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Nicht-radioaktive Nukleotidmarkierung kompatibel mit reverser Transkriptase?

Nicht-radioaktive Nukleotidmarkierung kompatibel mit reverser Transkriptase?


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Gibt es neben der radioaktiven Markierung Methoden zur Nukleotidmarkierung, die mit der Verwendung für die reverse Transkription kompatibel sind und für die die regulatorischen Rahmenbedingungen in der EU/USA zulässig sind? Zu strenge regulatorische Auflagen für Radionukleide.


Biotin-markierte Nukleotide können durch reverse Transkriptase in cDNA eingebaut werden. Jena Bioscience, ein Anbieter von Biotin-markierten Nukleotiden, hat eine Tabelle, die zeigt, welche Nukleotidchemien erfolgreich mit Reverser Transkriptase verwendet wurden, obwohl Sie in die Datenblätter bestimmter Produkte eintauchen müssen, um die Referenzen zu erhalten.

Eine Referenz auf der Produktseite für Biotin-11-dCTP:

APOBEC3G hemmt die Verlängerung von HIV-1-Reverse-Transkripten

Diese Studie untersucht die natürliche endogene reverse Transkription (nERT) bei HIV. Von den Methoden:

Für diesen Assay wurde eine nERT-Reaktion im Wesentlichen wie oben durchgeführt, mit Ausnahme der dNTP-Zugabe: Pelletierte Virionen wurden in PBS, 2,5 mM MgCl&sub2;2, 15 ug/ml Melittin und 0,5 mM Biotin-11-dCTP (Jena Bioscience) und inkubiert bei 37°C.


Ja, Biotin ist eine nicht radioaktive Option, die zur Markierung von Nukleotiden verwendet wird. Verschiedene Enzyme, die zum Einbau dieses Biotin-markierten Nukleotids verwendet werden, sind: Taq Polymerase für die Ploymerase-Kettenreaktion, DNA-Polymerase für die Nick-Translation, Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase for Reverse Transcription, Klenow Exonuclease for Primer Extension and Terminal Deoxynucleotidyl Transferase for 3'-End Labeling.

Der Nachweis dieser mit Biotin markierten Sonden erfolgt unter Verwendung von Streptavidin, konjugiert mit einer Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Agarose/magnetischen Kügelchen.

(Über: https://www.jenabioscience.com/probes-epigenetics/dna-cdna-labeling/hapten-labeling-of-dna-cdna/biotinylated-nucleotides

https://www.promocell.com/f/product-information/manual/PK-CA-BIO-DUTP-1000P.pdf)


SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster

ROX Referenzfarbstoff
Die Mischung kann auch in Kombination mit dem ROX-Referenzfarbstoff (#PCR-351) in PCR-Geräten verwendet werden, die mit der Auswertung des ROX-Signals kompatibel sind.

Inhalt:
SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster
2x konz. Mischung aus Reverse Transkriptase, antikörperblockierter Hot Start Polymerase, dNTPs, SYBR® Green DNA Interkalatorfarbstoff, Reaktionspuffer, Additiven und Stabilisatoren

Extraktionspuffer (Bitte vorsichtig handhaben und persönliche Schutzausrüstung tragen!)
10x Konz.


Verfahren
Bevor Sie beginnen, nehmen Sie die Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie vollständig auftauen. Alle Reagenzien kurz vortexen und die Flüssigkeiten abzentrifugieren.

1. Probenvorbereitung
1.a Vollblut (nicht empfohlen für Heparin-, EDTA- oder Citrat-behandeltes Vollblut)

  • Vollblut (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) ohne Vorbehandlung direkt in den qPCR-Assay zugeben


1.b Proben aus Nasen- oder Rachenabstrichen

  • Verdünnen Sie 10x Extraktionspuffer auf 1x mit Wasser in PCR-Qualität
  • 200 μl 1x Extraktionspuffer in ein 1,5 ml Mikroröhrchen überführen
  • Schneiden Sie den Wattestäbchen mit dem gesammelten Nasen- oder Rachenabstrich ab und legen Sie ihn in das Mikroröhrchen
  • Schließen Sie das Röhrchen und wirbeln Sie es 15 Sekunden lang vor
  • Bei Raumtemperatur (20-25 °C) für 2-3 Minuten inkubieren
  • Entfernen Sie das Wattestäbchen und drücken Sie es am Rand des Röhrchens aus
  • Kurz zentrifugieren und 1-5 μl des Überstands (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) in den RT-qPCR-Assay überführen


1.c Proben aus tierischem oder pflanzlichem Gewebe

  • Bereiten Sie ein kleines Stück aus tierischem oder pflanzlichem Gewebe mit einem Durchmesser von nicht mehr als 8 mm vor
  • Pflanzensamen mit einem BeadBeater, Tissue Lyser oder einem kleinen Hammer auf einen Durchmesser von weniger als 1 mm knacken
  • Geben Sie die Probe in ein 1,5 ml Mikroröhrchen
  • Fügen Sie der Gewebeprobe Extraktionspuffer wie folgt hinzu:
  • Mischen Sie kurz durch Klopfen oder Vortexen und stellen Sie sicher, dass die Probe mit Extraktionspuffer getränkt ist
  • Inkubation bei Raumtemperatur (20-25 °C) für 3 min
  • Kurz zentrifugieren und 1-5 μl des Überstands (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) in den RT-qPCR-Assay überführen
  • Wenn die Probe flüssig ist: 10x Extraktionspuffer auf 2x mit Wasser in PCR-Qualität verdünnen. Fügen Sie Ihrer Probe 2x Extraktionspuffer im Verhältnis 1:1 hinzu.

2. Vorbereitung des PCR-Assays
Die Vorbereitung eines Mastermixes ist bei quantitativen PCR-Reaktionen entscheidend, um Pipettierfehler zu vermeiden. Bereiten Sie einen Mastermix aus allen Komponenten außer der Vorlage wie unten angegeben vor. Für die meisten Echtzeit-Instrumente wird ein Reaktionsvolumen von 20-50 µm empfohlen. Pipettieren Sie mit sterilen Filterspitzen und minimieren Sie die Lichtexposition der markierten DNA-Sonde. Führen Sie die Einrichtung in einem von der DNA-Präparation oder -Analyse getrennten Bereich durch. Kontrollen ohne Schablone sollten in alle Amplifikationen eingeschlossen werden.

KomponenteLagerkonz.Endkonz.20 &mul
Assay
50 &mul
Assay
SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster2x1x10 &mul25 &mul
Extrahierte Probe oder Vollblut--1-2 &mul2-5 &mul
Vorwärts-Primer 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1,5 &mul
Umkehrgrundierung 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1,5 &mul
ROX Referenzfarbstoff
#PCR-351 2)
25 &m500 nM0,4 &mul1 &mul
Wasser in PCR-Qualität--auffüllen bis
20 &mul
auffüllen bis
50 &mul

Mischen Sie die Röhrchen kurz und drehen Sie sie herunter, um Blasen zu entfernen.
3. RT-PCR-Zyklen
Schalten Sie den Real-Time-PCR-Cycler ein und stellen Sie alle Zyklusparameter wie in der folgenden Tabelle empfohlen ein. Stellen Sie die Fläschchen in das Gerät und starten Sie das Programm.

Umkehren
Transkription 3)
50-55 °C10-15 Minuten1x
Initial
Denaturierung
95 °C5 Minuten1x
Denaturierung
Glühen
Verlängerung
95 °C
60-65 °C 4)
72 °C
15 Sek.
20-30 Sek.
30-60 Sek. 5)

35-45x

Um optimale Spezifitäts- und Amplifikationsergebnisse zu erzielen, wird eine individuelle Optimierung der empfohlenen Parameter für jedes einzelne Probe/Primer-Paar empfohlen.


[0003] Die reverse Transkription (RT) und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sind für viele Molekularbiologie und verwandte Anwendungen, insbesondere für Anwendungen der Genexpressionsanalyse, kritisch. Bei diesen Anwendungen wird reverse Transkription verwendet, um Matrizen-DNA (z. B. cDNA) aus einer anfänglichen RNA-Probe (z. B. mRNA) herzustellen, wobei die Matrizen-DNA dann unter Verwendung von PCR amplifiziert wird, um eine ausreichende Menge an amplifiziertem Produkt für die interessierende Anwendung herzustellen.

[0004] Die RT- und PCR-Schritte der DNA-Amplifikation können als zweistufiger oder einstufiger Prozess durchgeführt werden.

[0005] Bei einer Art von zweistufigem Verfahren umfasst der erste Schritt die Synthese von Erststrang-cDNA mit einer reversen Transkriptase, gefolgt von einem zweiten PCR-Schritt. Bei bestimmten Protokollen werden diese Schritte in getrennten Reaktionsgefäßen durchgeführt. In diesen beiden Röhrchenprotokollen wird nach der reversen Transkription der anfänglichen RNA-Matrize im ersten Röhrchen ein Aliquot des resultierenden Produkts dann in das zweite PCR-Röhrchen gegeben und einer PCR-Amplifikation unterzogen.

[0006] In einem zweiten Typ eines zweistufigen Verfahrens werden sowohl RT als auch PCR in demselben Röhrchen unter Verwendung eines kompatiblen RT- und PCR-Puffers durchgeführt. Typischerweise wird zuerst die reverse Transkription durchgeführt, gefolgt von der Zugabe von PCR-Reagenzien zum Reaktionsröhrchen und anschließender PCR.

[0007] Eine Vielzahl von einstufigen RT-PCR-Protokollen wurde entwickelt, siehe Blain & Goff, J. Biol. Chem.-Nr. (1993) 5: 23585-23592 Blain & Goff J. Virol. (1995) 69: 4440–4452 Sellner et al., J. Virol. Methode. (1994) 49: 47–58 PCR, Essential Techniques (Hrsg. J. F. Burke, J. Wiley & Sons, New York) (1996), S. 61–63, 80–81.

[0008] Einige einstufige Systeme sind im Handel erhältlich, zum Beispiel SuperScript One-Step RT-PCR System description im World Wide Web unter lifetech.com/world_whatsnew/archive/nz 1--3 .html Access RT-PCR System und Access RT-PCR Introductory System, beschrieben im World Wide Web unter promega.com/tbs/tb220/tb220.html AdvanTaq & AdvanTaq Plus PCR Kits und Benutzerhandbuch verfügbar unter www.clontech.com, und ProSTAR™ HF RT-PCR-Kit für Einzelröhrchen (Stratagene, Katalog-Nr. 600164, Informationen im World Wide Web unter stratagene.com verfügbar).

[0009] Die reverse Transkription wird üblicherweise mit viralen reversen Transkriptasen durchgeführt, die aus dem Vogel-Mycloblastose-Virus (AMV-RT) oder dem Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV-RT) isoliert wurden, die in Gegenwart von Magnesiumionen aktiv sind.

[0010] Bestimmte RT-PCR-Verfahren verwenden eine Enzymmischung oder Enzyme mit sowohl reverser Transkriptase- als auch DNA-Polymerase- oder Exonuklease-Aktivität, z. B. wie in US-Pat. Nr. 6,468,775, 6,399,320, 5,310,652, 6,300,073, Patentanmeldung Nr. US 2002/0119465A1 EP 1,132,470A1 und WO 00/71739A1, die alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind.

[0011] Einige existierende RT-PCR-Einschrittverfahren verwenden die native Reverse-Transkriptase-Aktivität von DNA-Polymerasen von thermophilen Organismen, die bei höheren Temperaturen aktiv sind, wie beispielsweise in den oben zitierten Literaturstellen und in US-Pat. Nr. 5,310,652, 6,399,320, 5,322,770 und 6,436677 Myers und Gelfand, 1991, Biochem., 30:7661-7666, die alle hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Thermostabile DNA-Polymerasen mit reverser Transkriptase-Aktivität werden üblicherweise aus Thermus-Spezies isoliert.

[0012] Kürzlich beschreibt die US-Patentanmeldung 2002/0012970 (hier durch Bezugnahme aufgenommen) das Modifizieren einer thermostabilen DNA-Polymerase, um eine RT-Aktivität für eine kombinierte RT-PCR-Reaktion zu erhalten.


SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster UNG

Beschreibung:
SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster UNG wurde für quantitative Echtzeitanalysen von RNA-Templates unter Verwendung von Dual Labeled Fluorescent Probes entwickelt. Der gebrauchsfertige Mix basiert auf einer gentechnisch hergestellten reversen Transkriptase mit erhöhter thermischer Stabilität, die eine erhöhte Spezifität, eine hohe cDNA-Ausbeute und eine verbesserte Effizienz für hochstrukturierte und lange cDNA-Fragmente bietet.
Die 2x Konz. mix enthält alle für die RT-qPCR erforderlichen Reagenzien (außer Template, Primer und die dual markierte Fluoreszenzsonde), um eine schnelle und einfache Vorbereitung mit einem Minimum an Pipettierschritten zu gewährleisten. Die hochwertigen Enzyme und der optimierte Reaktionspuffer mit hochreinen dNTPs sorgen für überlegene Echtzeit-PCR-Ergebnisse.

Die Mischung enthält UNG (Uracil-N-Glycosylase) und dUTP anstelle von dTTP, um eine Kontamination von DNA aus früheren PCR-Reaktionen zu vermeiden. Die UNG-Behandlung zu Beginn der thermischen Zyklen entfernt Uracilreste von dU-haltiger DNA und verhindert, dass sie als Matrize dient.

RT-qPCR wird verwendet, um doppelsträngige DNA aus einzelsträngigen RNA-Matrizen zu amplifizieren, um eine schnelle Echtzeit-Quantifizierung von RNA-Targets zu ermöglichen. Im Schritt der reversen Transkription synthetisiert die reverse Transkriptase einzelsträngige DNA-Moleküle (cDNA), die zur RNA-Matrize komplementär sind. Im ersten Zyklus des PCR-Schritts synthetisiert die Hot-Start-DNA-Polymerase zur cDNA komplementäre DNA-Moleküle und erzeugt so eine doppelsträngige DNA-Matrize. Die Hot-Start-Polymerase-Aktivität wird bei Raumtemperatur blockiert und beim Einsetzen der initialen Denaturierung automatisch eingeschaltet. Die thermische Aktivierung verhindert die Verlängerung von unspezifisch angelagerten Primern und Primer-Dimer-Bildungen bei niedrigen Temperaturen während des PCR-Setups.
Die RT-qPCR in einem Schritt bietet enormen Komfort bei der Analyse von Zielen aus mehreren RNA-Proben und minimiert das Kontaminationsrisiko.
Die Mischung kann auch in Kombination mit dem ROX-Referenzfarbstoff (#PCR-351) in PCR-Geräten verwendet werden, die mit der Auswertung des ROX-Signals kompatibel sind.

Der SCRIP RT-qPCR Probes Master ist für die molekulare Diagnose von SARS-CoV-2 validiert, die die neue Coronavirus-Infektionskrankheit COVID-19 verursacht.

Inhalt:
SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster UNG
Gebrauchsfertige Mischung aus SCRIPT Reverse Transcriptase, Hot Start Polymerase AB+, UNG, RNase Inhibitor, dNTPs inkl. dUTP, Reaktionspuffer und Stabilisatoren.


Doppelt markierte Fluoreszenzsonden:
Die Echtzeit-PCR-Technologie basierend auf zweifach markierten DNA-Sonden bietet ein hochempfindliches und spezifisches PCR-System mit Multiplexing-Fähigkeit. Es erfordert zwei Standard-PCR-Primer und die DNA-Sonde, die an einen internen Teil des Amplikons hybridisiert. Die Sequenz der doppelt markierten DNA-Sonde sollte eine Sekundärstruktur- und Primer-Dimer-Bildung vermeiden.

Fahren Sie wie empfohlen mit der reversen Transkription und dem Thermocycling fort.

Reverse Transkription und thermische Zyklen:
Stellen Sie die Fläschchen in einen PCR-Cycler und starten Sie das folgende Programm.

umkehren
Transkription 5)
50-55 °C20-30 Minuten1x
Initial
Denaturierung 6)
95°C5 Minuten1x
Denaturierung95°C15 Sek.35-45x
Glühen und
Verlängerung
60-65 °C 7) 40-60 Sek. 6) 35-45x

Für eine optimale Spezifität und Amplifikation kann eine individuelle Optimierung der empfohlenen Parameter erforderlich sein. Beachten Sie, dass optimale Reaktionszeiten und Temperaturen für jedes einzelne RNA/Primer-Paar angepasst werden sollten.


SCRIPT Direct RT-qPCR ProbesMaster

ROX Referenzfarbstoff
Die Mischung kann auch in Kombination mit dem ROX-Referenzfarbstoff (#PCR-351) in PCR-Geräten verwendet werden, die mit der Auswertung des ROX-Signals kompatibel sind.

Inhalt:
SCRIPT Direct RT-qPCR ProbesMaster
2x konz. Mischung aus Reverse Transcriptase, antikörperblockierter Hot Start Polymerase, dNTPs, Reaktionspuffer, Additiven und Stabilisatoren

Extraktionspuffer (Bitte vorsichtig handhaben und persönliche Schutzausrüstung tragen!)
10x Konz.


Verfahren
Bevor Sie beginnen, nehmen Sie die Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie vollständig auftauen. Alle Reagenzien kurz vortexen und die Flüssigkeiten abzentrifugieren.

1. Probenvorbereitung
1.a Vollblut (nicht empfohlen für Heparin-, EDTA- oder Citrat-behandeltes Vollblut)

  • Vollblut (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) ohne Vorbehandlung direkt in den qPCR-Assay zugeben


1.b Proben aus Nasen- oder Rachenabstrichen

  • Verdünnen Sie 10x Extraktionspuffer auf 1x mit Wasser in PCR-Qualität
  • 200 μl 1x Extraktionspuffer in ein 1,5 ml Mikroröhrchen überführen
  • Schneiden Sie den Wattestäbchen mit dem gesammelten Nasen- oder Rachenabstrich ab und legen Sie ihn in das Mikroröhrchen
  • Schließen Sie das Röhrchen und wirbeln Sie es 15 Sekunden lang vor
  • Bei Raumtemperatur (20-25 °C) für 2-3 Minuten inkubieren
  • Entfernen Sie das Wattestäbchen und drücken Sie es am Rand des Röhrchens aus
  • Kurz zentrifugieren und 1-5 μl des Überstands (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) in den RT-qPCR-Assay überführen


1.c Proben aus tierischem oder pflanzlichem Gewebe

  • Bereiten Sie ein kleines Stück aus tierischem oder pflanzlichem Gewebe mit einem Durchmesser von nicht mehr als 8 mm vor
  • Pflanzensamen mit einem BeadBeater, Tissue Lyser oder einem kleinen Hammer auf einen Durchmesser von weniger als 1 mm knacken
  • Geben Sie die Probe in ein 1,5 ml Mikroröhrchen
  • Fügen Sie der Gewebeprobe Extraktionspuffer wie folgt hinzu:
  • Mischen Sie kurz durch Klopfen oder Vortexen und stellen Sie sicher, dass die Probe mit Extraktionspuffer getränkt ist
  • Inkubation bei Raumtemperatur (20-25 °C) für 3 min
  • Kurz zentrifugieren und 1-5 μl des Überstands (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) in den RT-qPCR-Assay überführen
  • Wenn die Probe flüssig ist: 10x Extraktionspuffer auf 2x mit Wasser in PCR-Qualität verdünnen. Fügen Sie Ihrer Probe 2x Extraktionspuffer im Verhältnis 1:1 hinzu.


2. Vorbereitung des PCR-Assays
Die Vorbereitung eines Mastermixes ist bei quantitativen PCR-Reaktionen entscheidend, um Pipettierfehler zu vermeiden. Bereiten Sie einen Mastermix aus allen Komponenten außer der Vorlage wie unten angegeben vor. Für die meisten Echtzeit-Instrumente wird ein Reaktionsvolumen von 20-50 µm empfohlen. Pipettieren Sie mit sterilen Filterspitzen und minimieren Sie die Lichtexposition der markierten DNA-Sonde. Führen Sie die Einrichtung in einem von der DNA-Präparation oder -Analyse getrennten Bereich durch. Kontrollen ohne Schablone sollten in alle Amplifikationen eingeschlossen werden.

KomponenteLagerkonz.Endkonz.20 &mul
Assay
50 &mul
Assay
SCRIPT Direct RT-qPCR ProbesMaster2x1x10 &mul25 &mul
Extrahierte Probe oder Vollblut--1-2 &mul2-5 &mul
Vorwärts-Primer 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1,5 &mul
Umkehrgrundierung 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1,5 &mul
TaqMan® / Doppelmarkierte Sonde 1 1) 10 &muM200 nM0,4 &mul1 &mul
Vorwärtsprimer 2 2)10 &muM300 nM0,6 &mul1,5 &mul
Umkehrgrundierung 2 2)10 &muM300 nM0,6 &mul1,5 &mul
TaqMan® / Doppelmarkierte Sonde 2 2)10 &muM200 nM0,4 &mul1 &mul
ROX Referenzfarbstoff
#PCR-351 3)
25 &m500 nM0,4 &mul1 &mul
Wasser in PCR-Qualität--auffüllen bis
20 &mul
auffüllen bis
50 &mul

Mischen Sie die Röhrchen kurz und drehen Sie sie herunter, um Blasen zu entfernen.
3. RT-PCR-Zyklen
Schalten Sie den Real-Time-PCR-Cycler ein und stellen Sie alle Zyklusparameter wie in der folgenden Tabelle empfohlen ein. Stellen Sie die Fläschchen in das Gerät und starten Sie das Programm.

Umkehren
Transkription 4)
50-55 °C10-15 Minuten1x
Initial
Denaturierung
95 °C5 Minuten1x
Denaturierung
Glühen und Dehnung
95 °C
60-65 °C 5)
15 Sek.
30-60 Sek. 6)

35-45x

Um optimale Spezifitäts- und Amplifikationsergebnisse zu erzielen, wird eine individuelle Optimierung der empfohlenen Parameter für jedes einzelne Probe/Primer-Paar empfohlen.


12 - Vor Ort PCR

Vor Ort Polymerase-Kettenreaktion (IS-PCR) beschreibt die Primer-gesteuerte Amplifikation einer DNA- oder RNA-Matrize durch PCR und deren anschließende Detektion innerhalb eines histologischen Gewebeschnitts. Dieses Kapitel bietet einen umfassenden Überblick über die IS-PCR-Technik mit Schwerpunkt auf aktuellen Empfehlungen und Protokollen. Darüber hinaus werden andere wichtige Aspekte, die Forscher weiterhin davon abhalten, diese Technik zu übernehmen, ausführlicher erörtert. Diese Probleme sind Fixierung, Durchlässigkeit und Diffusion. Schließlich soll diese Übersicht als Quelle dienen, um den Leser auf detailliertere Abhandlungen zu allen relevanten Aspekten der vor Ort Verstärkung. Die Diskussion kommt zu dem Schluss, dass IS-PCR weiterhin viel Interesse und Diskussionen weckt. Da Lösungs-PCR schnell in diagnostische Assays integriert wird, besteht die Erwartung, dass IS-PCR den Übergang schaffen wird. Bis jedoch ein robustes, zuverlässiges Protokoll entwickelt und die Probleme der Diffusion und Quantifizierung gelöst sind, wird IS-PCR als eine Art Kunst und folglich weniger als Wissenschaft angesehen. Am Ende skizziert das Kapitel ein detailliertes Protokoll, das in verschiedenen Labors auf der ganzen Welt zum Nachweis eines Single-Copy-Gens in einem normalen Säugetiergewebe verwendet wird.


SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster highROX

ROX Referenzfarbstoff
Der SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster highROX enthält im Endtest 500 nM ROX passiven Referenzfarbstoff. Der Farbstoff nimmt nicht an der PCR-Reaktion teil, ermöglicht jedoch die Normalisierung auf nicht-PCR-bezogene Signalvariationen in Instrumenten, die mit der Auswertung des ROX-Referenzsignals kompatibel sind.

Inhalt:
SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster highROX
2 x konz. Mischung aus Reverse Transcriptase, antikörperblockierter Hot Start Polymerase, dNTPs, SYBR® Green DNA Intercalator Dye, ROX, Reaktionspuffer, Additiven und Stabilisator

Extraktionspuffer (Bitte vorsichtig handhaben und persönliche Schutzausrüstung tragen!)
10x Konz.

Verfahren
Bevor Sie beginnen, nehmen Sie die Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie vollständig auftauen. Alle Reagenzien kurz vortexen und die Flüssigkeiten abzentrifugieren.

1. Probenvorbereitung
1.a Vollblut (nicht empfohlen für Heparin-, EDTA- oder Citrat-behandeltes Vollblut)

  • Vollblut (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) ohne Vorbehandlung direkt in den qPCR-Assay zugeben


1.b Proben aus Nasen- oder Rachenabstrichen

  • Verdünnen Sie 10x Extraktionspuffer auf 1x mit Wasser in PCR-Qualität
  • 200 μl 1x Extraktionspuffer in ein 1,5 ml Mikroröhrchen überführen
  • Schneiden Sie den Wattestäbchen mit dem gesammelten Nasen- oder Rachenabstrich ab und legen Sie ihn in das Mikroröhrchen
  • Schließen Sie das Röhrchen und wirbeln Sie es 15 Sekunden lang vor
  • Bei Raumtemperatur (20-25 °C) für 2-3 Minuten inkubieren
  • Entfernen Sie das Wattestäbchen und drücken Sie es am Rand des Röhrchens aus
  • Kurz zentrifugieren und 1-5 μl des Überstands (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) in den RT-qPCR-Assay überführen


1.c Proben aus tierischem oder pflanzlichem Gewebe

  • Bereiten Sie ein kleines Stück aus tierischem oder pflanzlichem Gewebe mit einem Durchmesser von nicht mehr als 8 mm vor
  • Pflanzensamen mit einem BeadBeater, Tissue Lyser oder einem kleinen Hammer auf einen Durchmesser von weniger als 1 mm knacken
  • Geben Sie die Probe in ein 1,5 ml Mikroröhrchen
  • Fügen Sie der Gewebeprobe Extraktionspuffer wie folgt hinzu:
  • Mischen Sie kurz durch Klopfen oder Vortexen und stellen Sie sicher, dass die Probe mit Extraktionspuffer getränkt ist
  • Inkubation bei Raumtemperatur (20-25 °C) für 3 min
  • Kurz zentrifugieren und 1-5 μl des Überstands (1-2 &mul für 20 &mul oder 2-5 &mul für 50 &mul Gesamt-Assayvolumen) in den RT-qPCR-Assay überführen
  • Wenn die Probe flüssig ist: 10x Extraktionspuffer auf 2x mit Wasser in PCR-Qualität verdünnen. Fügen Sie Ihrer Probe 2x Extraktionspuffer im Verhältnis 1:1 hinzu.

2. Vorbereitung des PCR-Assays
Die Vorbereitung eines Mastermixes ist bei quantitativen PCR-Reaktionen entscheidend, um Pipettierfehler zu vermeiden. Bereiten Sie einen Mastermix aus allen Komponenten außer der Vorlage wie unten angegeben vor. Für die meisten Echtzeit-Instrumente wird ein Reaktionsvolumen von 20-50 µm empfohlen. Pipettieren Sie mit sterilen Filterspitzen und minimieren Sie die Lichtexposition der markierten DNA-Sonde. Führen Sie die Einrichtung in einem von der DNA-Präparation oder -Analyse getrennten Bereich durch. Kontrollen ohne Schablone sollten in alle Amplifikationen eingeschlossen werden.

KomponenteLagerkonz.Endkonz.20 &mul
Assay
50 &mul
Assay
SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster2x1x10 &mul25 &mul
Extrahierte Probe oder Vollblut--1-2 &mul2-5 &mul
Vorwärts-Primer 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1,5 &mul
Umkehrgrundierung 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1,5 &mul
Wasser in PCR-Qualität--auffüllen bis
20 &mul
auffüllen bis
50 &mul

Mischen Sie die Röhrchen kurz und drehen Sie sie herunter, um Blasen zu entfernen.
3. RT-PCR-Zyklen
Schalten Sie den Real-Time-PCR-Cycler ein und stellen Sie alle Zyklusparameter wie in der folgenden Tabelle empfohlen ein. Stellen Sie die Fläschchen in das Gerät und starten Sie das Programm.

Umkehren
Transkription 2)
50-55 °C10-15 Minuten1x
Initial
Denaturierung
95 °C5 Minuten1x
Denaturierung
Glühen
Verlängerung
95 °C
60-65 °C 3)
72 °C
15 Sek.
20-30 Sek.
30-60 Sek. 4)

35-45x

Um optimale Spezifitäts- und Amplifikationsergebnisse zu erzielen, wird eine individuelle Optimierung der empfohlenen Parameter für jedes einzelne Probe/Primer-Paar empfohlen.


Avidin-Biotin Technisches Handbuch

Unser 48-seitiges technisches Handbuch zu Avidin-Biotin enthält alles, was zum Biotinylieren, Reinigen oder Nachweisen von Proteinen erforderlich ist. Zu den vorgestellten Produkten gehören Biotinylierungs- und Reinigungskits für Zelloberflächenproteine, Antikörpermarkierung und neue photoreaktive Biotinylierungsreagenzien. Dieses Handbuch enthält Dutzende von Referenzen zusammen mit Protokollen, Tipps zur Fehlerbehebung, Auswahlanleitungen und eine vollständige Liste der verfügbaren Tools.

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Nachteile der Verwendung des Avidin-Biotin-Systems

Obwohl das Avidin-Biotin-System einfach einzurichten und zu verwenden ist, hat es gewisse Einschränkungen. Da jedes biotinylierte Molekül an jedes biotinbindende Protein bindet, müssen diese Reagenzien in Kombination mit anderen Nachweis-Sonden-Systemen (d. h. Primär-Sekundär-Antikörper) für Multiplex-Experimente verwendet werden.

Da Biotin ein biologisches Molekül ist, kann endogenes Biotin auch Hintergrund- und Spezifitätsprobleme verursachen, wenn Assays mit bestimmten biotinreichen Geweben und Extrakten (d. h. Gehirn, Leber, Milch, Eier, Mais) durchgeführt werden. Dies gilt auch für Proben, die körpereigene Biotin-bindende Proteine ​​enthalten, wie Eier (Quelle für Avidin) oder Bakterien wie Streptomyces avidinii (Quelle von Streptavidin).

Chemische Struktur von HNS-Desthiobiotin. Beachten Sie die modifizierte Ringstruktur rechts (natives Biotin hat eine Doppelringstruktur, die in die Bindungsstelle von Avidin, Streptavidin oder NeutrAvidin passt).

Bei Reinigungsanwendungen ist die Stärke der Bindungswechselwirkung zwischen Biotin und Avidin ein Faktor, der seinen Nutzen einschränkt. Dies liegt daran, dass harte Bedingungen erforderlich sind, um die Avidin-Biotin-Bindungen aufzubrechen (d. h. zu dissoziieren und zu eluieren), und diese können Zielproteine ​​denaturieren. Um diese Einschränkung zu überwinden, sind modifizierte Versionen von Avidin-Harzen und modifizierte Formen von Biotin-Markierungsreagenzien im Handel erhältlich, die die Wechselwirkung leicht reversibel machen. Diese umfassen monomeres Avidin, spaltbare Disulfid-Biotin-Reagenzien und Iminobiotin- und Desthiobiotin-Derivate (siehe Diskussion von Proteinisolierung und -anreicherung unten).

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Ergebnisse

AviRa- und AviRb-Methylat-23S-rRNA

Frühere Studien mit einem tritiierten AdoMet-Methylgruppendonor haben gezeigt, dass sowohl AviRa als auch AviRb eine Mischung aus E coli 16S- und 23S-rRNA als Substrat für die Methylierung (Weitnauer et al., 2001). Die Co-Inkubation beider Enzyme mit dem Substrat hatte einen additiven Effekt auf den Einbau von tritiierten Methylgruppen, was darauf hinweist, dass die Enzyme an unterschiedlichen Nukleotiden in der rRNA (oder möglicherweise an unterschiedlichen Positionen desselben Nukleotids) wirken. In dieser Studie wurden 16S- und 23S-rRNAs getrennt durch in vitro Transkription, und nur das 23S-rRNA-Transkript fungiert als Substrat für jedes der beiden Enzyme. Unter den hier verwendeten Testbedingungen zeigten die eingebauten Tritiummengen, dass jedes der Enzyme ungefähr eine Methylgruppe pro 23S-rRNA-Substratmolekül hinzufügte (Tabelle 1). Bei Versuchen, das 16S-rRNA-Transkript als Substrat zu verwenden, wurde kein signifikanter Einbau von Tritium beobachtet (Daten nicht gezeigt).

Plasmid Position in 23S-RNA RNA-Transkript Produktbildung a
AviRa AviRb
pCW1 gesamte 23S rRNA 2904n 0.86 ± 0.05 1 ± 0.05
pBDV 2031–2637 607n 0.81 ± 0.07 0.98 ± 0.12
pBDVCL 2446–2632 187n 0.81 ± 0.05 0.88 ± 0.07
pBDVCL2 2446–2532 87n ≤ 0.05 0.79 ± 0.07
  • ein. Die Menge an methylierter RNA wird in Mol eingebauter Methylgruppen pro Mol RNA angegeben. Die Werte sind die Mittelwerte von zwei unabhängigen Experimenten.

AviRa und AviRb wirken an unterschiedlichen Stellen in der 23S rRNA

Um die Methylierungsstellen durch AviRa und AviRb zu lokalisieren, wurden mehrere RNA-Transkripte aus Plasmiden erzeugt, die verkürzte Abschnitte des 23S-rRNA-Gens enthielten (Tabelle 1 und Fig. 2). Ein Transkript von 606 Nukleotiden (606n), das die gesamte Domäne V der 23S-rRNA umfasst, wurde von beiden Enzymen als Substrat akzeptiert, und die Methylierungsstellen konnten mit einem 187n-Transkript, das die 23S-rRNA-Domänen-V-Sequenz von Nukleotid 2446– enthält, weiter eingegrenzt werden. 2632, die Helices 89-91 enthält. Nach einer weiteren Verkürzung, um den größten Teil der Helix 91 (im 87n-Transkript) zu entfernen, ging die AviRa-Methylierungsaktivität verloren, obwohl die AviRb-Methylierung beibehalten wurde (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigten, dass AviRa und AviRb unterschiedliche Strukturen in der Helix 89–91 Region erkennen.

Identifizierung der AviRa- und AviRb-Methylierungsstellen

Methylierte RNA-Transkripte wurden durch Primer-Extension mit reverser Transkriptase analysiert, um die genauen Positionen der Nukleotide zu identifizieren, die durch die beiden Methyltransferasen modifiziert wurden. Die Verlängerung von einem Primer, der an die 23S-rRNA-Sequenz 2559–2578 hybridisiert, ergab einzelne einzigartige Stopps der reversen Transkriptase für jede der beiden Methylierungen ( 3 ). Die Methylierung der RNA durch AviRa führte zu einem starken Transkriptionsstopp an Position 2536 in Helix 91, was mit einer Modifikation am benachbarten Nukleotid (G2535) übereinstimmt. Die Analyse der durch AviRb methylierten RNA zeigte einen schwachen Stopp der reversen Transkriptase an Position 2480, entsprechend einer Modifikation am Nukleotid U2479 innerhalb der Helix 89. An anderen Positionen innerhalb der Domäne V der 23S-rRNA waren keine weiteren neuen Stopps ersichtlich.

Gel-Autoradiogramm, das die Stellen der AviRa- und AviRb-Methylierung zeigt. Nach Methylierung durch AviRa (Spur a) oder AviRb (Spur b) in vitro Transkripte von 23S-rRNA wurden vom ln05-Primer revers transkribiert. Die Stopps der reversen Transkriptase, die den Stellen der Nukleotidmodifikation bei G2535 und U2479 entsprechen, sind angegeben. Diese Stopps fehlen im unmodifizierten Kontroll-RNA-Transkript (Spur k) und in der unmodifizierten 23S-rRNA, die aus . extrahiert wurde E coli Zellen (Bahn o). Dideoxy-Sequenzierungsspuren (C, U, A und G) wurden unter Verwendung der E coli 23S-rRNA als Matrize. Die methylierungsabhängigen Stopps treten ein Nukleotid vor der entsprechenden Position in den Sequenzierspuren auf.

Der starke AviRa-abhängige Stopp bei G2535 passte gut zu den Methylierungsexperimenten mit tritiiertem AdoMet, während der schwache Stopp, der durch die AviRb-Methylierung bei U2479 verursacht wurde, schwer mit der Stöchiometrie des Einbaus tritiierter Methylgruppen in RNA-Substrate in Einklang zu bringen war. Es wurde zuvor gezeigt, dass 2'-Hydroxyl-Methylierungen unter Standard-Primer-Extensionsbedingungen eine geringe Wirkung auf die Verlangsamung der Reversen Transkriptase haben, obwohl eine Verringerung der Desoxynukleosidtriphosphat-Konzentration in der Verlängerungsreaktion die Termination an diesen methylierten Nukleotiden erhöht ( Maden et al., 1995). Das Wiederholen der Primerverlängerungen mit fortschreitend geringeren Mengen der dNTPs verstärkte spezifisch die Termination an der U2479-Stelle in AviRb-methylierter RNA ( 4 ). In Kontrollerweiterungen mit E coli 23S rRNA eine ähnliche Zunahme der Bandenintensität wurde für U2552 festgestellt, das intrinsisch am 2′-Hydroxyl methyliert ist ( Rozenski et al., 1999). Dies deutet stark darauf hin, dass AviRb auf die 2'-Position des Nukleotids U2479-Ribose abzielt.

Gel-Autoradiogramme von (linkes Feld) 23S-rRNA, extrahiert aus E coli Zellen (23S rRNA) und eine T7-RNA-Polymerase in vitro Transkript derselben Sequenz (T7-RNA), die vom ln05-Primer unter unterschiedlichen dNTP-Konzentrationen revers transkribiert wurden. Die Keile zeigen eine fallende Konzentration von dNTPs von 220 µM, 40 µM, 20 µM bis 10 µM an. Die intrinsische 23S rRNA 2'-O-Ribose Methylierung an U2552 wird bei den niedrigeren dNTP Konzentrationen sichtbar und fehlt im T7 RNA Transkript. Im rechten Feld wurde das T7-RNA-Transkript vor (kein Enzym) und nach der Modifikation durch die AviRb-Methyltransferase (AviRb) revers transkribiert. Diese RNAs wurden von dem Primer, der zu den Nukleotiden 2488–2504 komplementär war, revers transkribiert, wobei der Bereich der dNTP-Konzentrationen verwendet wurde, der durch die Keile angegeben ist (220 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM und 1 µM). Die AviRb-abhängige Bande, die dem modifizierten Nukleotid U2479 entspricht, ist bei den niedrigeren dNTP-Konzentrationen am deutlichsten.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Analysen von RNA-Methylierungen

Das 187n-RNA-Transkript wurde entweder durch AviRa oder AviRb methyliert und wurde dann vollständig mit RNase A oder RNase T1 verdaut. Nukleaseverdau reduziert das 187n zu einer Reihe spezifischer Oligonukleotide, deren exakte Massen aus der RNA-Sequenz berechnet und massenspektrometrisch gemessen werden können. Eine Nukleotidmodifikation schlägt sich in einer Diskrepanz zwischen berechneten und gemessenen Massen nieder ( Kirpekar et al., 2000). In den vollständigen Massenspektren können Oligonukleotide größer als Dinukleotide nachgewiesen und mit einer Massengenauigkeit besser als 0,2 Da zugeordnet werden.

Die Modifikation der 187n-RNA mit AviRa gefolgt von einem RNase-T1-Verdau erzeugte eine Reihe von Oligonukleotiden (Fig. 5A), einschließlich eines, das in unmethylierter RNA fehlte. Dieses Fragment hatte ein m/z von 1013,07, entsprechend UAGp plus einer Methylgruppe (theoretisches m/z 1013,16). Das methylierte UAGp wurde weiter durch Tandem-Massenspektrometrie (Fig. 5B) analysiert, eine Technik, die verwendet wird, um spezifische Oligonukleotide auszuwählen und anschließend zu fragmentieren. Von der y2- Andy1-Ionen (Nomenklatur nach McLuckey et al., 1992), konnte die Methylierungsstelle eindeutig dem Guanosinnukleotid zugeordnet werden. Darüber hinaus ergibt der Verlust einer methylierten G-Nukleobase aus UAGp ein Signal bei m/z 848,12 (theoretisch m/z 848.13) plus eine protonierte Guaninspezies bei 166,08 und dies zeigt schlüssig, dass sich die Methylgruppe an der Guaninbase befindet, und nicht auf der Ribose, von G2535. Der analoge RNase A-Verdau führte zu einem Signal bei m/z 1358,20, das einem methylierten AGGUp-Oligonukleotid entspricht, und die anschließende Analyse bestätigte, dass die Methylierung bei G2535 stattfand (Daten nicht gezeigt).

A. MALDI-Massenspektrum der 187n-RNA nach Methylierung durch AviRa und vollständigem Verdau mit RNase T1. Alle berechneten Fragmente größer als Dinukleotide wurden erkannt und mit einer Massenpräzision besser als 0,2 Da zugeordnet. Die Einfügung zeigt eine Vergrößerung des 1000-m/z-Bereichs, in dem sich der Peak befindet, der UAGp plus einer einzelnen Methylgruppe entspricht (gemessen bei m/z 1013,07).

B. Fragmentierung durch Tandem-Massenspektrometrie des methylierten UAGp-Peaks (erneut gemessen bei m/z 1013,19). Der Verlust der methylierten Guaninbase aus UAGp führt zu einem Peak von m/z 848,13 (– G Me H), und das protonierte Guanin-Ion erscheint bei 166,08 (G Me H2 +). Alle Spektren wurden geglättet.

Nach Methylierung der 187n-RNA durch AviRb gefolgt von RNase T1-Verdau entsprach das m/z eines der Fragmente der Sequenz 5'-UUCAUAUCGp-3' plus einer Methylgruppe (nicht gezeigt). Der Verdau der RNA mit RNase A lokalisierte die Methylierung innerhalb des größeren T1-Oligonukleotids auf die Sequenz AUCp, was ein Signal bei 973,15 ergab (der theoretische m/z dieses Oligonukleotids mit einer einzelnen Methylgruppe beträgt 973,11). Das AUCp-Oligonukleotid wurde für unmethylierte RNA nicht erhalten, da RNase A nach einem unmodifizierten U-Rest schneidet, was darauf hinweist, dass Nukleotid U2479 auf eine Weise methyliert wurde, die die RNase A-Spaltung hemmt. Eine weitere Analyse des AUCp-Oligonukleotids durch Tandem-MS (Fig. 6) ergab ein Spektrum von y2-, z1 und C1-Ionen, die eindeutig der Sequenz HO-A[methylated U]Cp zugeordnet werden können. Das deutliche Signal bei m/z 111,05 (Fig. 6) stimmt mit einem bekannten Ribose-Derivat überein (Phillips und McCloskey, 1993, Kirpekar und Krogh, 2001) mit einer angehängten Methylgruppe. Aus diesen Daten kann das AviRb-Target für die Methylierung der Ribose des Nukleotids U2479 zugeschrieben werden.

Fragmentierung durch Tandem-Massenspektrometrie der AUmCp-Peak (gemessen bei m/z 973,15). Dieser Peak wurde im MALDI-TOF-Spektrum (nicht gezeigt) beobachtet, das von dem 187n-RNA-Substrat nach Methylierung durch AviRb und anschließendem Verdau mit RNase A abgeleitet wurde. Die Region im unteren m/z-Bereich des Spektrums ist vergrößert (einfügen) und zeigt a Peak entsprechend 2'-O-Methylribose (m/z 111,05), abgeleitet von U2479.


ICLIP -- Transkriptom على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

RNA . ، قمنا بتطوير ومناعي (iCLIP) يسمح الجينوم على ورسم خرائط للمواقع النووي الريبي .

Abstrakt

تركيبة فريدة والترتيب المكاني للRNA ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) على نسخة دليل الجوانب المتنوعة في مرحلة ما بعد النسخي البند 1. لذلك ، خطوة أساسية نحو تنظيم محضر التفاهم على المستوى الجزيئي هي لاكتساب المعلومات الموضعية على مواقع الربط من الممارسات التجارية التقييدية 2.

ويمكن دراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعلات الكيميائية الحيوية باستخدام الأساليب ، ولكن هذه الطرق لا تتناول الحمض النووي الريبي ملزمة في سياقها الأصلي الخلوية. المحاولات الأولية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات في بيئتها الخلوية المستخدمة لتنقية تقارب أو مناعي جنبا إلى جنب مع الفرق عرض أو تحليل ميكروأري (RIP - CHIP) 3-5. وكانت هذه الأساليب عرضة لتحديد التفاعلات غير المباشرة أو غير الفسيولوجية - 6. يشار استراتيجية من أجل زيادة نوعية والقرار الموضعية ، على أنه قدم CLIP (الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط ومناعي) 7،8. CLIP يجمع عبر ربط الأشعة فوق البنفسجية من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي مع مخططات تنقية صارمة بما في ذلك تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام إستشراد. بالاشتراك مع تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، وقد ثبت CLIP كأداة قوية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعل على نطاق والجينوم واسعة (ويشار إلى CLIP - HITS CLIP أو بعدها) 9،10. مؤخرا ، تم إدخال PAR - CLIP يستخدم النظير لريبونوكليوزيد photoreactive عبر ربط 11،12.

على الرغم من نوعية عالية من البيانات التي تم الحصول عليها ، والتجارب CLIP كثيرا ما تولد من التعقيد مكتبات [كدنا] تسلسل محدودة. هذا يرجع جزئيا إلى كمية محدودة من شارك في المنقى واثنين من الحمض النووي الريبي RNA ربط الكفاءة ردود الفعل المطلوبة لإعداد المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت المقايسات تمديد التمهيدي cDNAs أن العديد من اقتطاع قبل الأوان بنسبة 13 في النوكليوتيدات crosslinked. يتم فقدان هذه cDNAs اقتطاع خلال بروتوكول CLIP معيار إعداد المكتبة. نحن وضعت مؤخرا iCLIP (فردية النوكليوتيدات CLIP القرار) ، والذي يجسد cDNAs اقتطاعها من خلال استبدال واحدة من الخطوات غير فعالة الربط بين الجزيئات RNA مع التعميم أكثر كفاءة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ [كدنا] (الشكل 1) 14. الأهم من ذلك ، تسلسل cDNAs اقتطاع يقدم أفكارا في موقف للموقع عبر وصلة في القرار النوكليوتيدات. طبقنا بنجاح iCLIP لدراسة الجسيمات C hnRNP منظمة على نطاق واسع الجينوم وتقييم دورها في تنظيم الربط 14.

Protokoll

1. الأشعة فوق البنفسجية عبر الربط بين خلايا الأنسجة

  1. إزالة وسائل الاعلام وإضافة 6 مل الجليد الباردة PBS إلى الخلايا المزروعة في صحن 10 سم (ما يكفي لمدة ثلاث تجارب).
  2. إزالة غطاء ووضعت على الجليد. أشرق مرة واحدة مع 150 ميغا جول / سم 2 في 254 نانومتر.
  3. حصاد الخلايا عن طريق كشط مع رافع الخلية.
  4. 2 تعليق نقل خلية لكل مل من ثلاثة microtubes. تدور بسرعة أعلى لمدة 10 ثانية عند 4 درجة مئوية إلى الخلايا بيليه ، ثم إزالة طاف.
  5. الإضافية تجميد الخلية في كريات الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  1. إضافة 100 ميكرولتر من البروتين Dynabeads (Dynal ، 100،02) في تجربة جديدة لmicrotube (استخدام البروتين Dynabeads G للماوس أو أجسام الماعز).
  2. تغسل حبات 2X مع تحلل العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ؛ 1 ٪ NP - 40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ 0.5 ٪ deoxycholate الصوديوم ؛ 1 / 100 مثبط البروتياز كوكتيل الثالث ، Calbiochem).
  3. Resuspend الخرز في 100 العازلة تحلل ميكرولتر مع الضد 20-10 ميكروغرام.
  4. تدوير أنابيب في درجة حرارة الغرفة ل30-60 دقيقة.
  5. غسل 3X مع 900 ميكرولتر العازلة تحلل وترك في الماضي حتى يغسل استعداد للشروع في الخطوة 4.1.

3. تحلل الخلايا والحمض النووي الريبي الهضم الجزئي

  1. Resuspend الكرية خلية في 1 مل العازلة تحلل ونقل إلى microtubes مل 1.5.
  2. يعد التخفيف 1 / 500 من أنا ريبونوكلياز (Ambion ، AM2295). أضف 10 ميكرولتر التخفيف أنا ريبونوكلياز فضلا عن 2 الدناز توربو ميكرولتر إلى lysate الخلية (1 / 500 ريبونوكلياز التخفيفات الأول [منخفضة ريبونوكلياز] تستخدم لإعداد المكتبة ، 1 / ​​50 التخفيفات [عالية ريبونوكلياز] ضرورية للسيطرة على خصوصية الضد) .
  3. احتضان العينات المطلوبة لل3 دقائق بالضبط عند 37 درجة مئوية ، والهز في 1100 دورة في الدقيقة. نقل على الفور إلى جليد.
  4. تدور عند 4 درجة مئوية و 22000 لمدة 20 دقيقة ز لمسح lysate. جمع بعناية طاف (اترك حوالي 50 lysate ميكرولتر مع بيليه).
  1. إزالة غسل العازلة من الخرز (من الخطوة 2.5) ، ثم إضافة lysate الخلية (من الخطوة 3.4).
  2. تدوير عينات لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  3. تجاهل طاف وتغسل حبات 2X مع 900 العازلة عالية من الملح ميكرولتر (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 1 M كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم و 1 ٪ NP - 40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ deoxycholate الصوديوم 0.5 ٪).
  4. غسل 2X مع 900 العازلة غسل ميكرولتر (20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 10 ملي MgCl 2 ؛ 0.2 ٪ توين - 20).

5. نزع الفسفات من الحمض النووي الريبي 3'ends

  1. تجاهل وطاف resuspend الخرز في 20 مزيج PNK ميكرولتر (15 ميكرولتر المياه ؛ 4 ميكرولتر الحموضة PNK 5X 6.5 العازلة [350mMTris ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 6.5 ؛ 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2] ؛ 0.5 انزيم PNK ميكرولتر ؛ 0.5 ميكرولتر RNasin [Promega]).
  2. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 500 ميكرولتر العازلة يغسل ويغسل 1X عالية مع الملح العازلة.
  4. غسل 2X مع العازلة يغسل.

6. رابط لربط الحمض النووي الريبي ينتهي 3 '

  1. إزالة بعناية وطاف resuspend الخرز في 20 ميكرولتر مزيج ربط (9 ميكرولتر المياه ؛ 4 ميكرولتر العازلة ربط 4X [200 mMTris - حمض الهيدروكلوريك ؛ MM 40m GCL 2 و 40 ملي dithiothreitol] ؛ 1 ميكرولتر RNA يغاز [NEB] ؛ 0.5 ميكرولتر RNasin [Promega] ؛ 1.5 ميكرولتر قبل adenylated رابط L3 [20 ميكرومتر] ؛ 4 ميكرولتر PEG400 [81170 ، سيغما]).
  2. يحضن بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
  3. إضافة 500 ميكرولتر العازلة يغسل ويغسل ثم 2X مع 1 العازلة عالية من الملح مل.
  4. غسل 2X مع 1 مل العازلة يغسل ويترك في 1 مل من غسل الثانية.
  1. إزالة وطاف resuspend حبات في 8 ميكرولتر من مزيج PNK الساخنة (0.4 ميكرولتر PNK [NEB] ؛ 0.8 ميكرولتر 32 - P - γ ATP ؛ 0.8 ميكرولتر العازلة PNK 10X [NEB] (6) ؛ المياه ميكرولتر).
  2. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. إزالة مزيج PNK الساخنة وresuspend حبات العازلة في 20 ميكرولتر 1X تحميل Nupage (Invitrogen).
  4. على احتضان thermomixer عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. المكان فورا على مغناطيس لترسيب حبات فارغة وتحميل طاف على هلام (راجع الخطوة 8).
  1. تحميل عينات على NuPAGE 4-12 ٪ مكرر تريس هلام (Invitrogen) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام 0.5 لتر من اجتماعات الأطراف 1X تشغيل العازلة (Invitrogen). أيضا تحميل 5 ميكرولتر من علامة حجم البروتين قبل الملون (على سبيل المثال PAGE حاكم زائد ، Fermentas ، SM1811).
  2. تشغيل لمدة 50 دقيقة هلام في 180 V.
  3. إزالة الجبهة جل والتخلص من النفايات الصلبة و(يحتوي على الخطوط المشعة ATP).
  4. نقل البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات من الجل لغشاء النيتروسليلوز باستخدام جهاز نقل Novex الرطب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Invitrogen ، ونقل في 30 ح 1 V).
  5. بعد نقل ، وشطف الغشاء العازلة في برنامج تلفزيوني ، ثم لف في التفاف ساران وتعريضها لفوجي فيلم في -80 درجة مئوية (مكان ملصقا الفلورسنت بجوار الغشاء لمحاذاة في وقت لاحق رانه فيلم وغشاء ؛ أداء التعرض لمدة 30 دقيقة ، وأكثر من ليلة 1H).
  1. عزل بروتين المجمعات الحمض النووي الريبي من التجربة المنخفضة ريبونوكلياز باستخدام صورة الإشعاع الذاتي من الخطوة 8.5 كقناع. قص قطعة من هذا الغشاء إلى شرائح صغيرة عدة ووضعها في microtube مل 1.5.
  2. إضافة 200 PK ميكرولتر العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA) و 10 ميكرولتر بروتيناز K (روش ، 03115828001) إلى قطع الغشاء. احتضان تهتز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من PKurea العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA ؛ 7 M اليوريا) ، واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. جمع الحل وإضافتها معا مع 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الفينول / الكلوروفورم (Ambion ، 9722) إلى المرحلة 2 مل أنبوب جل قفل الثقيلة (713-2536 ، VWR).
  5. احتضان لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية ، والهز في 1100 دورة في الدقيقة. فصل المراحل عن طريق الدوران لمدة 5 دقائق في الدقيقة 13000 في درجة حرارة الغرفة.
  6. نقل الطبقة المائية في أنبوب جديد (يجب الحرص على عدم لمس هلام مع ماصة). إضافة 0.5 glycoblue ميكرولتر (Ambion ، 9510) و 40 م 3 ميكرولتر الصوديوم الهيدروجيني 5.5 وخلات المزيج. ثم إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.
  1. تدور لمدة 20 دقيقة في 15000 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية. إزالة طاف بيليه ويغسل مع 0.5 مل من الايثانول 80 ٪.
  2. Resuspend الكرية 7.25 في الحمض النووي الريبي ميكرولتر / مزيج التمهيدي (6.25 ميكرولتر المياه ؛ 0.5 التمهيدي Rclip ميكرولتر [0.5pmol/μl] ؛ 0.5 ميكرولتر dNTP مزيج [10MM]). لكل تجربة أو تكرار ، واستخدام التمهيدي Rclip مختلفة تحتوي على تسلسل الباركود الفرد (انظر 14).
  3. احتضان لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية قبل التبريد إلى 25 درجة مئوية.
  4. إضافة 2.75 ميكرولتر RT مزيج (2 ميكرولتر العازلة RT 5X ؛ 0.5 ميكرولتر 0.1M DTT ؛ 0.25 ميكرولتر مرتفع الثالث عكس المنتسخة [Invitrogen]).
  5. احتضان 5 دقائق عند 25 درجة مئوية و 20 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، 40 دقيقة عند 50 درجة مئوية و 5 دقائق عند 80 درجة مئوية قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية.
  6. إضافة 90 ميكرولتر TE العازلة ، 0.5 و 10 ميكرولتر glycoblue خلات الصوديوم ميكرولتر الرقم الهيدروجيني 5.5 والمزيج. ثم يضاف 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.
  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend الكريات في 6 ميكرولتر من المياه.
  2. إضافة 6 ميكرولتر 2X العازلة تحميل TBE - اليوريا (Invitrogen). عينات الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 3 دقائق مباشرة قبل التحميل.
  3. تحميل العينات في جل الجاهزة TBE - اليوريا 6 ٪ (Invitrogen) وتشغيل لمدة 40 دقيقة عند 180 V كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. تحميل أيضا علامة منخفضة الوزن الجزيئي لقطع اللاحقة (أنظر أدناه).
  4. قطع ثلاثة نطاقات 120-200 في الإقليم الشمالي (عالية) ، 85-120 الإقليم الشمالي (وسط) والإقليم الشمالي 70-85 (منخفضة). استخدام صبغة theupper وعلامات على دعم هلام البلاستيك لتوجيه الختان (انظر الشكل 3). علما بأن التمهيدي Rclip وتسلسل حساب L3 معا لمدة 52 NT تسلسل CLIP.
  5. إضافة 400 TE ميكرولتر وسحق شريحة هلام الى قطع صغيرة باستخدام حقنة 1 مل المكبس. احتضان تهتز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  6. مكان اثنين من الزجاج 1 سم قبل المرشحات (Whatman ، 1823010) في عمود SpinX Costar (كورننغ إنكوربوريتد ، 8161). نقل الجزء السائل من العينة إلى العمود. تدور ل1 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة في أنبوب مل 1.5.
  7. إضافة 0.5 glycoblue ميكرولتر و 40 ميكرولتر خلات الصوديوم الهيدروجيني 5.5 ، ثم مزج العينة. إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

12. ربط من التمهيدي إلى 5'end من [كدنا]

  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend الكريات في 8 مزيج ربط ميكرولتر (6.5 ميكرولتر المياه ؛ 0.8 ميكرولتر 10X CircLigase الاحتياطي الثاني ؛ 0.4 ​​ميكرولتر 50 ملي MnCl 2 ؛ 0.3 ميكرولتر ؛ Circligase الثاني [Epicentre]) ، واحتضان ل 1 ح عند 60 درجة مئوية.
  2. 30 (26 3 FastDigest ميكرولتر [Fermentas] 1 cut_oligo [10 ميكرومتر]). 1 95 . الحرارة ثم 20 1 مئوية 25 .
  3. Mehr 2 BamHI-Spiele (Fermentas السريع) 30 37 .
  4. TE 50 glycoblue و 0,5 . 10 5,5 250 100 . ، ويعجل أكثر من -20 .
  1. باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspendieren بيليه في 19 ميكرولتر المياه.
  2. PCR (19 [كدنا] (1) P5/P3-Solexa ، 10 لكل منهما ؛ Accuprime 20 ميكرولتر Supermix 1 انزيم [Invitrogen]).
  3. تشغيل البرنامج PCR التالية : 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، [94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية] 25-35 و 68 .
  4. المنتج 8 PCR مع 2 ميكرولتر من 5X FSME العازلة التحميل وتحميل على هلام الجاهزة FSME 6 ٪ (Einladung). Sybrgreen (Invitrogen).
  5. Rclip لعينات مختلفة متعددة قبل تقديم لتسلسل إنتاجية . 15 .

14. رابط والتمهيدي متواليات

قبل adenyliert 3 'الحمض النووي رابط :

[نحن أجل المحول من الحمض النووي من IDT ثم جعل من aliquote 20μM.]

iCLIP : البروتين RNA غشاء (الخطوة 8.5) PCR (الخطوة 13.4). صورة الإشعاع الذاتي من منخفضة ريبونوكلياز ، ينبغي أن ينظر إلى النشاط الإشعاعي المنتشر فوق الوزن الجزيئي للبروتين (الشكل 2 ، نموذج 4). ريبونوكلياز العينات ، ويتركز النشاط الإشعاعي أقرب الوزن الجزيئي للبروتين (الشكل 2 ، نموذج 3). يتم استخدام أي جسم مناعي ، ينبغي عن أية إشارة (الشكل 2 ، وعينات 1 و 2). ضوابط هامة أخرى لخصوصية مناعي إما بحذف اشعة فوق البنفسجية أو استخدام الخلايا التي لا تعبر عن البروتين من الفائدة 14.

PCR (الخطوة 13,4) مجموعة الذي يتوافق مع [كدنا] (عالية أو متوسطة أو منخفضة) 11,4 (الشكل 4 ، الممرات 4-6). PCR P3Solexa P5Solexa 76 NT [كدنا]. يتم استخدام خلال مناعي الكشف عن PCR (الشكل 4 ، والممرات 1-3). التمهيدي المنتج ديمر تظهر في 140 NT.

من أجل تحقيق النتائج ممثل عالية الإنتاجية التسلسل والتحليلات بيوينفورمتيك اللاحقة انظر 14.


1. تمثيل تخطيطي لبروتوكول iCLIP. والبروتينات والحمض النووي الريبي تساهميا المجمعات عبر ربط المجراة اشعة فوق البنفسجية (الخطوة 1). تنقية البروتين في مع الحمض النووي ملزمة (الخطوات 2-5). للسماح لفتيلة محددة تسلسل النسخ العكسي ، ligierte محول RNA إلى 3 'نهاية الحمض النووي الريبي ، في حين أن 5' يسمى بالإشعاع نهاية (الخطوات 6 و 7). عبر ربط البروتين النووي RNA من المجمعات مجانا باستخدام SDS - SEITE ونقل غشاء (الخطوة 8). الجيش الملكي النيبالي من بواسطة هضم البروتين مع بروتين K ترك ببتيد المتبقية في الارتباط عبر النوكليوتيدات (الخطوة 9). (RT) المتبقية ويقدم شطورة الباركود (الخطوة 10). RT . التالية يولد قوالب مناسبة PCR (الخطوات 11-15). ، وارتفاع إنتاجية تولد يقرأ في التسلسل التي تليها مباشرة في تسلسل النوكليوتيدات الباركود من قبل الأخير من [كدنا] (الخطوة 16). منذ هذا الموقف النوكليوتيدات one المنبع من النوكليوتيدات عبر ربط ، يمكن استخلاصه الموقع ملزم مع دقة .


2. C - RNA hnRNP . hnRNP C - RNA C hnRNP (α hnRNP C 3 و 4). وكان يهضم جزئيا باستخدام الحمض النووي الريبي منخفضة (+) أو عالية (+) تركيز ريبونوكلياز. (40 ) (نموذج 4). التحول هو أقل وضوحا استخدمت تركيزات عالية ريبونوكلياز (نموذج 3). المشعة يختفي عندما تم أي جسم في مناعي (عينات 1 و 2).


3. Mehr 6 FSME - (Invitrogen) iCLIP [كدنا]. 40 180 V cDNAs (الضوء والظلام الأزرق) . شفرة حلاقة لقطع (خط أحمر) (H) ، متوسطة (M) ومنخفضة (L) الكسور [كدنا]. بقطع في منتصف صبغ الأزرق الفاتح وعلى الفور فوق علامة على الكاسيت هلام . كسور متوسطة ومنخفضة وتقليم العالية حوالي 1 فوق صبغ اللون الأزرق . تخفيضات العمودي تسترشد الجيوب لفصل المسارات المختلفة (في هذا المثال 1-4). ملطخة (م) أحجام . يشار إلى أحجام جزء على اليمين.


4. PCR - iCLIP [كدنا] . الجيش النيبالي (الشكل 1) وعكس المنقى التي تغيير طبيعة الكهربائي للهلام (الشكل 2). حجم ثلاثة من [كدنا] (عالية [H] : 120-200 الإقليم الشمالي والمتوسطة [M] : 85-120 NT ومنخفضة [L] : 70-85 NT) استردادها zirkularisiert ، وإعادة خطي وتضخيم PCR. PCR الحجم نتيجة لأحجام من كسور . التمهيدي PCR يقدم 76 NT إلى [كدنا] ، وينبغي أن أحجام تتراوح ما بين 196-276 NT عالية ، ، 146-161 الإقليم الشمالي للكسور حجم صغير. PCR عندما تم استخدام أي جسم لمناعي (الممرات 1-3).

Diskussion

iCLIP . على المواقع عبر RNA الحفاظ على واحد أو عناصر كافة مراحل والتحليلات الحسابية . أن تكون هذه الضوابط عدم الأضداد غير عبر ، أو مناعي الخلايا أو الأنسجة خروج . الناحية المثالية ، ينبغي تحكم هذه لا تنقي أي مجمعات البروتين RNA ، وبالتالي ينبغي أن تعطي أي إشارة على SDS - PAGE بعد اكتشاف PCR. عالية الإنتاجية تسلسل هذه التحكم عودة تسلسل فريد قليلة . ينصح الخلايا ضربة قاضية تحكم التسلسل تسلسل الناتجة تقابل ما زال عبر البروتين الذي تتم ضربة بكميات .

الواجب تلوث المنتجات PCR التجارب . وسيلة للحد من هو لفصل السابقة PCR. . على ذلك ، يجب كل عضو استخدام الخاصة بها مجموعة من المخازن والكواشف . في هذه الطريقة ، يمكن تحديد مصادر التلوث .

Offenlegung

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Danksagung

أشكر أعضاء المختبرات Luscombe Zupan . جيمس هادفيلد ونيك ماثيوز عن التسلسل الإنتاجية العالية. إلى iCLIP خطوات CLIP وضعه جنسن JU روبرت . هذا العمل عن طريق منح المجلس الأوروبي للبحوث 206726 - CLIP لJU والطويلة الأجل للعلوم الإنسان حدود الزمالة لبرنامج JK

Materialien

Name Gesellschaft Katalognummer Kommentare
Für Gelelektrophorese und Membrantransfer empfehlen wir die Verwendung von XCell SureLock® Mini-Cell und XCell IIâ Blot Module Kit CE-Zeichen (Invitrogen, EI0002), das mit der Verwendung der verschiedenen vorgefertigten Minigele kompatibel ist, die durchgehend spezifiziert sind das Protokoll. Die Marke und Bestellnummer aller verwendeten Materialien wird während des Protokolls erwähnt. Die Liste der im Protokoll verwendeten Enzyme ist in der folgenden Tabelle aufgeführt.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D Verwenden Sie Protein G für Maus- oder Ziegenantikörper
RNase I Ambion AM2295 Aktivität kann sich von Charge zu Charge ändern
T4-RNA-Ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
Proteinase K Roche-Gruppe 03115828001
Reverse Transkriptase hochgestellt III Invitrogen 18080044
Circligase II Epizentrum Biotechnologie CL9021K
FastDigest® BamHI Fermenten FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 dieser PCR-Mix liefert die besten Ergebnisse in unseren Händen

Verweise

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Erratum

Formale Korrektur: Erratum: iCLIP - Transkriptomweite Kartierung von Protein-RNA-Interaktionen mit individueller Nukleotidauflösung
Gepostet von JoVE-Redakteuren am 14.07.2011. Zitierfähiger Link.

iCLIP – Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution – wurde korrigiert. In Teil 2 von Schritt 3 ist ein Fehler aufgetreten. Eines der Zeichen hatte das falsche Symbol und wurde wie folgt korrigiert:



Bemerkungen:

  1. Derwin

    Es tut mir sehr leid, dass ich Ihnen bei nichts helfen kann. Ich hoffe, sie helfen Ihnen hier.

  2. Merwyn

    Ich stimme zu, das ist eine wunderbare Sache.

  3. Rawlins

    Darin ist etwas. Danke für die Erklärung.

  4. Beldene

    Dieser prächtige Satz muss absichtlich sein

  5. Gared

    Herzlichen Glückwunsch, welche Worte ... wundervoller Gedanke

  6. Delron

    Ich bin endlich, ich entschuldige mich, aber es kommt mir nicht nahe. Ich werde weiter suchen.

  7. Arashura

    Dieser sehr gute Satz muss genau absichtlich sein



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