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7.2: Saccharomyces-Genomdeletionsprojekt - Biologie

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Die Veröffentlichung der Hefegenomsequenz eröffnete Hefegenetikern neue Möglichkeiten. Homologe Rekombination ermöglicht Forschern
ein chromosomales Gen durch ein DNA-Konstrukt ihres eigenen Designs zu ersetzen. Transformierte Zellen, die die Ersatzkassetten in chromosomale DNA eingebaut haben, können durch Selektion auf das Markergen in der Ersatzkassette identifiziert werden.

Die Saccharomyces Genome Deletion Project (SGDP) nutzte diesen Ansatz, um systematisch jeden der vorhergesagten ORFs in der S. cerevisiae Genom mit einer Kanamycin-Resistenz (KANR) Gen. Für jeden ORF verwendeten die Forscher eine Reihe von PCR-Reaktionen (unten), um Kassetten zu konstruieren, in denen die KANR Gen wurde von kurzen DNA-Sequenzen flankiert, die stromaufwärts und stromabwärts des Ziel-ORF auf der S. cerevisiae Chromosom. Die Kassetten wurden dann verwendet, um den Stamm BY4742 (Brachmann et al., 1998). Stämme, die die enthalten hatten KANR Gen wurden auf Platten selektiert, die Analoga von Kanamycin (Winzeler et al., 1999).

Die S. cerevisiae Stämme, die wir in unseren Experimenten verwenden, sind Teil der SGDP-Sammlung von Deletionsmutanten. In diesem Lab verwenden Sie PCR, um zu identifizieren, welche GETROFFEN Gene in Ihren Stämmen zerstört wurden. Die PCR-Primer wurden von der SGDP entworfen und getestet, um die Stammidentitäten zu überprüfen. Zu den verfügbaren Primern gehören zwei genspezifische Primer (GSP) für jeden der GETROFFENGene. Einer der GSPs, GSP Primer A, befindet sich 200-400 bp stromaufwärts des Initiationscodons. Das zweite GSP, GSP Primer B, ist ein Antisense-Primer, der innerhalb des ORF bindet. Wir haben auch einen Antisense-Primer, der 250 bp innerhalb des bindet KANR Gen (KAN Grundierung B).


Genomweite Erzeugung von Hefe-Gendeletionsstämmen

Im Jahr 2001 wird eine Sammlung von Hefestämmen vervollständigt, die in den 6000 offenen Leserastern, die als mutmaßliche Gene durch die erste bioinformatische Analyse des Genoms von Saccharomyces cerevisiae ausgewählt wurden, deletiert werden. Die Sammlung wurde im Rahmen des transatlantischen Hefegen-Deletionsprojekts erstellt, einer Zusammenarbeit von Forschern in den USA, Kanada und Europa. Die europäischen Bemühungen waren Teil von EUROFAN (European Functional Analysis Network), wo einige der Stämme in verschiedene Funktionsanalyseknoten einfließen konnten, die sich mit bestimmten Bereichen der Zellbiologie befassen. Da etwa 40 % der menschlichen Gene, die an Erbkrankheiten beteiligt sind, ein Homolog in Hefe aufweisen und Hefe in verschiedenen Strategien zur Wirkstoffforschung verwendet wird, nicht zuletzt aufgrund der dramatischen Zunahme von Pilzinfektionen, werden diese Stämme für transgenomische Studien wertvoll sein und in spezialisierten Interessenstudien in einzelnen Labors. Eine detaillierte Analyse des Projekts durch das Konsortium ist in Vorbereitung, hier diskutieren wir die Hefestämme, berichteten Ergebnisse und Ansätze zur Nutzung dieser Ressource.


Die gal80 Löschung durch CRISPR-Cas9 in Engineered Saccharomyces cerevisiae Produziert Artemisinsäure ohne Galactose-Induktion

Das Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-Cas-System hat sich als das dominierende Werkzeug für das Genom-Engineering herausgestellt, während es auch die Geschwindigkeit und Effizienz des Metabolic Engineering in konventionellen und nicht-konventionellen Hefen verändert. Unter diesen CRISPR-Cas-Systemen wurde die CRISPR-Cas9-Technologie normalerweise zum Entfernen ungünstiger Zielgene verwendet. Hier haben wir die CRISPR-Cas9-Technologie verwendet, um die gal80 Gen in einem Stamm mit Uracil-Mangel und hatte den manipulierten Saccharomyces cerevisiae die Artemisinsäure ohne Galactose-Induktion produzieren kann. Ein L9(3 4 ) Ein orthogonaler Test wurde durchgeführt, um die Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die Artemisinsäureproduktion zu untersuchen. Als optimale Fermentationsbedingungen wurden Fermentationsmedium III mit Saccharose als Kohlenstoffquelle, 1% Inokulumgehalt und 84 h Kulturzeit identifiziert. Unter dieser Bedingung wird die maximale Artemisininsäureproduktion durch konstruierte S. cerevisiae 1211-2 war 740 mg/l im Schüttelkolben-Kultivierungsniveau. Diese Studie lieferte einen effektiven Ansatz, um den Stoffwechselweg des Artemisinsäure-produzierenden Stamms zu reformieren. Das konstruierte S. cerevisiae 1211-2 kann in Zukunft zur Herstellung von Artemisinsäure durch industrielle Fermentation verwendet werden.

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Die Identifizierung genetischer Determinanten der Methanoltoleranz in Hefe weist auf Unterschiede in den Toxizitätsmechanismen von Methanol und Ethanol und Kandidaten für eine verbesserte Methanoltoleranztechnik hin

Abbildung 1. Vergleich der Wachstumskurven von S. cerevisiae BY4741 in YPD-Medium (pH 4,5) ergänzt oder nicht ( ) mit 5% ( ), 8% ( ), 10% ( ) oder 14% ( v / v ) ( ) Methanol. Das Wachstum wurde in einem Mikroplatten-Lesegerät verfolgt, indem die optische Dichte bei 595 nm einer 96-Well-Platte gemessen wurde, die bei 35 °C mit orbitaler Bewegung für 36 h inkubiert wurde. Abbildung 1. Vergleich der Wachstumskurven von S. cerevisiae BY4741 in YPD-Medium (pH 4,5) ergänzt oder nicht ( ) mit 5% ( ), 8% ( ), 10% ( ) oder 14% ( v / v ) ( ) Methanol. Das Wachstum wurde in einem Mikroplatten-Lesegerät verfolgt, indem die optische Dichte bei 595 nm einer 96-Well-Platte gemessen wurde, die bei 35 °C mit orbitaler Bewegung für 36 h inkubiert wurde.

Diskussion

Trotz der Vielzahl von langen, nicht-kodierenden RNAs, die durch genomweite Ansätze identifiziert wurden, fehlen strenge genetische Studien, die bei der funktionellen Charakterisierung einzelner lncRNAs helfen könnten [2]. Hier machten wir uns die genetische Zugänglichkeit von Hefe zunutze und verwendeten eine Hochdurchsatz-SGA-Methodik, um die GIs von sechs intergenen SUTs systematisch zu katalogisieren. Zunächst verifizierten wir die Nützlichkeit des Ansatzes, indem wir zeigten, dass GIs für die Telomerase-RNA . identifiziert wurden TLC1 reichern GO-Terme entsprechend seiner bekannten zellulären Funktion an. Nachfolgende SGA-Screenings und die Analyse von GI-Profilen implizierten die sechs getesteten intergenen SUTs in verschiedene biologische Prozesse. Eine dieser lincRNAs, SUT457, zeigte GIs, die eine definitive GO-Annotation bereicherten, die sie mit der Telomerbiologie verknüpfte. Eine weitere funktionelle Charakterisierung enthüllte die Rolle von SUT457 bei der Verhinderung der Akkumulation von telomerer ssDNA. Darüber hinaus zeigten phänotypische Rescue-Experimente, dass SUT457 in trans um die physiologischen Spiegel der telomeren ssDNA aufrechtzuerhalten. Unsere Arbeit zeigt, dass eine systematische Kartierung der GIs von lncRNAs diese Moleküle mit spezifischen biologischen Prozessen in Verbindung bringen und ihre individuellen Funktionen lokalisieren könnte.

In Hefe wurde die Funktion identifizierter lncRNAs hauptsächlich mit der Regulation der Genexpression in Verbindung gebracht. Die meisten bisher charakterisierten lncRNAs regulieren ihre verwandten Gene entweder durch transkriptionelle Interferenz [23, 24, 66] oder durch Modulation ihrer lokalen Chromatinstruktur [19–22]. Neuere Beweise deuten jedoch darauf hin, dass lncRNAs über die Genregulation hinaus eine Rolle spielen könnten [42]. Die GO-Anreicherungsprofile der getesteten intergenen SUTs haben sie mit nuklearen Funktionen wie DNA-Reparatur, Meiose und Telomerorganisation verbunden, aber auch mit zytoplasmatischen Prozessen wie Membranfusionen und Vesikelbildung, z SUT042 (Abb. 2a). Letztere Beobachtung stimmt mit der Tatsache überein, dass eine große Anzahl von SUTs in das Zytoplasma transportiert wird und vorgeschlagen wurde, funktionelle Transkripte innerhalb dieses Zellkompartiments zu repräsentieren [18]. Darüber hinaus werden humane lncRNAs mit zytoplasmatischen Membranproteinen koexprimiert [67] und sind in extrazellulären Vesikeln vorhanden [68]. Daher ist eine zukünftige eingehende Charakterisierung von lincRNAs, wie SUT042, könnte die Rolle dieser Moleküle bei zytoplasmatischen Prozessen wie der Vesikelbiogenese und dem Handel aufklären.

Nur seltene Beispiele von trans-wirkende Hefe-lncRNAs wurden bisher beschrieben. Insbesondere die PHO84 Antisense-lncRNAs und ein kryptisches instabiles Transkript, das mit Ty1-Retrotransposons assoziiert ist, kontrollieren die transkriptionelle Abschaltung ihrer Zielgene in trans [69, 70]. Wir zeigen hier, dass GI-Profiling neben dem Rückschluss auf ihre biologische Funktion auch Erkenntnisse über die Wirkungsweise von lincRNAs liefern könnte. Dies wird durch den Vergleich der GI-Profile von lincRNAs mit denen ihrer benachbarten proteinkodierenden Gene erreicht. Zum Beispiel, TLC1 hat ein GI-Netzwerk, das sich vollständig von dem seiner vor- und nachgelagerten Gene unterscheidet (Abb. 2b), was damit übereinstimmt, dass TLC1 hat eine Funktion, die nichts mit seinen Nachbarn zu tun hat und handelt in trans an Chromosomenenden [71]. Ähnlich, SUT457 und SUT042 haben unterschiedliche GO-Profile im Vergleich zu ihren Nachbargenen (Abb. 2c und Zusatzdatei 7: Abbildung S2), was darauf hindeutet, dass diese SUTs auch in trans. Entsprechend, SUT457 Deletion beeinflusst nicht die Expression ihrer Nachbargene (Abb. 3b) und reguliert einen Telomerprozess, der distal von seiner Transkriptionsstelle stattfindet (Abb. 5). Es besteht jedoch immer noch die Möglichkeit, dass die SUT457 Locus befindet sich in der Nähe eines Gens, das an der Verarbeitung des Telomerendes innerhalb der dreidimensionalen Architektur des Genoms beteiligt ist. Daher ist in einem solchen Szenario SUT457 würde eine Rolle bei der Verarbeitung des Telomerendes spielen, indem er sein räumlich proximales Gen kontrolliert. Dennoch ist die phänotypische Rettung durch die Expression von SUT457 von einem anderen Chromosom (Abb. 5) macht dieses Szenario eher unwahrscheinlich. Drei der anderen getesteten intergenen SUTs (SUT014, SUT451 und SUT469) weisen GIs mit GO-Anreicherungsprofilen auf, die mit denen ihrer flankierenden Gene überlappen (zusätzliche Datei 7: Abbildung S2), was darauf hindeutet, dass diese lincRNAs an der Regulation ihrer benachbarten Gene in . beteiligt sein könnten cis. Natürlich können wir an dieser Stelle die Wahrscheinlichkeit nicht ausschließen, dass die Konstruktion dieser drei SUT-Deletionen zu einem Nachbargeneffekt führt [54, 55], der für die beobachtete Überlappung zwischen angereicherten GO-Profilen verantwortlich sein könnte (Zusatzdatei 7: Abbildung S2). Wir stellen fest, dass zwei der sechs getesteten intergenen SUTs (SUT042 und SUT457) weisen GI-Profile auf, die mit a . übereinstimmen trans-wirkende Rolle, und daher erwarten wir im Gegensatz zu gegenwärtigen Beweisen in der Literatur, dass eine beträchtliche Anzahl von knospenden Hefe-lincRNAs an Stellen distal von ihrem Syntheseort wirken würde.

Mangel an SUT457 zeigte eine beschleunigte Seneszenz in Telomerase-negativen Zellen (Abb. 3e und zusätzliche Datei 9: Abb. S4), verbunden mit einer verstärkten Telomerverkürzung (Abb. 3f) und einer Akkumulation im telomeren ssDNA-Überhang (Abb. 4a). Interessanterweise wurden analoge Phänotypen für Mutationen von Faktoren berichtet, die am Schutz des Telomerendes beteiligt sind [38, 40, 41, 52]. In Übereinstimmung mit den obigen Beobachtungen, SUT457 zeigt einen positiven GI mit dem Telomer-Capping-Faktor YKU70 (Abb. 3c und Zusatzdatei 12: Abbildung S7), was bedeutet, dass diese beiden Moleküle denselben molekularen Prozess beeinflussen [46]. Insbesondere bindet Yku70 an Telomere und schützt sie vor der nukleolytischen Exo1-Prozessierung, wodurch die Akkumulation eines telomeren ssDNA-Überhangs verhindert wird [30, 37, 64]. Unsere Daten zeigen auch, dass die Exo1-Nuklease für den in Abwesenheit von SUT457 nachgewiesenen Anstieg der telomeren ssDNA erforderlich ist ( 4d und e). Darüber hinaus in Übereinstimmung mit der Tatsache, dass EXO1-abhängige Akkumulation von telomerer ssDNA induziert den Zellzyklusarrest [37, 72], zeigen wir, dass der Verlust des telomeren ssDNA-Maskierungsproteins Gbp2 in sut457Δ Zellen führt nach der Subkultivierung zu einer Wachstumshemmung (Fig. 4c) und, was wichtig ist, wird dieser Wachstumsarrest durch Deletion von . gerettet EXO1 (Zusätzliche Datei 11: Abbildung S6). Basierend auf den obigen Beweisen spekulieren wir, dass SUT457 in einem Weg funktioniert, der Telomer-Enden vor nukleolytischer Prozessierung schützt, um die Höhe der telomeren ssDNA-Überhänge zu regulieren. Interessanterweise wurde auch die Telomer-assoziierte lncRNA-Telomer-Repeat-enthaltende RNA an diesem Stoffwechselweg beteiligt, erleichtert aber stattdessen die Nukleaseaktivität von Exo1 an den Chromosomenenden [73].

Die primäre Nukleotidsequenz von SUT457 (Zusätzliche Datei 6: Tabelle S5) zeigt keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit anderen Regionen innerhalb der S. cerevisiae Genom und ist selbst bei eng verwandten Hefearten nicht konserviert ([11] und Daten nicht gezeigt). Angesichts seiner enthüllten Rolle im fundamentalen und konservierten zellulären Prozess der Telomer-Überhang-Homöostase [35] glauben wir jedoch, dass funktionelle Analoga von SUT457 in anderen Eukaryoten existieren könnten. Ebenso ist TLC1 eine lncRNA, deren Primärsequenz evolutionär nicht konserviert ist, die aber in anderen Organismen funktionelle Analoga aufweist [26].


Verweise

Kell, D. B. Metabolomik, Modellierung und maschinelles Lernen in der Systembiologie: zum Verständnis der Sprachen von Zellen. Theodor Bücher-Vorlesung 2005. FEBS J. 273, 873–894 (2006).

Arakawa, K., Yamada, Y., Shinoda, K., Nakayama, Y. & Tomita, M. GEM System: automatisches Prototyping von zellweiten Stoffwechselwegmodellen aus Genomen. BMC Bioinformatik 7, 168 (2006).

Palsson, B.Ø. Systembiologie: Eigenschaften rekonstruierter Netzwerke. (Cambridge University Press, Cambridge 2006).

Duarte, N. C. et al. Globale Rekonstruktion des menschlichen Stoffwechselnetzwerks basierend auf genomischen und bibliomischen Daten. Proz. Nat. Akad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 104, 1777–1782 (2007).

Mager, W. H. & Winderickx, J. Hefe als Modell für die medizinische und medizinische Forschung. Trends Pharmacol. Wissenschaft 26, 265–273 (2005).

Goffeau, A. et al. Leben mit 6000 Genen. Wissenschaft 274, 546–567 (1996).

Winzeler, E. A. et al. Funktionelle Charakterisierung der S. cerevisiae Genom durch Gendeletion und parallele Analyse. Wissenschaft 285, 901–906 (1999).

Giaever, G. et al. Funktionsprofilierung der Saccharomyces cerevisiae Genom. Natur 418, 387–391 (2002).

Yen, K., Gitsham, P., Wishart, J., Oliver, S. G. & Zhang, N. Eine verbesserte tetO-Promotor-Ersatzsystem zur Regulierung der Expression von Hefegenen. Hefe 20, 1255–1262 (2003).

Hughes, T. R. et al. Funktionelle Entdeckung durch ein Kompendium von Expressionsprofilen. Zelle 102, 109–126 (2000).

Allen, J. K. et al. Hochdurchsatz-Charakterisierung von Hefemutanten für die funktionelle Genomik mittels metabolischer Fußabdrücke. Nat. Biotechn. 21, 692–696 (2003).

Zhu, H. et al. Globale Analyse von Proteinaktivitäten mit Proteomchips. Wissenschaft 293, 2101–2105 (2001).

Castrillo, J. I. et al. Wachstumskontrolle der Eukaryotenzelle: eine systembiologische Studie in Hefe. J. Biol. 6, 4 (2007).

Delneri, D. et al. Identifizierung und Charakterisierung von High-Flux-Kontrollgenen von Hefen durch Kompetitionsanalysen in kontinuierlichen Kulturen. Nat. Genet. 40, 113–117 (2008).

Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K. & Oliver, S.G. Globale Analyse der Nährstoffkontrolle der Genexpression in Saccharomyces cerevisiae während des Wachstums und des Hungers. Proz. Nat. Akad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 101, 3148–3153 (2004).

Oliver, S. Ein Netzwerkansatz zur systematischen Analyse der Genfunktion. Trends Genet. 12, 241–242 (1996).

Suter, B., Auerbach, D. & Stagljar, I. Hefebasierte funktionelle Genomik- und Proteomik-Technologien: die ersten 15 Jahre und darüber hinaus. Biotechniken 40, 625–644 (2006).

Förster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B.Ø. & Nielsen, J. Genom-skalige Rekonstruktion der Saccharomyces cerevisiae metabolisches Netzwerk. Genom-Res. 13, 244–253 (2003).

Duarte, N. C., Herrgard, M. J. & Palsson, B. Ø. Rekonstruktion und Validierung von Saccharomyces cerevisiae iND750, ein vollständig unterteiltes Stoffwechselmodell auf Genom-Ebene. Genom-Res. 14, 1298–1309 (2004).

Kuepfer, L., Sauer, U. & Blank, L.M. Metabolic Functions of Duplicate Genes in Saccharomyces cerevisiae. Genom-Res. 15, 1421–1430 (2005).

Caspi, R. et al. MetaCyc: eine Multiorganismus-Datenbank von Stoffwechselwegen und Enzymen. Nukleinsäuren Res. 34, D511–D516 (2006).

Hucka, M. et al. Die Systembiologie-Markup-Sprache (SBML): ein Medium zur Darstellung und zum Austausch biochemischer Netzwerkmodelle. Bioinformatik 19, 524–531 (2003).

Le Novère, N. et al. In der Annotation biochemischer Modelle (MIRIAM) geforderte Mindestangaben. Nat. Biotechn. 23, 1509–1515 (2005).

akir, T. et al. Die Integration von Metabolomdaten mit metabolischen Netzwerken zeigt Reporterreaktionen. Mol.-Nr. Syst. Biol. 2, 50 (2006).

Kümmel, A., Panke, S. &. Heinemann, M. Mutmaßliche regulatorische Stellen, die durch netzwerk-eingebettete thermodynamische Analyse von Metabolomdaten entschlüsselt wurden. Mol.-Nr. Syst. Biol. 2, 2006.0034 (2006).

Reed, J. L., Vo, T. D., Schilling, C. H. & Palsson, B. Ø. Ein erweitertes Genom-Scale-Modell von Escherichia coli K12 (iJR904 GSM/GPR). Genom Biol 4, R54 (2003).

Förster, J., Famili, I., Palsson, B.Ø. & Nielsen, J. Groß angelegte Bewertung von in silico Löschungen in Saccharomyces cerevisiae. OMICS 7, 193–202 (2003).

Kanehisa, M. et al. Von der Genomik bis zur chemischen Genomik: Neuentwicklungen bei KEGG. Nukleinsäuren Res. 34, D354–D357 (2006).

Nash, R. et al. Erweiterte Proteininformationen bei SGD: neue Seiten und Proteombrowser. Nukleinsäuren Res. 35, D468–D471 (2007).

Caspi, R. et al. Die MetaCyc-Datenbank von Stoffwechselwegen und Enzymen und die BioCyc-Sammlung von Pathway/Genom-Datenbanken. Nukleinsäuren Res. 36, D623–D631 (2008).

Li, X. J. et al. in Metabolisches Profiling: seine Rolle bei der Entdeckung von Biomarkern und der Analyse der Genfunktion. (Hrsg. Harrigan, G. G. & Goodacre, R.) 293–309 (Kluwer Academic Publishers, Boston, 2003).

Goble, C.& Wroe, C. Die Montagues und die Capulets. Komp. Funktion Genomik 5, 623–632 (2004).

Ananiadou, S., Kell, D. B. & Tsujii, J. Text Mining und seine potentiellen Anwendungen in der Systembiologie. Trends Biotechnologie. 24, 571–579 (2006).

Poolman, M. G., Bonde, B. K., Gevorgyan, A., Patel, H. H. & Fell, D. A. Herausforderungen bei der Rekonstruktion von Stoffwechselnetzwerken aus öffentlichen Datenbanken. Syst. Biol. (Stevenage) 153, 379–384 (2006).

Spasić, I. et al. Erleichterung der Entwicklung kontrollierter Vokabulare für die Metabolomik mit Text Mining. BMC Bioinformatik 9, S5 (2008).

Williams, A. J. Internetbasierte Tools für die Kommunikation und Zusammenarbeit in der Chemie. Drogen-Disc. Heute 13, 502–506 (2008).

Williams, A. J. Eine Perspektive öffentlich zugänglicher/frei zugänglicher Chemiedatenbanken. Drogen-Disc. Heute 13, 495–501 (2008).

Ma, H. et al. Die Rekonstruktion des menschlichen metabolischen Netzwerks in Edinburgh und ihre funktionelle Analyse. Mol.-Nr. Syst. Biol. 3, 135 (2007).

Brooksbank, C., Cameron, G. & Thornton, J. Die Datenressourcen des European Bioinformatics Institute: in Richtung Systembiologie. Nukleinsäuren Res. 33, D46–D53 (2005).

Wheeler, D. L. et al. Datenbankressourcen des National Center for Biotechnology Information. Nukleinsäuren Res. 35, D5–D12 (2007).

Weininger, D. SMILES, ein chemisches Sprach- und Informationssystem. 1. Einführung in Methodik und Kodierungsregeln. J.Chem. Inf. Berechnen. Wissenschaft 28, 31–36 (1988).

Coles, S. J., Day, N. E., Murray-Rust, P., Rzepa, H. S. & Zhang, Y. Verbesserung des Chemical Semantic Web durch die Verwendung von InChI-Identifikatoren. Org. Biomol. Chem.-Nr. 3, 1832–1834 (2005).

Wishart, D. S. et al. HMDB: die Datenbank des menschlichen Metaboloms. Nukleinsäuren Res. 35, D521–D526 (2007).

Das UniProt-Konsortium. Die universelle Proteinquelle (UniProt). Nukleinsäuren Res. 36, D190–D195 (2008).

Ashburner, M. et al. Gene Ontology: Werkzeug zur Vereinheitlichung der Biologie. Nat. Genet. 25, 25–29 (2000).

Sud, M. et al. LMSD: LIPID MAPS-Strukturdatenbank. Nukleinsäuren Res. 35, D527–D532 (2007).

Barabasi, A.-L. & Oltvai, Z. N. Netzwerkbiologie: Verständnis der funktionellen Organisation der Zelle. Nat. Rev. Genet. 5, 101–113 (2004).

Wagner, A. & Fell, D.A. Die kleine Welt in großen Stoffwechselnetzwerken. Proz. R. Soc. London, B, Biol. Wissenschaft 268, 1803–1810 (2001).

Hoops, S. et al. COPASI: ein COMplex PAthway-Simulator. Bioinformatik 22, 3067–3074 (2006).

Vallabhajosyula, R. R., Chickarmane, V. &. Sauro, H. M. Konservierungsanalyse großer biochemischer Netzwerke. Bioinformatik 22, 346–353 (2006).

Shannon, P. et al. Cytoscape: eine Softwareumgebung für integrierte Modelle biomolekularer Interaktionsnetzwerke. Genom-Res. 13, 2498–2504 (2003).

Funahashi, A., Tanimura, N., Morohashi, M. & Kitano, H. CellDesigner: ein Prozessdiagramm-Editor für Genregulation und biochemische Netzwerke. BIOSILICO 1, 159–162 (2003).

Li, P., Oinn, T., Soiland, S. & Kell, D.B. Automatisierte Manipulation von systembiologischen Modellen mit libSBML in Taverna-Workflows. Bioinformatik 24, 287–289 (2008).

Bornstein, B. J., Keating, S. M., Jouraku, A. & Hucka, M. LibSBML: eine API-Bibliothek für SBML. Bioinformatik 24, 880–881 (2008).

Surowiecki, J. Die Weisheit der Massen: Warum die Vielen schlauer sind als die Wenigen (Abakus, London, 2004).

Tapscott, D. & Williams, A. Wikinomics: Wie Massenkollaboration alles verändert (Neues Paradigma, Toronto, 2007).

Palsson, B. Zweidimensionale Annotation von Genomen. Nat. Biotechn. 22, 1218–1219 (2004).

Whelan, K. E. &. King, R.D. Verwendung eines logischen Modells zur Vorhersage des Hefewachstums. BMC Bioinformatik 9, 97 (2008).

Blank, L. M., Kuepfer, L. &. Sauer, U. Eine groß angelegte 13 C-Fluss-Analyse zeigt mechanistische Prinzipien der Robustheit des metabolischen Netzwerks gegenüber Nullmutationen in Hefe. Genom Biol. 6, R49 (2005).

Kell, D. B. Systembiologie, metabolische Modellierung und Metabolomik in der Wirkstoffforschung und -entwicklung. Drogen-Disc. Heute 11, 1085–1092 (2006).

Nookaew, I. et al. Das Stoffwechselmodell iIN800 auf Genomskala von Saccharomyces cerevisiae und seine Validierung: ein Gerüst zur Abfrage des Fettstoffwechsels. BMC-System. Biol. 2, 71 (2008).


Großflächige phänotypische Bildschirme

Der folgende Abschnitt beleuchtet verschiedene Anwendungen der YKO-Kollektion und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit.

Zellwachstum

Ein Screening der heterozygoten und homozygoten Deletionssammlungen ergab, dass ∼3% der Gene in Rich Media haploinsuffizient sind (Deutschbauer et al. 2005). Dieses Ergebnis hat wichtige Konsequenzen für gepoolte Screens der heterozygoten Deletionssammlung, da 97% aller Heterozygoten ohne Störung keinen nachweisbaren Phänotyp zeigen und dass die Verlängerung der Anzahl der Wachstumsgenerationen eine größere Sensitivität und einen größeren Dynamikbereich realisiert. Der Fitnessdefekt (3–5%) der meisten haploinsuffizienten Heterozygoten ist ungefähr eine Größenordnung kleiner als bei ihren haploiden oder homozygoten Gegenstücken (10–50%). Über die Hälfte der 3% der haploinsuffizienten Gene sind funktionell verwandt oder für die ribosomale Funktion angereichert (Deutschbauer et al. 2005). Die Autoren spekulierten, dass dies auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die ribosomale Funktion unter Bedingungen schnellen Wachstums in reichen Medien geschwindigkeitsbeschränkend wird. Diese Hypothese wurde durch die Beobachtung gestützt, dass viele der haploinsuffizienten Mutanten im Minimalmedium keinen Wachstumsphänotyp mehr zeigten, in dem alle Stämme langsamer wachsen. Somit scheint es, dass die Hauptursache für Haploinsuffizienz unter idealen Wachstumsbedingungen in einer unzureichenden Proteinproduktion liegt.

Andere Wachstums-/Fitness-Assays der Deletionssammlung bewerteten Phänotypen wie die Zellgröße. Jörgensen et al. (2002) identifizierten 500 kleine (whi) oder große (lge) Mutanten und enthüllten ein Netzwerk von Genprodukten, die die Zellgröße am „Start“ kontrollieren, dem Punkt im Zellzyklus, an dem sich Zellen in den nächsten Zellzyklus begeben. Diese Studie zeigte die enge Beziehung zwischen Ribosomenbiogenese und Zellgröße, die durch den Transkriptionsfaktor Sfp1 vermittelt wird. Ein Assay der Zellgröße aller nicht-essentiellen homozygoten und aller 1166 essentiellen heterozygoten Deletionsmutanten identifizierte einen viel kleineren Satz von 49 Genen, die die Zellgröße dramatisch verändern, von denen 88% menschliche Homologe haben (Zhang et al. 2002), was das bemerkenswert hohe Maß an Konservierung in den Kontrollgenen des Kernzellzyklus unterstreicht.

Paarung, Sporulation und Keimung

Der erste genomweite Screening auf Sporulations- und Keimungsdefekte verdoppelte die Zahl der an der Sporulation beteiligten Gene (Deutschbauer et al. 2002). Unter diesen 400 Genen befinden sich sowohl positive als auch negative Regulatoren, darunter Gene, die an der Autophagie, Kohlenstoffverwertung und Transkription sowie an der Rekombination und Chromosomensegregation beteiligt sind. Ein Vergleich dieses phänotypischen Assays mit zuvor veröffentlichten Expressionsassays ergab, dass 16% der unterschiedlich exprimierten Sporulationsgene die Sporenproduktion beeinflussen, was wiederum den häufigen Mangel an Korrelation zwischen der Regulation der Genexpression und dem Phänotyp zeigt.

Ein Screening auf Keimungsmutanten (Kloimwieder und Winston 2011) lieferte eine aktualisierte Liste der Gene, die an der Keimung beteiligt sind, und enthüllte zwei neue Gene, die zuvor nicht an der Keimung beteiligt waren (Kloimwieder und Winston 2011), was die Nützlichkeit von erneuten und wiederholten Screens, die an der Deletionssammlung durchgeführt wurden, demonstriert um zuvor gesammelte Datensätze zu bestätigen und zu erweitern.

Membranhandel

Hefezellen sind stark auf ein komplexes Zusammenspiel von Vesikelbildung, Transport und Recycling angewiesen, um die zelluläre Organisation und Homöostase aufrechtzuerhalten und ihre Reaktion auf Umweltveränderungen abzupuffern. Die Bedeutung des richtigen Membranverkehrs wird durch die Allgegenwart von Genen mit Defekten in diesem Prozess in den Ergebnissen fast aller genomweiten Deletions-Screenings demonstriert. Die Anreicherung dieser Mutanten ist besonders offensichtlich bei Screens auf Drogen- und Umweltstörungen.

Mehrere Screens konzentrierten sich auf bestimmte Aspekte des Membran- und Vesikeltransports. Ein Screening der haploiden nichtessentiellen Deletionssammlung auf Mutanten, die für den endosomalen Transport defekt sind, identifizierte die VPS55/68 Sortierkomplex als Hauptakteur in diesem Prozess (Schluter et al. 2008). Ein Screening der Sammlung nicht essentieller haploider Mutanten identifizierte 87 Gene, die für die intrazelluläre Retention des ER-Chaperons erforderlich sind Kar2, darunter eine Reihe von Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie an der Modifikation und Sortierung von sekretorischen Proteinen beteiligt sind (Copic et al. 2009).

Membranverkehr und -dynamik sind eng mit der Vakuole verbunden, dem funktionellen Äquivalent des Säugetier-Lysosoms. Jüngste Studien zeigen, dass diese multifunktionale Organelle für die Proteinsortierung, die Ansäuerung der Organellen, die Ionenhomöostase, die Autophagie und die Reaktion auf Umweltstress essentiell ist. Darüber hinaus bietet die Vakuole der Zelle mehrere Optionen für den Umgang mit und die Entgiftung von Xenobiotika und Medikamenten (zur Übersicht Li und Kane 2009). Beispielsweise wurde die vakuoläre H+ ATPase in zwei groß angelegten Studien (Parsons et al. 2004 Hillenmeyer et al. 2008).

Ausgewählte Umweltbelastungen

Ungefähr 20 % der Screenings der Hefedeletionssammlung konzentrierten sich auf die Reaktion auf Umweltstress, einschließlich Hitzeschock, oxidativer Stress, schwacher Säure- und Ionenstress und osmotischer Schock (Gasch et al. 2000). Ähnliche genomische Expressionsmuster als Reaktion auf eine Vielzahl von Umweltstressbedingungen wurden beobachtet (Gasch et al. 2000), aber analoge Studien mit den Hefe-Deletionssammlungen beobachteten das Gegenteil, indem sie Gene identifizierten, die einzigartig erforderlich sind, um diversen Belastungen zu widerstehen. Die Grundlage für die Diskrepanz zwischen Genexpression und Genen, die zur Stressresistenz benötigt werden, bleibt ein Rätsel.


Abstrakt

Isoprenol (3-Methyl-3-buten-1-ol) ist ein wertvoller Drop-in-Biokraftstoff und ein wichtiger Vorläufer mehrerer Grundchemikalien. Kürzlich wurden synthetische mikrobielle Systeme unter Verwendung des heterologen Mevalonat-Wegs zur Herstellung von Isoprenol in Escherichia coli, und eine signifikante Verbesserung von Ausbeute und Titer wurde durch ein Jahrzehnt der Forschung erreicht. Saccharomyces cerevisiae wurde in der Biotechnologie-Industrie häufig für die Isoprenoid-Produktion verwendet, aber es wurde kein gutes Beispiel für die Isoprenol-Produktion in diesem Wirt berichtet. In dieser Studie haben wir die angehende Hefe entwickelt S. cerevisiae zur verbesserten Biosynthese von Isoprenol. Der mit dem Mevalonat-Weg konstruierte Stamm erreichte eine Isoprenol-Produktion mit einem Titer von 36,02 ± 0,92 mg/l im Kolben. Der IPP (Isopentenyldiphosphat)-Bypass-Weg, der eine effizientere Isoprenol-Produktion gezeigt hat, indem die Akkumulation des toxischen Zwischenprodukts in E coli, wurde auch gebaut in S. cerevisiae und verbesserte den Isoprenol-Titer um das 2-fache. Wir entwickelten die Stämme weiter, indem wir eine promiskuitive endogene Kinase löschten, die den Stoffwechselfluss von der Isoprenol-Produktion ablenken und den Titer auf 130,52 ± 8,01 mg/L verbesserten. Schließlich identifizierten wir mittels Metabolomics-Analyse einen Engpass im Stoffwechselweg und überexprimierten eine promiskuitive alkalische Phosphatase, um diesen Engpass zu beseitigen. Die kombinierten Bemühungen führten zu einer Titerverbesserung auf 383,1 ± 31,62 mg/L im Kolben. Dies ist der bisher höchste Isoprenol-Titer in S. cerevisiae und diese Arbeit liefert die Schlüsselstrategien, um Hefe als industrielle Plattform für die Isoprenol-Produktion zu entwickeln.


Pilze (Hefen und andere)

Suchen Sie nach Informationen über die spleißosomalen Introns der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Finden Sie genomische Sequenzdaten sowie Gen- und Proteininformationen für Aspergilli.

Suchen und analysieren Sie genomische Daten, die aus Aspergillus-Arten extrahiert wurden.

Eine biologische Ressource, die die relevantesten Informationen zu Genen und Proteinen sammelt, die an Prozessen des menschlichen und Hefezellzyklus beteiligt sind.

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Yeast nitrogen utilization under wine fermentative conditions

Several reviews exist that focus on yeast nitrogen sensing, signalling, transport, assimilation and metabolism [27,28,29,30,31,32,33,34,35]. A general conclusion is that yeast growth rate is not only associated with the amount of available nitrogen, but also with the quality of the nitrogen source [18, 27]. Thus, nitrogen sources sustaining high growth rate such as glutamine, glutamate, asparagine and ammonium are considered as preferred, whereas proline, allantoin and urea allows slow growth rate and, therefore, are considered as non-preferred nitrogen sources [28].

Nitrogen can be found in various forms in grape must, with yeast consuming mainly ammonium and amino acids from them, the main amino acids present are proline, arginine, alanine, glutamate, glutamine, serine and threonine, in addition to ammonia [36]. Moreover, in wine fermentation context these nitrogen sources are consumed following a specific order, where asparagine, threonine, glutamine, leucine, histidine, methionine, isoleucine, serine, glycine and phenylalanine are utilized at the beginning of the fermentation, while ammonium, valine, arginine, alanine, tryptophan and tyrosine are preferred at later times [37]. This preference for different nitrogen sources is the aftermath of a tight metabolic regulation system where four different mechanisms regulate nitrogen utilization: Ssy1-Ptr3-Ssy5 system (SPS), nitrogen catabolic repression (NCR), retrograde signalling pathway (RTG) and the general control of amino acids (GAAC) with all of them in turn regulated by the TORC1 signalling pathway [29, 30].

Under nitrogen limited conditions, yeast cells grow slowly, reducing the ribosome biogenesis, protein translation and arresting the cell cycle in G1 [38]. There are a couple of excellent reviews covering this topic in wine fermentation context [18, 21, 26], mainly focused on studies that used media containing a mixture of different nitrogen sources mimicking natural grape musts. Remarkably, several groups around the world have shown that the nitrogen requirements of S. cerevisiae are strain-dependent, i.e. different yeast strains have different necessities of nitrogen, and then have different capacities to growth and perform wine fermentation in nitrogen-limited musts [39,40,41,42,43]. In this context, the wide phenotypic diversity observed in S. cerevisiae for nitrogen requirements is probably a consequence of its genetic diversity, being an important challenge to disentangle this diversity.

Yeast genetic diversity

Genome sequencing and population structure

As abovementioned, S. cerevisiae is a model organism with its genome fully sequenced since 1996 [1]. Since then, different attempts have been made to unveil the genetic diversity and population structure of the species. The first attempts to unveil the genetic diversity present in S. cerevisiae were done sequencing individual genes and using molecular markers, which showed the presence of two main yeast populations: domesticated yeasts associated with human activities (wine, beer, bread, etc.) and wild yeasts from natural environments without human intervention [44,45,46].

These two populations reflect different evolutionary trajectories, for instance, wine yeasts have been selected by centuries of human activity, preferring traits such as ethanol production and fruity flavours and fragrances while wild yeasts have faced challenging environments with scarcity of carbon and nitrogen sources [47]. Furthermore, this divergent track of selection was confirmed by assaying the ability of wild yeasts to growth in a wide range of carbon and nitrogen sources, which contrasts with the limited nitrogen and carbon sources sustaining growth in wine yeasts [48].

After these first attempts, the population structure of S. cerevisiae was finally resolved by genome sequencing of 37 yeast strains isolated from different ecological niches, demonstrating the presence of five clean lineages or subpopulations in the species: Malaysian (MA), Sake (SA), North American (NA), West African (WA) and Wine/European (WE) [49, 50]. Afterward, the genome sequencing of 100 yeast strains confirmed the presence of these five clean lineages (MA, NA, SA, WA and WE) in the population structure of S. cerevisiae [51]. Interestingly, the information obtained by these and other sequencing efforts has revealed unique sets of genetic features related with yeast strains specific niche adaptation, often absent in the reference genome, some of them acquired by horizontal gene transfer events from distant species or by introgression from closely relative ones [52,53,54,55,56,57,58].

Recently, the “1002 yeast genomes project” has been finished, representing the most complete catalogue of the genetic variation in S. cerevisiae, where a population of 1011 yeast strains isolated from different ecological niches has been sequenced [59]. In the “1011 population”, a total of 26 clades were described, expanding the number of phylogenetic clusters initially observed in the species of them, 362 isolates were grouped into the WE cluster [59]. Additionally, the sequencing of this huge population confirmed that isolates from Asia have the greatest genetic diversity within the species [59, 60]. Nowadays, the repertory of yeast strains with sequenced genomes includes wild isolates from environments such as tree bark and flowers, and domesticated isolates from clinical, dairy, cheese, brewery and vineyard environments (among others) [49, 51, 54, 59,60,61,62] with the “1011 yeasts population” including most the genetic variation existing in S. cerevisiae and becoming a powerful resource for genotype–phenotype correlations [59].

Phenotype–genotype correlation by QTL mapping

The extensive knowledge and information generated by the sequencing projects in S. cerevisiae has been accompanied by massive phenotyping efforts under different culture conditions, showing that phenotypic variation is wider than genotypic diversity in the species [63, 64]. This observation suggests that yeast has a broad phenotypic plasticity and, more importantly, that multiple genes contributes to most of the phenotypes studied, which are commonly refers as polygenic traits or complex traits [65].

QTL mapping has been the main experimental approximation to fill the gap between genotype and phenotype in yeast [66]. In this approach, a population of individuals derived from a cross is genotyped and phenotyped, allowing the statistical correlation between genotype and phenotype to map genes affecting the trait of interest [67, 68]. This approach has been extensively used in yeast for mapping causatives genes affecting phenotypes such as thermotolerance [69,70,71], chemical resistance [69, 72], translation termination [73] and dehydration stress tolerance [74], among many others, being particularly important in identifying quantitative trait nucleotides impacting technological performances of industrial yeast strains (see [75] for more details in the topic).

In this context, several QTLs have been mapped for phenotypes associated with the fermentation process, such as ethanol production, residual sugar and acidity [76,77,78,79,80], as well as QTLs involved in nitrogen-limited fermentations and in nitrogen consumption and utilization [41, 42, 78, 81,82,83,84,85] (Table 1). Overall, QTL mapping has proved to be an efficient tool for the detection of genes responsible of the phenotypic variation observed in populations generated by crosses, particularly for fermentative phenotypes.

Yeast natural diversity related to low nitrogen adaptation

Nitrogen consumption

Several genes have been linked with yeast strains differences in nitrogen consumption, under laboratory and/or fermentative conditions, not only by QTL mapping but also using other experimental strategies (Table 1). For example, transcriptomic studies have given insights into groups of genes related to nitrogen uptake [86], nitrogen requirements [39] and response to nitrogen availability [87, 88], all of them using wine strains. In other approach, a massive hemizygote analysis showed that the inability of a commercial wine strain to utilize methionine is a consequence of mutations in ADE5,7, ARO8 und VBA3 genes [40]. In a similar way, the use of a wine yeast deletion collection (WYDC) showed that deletion of MFA2 resulted in a decrease in fermentation duration in nitrogen-limited conditions [89].

In a different genetic strategy, allele specific expression (ASE), an approach that allows the study of eQTLs (expression QTLs) through the combination of recombinant populations (as in traditional QTL mapping) and sequencing-based methods (RNA-seq), has also been used in studies that showed that coding and non-coding mutations in ASN1 explains nitrogen consumption differences between different yeast strains [90] and that polymorphisms within the coding region of GDB1 underlie fermentation kinetics differences [91].

Anyway, QTL mapping has been a preferred method for detection of genes linked to industrial-importance phenotypes in general (reviewed in [75]) and nitrogen consumption in particular (Table 1). One strategy has been the use of recombinant populations derived from wine strains. For example, using a recombinant population derived from two wine strains and phenotyped for nitrogen requirements for efficient fermentation, ARG8, BIO3, GCN1 und MDS3 genes were linked to key roles in nitrogen metabolism and signalling [82]. Other study found, utilizing a recombinant population derived from a wine and a laboratory strain, that ABZ1 gene controls the fermentation rate through modulation of nitrogen utilization [76].

In contrast, another useful strategy is to use strains representative of the clean lineages abovementioned for S. cerevisiae [49] as the parental strains of the recombinant populations. Through this approach, several genes have been mapped and validated: AGP1, ASI1 und GLT1 for variation in nitrogen sources consumption underlying differences in the central nitrogen metabolism [41] DAL1, DAL4, RIM15 und PUT4 for nitrogen source use variations [48] and RIM15, this last gene having an antagonistic pleiotropy, with a wine strain allele conferring a greater nitrogen utilization efficiency and glycerol production but also fungicide sensitivity [42].

An alternative to the use of these bi-parental recombinant populations is the utilization of the SGRP-4X population, a multi-parental recombinant population derived from four representative strains from lineages NA, SA, WA and WE [92]. Using this population and a combined strategy of QTL mapping and BSR-seq (bulk segregant RNA-seq), allelic variants in a large set of genes (ARO1, ALP1, ASI2, CPS1, EAP1, GTR1, LYP1, NPR1, PDC1, RPI1, SAP185, SCH9, SIT4 und TOR2) were identified as responsible for nitrogen consumption differences during wine fermentation [81, 83, 85]. Interestingly, half of these genes (EAP1, GTR1, NPR1, SAP185, SCH9, SIT4 und TOR2) are directly linked to the TORC1 signalling pathway in yeast [85].

TORC1 pathway-associated genes

TORC1 signalling pathway is a pleiotropic signalling pathway, conserved through the eukaryotic domain from yeast to humans (where is known as “mTORC1”), that connects nutrient availability with growth, playing a central role in general metabolism regulation, specially linked to nitrogen metabolism [26]. In nitrogen starvation conditions, TORC1 activates autophagy, stress response genes, nitrogen catabolic genes and ammonium permeases on the contrary, it represses protein biosynthesis, amino acid biosynthesis, translation initiation and ribosome biogenesis [28].

One of the major actual challenges in the TORC1 field is to determine exactly how intracellular levels of nitrogen are sensed by the TORC1 complex and how this pathway differentiate between preferred and non-preferred nitrogen sources [29, 30, 93, 94]. In this sense, a recently developed method allows the indirect monitoring of TORC1 activation for hundreds of strains, enabling the study of this phenotype by approaches like QTL mapping [95]. Using these experimental capacities, KAE1 allelic variants were identified to affect both TORC1 activation by glutamine and fermentation kinetics under nitrogen-sufficient and nitrogen-limited wine conditions [84] (Fig. 1).

Central role of TORC1 signalling pathway and importance of wild alleles for yeast nitrogen consumption. The proteins encoded by nitrogen-associated genes identified in the studies summarized in this review are highlighted in colour (green or red). Among them, proteins encoded by genes for which wild alleles cause higher consumption levels for some nitrogen sources are highlighted in red, while the rest are in green

We can add to this last antecedent the fact that that allelic variants of EAP1, GTR1, NPR1, SAP185, SCH9, SIT4 und TOR2, all of them genes directly associated to the yeast TORC1 pathway, underlie differences in ammonium and amino acids consumption under wine fermentation conditions [85] (Fig. 1). Also, allelic variants of RIM15 are involved in nitrogen source use variations [47] and utilization efficiency [41], with Rim15 being downstream TORC1. Thus, the experimental evidence obtained to date reinforces the suggested idea of the importance of this pleiotropic pathway (i.e. a pathway that contribute to the regulation of multiple developmental outcomes) in yeast adaptation to low nitrogen environments in wine fermentation [26]. It this sense, it is well stablished that signalling mechanisms that control development in yeast are highly pleiotropic, implying that perturbations of signalling pathways like TORC1 can manifest in multiple and/or unexpected ways [96].

Wild yeast strains as reservoir of beneficial alleles

Surprisingly, for four of the aforementioned TORC1-related genes (NPR1, SAP185, SCH9 und TOR2), allelic variants from the wild NA strain (which correspond to an oak tree isolate [49]) presented higher consumption levels for certain amino acids (aspartic acid, histidine, glutamine and threonine) [85] (Fig. 1). Conversely, several studies have shown that alleles coming from the domesticated WE strain (which was isolated from a winemaking environment [49]) presented lower consumption levels for particular amino acids in comparison to other strains (NA, SA and WA) [41, 81, 83, 85].

These facts are quite interestingly, because one might thought that the WE strain would be better adapted to wine fermentation conditions that, for example, the NA strain, which is a wild isolate not adapted to this environment [49]. While this is true for ammonium consumption (a nitrogen source regularly in high proportion in grape must [36]), with alleles coming from WE strain causing higher rates of it [85], it is not for the consumption of certain amino acids (as abovementioned). It is still unclear if these amino acids are present in some natural environments (like oak bark) but absent in wine environments and if this is related to the specific demand for each amino acid, information that could help to better understand the differential nitrogen consumption between wine and wild yeast strains.

A possible explanation to this phenomenon is that, while wine yeast strains have been selected by humans for phenotypes directly linked to wine final characteristics (e.g. ethanol production and fermentation kinetics properties), wild yeast strains face environments with nitrogen limitations [47], being able to growth in a wider range of nitrogen sources than wine strains [48]. Therefore, these different evolutionary trajectories between wild and wine yeasts could have led to the existence of different genetic adaptations to nitrogen-limited environments, with wild strains better adapted to this condition, thus being a reservoir of beneficial alleles from an industrial point of view.

However, an alternative explanation is that wine yeasts have high nitrogen requirements because of the production of high concentrations of ethanol, while wild yeast only need the (low) nitrogen enough to allow growth and survival. Therefore, these differences could be a consequence of their metabolism related to the substrate where they develop rather than an environmental adaptation. New evidences towards one or another explanation are needed to gain a better understanding on this topic, like genomic and/or transcriptomic studies in nitrogen-limited fermentations comparing wine and wild yeast strains.

Even so, the hypothesis that wild yeast strains are better adapted to nitrogen-limited conditions is reinforced by the fact that alleles coming from WE strain tend to cause higher rates of ammonium consumption [85], which may be caused by the regular high proportion of this nitrogen source in the grape must [36] and the oenological practice of ammonium must supplementation [25]. All these antecedents are suggesting that wine yeasts are not well adapted to low nitrogen environments, requiring high levels of nitrogen to complete the fermentation process [26]. Therefore, wild allelic variants augmenting amino acid consumption could be of industrial potential, e.g. for the improvement of industrial wine strains, maybe favouring amino acids consumption over ammonium, by genetic improvement programs.

Zukünftige Richtungen

Although QTL mapping and “omics”-linked approaches have been the preferred tools for the identification of genes associated with yeast adaptation to low nitrogen fermentative conditions, another experimental strategy that can also be applied for phenotype–genotype correlations is Genome-wide association study (GWAS) [66]. This approach is based on a population of individuals without direct genetic relationship, which has been genotyped (generally by chips or sequencing) and phenotyped (for a specific trait), also allowing a direct correlation between genotype and phenotype [65]. While GWAS has been successfully applied in human populations for detection of risk genetic variants associated with diseases, when is applied to microorganism populations several confounding factors must be undertaken, such as selective sweeps, recombination frequency, horizontal gene transfer and clonal expansion [97].

In yeast, GWAS has been seldom utilized due to the necessity to genotype a large number of strains from diverse ecological niches, making the QTL mapping the preferred tool for the analysis of complex traits [65]. As far as we know, there is no study focused on nitrogen-related genes using GWAS. However, the recently sequenced “1011 yeasts population” overcome this problem, allowing to apply GWAS on this yeast population and becoming in a powerful resource for a direct association between genotype and phenotype [59]. Thus, we have now the chance to use GWAS as a tool for the identification of genes affecting phenotypes related to wine fermentation, particularly nitrogen utilization, as well as to TORC1 activation.

The GWAS experimental approach has also the advantage to allow the direct phenotypic and genotypic comparison between wild and domesticated yeast strains. S. cerevisiae is one of the most important domesticated species, due to its use for food (e.g. bread) and beverage (e.g. beer and wine) fermentations for thousands of years [98], but wild yeast strains also exist in non-human environments, such as tree barks and flowers [49]. However, little is known about the phenotypic effects linked to domestication in yeast, for example, over low nitrogen adaptation.

In this context, it will be of great importance for the yeast researcher community to study the effect that domestication process has had over these and other traits. Given the actual evidence pointing towards the different evolutionary trajectories of wild and domesticated yeast strains [47, 48, 59, 64], we can hypothesize that wild strains of S. cerevisiae are better adapted to low nitrogen conditions, being a reservoir of useful alleles to improve industrial yeasts for wine production. Moreover, this domestication process may have caused differences in TORC1 activation between wild and domesticated strains, with some works suggesting the existence of lineage-specific functional divergence for TORC1-associated phenotypes [64, 84, 99, 100], which in turn may have impacted on their fermentative capacities. The disentangling of the genetic bases of yeast adaptation to low nitrogen environments in wine fermentation will help to answer this and other questions, and to take the accumulated knowledge for industrial application in wine industry.


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