skin extract was confirmed to contain the family proteins, HMGB2 and HMGB3, besides HMGB1 (FIG. 15). Expression vectors of HMGB1/HMGB2/HMGB3 having a Flag tag added at the N-terminus of each protein, were prepared (FIG. 16). These expression vectors were introduced into HEK293 cells, and the expressed proteins were purified using the Flag tag, and Western blotting was carried out to observe these proteins (FIG. 17). The mouse bone marrow mesenchymal stem cell migration activity was measured using these purified proteins, and the activity was confirmed in all of the proteins (FIG. 18). The ulcer area produced in the back of the mouse was measured every 7 days, and a significant effect on reducing ulcer area was confirmed in the HMGB1, 2, and 3 treatment group, as compared to the non-treatment group (FIG. 19). Similar to the mouse case, human HMGB1 and the human skin extract were revealed to have human bone marrow mesenchymal stem cell migration activity (FIG. 20).

Discussion: HMGB2 and HMGB3 are known as proteins having high homologies to HMGB1. These proteins are also expected to have properties similar to HMGB1. It was confirmed that HMGB2 and HMGB3 of the HMGB1 family are also produced from the extract of the free skin section. Further, HMGB1/HMGB2/HMGB3 recombinant proteins were produced, and their in vitro bone marrow mesenchymal stem cell migration activity and the in vivo therapeutic effect on a cutaneous ulcer were also confirmed. It was revealed that the HMGB family (HMGB1/HMGB2/HMGB3) and the recombinant HMGB family in the neonatal mouse free skin section have a bone marrow mesenchymal stem cell-inducing activity and an activity of locally inducing bone marrow-derived stem cells which are differentiatable into epithelium, and that the thus induced bone marrow-derived cell group differentiates into various cells such as epidermal keratinocytes, hair follicles, and fibroblasts in the damaged tissue to promote the recovery of the damaged tissue. Moreover, since bone marrow mesenchymal stem cells are multipotent stem cells, the present inventors believe that therapeutic effects can also be expected in the same manner by systematic administration or local administration of the HMGB family to treat damaged states in other tissues, for example, tissue damages such as brain injury, myocardial infarction, and bone fracture.

Moreover, it is known that, between human and mouse, amino acid sequence homology for HMGB1 is 98% (213/215), 96% (202/210) for HMGB2, and 97% (195/200) for HMGB3. Therefore, human HMGB and mouse HMGB are considered to have similar activities, and the results of the present Examples revealed that human skin extract and human HMGB1 have bone marrow mesenchymal stem cell-inducing activities in a manner same as those of mouse skin extract and mouse HMGB1.


FUNDING

A.V., S.M., T.M., L.V., C.L. were supported by CNRS (Mission pour l’interdisciplinarité, Agromics 2014–2016) this work was submitted to fulfill the requirements for a doctorate of biology at ED341-E2M2 from Université de Lyon, granted from the French Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche (to T.M.) this work has benefited from the I2BC crystallization and protein–protein interactions platforms supported by FRISBI [ANR-10-INSB-05-01] Cell and Tissue Imaging (PICT IBiSA), Institut Curie, member of the French National Research Infrastructure France-BioImaging [ANR10-INBS-04]. Funding for open access charge: CNRS.

Interessenkonflikt-Erklärung. None declared.


An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

A multi-column plate adapter allows chromatography columns to be interfaced with multi-well collection plates for parallel affinity or ion exchange purification providing an economical high throughput protein purification method. It can be used under gravity or vacuum yielding milligram quantities of protein via affordable instrumentation.

An economical and versatile high throughput protein purification system using a multi column plate adapter. Hi, protein purification is imperative to the study of protein structure and function. And it's usually used in combination with biophysical techniques.

This is especially important in the era of functional proteomics that require a high-throughput protein production. We hypothesized that a multi-column plate adapter, the MCPA, can interface multiple chromatography columns of different resins with multi-well plates for parallel purification. With this adapter, we have developed an economical and versatile method of protein purification that can be used under gravity or vacuum rival in the speed of an automated system.

Here we show this method for nickel affinity chromatography and ion exchange chromatography. Assemble the MCPA by placing a punctured sealing mat onto a long drip plate, then insert the desired number of columns into the holes of the sealing mat. Place an open collection plates in the base of the manifold and close with the top of the manifold.

Attach tubing and place the assembled MCPA with columns on the top. Pipet 1.2 mil of the nickel-NTA solution into the columns. Whilst pipetting, ensure that the beads remain fully mixed.

Switch on the pump and run the 20%ethanol through the columns and into the collection plate below. Turn off the pump once the liquid is run through. Dispose of the contents of the collection plate into a waste box.

Add three resin volumes of EDTA buffer to all the columns. Turn on the pump and run the liquid through. Now wash the columns with three resin volumes of 0.5 molar sodium hydroxide buffer.

Wash the columns with four resin volumes of 100 millimolar nickel sulfate, then 10 resin volumes of Mili-Q water. If a column is running slower, push the liquid through with the syringe plunger. Pour out the contents of the collection plates into a waste box.

Then wash the columns twice with four resin volumes of 10 millimolar imidazole wash buffer and empty the collection plates. If multiple samples are being purified, replace the open collection plates with a 48-well plates. With the vacuum off, load the lysates into the columns.

Use a thin plastic stirrer to gently mix the beads and the lysates in the column to maximize binding. Turn on the pump and run the liquid through. If a column becomes blocked, transfer the lysate resin mixture to a column with a fresh filter.

Freeze the collection plates to contain your flow-through. Replaced with an open collection plate and then wash the columns with nine resin volumes of 10 millimolar imidazole wash buffer. Repeat this step four or five times.

To avoid overflow, periodically empty the waste plates. Replace the open collection plates with a 96-well plate, ensuring A1 is in the top left corner. Pipet one resin volume of denaturing elution buffer into the columns.

Run the liquid through and check the collection plate to ensure that there is no contamination between the wells. For the next dilution, repeat the previous steps and collect in a fresh collection plate. Take a 50 microliter aliquot of each elution for the purity and concentration analysis.

Next, wash the columns with two milliliters of 20%ethanol. Add another two mil of 20%ethanol to the columns and use the fresh thin plastic stirrer to mix up the beads in the ethanol before transferring to a 50 mil tube for storage at four degrees Celsius. Assemble the MCPA in vacuum manifold with an open collection plate and syringe plungers in all of the columns.

Remove all of the syringe plungers from the front row. Remove the rubber gasket from a five mil syringe plunger and then pierce a hole in the center. Then push the bottom of an open column through the punctured rubber gasket.

Repeat these steps and insert into the front row of columns. Ensure that the Q sepharose beads are fully mixed. And with the blue pipette tip that is cut two centimeters from the bottom, pipet 800 microliters of the Q sepharose beads into the open columns.

Once the beads have settled to the bottom of the columns, switch on the vacuum pump enough to run the 20%ethanol through. Wash the columns twice with two mil of 10 millimolar Tris. Turn off the pump just before the Tris buffer has run through to prevent the resin drying out.

Runoff can be discarded and replace with a 48-well collection plates. Transfer all samples to be purified to the Q Sepharose columns in the first row and use a thin plastic stirrer to mix the samples and the beads for around two minutes before turning on the vacuum pump. Store or freeze your flow-through for later analysis.

With an open collection plate, wash the columns twice with two mil of 10 millimolar Tris. Replace the open collection plates with the 96-well plate. The first elution fraction can be collected in the first row or in the second row.

To elute in the second row, remove the syringe plungers from these positions. Move the Q Sepharose columns into these positions and then place syringe plungers into the open columns in the first row. Pipet one milliliter of the first salt concentrations into the Q Sepharose columns.

Turn on the pump and collect the elution. To collect the next elution, remove the syringe plungers from the next positions, move the Q Sepharose columns into these positions and then replace the plungers in the previous positions. Repeat these steps for each successive salt concentration used to elute.

Ensure that a new collection plate is used for every four elutions and that every plate is labeled and stored. With an open collection plates, wash the columns with two mil of four molar sodium chloride, 10 millimolar Tris. Pipet two mil of 20%ethanol and run this through until it is just above the beads and then seal the columns for storage.

As an example, the MCPA has successfully purified 14 AbpSH3 mutants in denaturing conditions by a nickel-NTA. A small contaminant can be seen at 25 kilodaltons, though the protein is still largely pure. The small contaminants seen in denaturing conditions is removed in native conditions.

This was shown when 11 different SH3 domains were purified. This shows that the MCPA can be used for comparison of purification conditions. AbpSH3 can be separated from the majority of contaminants via ion exchange purification from lysates.

Good yields of considerably pure AbpSH3 protein were recovered with various higher molecular weights contaminants. Purification of samples post-nickel-NTA using ion exchange with the MCPA has successfully removed these high-weight contaminants. Though there is still a slight contamination, the fractions are still largely pure and have yielded good biophysical data using NMR and thermal chemical denaturation assays.

In conclusion, our results show that our hypothesis is correct and that the MCPA can successfully purify milligram quantities of proteins using different chromatography techniques. The MCPA system can be configured in multiple ways within the same runs to optimize purification conditions. The setup is simple, cheap, and easy to train inexperienced users, especially in labs that do not routinely purify proteins.


Einführung

Figure 1. Polymer p(SS-co-PEGMA) stabilizes FGF2 as a conjugate and pVS facilitates FGF2-receptor binding when added as an excipient. When combined into a block copolymer, p(SS-co-PEGMA)-B-VS, the new conjugate both stabilizes FGF2 and increases protein activity. Protein structure modified from PDB 1CVS using PyMOL software.



Bemerkungen:

  1. Wigmaere

    Meiner Meinung nach gestehen Sie den Fehler ein. Treten Sie ein, wir diskutieren.

  2. Ain

    Nun, versuchen Sie, sich von dieser Methode abzumelden ...

  3. Nizshura

    Ich meine, du hast nicht Recht. Ich kann meine Position verteidigen. Schreiben Sie mir in PM.



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