Information

Wie spezifisch sind CRISPR-cas9-Schnitte?

Wie spezifisch sind CRISPR-cas9-Schnitte?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

CRISPR-cas9 verwendet einen RNA-String, der mit der DNA übereinstimmt, und führt an dieser Stelle einen doppelsträngigen Schnitt durch.

Wenn die RNA nur wenige Buchstaben lang ist, würde das Enzym die DNA an vielen Stellen zerschneiden. Es wäre unspezifisch. Aber wenn Sie den RNA-String sehr lang machen können, würde er nur genau an der Stelle schneiden, an der Sie schneiden möchten.

Wie lange können Sie also die RNA-Sequenzen herstellen? Und reicht das aus, um unbeabsichtigte Schnitte zu vermeiden?


Das Problem von Off-Targets bei CRISPR/Cas wird oft diskutiert. Es wurde gezeigt, dass das System Fehlpaarungen von bis zu fünf Basenpaaren erlaubt. Zu Ihrer Frage, ob es hilfreich ist, die gRNA zu verlängern: Es wurde gezeigt, dass das Verkürzen der RNA die Spezifität stärker erhöht als das Elongieren (siehe auch hier).

Also was können wir tun? Nun, es gibt verschiedene Methoden, um die Spezifität zu verbessern. Am einfachsten kann die Verwendung niedrigerer Dosierungen des CRISPR/Cas-Systems sein. Ein anderes Verfahren besteht darin, veränderte PAM-Motive zu verwenden.

Eine kompliziertere Methode besteht darin, das Cas9 in eine Nickase umzuwandeln. Bei dieser Strategie würden Sie zwei verschiedene gRNAs für zwei verschiedene Zielorte verwenden und ssbreaks einführen. Eine Modifikation dieses Verfahrens besteht darin, die enzymatische Aktivität von Cas9 vollständig auszuschalten und an eine FokI-Nuklease zu fusionieren, die die DNA nur schneidet, wenn sie dimerisiert.

Diese Methoden haben mehrere Vorteile, Sie können jedoch auch gezielte Effekte verlieren.

Es gibt eine andere Methode, die meiner Meinung nach wirklich großartig ist. Es ist möglich, die Energetik der DNA-Bindungsstelle zu ändern, was zu High-Fidelity-Varianten von Cas9 (HF1 und HF2) führt

Also ich hoffe ich konnte dir helfen. Es gibt andere und noch effektivere Möglichkeiten, die CRISPR/Cas-Spezifität zu erhöhen, anstatt die gRNA zu verändern. Bei Interesse werfen Sie einen Blick auf die Referenzen.


Bewertung der ortsspezifischen CRISPR/Cas9-Funktion und Validierung der sgRNA-Sequenz durch eine Cas9/sgRNA-unterstützte reverse PCR-Technik

Die effektive Anwendung des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Cas9-Systems in Biologie, Medizin und anderen Bereichen wird durch die Off-Target-Effekte und die Loci-Affinität von Cas9-sgRNA, insbesondere im genomweiten Maßstab, behindert. Um das Auftreten von Off-Target-Effekten zu eliminieren und die Loci-Affinität durch ortsspezifischen CRISPR/Cas9-Nachweis bzw Nachweis und Validierung der sgRNA-Sequenz. Das auf PCR basierende Nachweisverfahren kann direkt im Labor unter PCR-Reaktionsbedingungen eingesetzt werden, ohne dass ein zusätzliches Nachweissystem erforderlich ist, und der gesamte Nachweisprozess kann innerhalb von 2 h abgeschlossen werden. Daher kann es leicht mit einem PCR-Instrument populär gemacht werden. Schließlich wird diese Methode vollständig verifiziert, indem mehrere Formen von Ortsmutationen nachgewiesen werden und die Affinität einer Vielzahl von sgRNA-Sequenzen für das CRISPR/Cas9-System bewertet wird. Zusammenfassend bietet es ein effektives neues Analysewerkzeug für die CRISPR/Cas9 Genome Editing-bezogene Forschung. Für den ortsspezifischen Nachweis von Cas9/sgRNA und die Validierung der sgRNA-Sequenz wurde eine CRISPR/Cas9-unterstützte reverse PCR-Methode entwickelt. Die Technik erkennt Ziel-DNA in drei Schritten: (1) Ziel-DNA wird spezifisch durch ein Paar Cas9/sgRNA-Komplexe geschnitten (2) die gespaltene DNA wird schnell durch T4-DNA-Ligase verknüpft (3) die ligierte DNA wird effizient durch PCR amplifiziert ( PCR oder qPCR).

Schlüsselwörter: CRISPR/Cas9 Site-spezifische Detektion von sgRNA-Validierung.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Figuren

Eine CRISPR/Cas9-unterstützte reverse PCR-Methode wurde entwickelt…

Für den ortsspezifischen Nachweis von Cas9/sgRNA und die Validierung der sgRNA-Sequenz wurde eine CRISPR/Cas9-unterstützte reverse PCR-Methode entwickelt.…

Schematische Darstellung der CARP-Erkennung

Schematische Darstellung der CARP-Erkennung

CARP-Nachweis von Single-Base-Mutation…

CARP-Nachweis von Single-Base-Mutation (PCR). ein Bestimmung der Fähigkeit von CARP,…

CARP-Nachweis von Single-Base-Mutation…

CARP-Nachweis von Single-Base-Mutation (qPCR) (die Fehlerbalken repräsentieren technische Replikate und…

Nachweis der Einzelnukleotid-Spezifität von Cas9-sgRNA…

Nachweis der Einzelnukleotid-Spezifität von Cas9-sgRNA mit qPCR-basierter CARP. ein Detaillierte Lage der gemeinsamen…

Bewertung der Einzelnukleotid-Spezifität von sgRNA…

Bewertung der Einzelnukleotid-Spezifität von sgRNA mit qPCR-basiertem CARP. ein Detaillierte Lage der Einzelbasis…

Die Auswirkungen verschiedener…

Gleichzeitige Untersuchung der Auswirkungen verschiedener sgRNAs auf die Spaltungseffizienz. ein qPCR logarithmisch…


Funktion und Mechanismus von CRISPR bei Prokaryoten

CRISPR verleiht Prokaryoten eine erworbene Immunität gegen invasive genetische Elemente. Diese Loci enthalten genetisches Material von Viren und Plasmiden und verwenden es, um sequenzspezifisch auf fremde genetische Elemente abzuzielen. Die Schritte zum Schutz vor fremden genetischen Elementen unter Verwendung des CRISPR/Cas-Systems sind der Erwerb von Spacer-DNA aus dem eindringenden Virus, die Biogenese von CRISPR-RNA (crRNA), die die Erkennung von fremder DNA ermöglicht, und die Interferenz, bei der die invasive DNA wird erkannt und gespalten.

Erwerb von Spacer-DNA

Wenn ein Virus in eine prokaryontische Zelle eindringt, werden Teile der viralen DNA entnommen und in die Spacer-Regionen des CRISPR-Locus eingebaut. Die Nukleaseenzyme Cas1 und Cas2 sind an der Spacer-Akquisition in E. coli und wahrscheinlich allen CRISPR/Cas-Systemen beteiligt, da sie die einzigen Cas-Proteine ​​sind, die in allen Systemen konserviert sind. Die DNA, die als Spacer entnommen und in CRISPR-Loci eingebaut wird, kann sich neben Protospacer-Nachbarmotiven (PAMs) innerhalb des viralen Genoms befinden. PAMs sind bei der Selektion von Fremdnukleinsäuren in Typ-I- und Typ-II-Systemen wichtig. Spacer werden normalerweise neben der Leadersequenz hinzugefügt, obwohl der neue Spacer auch zufällig in das Repeat-Spacer-Array eingefügt werden kann.

CrRNA-Biogenese

Während der Interferenzphase assoziieren crRNAs mit Cas-Proteinen, um einen Komplex zu bilden, der virales genetisches Material erkennt, angreift und zerstört. Die crRNA-Base paart sich mit der komplementären Sequenz in der viralen DNA und markiert sie für die Zerstörung. Die Erkennung der PAM-Sequenz kann auch für die Erkennung der Fremd-DNA erforderlich sein. In Typ-II-Systemen führt Cas9 den Interferenzschritt unter Verwendung sowohl einer crRNA als auch einer tracrRNA durch, die es ihm ermöglicht, fremde DNA zu erkennen. Cas9 erkennt nicht nur Zielsequenzen, sondern besitzt auch eine Endonuklease-Aktivität und spaltet die Fremd-DNA.


Die Abbildung zeigt, wie sich das CRISPR/Cas-System gegen fremde genetische Elemente in Prokaryonten verteidigt.


CRISPR-Cas9 kann auch RNA schneiden

Würzburger Wissenschaftler entdeckten, dass auch die sogenannte Cas9-DNA-Schere aus Campylobacter problemlos auf RNA abzielen kann. Von links: Prof. Dr. Cynthia Sharma, Sara Eisenbart, Thorsten Bischler, Belinda Aul vom Institut für Molekulare Infektionsbiologie (IMIB) und Prof. Dr. Chase Beisel vom Helmholtz-Institut für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) in Württemberg. Bildnachweis:Hilde Merkert, IMIB

Die Fähigkeit, Gene nach Belieben zu bearbeiten, sei es, um genetische Krankheiten umzukehren oder Nahrungs- und Energiepflanzen zu verbessern, erlebt eine Revolution. Es wird von CRISPR-Cas9 angetrieben, einer Technologie, die einem zellulären Mechanismus nachempfunden ist, der in Bakterien gefunden wird. CRISPR-Cas9 erkennt und schneidet fremdes Genommaterial vor eindringenden Viren und schützt so die Bakterien vor einer Infektion.

Das Cas9-Protein fungiert als Schere, während andere Teile des Systems Cas9 zu den zu schneidenden DNA-Abschnitten führen. Wissenschaftler haben diese molekulare Schere in Kombination mit künstlichen Leitfäden genutzt, um Gene gezielt zu verändern, nicht nur in Bakterien, sondern auch in Pflanzen und Tieren.

Während die Cas9-Schere dafür bekannt ist, DNA zu schneiden, haben Forscher der Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) und des Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) in Deutschland gezeigt, dass das Cas9-Protein des lebensmittelbedingten Erregers Campylobacter jejuni schneidet auch RNA.

„Das Protein ist auch in der Lage, Ribonukleinsäuren, kurz RNA, zu schneiden“, sagt Prof. Cynthia Sharma vom Institut für Molekulare Infektionsbiologie (IMIB) der JMU. "Nicht nur das, wir haben auch festgestellt, dass wir Cas9 so programmieren können, dass es auf bestimmte RNA-Moleküle abzielt und sie schneidet."

RNA spielt in allen Lebensformen eine zentrale Rolle. Eine wichtige Rolle von RNAs besteht darin, als Botenstoff für genomisches Material in der Zelle zu dienen. In der DNA kodierte Gene werden extrahiert, indem sie in RNA transkribiert werden. Die RNA dient dann als Matrize für die Übersetzung dieser Informationen in Proteine. Die Möglichkeit, auf RNA anstelle von DNA zu zielen, erweitert die Einsatzmöglichkeiten von Cas9-Scheren. Zu den möglichen Anwendungen gehören die Kontrolle, welche Gene aktiviert oder deaktiviert werden, die Bekämpfung menschlicher Viren und der schnelle Nachweis von Infektionserregern.

Die Forscher entdeckten diese Funktion, als sie Moleküle untersuchten, die mit dem Cas9 in Campylobacter interagieren. Dazu gehörten zahlreiche RNAs aus der Zelle. Weitere Analysen zeigten, dass Cas9 nicht nur an RNA bindet, sondern diese auch wie DNA schneiden kann. Die Forscher stellten fest, dass es leicht angewiesen werden könnte, bestimmte RNAs zu schneiden.

„Das Ergebnis war überraschend, da man annimmt, dass Cas9 von Natur aus nur auf DNA abzielt“, sagt Prof. Chase Beisel, die kürzlich von der NC State University (USA) zum HIRI kam und an dem Projekt mit Prof. Sharma zusammengearbeitet hat.

Während die Forscher diese Erkenntnis mit dem Cas9-Protein von Campylobacter machten, berichteten kürzlich zwei andere Forschergruppen ähnliche Ergebnisse mit Cas9s von zwei anderen Bakterien. Dies lässt die Möglichkeit aufkommen, dass diese faszinierende neue Entdeckung ein allgemeines Merkmal von Cas9-Proteinen in der Natur sein könnte. Eine weitere von dieser Studie aufgeworfene Frage ist, ob die Fähigkeit von Cas9, auf RNA abzuzielen, eine physiologische Rolle bei Campylobacter spielt. Zum Beispiel häufen sich die Beweise dafür, dass CRISPR-Cas-Systeme nicht nur zur Bekämpfung von Infektionen dienen könnten, sondern vielmehr auf natürliche Weise daran beteiligt sein könnten, zu kontrollieren, welche Gene in Campylobacter an- und ausgeschaltet werden. Prof. Sharma und Prof. Beisel sind sich einig: „Wir sind immer wieder erstaunt, was Cas9 leisten kann und welche neuen Anwendungen und Technologien diese Erkenntnisse schaffen.“


Die Entdeckung von CRISPR ebnet den Weg für eine neuartige COVID-19-Testmethode

Die neuartige Plattform LEOPARD hat das Potenzial, eine Vielzahl von krankheitsbezogenen Biomarkern in nur einem Test nachzuweisen. Bildnachweis: Sandy Westermann / HIRI

Die meisten konventionellen molekularen Diagnostika weisen meist nur einen einzigen krankheitsbezogenen Biomarker nach. Tolle Beispiele sind die PCR-Tests, die derzeit zur Diagnose von COVID-19 verwendet werden, indem eine bestimmte Sequenz von SARS-CoV-2 nachgewiesen wird. Solche sogenannten Singleplex-Methoden liefern zuverlässige Ergebnisse, da sie auf einen einzigen Biomarker kalibriert sind. Um jedoch festzustellen, ob ein Patient mit einer neuen SARS-CoV-2-Variante oder einem ganz anderen Erreger infiziert ist, müssen viele verschiedene Biomarker gleichzeitig sondiert werden.

Wissenschaftler des Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) und der Julius-Maximilians-Universität (JMU) in Würzburg haben mit LEOPARD nun den Weg für eine völlig neue Diagnoseplattform geebnet. Es handelt sich um eine CRISPR-basierte Methode, die hochgradig multiplexfähig ist und das Potenzial hat, eine Vielzahl von krankheitsbezogenen Biomarkern in nur einem Test zu erkennen.

LEOPARD, was für "Leveraging Engineered tracrRNAs and On-target DNAs for PArallel RNA Detection" steht, basiert auf der Erkenntnis, dass das DNA-Schneiden durch Cas9 mit dem Vorhandensein einer spezifischen Ribonukleinsäure (RNA) in Verbindung gebracht werden könnte. Diese Verbindung ermöglicht es LEOPARD, viele RNAs gleichzeitig nachzuweisen, was Möglichkeiten für den gleichzeitigen Nachweis von RNAs aus Viren und anderen Krankheitserregern in einer Patientenprobe eröffnet.

Die heute veröffentlichte Studie in Wissenschaft wurde von Chase Beisel, Professorin an der JMU und Forschungsgruppenleiterin am HIRI, und Professorin Cynthia Sharma vom Institut für Molekulare Infektionsbiologie (IMIB) der JMU initiiert. „Mit LEOPARD ist es uns gelungen, RNA-Fragmente von neun verschiedenen Viren nachzuweisen“, sagt Beisel Geduldig."

CRISPR-Cas9 ist vor allem als biomolekulares Werkzeug zur Genom-Editierung bekannt. CRISPR-Cas9 fungiert hier als molekulare Schere, die spezifische DNA-Sequenzen schneidet. Dieselbe Schere wird natürlich von Bakterien verwendet, um DNA zu schneiden, die mit eindringenden Viren in Verbindung steht. Ob das Editieren von Genomen oder das Eliminieren von Viren, das Schneiden von Cas9 wird von Leit-RNAs gesteuert. Die in Bakterien gefundenen Leit-RNAs müssen sich mit einer separaten RNA namens tracrRNA paaren. Das RNA-Paar kann dann mit Cas9 zusammenarbeiten, um das DNA-Schneiden zu steuern.

Eine unerwartete Entdeckung

Es wurde angenommen, dass die tracrRNA nur mit Guide-RNAs paart, die aus dem antiviralen System stammen. Die Würzburger Wissenschaftler entdeckten jedoch, dass sich die tracrRNA mit anderen RNAs paarte und diese in Leit-RNAs verwandelte. Cynthia Sharma, Lehrstuhlinhaberin für Molekulare Infektionsbiologie II am IMIB und Sprecherin des Forschungszentrums für Infektionskrankheiten (ZINF) an der JMU, war verblüfft über diese Entdeckung: „Als wir in unserem Modellorganismus Campylobacter nach RNAs suchten, die an Cas9 binden, fanden wir überraschend dass wir nicht nur Guide-RNAs, sondern auch andere RNA-Fragmente in der Zelle entdeckten, die wie Guide-RNAs aussahen. Die tracrRNA paarte sich mit diesen RNAs, was zu "nicht-kanonischen" Guide-RNAs führte, die das DNA-Schneiden durch Cas9 steuern konnten."

Die Diagnoseplattform LEOPARD baut auf dieser Entdeckung auf. "Wir haben herausgefunden, wie wir die tracrRNAs umprogrammieren können, um zu entscheiden, welche RNAs zu Leit-RNAs werden", sagt Beisel. „Durch die Überwachung einer Reihe übereinstimmender DNAs können wir anhand der geschnittenen DNAs feststellen, welche RNAs in einer Probe vorhanden waren. Im Rahmen der anhaltenden Pandemie könnte LEOPARD einem Arzt ermöglichen, herauszufinden, ob der Patient mit SARS-CoV . infiziert ist -2, ob es sich um eine einzigartige Variante handelt und ob die Probe richtig entnommen wurde oder wiederholt werden muss – alles in einem Test."

In Zukunft könnte die Leistung von LEOPARD sogar Multiplex-PCR-Tests und andere Methoden in den Schatten stellen. „Die Technologie hat das Potenzial, die medizinische Diagnostik nicht nur bei Infektionskrankheiten und Antibiotikaresistenzen, sondern auch bei Krebs und seltenen Erbkrankheiten zu revolutionieren“, sagt Oliver Kurzai, Direktor des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie der JMU, das Patientenproben für die Studie zur Verfügung gestellt hat.

„Die Arbeit unterstreicht die exzellente kollaborative und interdisziplinäre Forschung hier in Würzburg“, sagt Jörg Vogel, Direktor von IMIB und HIRI, einer gemeinsamen Einrichtung der JMU mit dem Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig. „LEOPARD zeigt eindrucksvoll, dass wir in Würzburg das gesamte Spektrum komplementärer Spitzenforschung abdecken können, von den Grundlagen der RNA-Forschung bis hin zur klinischen Anwendung.“


Einfache Technologie macht die CRISPR-Genbearbeitung billiger

Forscher der University of California, Berkeley, haben einen viel billigeren und einfacheren Weg entdeckt, um ein heißes neues Gen-Editing-Tool, CRISPR-Cas9, gezielt zum Schneiden oder Markieren von DNA einzusetzen.

Einige DNA-Sequenzen erscheinen mehrfach im Genom. Hier markiert eine RNA-Führungssonde repetitive Regionen im Kern einer Samenzelle des Frosches Xenopus laevis.

Die CRISPR-Cas9-Technik, die vor drei Jahren an der UC Berkeley erfunden wurde, hat die Genomik im Sturm erobert. Dies ist vielversprechend für eine gezielte Gentherapie, um genetische Krankheiten zu heilen und die Ursachen von Krankheiten zu entdecken.

Die Technologie kann auch so optimiert werden, dass sie sich ohne Schneiden einklinkt, indem sie DNA mit einer fluoreszierenden Sonde markiert, die es Forschern ermöglicht, ein Gen unter Tausenden im Kern einer lebenden, sich teilenden Zelle zu lokalisieren und zu verfolgen.

Die neu entwickelte Technik macht es jetzt einfacher, die RNA-Leitfäden zu erstellen, die es CRISPR-Cas9 ermöglichen, DNA so präzise zu zielen. Tatsächlich kann jeder für weniger als 100 US-Dollar an Vorräten Zehntausende solcher präzise geführter Sonden herstellen, die das gesamte Genom eines Organismus abdecken.

Über den Prozess, den sie als CRISPR-EATING bezeichnen – für „Alles Verfügbare wurden zu neuen Anleitungen“ – wird in einem Papier berichtet, das in der Ausgabe des Journals vom 10. August erscheinen wird Entwicklungszelle.

Als Beweis für das Prinzip haben die Forscher das gesamte Genom des Darmbakteriums verändert E coli in eine Bibliothek von 40.000 RNA-Leitfäden, die 88 Prozent des bakteriellen Genoms abdeckten. Jeder RNA-Guide ist ein Segment von 20 RNA-Basenpaaren: die Matrize, die von CRISPR-Cas9 verwendet wird, um nach komplementärer DNA zum Binden und Schneiden zu suchen.

Die Forscher stellten Hunderte von RNA-Führungssonden für eine kleine Region des Genoms des Frosches Xenopus laevis her, befestigten sie mit einer Fluoreszenzmarkierung an CRISPR-Cas9 und markierten diese DNA-Region erfolgreich in einem Zellkern, sodass sie im Leben verfolgt werden kann Proben.

Diese Bibliotheken können in der traditionellen CRISPR-Cas9-Editierung verwendet werden, um auf eine bestimmte DNA-Sequenz im Genom abzuzielen und sie zu zerschneiden . Dies kann beispielsweise helfen, die Ursache einer Krankheit zu lokalisieren. Das Verfahren wird genetisches Screening genannt und erfolgt in Chargen: Jede der Tausenden von Sonden wird in eine einzelne Zelle auf einer Platte mit Hunderttausenden von Zellen eingebracht.

„Wir können diese Bibliotheken für viel weniger Geld herstellen, was das genetische Screening in Organismen, die weniger gut untersucht sind, potenziell zugänglich macht“, sagte Erstautor Andrew Lane, ein Postdoktorand der UC Berkeley .

Zellenüberwachung in Echtzeit

Aber Lane und ihre Kollegin Rebecca Heald, Professorin für Molekular- und Zellbiologie an der UC Berkeley, haben die Technologie entwickelt, um Chromosomen in Echtzeit in lebenden Zellen zu verfolgen, insbesondere während der Zellteilung, einem Prozess, der als Mitose bekannt ist. Dies ist Teil eines größeren Projekts von Heald, um herauszufinden, was die Größe des Zellkerns und anderer subzellulärer Komponenten reguliert, wenn Organismen von wenigen Zellen zu vielen Zellen wachsen.

„Diese Technologie wird es uns ermöglichen, ein ganzes Chromosom zu malen und es live zu betrachten und es im Zellkern während des Zellzyklus oder während der Entwicklungsübergänge, zum Beispiel in einem Embryo, wirklich zu verfolgen, um zu sehen, wie es sich in Größe und Struktur verändert.“ “, sagte Heald.

Die neue Technik verwendet Standard-PCR (Polymerase-Kettenreaktion), um viele kurze DNA-Längen aus jedem DNA-Segment, an dem ein Forscher interessiert ist, bis hin zu einem gesamten Genom zu erzeugen. Diese Fragmente werden dann präzise an einer als PAM bezeichneten Region geschnitten, die für die CRISPR-Bindung entscheidend ist. Einfache Restriktionsenzyme werden dann verwendet, um jedes Stück 20 Basenpaare vom PAM-Ende entfernt zu schneiden, wodurch die genaue Größe des RNA-Leitfadens erzeugt wird, den CRISPR bei der Suche nach komplementären Stellen im Genom verwendet. Diese Leit-RNAs werden dann leicht in den CRISPR-Cas9-Komplex eingebaut, wodurch Zehntausende von Sonden zum Markieren oder Schneiden von DNA erhalten werden.

„Durch die Verwendung des Genoms selbst als Quelle für Leit-RNAs ermöglicht ihr Ansatz die Erstellung von Bibliotheken, die auf zusammenhängende Regionen abzielen, die für fast jedes Labor zugänglich sind“, sagte Jacob Corn, Geschäftsführer und wissenschaftlicher Direktor der Innovative Genomics Initiative an der UC Berkeley. „Dies könnte für die Genom-Bildgebung und bestimmte Arten von Screens sehr nützlich sein, und ich bin sehr daran interessiert zu sehen, wie es die biologische Entdeckung mit Cas9-Tools ermöglicht.“

Co-Autoren von Lane und Heald sind Magdalena Strzelecka, Andreas Ettinger, Andrew W. Grenfell und Torsten Wittmann. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health unterstützt.

ZUGEHÖRIGE INFORMATIONEN


Wie spezifisch sind CRISPR-cas9-Schnitte? - Biologie

Das Schöne an dem System besteht darin, dass es nur aus zwei Elementen besteht: einer Leit-RNA, die die Ziel-DNA bindet, und der DNA-schneidenden Nuklease Cas9, die mit der Leit-RNA komplexiert. Beide Elemente können unter Verwendung eines einzigen Vektors in Zellen eingebracht werden. Die hocheffiziente und kostengünstige Technik ist so vielseitig, dass sie eine Vielzahl von Disziplinen verändern wird, von der Medizin über die Landwirtschaft bis hin zur industriellen Biotechnologie.

Menschliche Gesundheit

Der Einsatz von CRISPR-Cas9 birgt enorme Möglichkeiten, die menschliche Gesundheit und das Wohlbefinden weiter zu fördern. Obwohl das ultimative Ziel darin besteht, Krankheiten auszurotten, befindet sich der Großteil der Arbeiten mit dieser Technik noch im Forschungsstadium. CRISPR hat beispielsweise einen großen Einfluss darauf, wie potenzielle Angriffspunkte für Medikamente gegen Krebs und andere Erkrankungen entdeckt werden, da es Forschern ermöglicht, spezifische Gene viel effizienter und kostengünstiger zu bearbeiten und zu bearbeiten als mit früheren Methoden zur Genom-Editierung.

Im Februar 2016 erhielten Forscher in London die Erlaubnis, mit CRISPR-Cas9 gesunde menschliche Embryonen zu bearbeiten, um Behandlungen für Unfruchtbarkeit zu entwickeln. Dies war die weltweit erste Billigung einer solchen Forschung und ein starker Präzedenzfall für die Zulassung ähnlicher Anwendungen.

Wer wird also das Rennen um die Entwicklung des ersten CRISPR-Therapeutikums gewinnen? Im Jahr 2015 kündigte Editas Medicine seine Pläne an, CRISPR zu verwenden, um zu versuchen, eine seltene Form der Blindheit zu behandeln, die als Lebersche angeborene Amaurose bekannt ist.

Erst kürzlich, im Juni 2016, wurde in den USA von einem Bundesgremium die Genehmigung für die erste klinische Studie zu CRISPR zur Herstellung genetisch veränderter Immunzellen zur Behandlung von Krebs erteilt. Wissenschaftler der University of Pennsylvania planen, CRISPR in der bahnbrechenden Technologie der Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-Zelltherapie einzusetzen, um T-Zellen so zu entwickeln, dass sie bei der Identifizierung und Zerstörung von drei Arten von Krebstumorzellen effektiver sind. Die CAR-T-Zelltherapie hat bei bestimmten Blutkrebsarten bei Patienten, die auf andere Behandlungen nicht angesprochen haben, schon früh erstaunliche Erfolge erzielt. Die Verwendung von CRISPR-Cas9 in Kombination mit CAR-T-Zellen könnte sich als bahnbrechend erweisen, um das Leben von Menschen mit bisher nicht behandelbaren Krebserkrankungen zu retten.

An anderer Stelle untersuchen Forscher die Möglichkeit, CRISPR zur Heilung von HIV einzusetzen, wobei bereits einige Erfolge sowohl in isolierten menschlichen Zellen als auch in Maus- und Rattenmodellen gemeldet wurden, während ein anderes Team in Berkeley versucht, die Technik zu verwenden, um die Mutation zu korrigieren, die die Sichel verursacht Zellanämie.

Pflanzenforschung

Während die potenzielle Rolle von CRISPR in der Therapie zweifellos im Mittelpunkt steht, wird es auch als Werkzeug zur Genom-Editierung in einer Vielzahl von Nutzpflanzen verwendet, darunter Weizen, Reis, Sojabohnen, Kartoffeln, Sorghum, Orangen und Tomaten. In einer kürzlich durchgeführten Studie nutzten Wissenschaftler des John Innes Centre die Technologie, um gezielte Bearbeitungen an zwei britischen Nutzpflanzen vorzunehmen – einer brokkoliähnlichen Brassica und Gerste – und diese Bearbeitungen werden in nachfolgenden Generationen erhalten bleiben. CRISPR wurde auch verwendet, um Weinreben zu erzeugen, die gegen Falschen Mehltau resistent sind, und Weizen, der gegen Echten Mehltau resistent ist.

Industrielle Biotechnologie

Für den Einsatz von CRISPR in der industriellen Biotechnologie besteht ein enormes Potenzial. Ein wichtiger Akteur auf diesem Gebiet ist Caribou Biosciences, die daran arbeiten, mikrobielle Produktionsstämme zu verbessern, um bessere Zellfabriken für die Fermentation zu erzeugen. Sie nutzen die Technik auch, um das Potenzial von Mikroben zur Bioproduktion von Chemikalien und Enzymen zu erschließen, die noch nie zuvor durch Fermentation hergestellt wurden.

Auch das Schweizer Unternehmen Evolva für synthetische Biologie erweitert sein Toolkit um CRISPR, was seiner Suche nach neuen Inhaltsstoffen und Spezialchemikalien mit Brau- und technisch hergestellten Mikroorganismen einen großen Schub verspricht. Die Produkte von Evolva reichen von Nootkaton, einem Geschmacksstoff von Grapefruit, der dazu beitragen könnte, die Verbreitung von Zika zu stoppen, bis hin zu landwirtschaftlichen Bioaktivstoffen und Komponenten von Materialien der nächsten Generation.

Jenseits von CRISPR

Trotz der außergewöhnlichen Leistungsfähigkeit und der potenziellen Anwendungsmöglichkeiten der Technik gibt es in der wissenschaftlichen Gemeinschaft Bedenken, dass CRISPR versehentlich andere Regionen des Genoms als die beabsichtigten verändern könnte, wodurch die behandelte Zelle auf möglicherweise unvorhersehbare Weise beeinflusst wird. Während das Potenzial für Off-Target-Mutationen bei Techniken wie der CAR-T-Zelltherapie, die eher somatische als genomische Veränderungen beinhalten, weniger Bedeutung hat, muss dieses Problem angegangen werden. Viele Forscher, einschließlich derjenigen, die klinische Studien planen, verwenden webbasierte Algorithmen, um die Off-Target-Effekte von CRISPR vorherzusagen. Inzwischen ist jedoch bekannt, dass sie nicht hundertprozentig genau sind, was bedeutet, dass die Methoden zur Identifizierung außerhalb des Targets stark verbessert werden müssen, wenn die Genom-Editierung sicher zur Behandlung von Patienten eingesetzt werden soll.

CRISPR hat andere Einschränkungen, die die Suche nach alternativen Gen-Editing-Techniken vorangetrieben haben. Beispielsweise sind die Bestandteile von CRISPR zu groß, um sie in das Genom des normalerweise für die Gentherapie verwendeten Virus einzufügen. Eine mögliche Lösung hierfür bietet ein Mini-Cas9, das erfolgreich bei Mäusen eingesetzt wurde, um das für Muskeldystrophie verantwortliche Gen zu korrigieren. Andere Probleme sind, dass Cas9 nicht überall schneidet, wohin es gerichtet ist, und der Weg, den es verwendet, um eine neue DNA-Sequenz einzufügen, ist fehleranfällig. Forscher suchen aktiv nach alternativen Enzymen zu Cas9, um das Repertoire der Technik zu erweitern, zusätzlich zu Strategien, bei denen Cas9 deaktiviert und an andere Enzyme gebunden wird, um verschiedene Sequenzänderungen zu ermöglichen.

Im Mai sorgte ein völlig neues Gen-Editing-System – ein aus Bakterien stammendes Protein namens NgAgo, das mit einer kurzen DNA-Sequenz programmiert wird, die dem Zielgebiet entspricht – für erste Aufregung. Obwohl es Laboren bisher nicht gelungen ist, die Ergebnisse zu reproduzieren, verspricht die Technik, auf diesem Gebiet einen neuen Weg einzuschlagen.

Verantwortungsvolle Innovation

Die öffentliche Besorgnis über die Verwendung von CRISPR zur Genommanipulation kann nicht ignoriert werden, da viele Menschen glauben, dass dies den Weg in eine Zukunft ebnet, in der Eltern die Eigenschaften ihrer Kinder wählen können. Eine weitere Befürchtung ist, dass eine solche Keimbahn-Editierung es ermöglicht, das modifizierte Gen mit unvorhersehbaren Ergebnissen an zukünftige Generationen weiterzugeben. Andere bieten eher subjektive Argumente. Wer entscheidet, was eine Genomverbesserung ist? Sollten wir lebende Organismen überhaupt verändern?

Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist sich der Notwendigkeit bewusst, in diesem umstrittenen Bereich sorgfältig vorzugehen und konkrete Leitlinien für eine verantwortungsvolle Praxis festzulegen. Eine Konferenz in Washington DC im Dezember 2015 zur Diskussion der Ethik des Einsatzes der CRISPR-Technologie beim Menschen forderte ein „Moratorium für alle Versuche zur Modifikation des Keimbahngenoms für die klinische Anwendung beim Menschen“ und einen „Rahmen für einen offenen Diskurs über die Verwendung von“ CRISPR-Cas9-Technologie zur Manipulation des menschlichen Genoms“.

Es ist richtig, dass Wissenschaftler weiterhin öffentliche Bedenken ansprechen und die Vorteile und Risiken von CRISPR offen diskutieren. Es ist wahrscheinlich, dass die Technik mit der Zeit immer mehr akzeptiert wird, da ihre außergewöhnlichen Fähigkeiten erkannt und Ängste vor einem möglichen Missbrauch zerstreut werden. Inzwischen ist nicht zu übersehen, dass CRISPR bereits alle Bereiche der Life Sciences erfasst und es nur eine Frage der Zeit ist, bis wir vor einer ernsthaften technologischen Revolution stehen.


Verweise

Costanzo M, Baryshnikova A, Bellay J, Kim Y, Spear ED, Sevier CS et al. Die genetische Landschaft einer Zelle. Wissenschaft. 2010327:425–31.

Berns K, Hijmans EM, Mullenders J, Brummelkamp TR, Velds A, Heimerikx M, et al. Ein groß angelegter RNAi-Screen in menschlichen Zellen identifiziert neue Komponenten des p53-Wegs. Natur. 2004428:431–7.

Marcotte R, Sayad A, Brown KR, Sanchez-Garcia F, Reimand J, Haider M, et al. Funktionelle genomische Landschaft menschlicher Brustkrebstreiber, Anfälligkeiten und Resistenzen. Zelle. 2016164:293–309.

McDonald ER 3., de Weck A, Schlabach MR, Billy E, Mavrakis KJ, Hoffman GR, et al. Projekt DRIVE: ein Kompendium von Krebsabhängigkeiten und synthetischen tödlichen Beziehungen, das durch groß angelegte, tiefgreifende RNAi-Screenings aufgedeckt wurde. Zelle. 2017170:577–92 e10.

A. Tsherniak, F. Vazquez, PG Montgomery, BA Weir, G. Kryukov, GS Cowley et al. Definieren einer Krebsabhängigkeitskarte. Zelle. 2017170:564–76 e16.

Jackson AL, Burchard J, Leake D, Reynolds A, Schelter J, Guo J, et al. Die positionsspezifische chemische Modifikation von siRNAs reduziert das „Off-Target“-Transkript-Silencing. RNA. 200612:1197–205.

Echeverri CJ, Beachy PA, Baum B, Boutros M, Buchholz F, Chanda SK, et al. Minimierung des Risikos der Meldung falsch positiver Ergebnisse bei groß angelegten RNAi-Screens. Nat-Methoden. 20063:777–9.

O. Shalem, NE Sanjana, E. Hartenian, X. Shi, DA Scott, T. Mikkelson et al. CRISPR-Cas9-Knockout-Screening im Genommaßstab in menschlichen Zellen. Wissenschaft. 2014343:84–7.

Wu X, Scott DA, Kriz AJ, Chiu AC, Hsu PD, Dadon DB et al. Genomweite Bindung der CRISPR-Endonuklease Cas9 in Säugerzellen. Nat. Biotechnologie. 201432:670–6.

Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES. Genetisches Screening in menschlichen Zellen mit dem CRISPR-Cas9-System. Wissenschaft. 2014343:80–4.

Koike-Yusa H, Li Y, Tan E-P, Velasco-Herrera MDC, Yusa K. Genomweites rezessives genetisches Screening in Säugerzellen mit einer lentiviralen CRISPR-guide-RNA-Bibliothek. Nat. Biotechnologie. 201432:267–73.

Morgens DW, Dekane RM, Li A, Bassik MC. Systematischer Vergleich von CRISPR/Cas9- und RNAi-Screenings für essentielle Gene. Nat. Biotechnologie. 201634:634–6.

Evers B, Jastrzebski K, Heijmans JPM, Grernrum W, Beijersbergen RL, Bernards R. CRISPR Knockout-Screening übertrifft shRNA und CRISPRi bei der Identifizierung essentieller Gene. Nat. Biotechnologie. 201634:631–3.

K. Tzelepis, H. Koike-Yusa, E. De Braekeleer, Y. Li, E. Metzakopian, OM Dovey et al. Ein CRISPR-Dropout-Screen identifiziert genetische Schwachstellen und therapeutische Angriffspunkte bei akuter myeloischer Leukämie. Cell Rep. 201617:1193–205.

T. Hart, M. Chandrashekhar, M. Aregger, Z. Steinhart, K.R. Brown, G. MacLeod et al. Hochauflösende CRISPR-Screens zeigen Fitnessgene und genotypspezifische Krebsrisiken auf. Zelle. 2015163:1515–26.

Wang T, Yu H, Hughes NW, Liu B, Kendirli A, Klein K, et al. Ein Genessentizitätsprofil deckt Gennetzwerke und synthetische tödliche Interaktionen mit onkogenem Ras auf. Zelle. 2017168:890–903 e15.

Kaelin WG Jr. Das Konzept der synthetischen Letalität im Kontext der Krebstherapie. Nat. Rev Krebs. 20055:689–98.

Itsara A, Cooper GM, Baker C, Girirajan S, Li J, Absher D, et al. Populationsanalyse von Varianten mit großer Kopienzahl und Hotspots menschlicher genetischer Erkrankungen. Bin J Hum Genet. 200984:148–61.

R. Beroukhim, CH Mermel, D. Porter, G. Wei, S. Raychaudhuri, J. Donovan et al. Die Landschaft der somatischen Kopienzahländerung bei menschlichen Krebsarten. Natur. Verlagsgruppe Natur. 2010463:899–905.

Aguirre AJ, Meyers RM, Weir BA, Vazquez F, Zhang C-Z, Ben-David U, et al. Die Zahl der genomischen Kopien bestimmt eine genunabhängige Zellantwort auf das CRISPR/Cas9-Targeting. Krebs-Disc. Amerikanische Gesellschaft für Krebsforschung. 20166:914–29.

Munoz DM, Cassiani PJ, Li L, Billy E, Korn JM, Jones MD, et al. CRISPR-Screens bieten eine umfassende Bewertung von Krebsanfälligkeiten, erzeugen jedoch falsch-positive Treffer für stark amplifizierte Genomregionen. Krebs-Disc. 20166:900–13.

Meyers RM, Bryan JG, McFarland JM, Weir BA, Sizemore AE, Xu H, et al. Die rechnerische Korrektur des Kopienzahleffekts verbessert die Spezifität von CRISPR-Cas9-Essentialitäts-Screenings in Krebszellen. Nat Genet. 201749:1779–84.

Iorio F, Behan FM, Gonçalves E, Bhosle SG, Chen E, Shepherd R, et al. Unüberwachte Korrektur genunabhängiger Zellreaktionen auf CRISPR-Cas9-Targeting. BMC Genomik. 201819:604.

Sudmant PH, Rausch T, Gardner EJ, Handsaker RE, Abyzov A, Huddleston J, et al. Eine integrierte Karte der strukturellen Variation in 2.504 menschlichen Genomen. Natur. 2015526:75–81.

Li Y, Roberts N, Weischenfeldt J, Wala JA, Shapira O, Schumacher S, et al. Patterns of structural variation in human cancer [Internet]. bioRxiv. 2017 [cited 2017 Dec 14]. P. 181339. Available from: https://www.biorxiv.org/content/early/2017/08/27/181339

Glodzik D, Morganella S, Davies H, Simpson PT, Li Y, Zou X, et al. A somatic-mutational process recurrently duplicates germline susceptibility loci and tissue-specific super-enhancers in breast cancers. Nat Genet. 201749:341–8.

Garnett MJ, Edelman EJ, Heidorn SJ, Greenman CD, Dastur A, Lau KW, et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Natur. 2012483:570–5.

Iorio F, Knijnenburg TA, Vis DJ, Bignell GR, Menden MP, Schubert M, et al. A landscape of pharmacogenomic interactions in cancer. Zelle. 2016166:740–54.

Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Natur. 2016534:47–54.

McBride DJ, Etemadmoghadam D, Cooke SL, Alsop K, George J, Butler A, et al. Tandem duplication of chromosomal segments is common in ovarian and breast cancer genomes. J Pathol. 2012227:446–55.

Stephens PJ, Greenman CD, Fu B, Yang F, Bignell GR, Mudie LJ, et al. Massive genomische Neuordnung, die bei einem einzigen katastrophalen Ereignis während der Krebsentwicklung erworben wurde. Zelle. 2011144:27–40.

Turner KM, Deshpande V, Beyter D, Koga T, Rusert J, Lee C, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Natur. 2017543:122.

Barrangou R, Doudna JA. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nat. Biotechnologie. 201634:933–41.

Knott GJ, Doudna JA. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Wissenschaft. 2018361:866–9.

Greenman CD, Bignell G, Butler A, Edkins S, Hinton J, Beare D, et al. PICNIC: an algorithm to predict absolute allelic copy number variation with microarray cancer data. Bio-Statistiken. 201011:164–75.

Garcia-Alonso LM, Iorio F, Matchan A, Fonseca NA, Jaaks P, Peat G, et al. Transcription factor activities enhance markers of drug sensitivity in cancer. Krebs Res. 2017canres.1679.2017.

Fonseca NA, Petryszak R, Marioni J, Brazma A. iRAP - an integrated RNA-seq analysis pipeline [Internet]. bioRxiv. 2014 [cited 2018 Feb 26]. P. 005991. Available from: http://biorxiv.org/content/early/2014/06/06/005991

Agu CA, Soares FAC, Alderton A, Patel M, Ansari R, Patel S, et al. Successful generation of human induced pluripotent stem cell lines from blood samples held at room temperature for up to 48 hr. Stem Cell Reports. 20155:660–71.

Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatik. 200925:1754–60.

Quinlan AR, Hall IM. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatik. 201026:841–2.

Dale RK, Pedersen BS, Quinlan AR. Pybedtools: a flexible Python library for manipulating genomic datasets and annotations. Bioinformatik. 201127:3423–4.

Pedregosa F, Varoquaux G, Gramfort A, Michel V, Thirion B, Grisel O, et al. Scikit-learn: machine learning in python. J Mach Learn Res. 201112:2825–30.

Glodzik D, Morganella S, Davies H, Simpson PT, Li Y, Zou X, et al. A somatic-mutational process recurrently duplicates germline susceptibility loci and tissue-specific super-enhancers in breast cancers. Dataset. Figshare. https://figshare.com/articles/Structural_rearrangements_generate_cell-specific_gene-independent_CRISPR-Cas9_loss_of_fitness_effects/7610918

Glodzik D, Morganella S, Davies H, Simpson PT, Li Y, Zou X, et al. A somatic-mutational process recurrently duplicates germline susceptibility loci and tissue-specific super-enhancers in breast cancers. Dataset. European Genome-Phenome Archive. https://ega-archive.org/datasets/EGAD00001004124.

Glodzik D, Morganella S, Davies H, Simpson PT, Li Y, Zou X, et al. A somatic-mutational process recurrently duplicates germline susceptibility loci and tissue-specific super-enhancers in breast cancers. Dataset. European Genome-Phenome Archive. https://www.ebi.ac.uk/ega/studies/EGAS00001000978.

Gonçalves E, Behan FM, Louzada S, Arnol D, Stronach EA, Yang F, Yusa K, Stegle O, Iorio F, Garnett MJ. Structural rearrangements generate cell-specific, geneindependent CRISPR-Cas9 loss of fitness effects. Software. Zenodo. . https://doi.org/10.5281/zenodo.2530755.


These authors contributed equally: Xueli Tian and Tingxuan Gu

Mitgliedschaften

Basic Medical College, Zhengzhou University, 450001, Zhengzhou, Henan, China

Xueli Tian, Mee-Hyun Lee & Zigang Dong

China-US (Henan) Hormel Cancer Institute, No.127, Dongming Road, Jinshui District, 450008, Zhengzhou, Henan, China

Xueli Tian, Tingxuan Gu, Satyananda Patel, Mee-Hyun Lee & Zigang Dong

The Hormel Institute, University of Minnesota, Austin, 55912, USA

The Collaborative Innovation Center of Henan Province for Cancer Chemoprevention, Zhengzhou, China

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

Beiträge

X.T. and M.H.L. contributed to the literature search and collection of articles, assisted with designing the figures and writing T.G. and S.P. assisted in the literature search and advised which articles were most appropriate A.M.B. edited the manuscript Z.D. supervised the studies and allocated the funding.

Korrespondierende Autoren