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Warum wird die ATP-Hydrolyse zu ADP und nicht die ADP-Hydrolyse zu AMP verwendet, um biochemische Reaktionen voranzutreiben?

Warum wird die ATP-Hydrolyse zu ADP und nicht die ADP-Hydrolyse zu AMP verwendet, um biochemische Reaktionen voranzutreiben?


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ADP hat zwei Phosphatgruppen und kann in einer Reaktion zu AMP hydrolysiert werden, die eine ähnliche Änderung der freien Energie beinhaltet wie die Hydrolyse von ATP zu ADP.

Warum ist die letztere Reaktion, eher als die frühere Reaktion, gekoppelt mit energetisch ungünstigen Reaktionen zu einer Gesamtreaktion mit einer negativen Änderung der Gibbs-Freien Energie?


Zusammenfassung

Die ursprüngliche Frage wurde – mit Zustimmung des Posters – so bearbeitet, dass sie nun kurz gefasst lautet:

Warum ist die ATP-Hydrolyse zu ADP und nicht die ADP-Hydrolyse zu AMP der normale Weg, auf dem Zellen Reaktionen auslösen, die allein positive Veränderungen der freien Gibbs-Energie beinhalten?

Der Umfang davon ist breiter als ursprünglich in der Antwort von @ user1136 angenommen, aber er hat auch durch seine Kommentare, die ich in meine Überarbeitung aufgenommen habe, zu dieser Antwort beigetragen.

Meines Wissens gibt es Nein allgemein anerkannte beweisbare Antwort zu dieser Frage (im Gegensatz zur Auflistung der Vorteile für das System, wie es heute funktioniert). Was ich tun werde, ist präsentieren a Hypothese das könnte diese situation erklären. Die Grundidee dabei ist:

Die gegenwärtige Verwendung von ATP anstelle von ADP in Energietransferreaktionen hat sich aus der Bevorzugung von NTPs anstelle von NDPs als Vorläufer der RNA-Synthese entwickelt. Diese Präferenz war das Ergebnis der Tatsache, dass die Umwandlung von NTPs zu NMPs und Pyrophosphat die Umkehrung dieses (und anderer) Syntheseprozesse in einer Weise verhindern konnte, die Phosphat freisetzende Umwandlungen nicht konnten.

AMP, ADP und ATP: Freie Standardenergien der Hydrolyse

Es besteht allgemeine Übereinstimmung, dass die Werte für ∆G°' (Standardänderung der freien Energie bei 37˚C) für die Hydrolyse der terminalen Phosphatbindung von ATP (β-γ) und ADP (α-β) ähnlich sind. (Die folgenden sind von J.L. Jain, et al.:

ATP → ADP + Pi -7,3 kcal/mol ADP → AMP + Pi -7,3 kcal/mol

Daher gibt es Nein intrinsischer energetischer Unterschied, der die bevorzugte Verwendung von ATP gegenüber ADP als „Energiespender“ in biochemischen Prozessen erklären könnte, d.h. es ist nicht ersichtlich, warum z.B.:

Glucose + ATP → Glucose-6-phosphat + ADP

und nicht

Glucose + ADP → Glucose-6-phosphat + AMP

Und, wie @ user1136 erwähnt, gibt es Beispiele, bei denen die Energie der Hydrolyse von ADP zu AMP verwendet werden kann, um andere Reaktionen „anzutreiben“. Er erwähnt Polynukleotid-Phosphorylase, zu der ich Adenylat-Kinase hinzufügen würde, da dies kein synthetischer Prozess ist und für den Energiestoffwechsel von Nukleotidphosphaten relevant ist:

ADP + ADP AMP + ATP

Die Einführung von AMP in die Diskussion wirft die Frage nach dem Wert des ∆G°' für die folgende Reaktion auf:

ATP → AMP + PPi

Viele Texte geben einen Wert an, der nur geringfügig höher ist (ohne das Minuszeichen) als der für die Phosphatfreisetzung (der zitierte gibt -7,7 kcal/mol an), aber eine Überprüfung der Situation im Journal of Biochemistry aus dem Jahr 1995 legt nahe, dass der Unterschied tatsächlich größer ist : -10,9 kcal/mol, im Gegensatz zu -7,8 kcal/mol für die Hydrolyse von ATP zu ADP und Pi.

Auf ihre Relevanz wird im nächsten Abschnitt eingegangen.

Biosynthetische Prozesse und ATP

Mir scheint, das Beispiel der Polynukleotid-Phosphorylase ist besonders relevant, da es sich um einen biosynthetischen Prozess handelt, bei dem das Nukleotid-Monophosphat tatsächlich in das Produkt eingebaut wird.

[AMPERE]n + ADP → [AMP]n+1 + Mehr

Diese ADP-getriebene nicht-templatabhängige Synthese von Polynukleotiden ist jedoch kein Modell für die Template-abhängige RNA-Synthese, da sie auch in der umgekehrte Richtung als phosphorolytische 3ʹ zu 5ʹ Exoribonuklease-Reaktion:

[AMPERE]n+1 + Pi → [AMP]n + ADP

Irreversibilität ist ein wichtiges Merkmal der templatabhängigen Synthese von RNA¶, und es wird angenommen, dass der Schlüssel dazu in der Tatsache liegt, dass ATP das Substrat ist und zwischen den α- und β-Phosphaten gespalten wird, die freisetzen Pyrophosphat statt Monophosphat.

[NMP]n + NTP → [NMP]n+1 + PPi

Der allgemein vorgeschlagene Grund, warum diese Reaktion irreversibel ist, besteht darin, dass die Pyrophosphatase in der Zelle das Pyrophosphat in einer exothermen Reaktion zu Phosphat hydrolysiert. Das evolutionäre Problem besteht jedoch darin, dass sich Pyrophosphatasen entwickeln müssten, bevor dies funktionieren würde. Wenn jedoch ∆G°' für die Pyrophosphatfreisetzung einen größeren absoluten Wert hat als der für die Phosphatfreisetzung, würde dies an sich das Reaktionsgleichgewicht in einer für die Synthese günstigen Weise beeinflussen, wenn auch mit den höheren effektiven Kosten eines zusätzlichen ATP. Die spätere Entwicklung von Pyrophosphatasen hätte dazu gedient, die Irreversibilität zu verstärken und zu verstärken.

Die Hypothese

Die Hypothese ist das nukleosid tri-Phosphate wurden früh in der Evolution entwickelt, um ein Mittel bereitzustellen, um die Nukleinsäuresynthese durch einen Mechanismus, der Pyrophosphat erzeugte, im Wesentlichen irreversibel zu machen. Wie das Beispiel der Polynukleotid-Phosphorylase zeigt, sind Nukleosid di-Phosphate lassen dies nicht zu.

A priori es scheint keinen Grund zu geben, warum ATP anstelle von ADP für die Kopplung biochemischer Reaktionen bevorzugt werden sollte. Wenn man jedoch das Argument akzeptiert, dass die ATP-Synthese für die Nukleinsäuresynthese erforderlich war, scheint es keinen Grund zu geben, eine Reihe von Reaktionen zu haben, die ADP für andere Zwecke erzeugen. Die Hydrolyseenergie von ATP zu ADP bei solchen Reaktionen müsste auf jeden Fall genutzt werden, sonst würde sie einen Nettoverlust darstellen. Warum weitergehen?

Möglicherweise ging ATP in der Evolution ein früherer „Energiespender“ voraus. Ich würde jedoch vorschlagen, dass, sobald sich ein Mechanismus zur Synthese und Verwendung von ATP (und anderen NTPs) für synthetische Zwecke entwickelt hat, es effizienter war, diesen für metabolische Zwecke zu verwenden und jedes vorherige Energiedonormolekül weitgehend zu ersetzen.

† Fußnote 1

Ich habe dies in meiner Antwort auf eine ganz andere Frage zu ATP sehr tangential berührt. Die allgemeine Idee ist jedoch, dass die Purin- und Pyrimidinringe von NTPs keinen Zweck beim Energietransfer erfüllen, sondern ein Relikt ihres Bedarfs in der RNA-Synthese sind, wo die NTPs nicht nur Energie liefern, sondern eingearbeitet in das RNA-Produkt.

¶ Fußnote 2

RNA- und DNA-Synthese sind nicht die einzigen Syntheseverfahren, bei denen diese Strategie der Irreversibilität angewendet wird. Die tRNA-Aminoacylierungsreaktion - essentiell für Proteinsynthese ist wie folgt:

Aminosäure + ATP → Aminoacyl-AMP + PPi

Und der erste Schritt hinein Glykogensynthese ist die Bildung von UDP-Glukose:

Glucose-1-Phosphat + UTP → UDP-Glucose + PPi


Es kann, und ein sehr berühmtes Beispiel ist die Polynukleotid-Phosphorylase, ein Enzym von großer historischer Bedeutung bei der Aufklärung des genetischen Codes.

Dies ist jedoch sehr ungewöhnlich, und Polynukleotid-Phosphorylase ist das einzige mir bekannte Beispiel (aber andere Benutzer können möglicherweise zusätzliche Beispiele liefern).

Es gibt sicherlich keinen thermodynamischen Grund, warum die „hochenergetische“ Bindung von ADP nicht als Quelle für freie Energie verwendet werden kann.

Polynukleotid-Phosphorylase wurde in Ochoas Labor von Mairanna Grunberg-Manago entdeckt. Die Geschichte besagt (aus dem Gedächtnis), dass Ochoa sehr abweisend war, als Grunberg-Manago ihm sagte, dass das Enzym Dinukleotidphosphate anstelle von Trinukleotidphosphaten verwendet, und er sagte ihr, dass ihre Schlussfolgerung unmöglich sei. Später erkannte er seinen Fehler und entschuldigte sich, und die biosynthetische Aktivität des Enzyms bot eine einfache und elegante Methode zur Herstellung kurzer RNAs, die verwendet wurden, um den genetischen Code zu entschlüsseln.

(Ich habe die Quelle der obigen Geschichte nicht 'zur Hand' (da ich im Urlaub bin). Vielleicht kann mir jemand mit einer authentischeren Darstellung der Geschichte helfen? in den kommenden Tagen).


ATP -> ADP ist leichter zu brechen als ADP -> AMP. Ich glaube nicht, dass ich erklären kann, warum, ohne sich auf die chemischen Vorstellungen des dritten Jahres von Elektronenorbitalen zu berufen…

Konzeptionell ist die terminale Phosphatbindung am Triphosphat instabiler als die terminale am Dipeptid, so dass das Aufbrechen dieser Bindung und das Freisetzen dieser Bindungsenergie für die Arbeit einfacher ist, und die Energiemenge ist eine kleine und nützliche Menge. Das Aufbrechen hochenergetischer Bindungen ist schwieriger, und wenn die freigesetzte Energie den Bedarf übersteigt, kann dies zu unerwünschten Nebenreaktionen führen.

Der Stoffwechsel erfolgt schrittweise, um die Energieeinheit auf einem angemessenen Niveau zu halten.


Warum setzt ATP Energie frei, wenn es zu ADP wird?

Wenn die Zelle braucht Energie arbeiten, ATP verliert seine 3. Phosphatgruppe und setzt . frei Energie in der Bindung gespeichert, mit der die Zelle ihre Arbeit verrichten kann. Jetzt ist es wieder da ADP und ist bereit, die Energie aus der Atmung durch Bindung mit einer 3. Phosphatgruppe.

Warum ist es ebenso falsch zu sagen, dass die Phosphoesterbindung in ATP eine große Menge an Energie freisetzt, wenn ATP in ADP umgewandelt wird? Erkläre in diesem Sinne, warum es so ist Es ist falsch zu sagen, dass die Phosphoesterbindung in ATP eine große Menge Energie freisetzt, wenn ATP zu ADP . wird. Nein, die Energie kommt nicht aus dem Phosphoesterbindung wenn es kaputt ist. Eher die Energie ist freigegeben wenn die Wassermolekülteile hinzugefügt werden ADP.

Welcher Prozess liefert auf diese Weise die Energie, die zur Herstellung von ATP aus ADP verwendet wird?

Die Hydrolyse von ATP zu produzieren ADP ist eine reversible Reaktion und somit ADP nutzt das Extra Energie mit in der Zelle, um zurück in umzuwandeln ADP. Dieses Extra Energie kommt aus der Nahrungsaufnahme.

Ist ATP stabiler als ADP?

Das macht ATP ein relativ instabiles Molekül, weil es bei Gelegenheit seine Phosphatgruppen abgeben will, um ein stabiler Molekül. Resonanzstabilisierung von ADP und von Pich ist größer als das von ATP. Die Sauerstoffmoleküle der ADP teilen sich Elektronen. Dies stallt die ADP.


20.1: ATP: die universelle Energiewährung

Adenosintriphosphat (ATP), ein Nukleotid aus Adenin, Ribose und drei Phosphatgruppen, ist vielleicht die wichtigste der sogenannten energiereichen Verbindungen in einer Zelle. Seine Konzentration in der Zelle variiert zwischen 0,5 und 2,5 mg/ml Zellflüssigkeit.

Energiereiche Verbindungen sind Stoffe mit besonderen Strukturmerkmalen, die nach der Hydrolyse zu einer Energiefreisetzung führen. Dadurch sind diese Verbindungen in der Lage, Energie für biochemische Prozesse bereitzustellen, die Energie benötigen. Das bei ATP wichtige Strukturmerkmal ist die Phosphorsäureanhydrid- oder Pyrophosphatbindung:

Die Pyrophosphatbindung, symbolisiert durch eine Kringel (

), wird hydrolysiert, wenn ATP in Adenosindiphosphat (ADP) umgewandelt wird. Bei dieser Hydrolysereaktion enthalten die Produkte weniger Energie als die Reaktanten, es erfolgt eine Energiefreisetzung (> 7 kcal/mol). Ein Grund für die freigesetzte Energiemenge ist, dass die Hydrolyse die Elektron-Elektronen-Abstoßung der negativ geladenen Phosphatgruppen lindert, wenn sie aneinander gebunden sind (Abbildung 20.1.1).

Abbildung (PageIndex<1>): Hydrolyse von ATP zu ADP

Energie wird freigesetzt, weil die Produkte (ADP und Phosphation) weniger Energie haben als die Reaktionspartner [ATP und Wasser (H2Ö)].

Die allgemeine Gleichung für die ATP-Hydrolyse lautet wie folgt:

[ATP + H_2O &rarr ADP + P_i + 7,4 kcal/mol]

Wenn die Hydrolyse von ATP Energie freisetzt, benötigt seine Synthese (aus ADP) Energie. In der Zelle wird ATP durch Prozesse produziert, die dem Organismus Energie liefern (Aufnahme von Sonnenstrahlung bei grünen Pflanzen und Abbau von Nahrung bei Tieren) und es wird durch Prozesse hydrolysiert, die Energie benötigen (die Synthese von Kohlenhydraten). , Lipide, Proteine ​​die Übertragung von Nervenimpulsen Muskelkontraktionen). Tatsächlich ist ATP das Hauptmedium des Energieaustauschs in biologischen Systemen. Viele Wissenschaftler nennen es die Energiewährung der Zellen.

(P_i) ist das Symbol für die anorganischen Phosphatanionen (H_2PO_4^&minus) und (HPO_4^<2&minus>).

ATP ist nicht die einzige energiereiche Verbindung, die für den Stoffwechsel benötigt wird. Einige andere sind in Tabelle (PageIndex<1>) aufgeführt. Beachten Sie jedoch, dass die bei der Hydrolyse von ATP freigesetzte Energie ungefähr in der Mitte zwischen der der hochenergetischen und der niederenergetischen Phosphatverbindungen liegt. Dies bedeutet, dass die Hydrolyse von ATP Energie für die Phosphorylierung der in der Tabelle darunter stehenden Verbindungen bereitstellen kann. Beispielsweise liefert die Hydrolyse von ATP ausreichend Energie für die Phosphorylierung von Glucose, um Glucose-1-phosphat zu bilden. Ebenso die Hydrolyse von Verbindungen wie Kreatinphosphat, die auftreten Oben ATP in der Tabelle kann die Energie bereitstellen, die benötigt wird, um ATP aus ADP neu zu synthetisieren.


ATP und Energiekopplung

Wie viel freie Energie (∆G) wird bei der Hydrolyse von ATP genau freigesetzt und wie wird diese freie Energie verwendet, um zelluläre Arbeit zu verrichten? Die berechnete ∆G für die Hydrolyse von einem Mol ATP zu ADP und Pich beträgt &minus 7,3 kcal/mol (&minus 30,5 kJ/mol). Dies gilt jedoch nur unter Standardbedingungen, und der ∆G für die Hydrolyse von einem Mol ATP in einer lebenden Zelle ist fast doppelt so hoch wie der Wert unter Standardbedingungen: 14 kcal/mol (&minus 57 kJ/mol).

ATP ist ein sehr instabiles Molekül. ATP dissoziiert spontan in ADP + P ., wenn es nicht schnell zur Arbeitsleistung verwendet wirdich, und die dabei freigesetzte freie Energie geht als Wärme verloren. Um die Energie innerhalb der ATP-Bindungen zu nutzen, verwenden Zellen eine Strategie namens Energiekopplung.

Zellen koppeln die exergonische Reaktion der ATP-Hydrolyse mit den endergonischen Reaktionen zellulärer Prozesse. Beispielsweise müssen bei zellulären Stoffwechselreaktionen oder dem Auf- und Abbau von Nährstoffen bestimmte Moleküle in ihrer Konformation geringfügig verändert werden, um Substrate für den nächsten Schritt der Reaktionsreihe zu werden. In den allerersten Schritten der Zellatmung wird Glukose durch den Prozess der Glykolyse abgebaut. ATP wird für die Phosphorylierung von Glucose benötigt, wodurch ein energiereiches, aber instabiles Zwischenprodukt entsteht. Diese Phosphorylierungsreaktion verursacht eine Konformationsänderung, die es Enzymen ermöglicht, das phosphorylierte Glucosemolekül in den phosphorylierten Zucker Fructose umzuwandeln. Fruktose ist ein notwendiges Zwischenprodukt, damit die Glykolyse voranschreiten kann. In diesem Beispiel ist die exergonische Reaktion der ATP-Hydrolyse mit der endergonischen Reaktion der Umwandlung von Glucose zur Verwendung im Stoffwechselweg gekoppelt.


DISKUSSION

In dieser Studie wurde ein lösliches, multimeres Aceton verwertendes Enzym gereinigt und charakterisiert aus Xanthobacter Stamm Py2. Die physiologische Funktion der Acetoncarboxylase besteht darin, Aceton, ein toxisches und widerspenstiges organisches Molekül, in Acetoacetat umzuwandeln, das ein zentraler Metabolit ist, der über konventionelle und gut charakterisierte biochemische Wege weitere metabolische Umwandlungen eingehen kann.

Aceton-Carboxylase zeigte einen obligatorischen Bedarf an ATP als Cofaktor. Die Acetoncarboxylierung ist ein thermodynamisch ungünstiger Prozess (ΔG°′ für die Acetoncarboxylierung mit Bicarbonat beträgt +17,1 kJ/mol), und die Hydrolyse von ATP zu ADP (ΔG°′ = −31 kJ/mol) würde theoretisch ausreichend Energie liefern, um die Carboxylierungsreaktion. Interessanterweise entstehen im Verlauf der Aceton-Carboxylierung AMP und anorganisches Phosphat als Produkte der ATP-Hydrolyse (Abb. 3EIN) nach Gl. 4: 4 Die Carboxylierung von Aceton erfordert daher die Hydrolyse sowohl der α-β- als auch der β-γ-Phosphodiesterbindungen eines einzelnen ATP-Moleküls.

Es ist vernünftig zu spekulieren, dass die ATP-Hydrolyse eine Rolle bei der Aktivierung von Aceton für CO . spielt2 Addition durch eine oder mehrere Gruppenübertragungsreaktionen. Möglicherweise wird eine Phosphoryl- oder Pyrophosphorylgruppe direkt auf Aceton oder über die Vermittlung eines Phosphoryl- oder Pyrophosphoryl-Enzym-Zwischenprodukts übertragen. Die Carboxylierung von Aceton beinhaltet vermutlich einen nukleophilen Angriff des Carbonions von Aceton auf CO2 (oder Bikarbonat). Das Carbanion könnte durch allgemeine Basenabstraktion eines Protons gebildet werden, wäre aber aufgrund des hohen pK . schwer zu erzeugen und sehr instabilein der Methylgruppe. Das Carbanion konnte durch Keto-zu-Enol-Tautomerisierung stabilisiert werden, und das Enol-Tautomer konnte durch die Übertragung einer Phosphorylgruppe (oder einer anderen) von ATP auf das Sauerstoffatom des Enolats weiter stabilisiert werden. Nucleophiler Angriff des Enols auf CO2 (oder Bicarbonat) mit gleichzeitiger Hydrolyse der Sauerstoff-Phosphat-Bindung würde zur Bildung von Acetoacetat führen.

Dieses hypothetische Reaktionsschema weist Ähnlichkeiten mit gut charakterisierten Reaktionen auf, an denen die glykolytischen Zwischenprodukte Pyruvat und Phospho . beteiligt sindenolPyruvat (24–26). Die Umwandlung von Pyruvat in PhosphoenolPyruvat wird durch Phospho katalysiertenolPyruvat-Synthase, die das Enol-Tautomer von Pyruvat auf Kosten von zwei hochenergetischen Phosphoanhydrid-Bindungen phosphoryliert, wie in Gl. 5 (24, 26): 5 Die Hydrolyse zweier Phosphoanhydrid-Bindungen ist erforderlich, um die Phosphorylierung von Pyruvat voranzutreiben, die im Vergleich zu einer einzelnen ATP-Hydrolyse (ΔG°′ für PhosphoenolPyruvathydrolyse beträgt –61,9 kJ/mol). Aufgrund derselben thermodynamischen Überlegungen kann die Hydrolyse zweier Phosphoanhydrid-Bindungen für die Bildung von Phospho . erforderlich seinenolAceton oder ein anderes aktiviertes Aceton-Zwischenprodukt ebenso.

Wenn im Rahmen des katalytischen Mechanismus eine Gruppenübertragung von ATP auf Aceton stattfindet, scheint das Intermediat nicht stabil zu sein, da in Assays, die in Abwesenheit von CO . durchgeführt wurden, keine nachweisbare Verarmung an Aceton beobachtet wurde2 (Abb. 3B). In diesen Assays stimulierte Aceton die Hydrolyse von ATP um das 20-fache gegenüber Assays, die in Abwesenheit von Aceton durchgeführt wurden, was darauf hindeutet, dass eine Reaktion von ATP mit Aceton stattfindet. Möglicherweise zerfällt das aktivierte Aceton-Zwischenprodukt einfach wieder zu Aceton, wenn CO2 steht für eine weitere Reaktion zu Acetoacetat nicht zur Verfügung. Alternativ kann Aceton eine Konformationsänderung induzieren, die die ATPase-Aktivität des Enzyms aktiviert.

Interessanterweise akkumulierten sowohl ADP als auch AMP als signifikante Produkte der acetonabhängigen ATP-Hydrolyse in Abwesenheit von CO .2 (Abb. 3). ADP wurde auch als geringfügiges Hydrolyseprodukt in Assays nachgewiesen, die in Gegenwart von CO . durchgeführt wurden2 (Abb. 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass Acetoncarboxylase die Hydrolyse sowohl der α-β- als auch der β-γ-Phosphodiesterbindungen von ATP katalysieren kann. Möglicherweise erfolgt die ATP-Hydrolyse durch die sequentielle Spaltung der β-γ- und α-β-Phosphodiesterbindungen von ATP unter Bildung einer ADP-Zwischenstufe und nicht durch eine anfängliche Spaltung der α-β-Bindung, die AMP und Pyrophosphat (oder ein pyrophosphoryliertes Zwischenprodukt) als erste Hydrolyseprodukte. Aceton-Carboxylase zeigte keine Pyrophosphatase-Aktivität, und wir konnten Pyrophosphat nicht als Zwischenprodukt in den Steady-State-Carboxylierungsreaktionen nachweisen (Abb. 2 und 3).Diese Ergebnisse sprechen gegen Pyrophosphat als Zwischenprodukt in der Reaktion. Wir können jedoch die Möglichkeit einer fest oder kovalent gebundenen Pyrophosphorylgruppe als Zwischenprodukt in der Reaktionssequenz nicht ausschließen. Es ist offensichtlich, dass die Aufklärung der mechanistischen Details der Acetoncarboxylierung und der Rolle der ATP-Hydrolyse bei dieser Reaktion den Einsatz einer Vielzahl von kinetischen, mechanistischen und spektroskopischen Methoden erfordert.

Schink und Mitarbeiter (5, 10, 11, 27, 28) haben den Acetonstoffwechsel bei mehreren anaeroben Bakterien untersucht und erhalten in vivo und in vitro Daten, die die Existenz von CO . belegen2-abhängige Wege, bei denen Aceton zu Acetoacetat oder einem Acetoacetyl-Derivat (z. B. Acetoacetyl-CoA) carboxyliert wird. Die enzymatische Aktivität, von der angenommen wird, dass sie für die Aceton-Carboxylierung in einem Denitrifizierer, der als Stamm BunN bezeichnet wird, verantwortlich ist, wurde in Zellextrakten untersucht. Die Carboxylierung von Aceton konnte in Zellextrakten weder in Abwesenheit noch in Gegenwart von ATP und anderen Cofaktoren rekonstituiert werden (9, 12). Zellextrakte des Stammes BunN katalysierten zwei Reaktionen, von denen angenommen wurde, dass sie für die Carboxylierung von Aceton relevant sind: die ADP-abhängige Decarboxylierung von Acetoacetat und den ADP-abhängigen Austausch von 14 CO2 in das Carboxylat-Kohlenstoffatom von Acetoacetat (9, 12). Bemerkenswerterweise fehlten diese enzymatischen Aktivitäten in Zellextrakten, die aus Zellen hergestellt wurden, die mit anderen Kohlenstoffquellen gezüchtet wurden, oder waren stark reduziert, was darauf hindeutet, dass sie mit dem Aceton-carboxylierenden Enzym assoziiert sind (9, 12).

Vor kurzem zeigten Birks und Kelly (13) Aceton-Carboxylase-Aktivität in Zellextrakten, die aus in Aceton gezüchteten Kulturen von . hergestellt wurden Rhodobacter capsulatus. Diese Aktivität erforderte ATP und wurde durch CoA oder Acetyl-CoA stimuliert (diese Cofaktoren hatten keinen Einfluss auf die Aceton-Carboxylase-Aktivität in Xanthobacter Py2). Die beobachteten Aktivitätsgrade für R. capsulatus Extrakte waren viel niedriger (200- bis 1.000-fach) als die in Zellextrakten von . beobachteten Xanthobacter Py2 und, wie von den Autoren festgestellt, zu niedrig, um von physiologischer Bedeutung zu sein (13). Eventuell eine zusätzliche Komponente, die von der Xanthobacter System ist im Assay limitierend und/oder das Enzym ist viel weniger stabil in vitro. Ähnliche Szenarien können für den Stamm BunN und andere Anaerobier gelten, bei denen die Acetoncarboxylierung nicht rekonstituiert werden kann in vitro.

Zusammenfassend bietet dieses Papier die erste berichtete Reinigung und Charakterisierung eines katabolen Aceton-metabolisierenden Enzyms. Die Identifizierung und Charakterisierung dieses Enzyms schließt eine seit langem bestehende Lücke in unserem Verständnis des mikrobiellen Acetonzyklus. Die in dieser ersten Studie berichteten Eigenschaften der Aceton-Carboxylase legen einen neuen Mechanismus der ATP-abhängigen Aceton-Carboxylierung nahe, der neue Einblicke in biologische Strategien der CO .-Addition verspricht2 auf organische Substrate.


3.1: Die Gesetze der Thermodynamik

  • Beigetragen von E. V. Wong
  • Axolotl Academica Publishing (Biologie) bei Axolotl Academica Publishing

Zwei grundlegende Konzepte regeln Energie in Bezug auf lebende Organismen: Der Erste Hauptsatz der Thermodynamik besagt, dass die Gesamtenergie in einem geschlossenen System weder verloren noch gewonnen, sondern nur umgewandelt wird. Der Zweite Hauptsatz der Thermodynamik besagt, dass die Entropie in einem geschlossenen System ständig zunimmt.

Genauer gesagt besagt der Erste Hauptsatz, dass Energie weder erzeugt noch zerstört werden kann: sie kann nur ihre Form ändern. Daher ist die Gesamtenergie des Universums oder eines anderen geschlossenen Systems durch alle Prozesse konstant. In einem einfachen thermodynamischen System bedeutet dies, dass die Energie entweder durch Übertragung von Wärmeenergie (d. h. Erwärmung und Abkühlung eines Stoffes) oder durch Leistung mechanischer Arbeit (d. h. Bewegung) umgewandelt wird. In biologischer und chemischer Hinsicht lässt sich diese Idee auf andere Energieformen ausweiten, wie zum Beispiel die chemische Energie, die in den Bindungen zwischen Atomen eines Moleküls gespeichert ist, oder die Lichtenergie, die von Pflanzenblättern absorbiert werden kann.

Die Arbeit muss in diesem Fall keinen komplizierten Mechanismus implizieren. Tatsächlich leistet jedes Molekül Arbeit bei der einfachen Expansion einer erhitzten Masse gasförmiger Moleküle (wie zum Beispiel durch die Expansion eines erhitzten Ballons visualisiert). Dies wird mathematisch als die fundamentale thermodynamische Beziehung ausgedrückt:

wobei (E) die innere Energie des Systems ist, (T) die Temperatur, (S) die Entropie, (p) der Druck und (V) das Volumen ist.

Im Gegensatz zum Ersten Hauptsatz, der sogar für Teilchen innerhalb eines Systems gilt, ist der Zweite Hauptsatz ein statistisches Gesetz und gilt allgemein für makroskopische Systeme. Es schließt jedoch nicht kleine Variationen in der Richtung der Entropie über die Zeit aus. Tatsächlich besagt das Fluktuationstheorem (von Evans et al. 1993 vorgeschlagen und 2002 von Wang et al. demonstriert), dass mit zunehmender Zeitdauer oder Systemgröße die Wahrscheinlichkeit einer negativen Entropieänderung (dh gegen die Zweiter Hauptsatz) nimmt exponentiell ab. Auf sehr kleinen Zeitskalen besteht also eine reale Wahrscheinlichkeit, dass Entropiefluktuationen gegen den zweiten Hauptsatz existieren können.

Der Zweite Hauptsatz schreibt vor, dass die Entropie immer versucht, mit der Zeit zuzunehmen. Entropie ist einfach ein schickes Wort für Chaos oder Unordnung. Der theoretische End- oder Gleichgewichtszustand ist einer, in dem die Entropie maximiert ist und es keine Ordnung im Universum oder geschlossenen System gibt. Spontane Prozesse, die ohne äußere Einwirkung ablaufen, sind immer Prozesse, die Ordnung in Unordnung umwandeln. Dies schließt jedoch nicht aus, dass einem System eine Ordnung aufgezwungen wird. Untersuchung der mathematischen Standardform des zweiten Hauptsatzes:

zeigt, dass die Entropie innerhalb eines Systems abnehmen kann, solange die Entropie der Umgebung des Systems gleich oder größer zunimmt.

Der Satz „in einem geschlossenen System&rdquo ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Gesetze, und zwar mit der in diesem Satz zusammengefassten Idee, dass Leben möglich sein kann. Denken wir an eine typische Zelle: Im Laufe ihres Lebens baut sie unzählige komplexe Moleküle auf – riesige Proteine ​​und Nukleinsäuren, die aus einem Gemisch kleiner Aminosäuren bzw. Nukleotiden gebildet werden. Oberflächlich betrachtet scheint dieses Beispiel ein Gegenbeispiel zum zweiten Hauptsatz zu sein – der Übergang von einer Mischung verschiedener kleiner Moleküle zu einem größeren Molekül mit gebundenen und geordneten Komponenten scheint eine Abnahme der Entropie (oder eine Zunahme der Ordnung) zu sein. . Wie ist dies in Bezug auf den zweiten Hauptsatz möglich? Denn der zweite Hauptsatz gilt nur für geschlossene Systeme. Das heißt, ein System, das weder Materie noch Energie gewinnt oder verliert.

Das &ldquouniversum&rdquo ist per Definition ein geschlossenes System, weil es nichts außerhalb davon gibt.

Eine lebende Zelle ist kein geschlossenes System: Sie hat Eingänge und Ausgänge. Der zweite Hauptsatz ist jedoch immer noch nützlich, wenn wir erkennen, dass er nur durch Energiezufuhr umgangen werden kann. Wenn eine Zelle keine Nahrung aufnehmen kann (Eintrag von Materie und Energie in das System), stirbt sie, weil der zweite Hauptsatz verlangt, dass alles schließlich in zufälligere / chaotischere Ansammlungen kleinerer Komponenten zerfällt. Die Ordnung, die erforderlich ist, um Leben zu erhalten (denken Sie an all die verschiedenen komplexen Moleküle, die im vorherigen Kapitel erwähnt wurden) ist phänomenal. Das gleiche gilt auf der Ebene des Organismus (Abbildung (PageIndex<1>)) - ohne Energiezufuhr (in Form von Nahrungsmolekülen für Tiere oder in Form von Licht für Pflanzen) stirbt der Organismus und anschließend zersetzen.

Abbildung (PageIndex<1>). Im oberen Bereich, der ein offenes System darstellt, in dem Materie und Energie (in Form von Nahrung) zugeführt werden, ist die Box geöffnet und kann Luft ausgetauscht, Nahrung eingeworfen werden usw. Dadurch kann die Maus wachsen. Im unteren Bereich, der ein geschlossenes System darstellt, hat die Maus jedoch weder mehr Sauerstoff als in der Box, noch hat sie Zugang zu Nahrung. Ohne diese Eingaben tritt der zweite Hauptsatz in Kraft, und die Maus stirbt und zerfällt in viele kleinere Moleküle.

Die Erzeugung von Molekülen aus Atomen kostet Energie, weil es eine ungeordnete Ansammlung von Atomen braucht und sie durch chemische Bindungen in geordnete, nicht zufällige Positionen zwingt. Die Bildung von Makromolekülen aus kleineren Molekülen ist ebenfalls mit Energiekosten verbunden. Durch das Auferlegen von Ordnung im System muss ein entsprechender Energieeintrag erfolgen. Dies geschieht auf jeder Ebene des Systems: Atome zu Molekülen, kleine Moleküle zu Makromolekülen, Molekülgruppen zu Organellen usw.

Da die Polymerisationsreaktion die Entropie reduziert, wird Energie benötigt, die (normalerweise) durch den Abbau von ATP in AMP und PPi erzeugt wird, was eine Reaktion ist, die die Entropie erhöht.

Wohin geht diese Energie? Es endet in den Bindungen, die die Moleküle oder Makromoleküle in ihrem geordneten Zustand halten. Wenn eine solche Bindung gebrochen wird und ein Molekül wieder in eine Ansammlung von Atomen umgewandelt wird, wird Energie frei. Die Energie in einer chemischen Bindung ist also potentielle Energie – es ist gespeicherte Energie, die, wenn sie freigesetzt wird, Arbeit verrichten kann. Dieser Begriff wird, wenn Sie sich an Ihre High-School-Physik erinnern, normalerweise zusammen mit kinetischer Energie gelernt, dh Energie, die bei der eigentlichen Arbeit verwendet wird (d. h. beim Bewegen eines Objekts von einem Ort zum anderen). Das klassische Beispiel ist der Fels auf der Spitze eines Hügels: Er hat potenzielle Energie, weil er erhöht ist und möglicherweise herunterfallen könnte. Wenn es nach unten stürzt, hat es kinetische Energie, während es sich bewegt. In ähnlicher Weise kann in einer Zelle die potentielle Energie einer chemischen Bindung freigesetzt und dann für Prozesse wie das Zusammenfügen kleinerer Moleküle zu größeren Molekülen oder das Drehen oder Biegen eines molekularen Motors verwendet werden – Aktionen, die zum Pumpen von Protonen oder zum Kontraktion der Muskelzellen bzw.

Um auf den zweiten Hauptsatz zurückzukommen, besagt dieser im Wesentlichen, dass der Abbau von Molekülen Energie freisetzt und dass die Herstellung neuer Moleküle (entgegen der natürlichen Tendenz zur Unordnung) Energie erfordert. Jedes Molekül hat eine intrinsische Energie, und daher kommt es immer dann, wenn ein Molekül an einer chemischen Reaktion beteiligt ist, zu einer Energieänderung der resultierenden Moleküle. Ein Teil dieser Energieänderung des Systems kann zur Verrichtung von Arbeit verwendet werden, und diese Energie wird als freie Energie der Reaktion bezeichnet. Der Rest wird als Wärme abgegeben.

Die Gibbs-Gleichung beschreibt diese Beziehung als

Dabei ist &DeltaG die Änderung der freien Energie, &DeltaH ist die Enthalpieänderung (ungefähr äquivalent zur Wärme), T ist die Temperatur, bei der die Reaktion stattfindet und &DeltaS ist die Entropieänderung. Konventionsgemäß ist die Abgabe von freier Energie eine negative Zahl, während ein Bedarf an Energiezufuhr mit einer positiven Zahl bezeichnet wird. Im Allgemeinen eine chemische Reaktion, bei der &DeltaG < 0 eine spontane Reaktion ist (auch als exergonische Reaktion bezeichnet), während eine chemische Reaktion, bei der &DeltaG > 0 nicht spontan (oder endergonisch) ist. Bei &DeltaG = 0 befindet sich das System im Gleichgewicht. &DeltaG kann auch in Bezug auf die Konzentration von Produkten und Edukten ausgedrückt werden:

Begriffe in eckigen Klammern bezeichnen Konzentrationen, &DeltaG° ist die freie Standardenergie für die Reaktion (durchgeführt mit 1M Konzentration jedes Reaktanten, bei 298K und 1 atm Druck), R ist die Gaskonstante (1,985 cal K -1 mol -1 ), und T ist die Temperatur in Kelvin. In einem einfacheren System, in dem es nur zwei Edukte und zwei Produkte gibt:

die Gleichung für die Änderung der freien Energie wird

Das ist uns als Zellbiologen wichtig, denn Zellen sind zwar nicht sehr gut geeignet, chemische Reaktionen durch Variation der Temperatur oder des Drucks der Reaktionsbedingungen zu regulieren, können aber die Konzentrationen von Substraten und Produkten relativ leicht verändern. Tatsächlich ist es sogar möglich, eine nicht-spontane Reaktion (&DeltaG > 0) spontan (&DeltaG < 0) entweder durch Erhöhung der Substratkonzentration (evtl. durch Transport in die Zelle) oder durch Verringerung der Produktkonzentration ( entweder indem sie sie aus der Zelle ausscheiden oder sie als Substrate für eine andere chemische Reaktion aufbrauchen).

Änderungen der Substrat- oder Produktkonzentration, um eine nicht-spontane Reaktion voranzutreiben, sind ein Beispiel für die allgemeinere Idee von Kupplungsreaktionen, um eine energetisch ungünstige Reaktion voranzutreiben. Endergone Reaktionen können an exergonische Reaktionen als eine Reihe von Reaktionen gekoppelt werden, die letztendlich in der Lage sind, fortzuschreiten. Die einzige Voraussetzung ist, dass die gesamte Änderung der freien Energie negativ sein muss (&DeltaG < 0). Unter der Annahme von Standardbedingungen (&DeltaG = &DeltaG°&rsquo) ist eine Reaktion mit einer Änderung der freien Energie von +5 kcal/mol nicht spontan. Wenn wir diese Reaktion jedoch beispielsweise an die ATP-Hydrolyse koppeln, laufen beide Reaktionen ab, da die standardmäßige Änderung der freien Energie der ATP-Hydrolyse zu ADP und Phosphat exergonisch -7,3 kcal/mol beträgt. Die Summe der beiden &DeltaG-Werte beträgt -2,3 kcal/mol, was bedeutet, dass die gekoppelte Reaktionsfolge spontan ist.

Tatsächlich ist ATP die häufigste Energie- „Währung&rdquo in Zellen, gerade weil die Änderung der freien Energie von -7,3 kcal/mol durch seine Hydrolyse ausreicht, um viele ansonsten endergonische Reaktionen durch Kopplung anzutreiben, aber es ist weniger kostspielig (energetisch) in der Herstellung als andere Verbindungen, die möglicherweise noch mehr Energie freisetzen könnten (zB Phosphoenolpyruvat, PEP). Außerdem würde ein Großteil der -14,8 kcal/mol (&DeltaG°) aus der PEP-Hydrolyse verschwendet, da relativ wenige endergonische Reaktionen so ungünstig sind, dass sie so viel freie Energie benötigen.

Warum unterscheidet sich ATP von anderen kleinen phosphorylierten Verbindungen? Wie kommt es, dass die &gamma-Phosphoanhydrid-Bindung (die am weitesten entfernte) von ATP so viel Energie liefern kann, wenn die Hydrolyse von Glycerin-3-phosphat weniger als ein Drittel der freien Energie erzeugt? Die offensichtlichste ist die elektrostatische Abstoßung. Obwohl sie durch die kovalenten Bindungen zusammengehalten werden, gibt es viele negative Ladungen auf kleinem Raum (jedes Phosphat trägt ungefähr 4 negative Ladungen). Das Entfernen eines der Phosphate reduziert die elektrostatische Abstoßung erheblich. Wenn man bedenkt, dass DG aus dem Gleichgewicht von Reaktanten und Produkten berechnet wird, sehen wir auch, dass die Produkte der ATP-Hydrolyse, ATP und Phosphat, aufgrund von Resonanz (sowohl ADP als auch Pi haben eine größere Resonanzstabilisierung) und Stabilisierung durch Hydratation sehr stabil sind . Die größere Stabilität der Produkte bedeutet eine größere freie Energieänderung.

Auch wenn eine Reaktion energetisch günstig ist (&DeltaG < 0), kann sie chemisch gesehen nicht ohne ein wenig „Push&rdquo ablaufen. Der &ldquopush&rdquo ist etwas namens Aktivierungsenergieund überwindet die thermodynamische Stabilität. Betrachten Sie zum Beispiel Glukose. Dieser einfache Zucker ist die primäre Energiequelle für alle Zellen und die in seinen Bindungen enthaltene Energie wird beim Zerfall in Kohlendioxid und Wasser freigesetzt. Da es sich um große Moleküle handelt, die in kleinere zerlegt werden, wird die Entropie erhöht, wodurch Energie aus der Reaktion freigesetzt wird, und es handelt sich technisch um eine spontane Reaktion. Wenn wir jedoch etwas Glukose in einer Schüssel auf dem Labortisch betrachten, wird sie offensichtlich nicht spontan abgebaut, es sei denn, wir fügen Wärme hinzu. Sobald wir genügend Wärmeenergie hinzufügen, können wir die Energiequelle entfernen, aber der Zucker wird weiterhin durch Oxidation (Verbrennung) zu CO . abgebaut2 und H2Ö.

Abbildung (PageIndex<2>). Katalysatoren senken die Aktivierungsenergiebarriere für chemische Reaktionen, ohne die Änderung der freien Energie für diese Reaktion zu ändern.

Anders ausgedrückt: Der/die Reaktant(en) muss/müssen in einen instabilen Energiezustand gebracht werden, der als Übergangszustand bekannt ist (wie in der Spitze der Graphen in Abbildung (PageIndex<2>) gezeigt). Diese Energiebedarfsbarriere für das Auftreten einer spontanen thermodynamisch begünstigten Reaktion wird als Aktivierungsenergie bezeichnet. In Zellen bedeutet der Bedarf an Aktivierungsenergie, dass die meisten chemischen Reaktionen zu langsam/zu selten ablaufen würden, um alle Prozesse zu berücksichtigen, die die Zellen am Leben erhalten, da die erforderliche Energie wahrscheinlich aus dem Zufall resultieren würde, dass zwei Reaktanten normalerweise mit ausreichender Energie ineinander prallen das heißt, sie müssen erhitzt werden. Auch hier sind Zellen im Allgemeinen nicht in der Lage, einen mikroskopisch kleinen Bunsenbrenner anzuschalten, um die erforderliche Aktivierungsenergie zu erzeugen, es muss einen anderen Weg geben. Tatsächlich überwinden Zellen das Problem der Aktivierungsenergie, indem sie Katalysatoren für ihre chemischen Reaktionen verwenden. Grob definiert ist ein Katalysator eine chemische Substanz, die die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht, vorübergehend mit den Reaktanten interagieren kann, aber von ihnen nicht dauerhaft verändert wird. Der Katalysator kann wiederverwendet werden, da er vor Beginn der Reaktion und nach Beendigung der Reaktion gleich ist. Aus thermodynamischer Sicht senkt es die Aktivierungsenergie der Reaktion, ändert aber nicht das &DeltaG. Es kann also keine nicht-spontane Reaktion ablaufen lassen, es kann nur eine bereits spontane Reaktion schneller oder häufiger ablaufen lassen.


Korrekturlesen

Nicht übereinstimmende Basenpaare in DNA resultieren aus einem Fehleinbau durch Polymerasen. Die Erkennung und Reparatur von fehlgepaarten Basenpaaren in DNA ist wesentlich, und das Versagen dieses Prozesses ist eine Hauptursache für Genominstabilität und damit Krebs (Modrich und Lahue, 1996). Homologe der MutHLS-Proteinfamilie kommen in fast allen Organismen vor und werden für die Reparatur von Fehlpaarungen benötigt. Das MutS-Protein erkennt die Fehlpaarung und kontrolliert die Aktivität der anderen Proteine. MutS ist eine ATPase und neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass das Protein die ATP-Hydrolyse verwendet, um sowohl Fehlpaarungen zu bestätigen als auch die Initiierung des Reparaturprozesses durch die Proteine ​​MutH und MutL zu aktivieren ( Junop et al., 2001). Der Mechanismus wird als eine Form des Korrekturlesens der Fehlpaarung vorgeschlagen, so dass eine Aktivierung nur erfolgt, wenn ATP und ein fehlgepaartes Basenpaar gleichzeitig gebunden werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die beiden ATPase-Stellen in MutS asymmetrisch sind, obwohl sie chemisch identisch sind ( Lamers et al., 2003) und dass der Wechsel der ATP-Hydrolyse zwischen diesen Stellen das Timing der verschiedenen Schritte der Fehlpaarungsreparatur steuert.

Interessanterweise ist das MutL-Protein auch eine ATPase, aber in diesem Fall dient die ATP-Hydrolyse als Schalter zur Kontrolle der Aktivierung der MutH-Endonukleaseaktivität (Hall und Matson, 1999).


7.1 Energie in lebenden Systemen

Am Ende dieses Abschnitts können Sie Folgendes tun:

  • Diskutieren Sie die Bedeutung von Elektronen bei der Energieübertragung in lebenden Systemen
  • Erklären Sie, wie ATP von Zellen als Energiequelle verwendet wird

Die Energieproduktion innerhalb einer Zelle umfasst viele koordinierte chemische Wege. Die meisten dieser Reaktionswege sind Kombinationen von Oxidations- und Reduktionsreaktionen, die gleichzeitig ablaufen. Eine Oxidationsreaktion entfernt ein Elektron von einem Atom in einer Verbindung, und die Addition dieses Elektrons an eine andere Verbindung ist eine Reduktionsreaktion. Da Oxidation und Reduktion normalerweise zusammen auftreten, werden diese Reaktionspaare als Oxidations-Reduktions-Reaktionen oder Redox-Reaktionen bezeichnet.

Elektronen und Energie

Die Entfernung eines Elektrons aus einem Molekül (Oxidation) führt zu einer Abnahme der potentiellen Energie in der oxidierten Verbindung. Das Elektron (manchmal als Teil eines Wasserstoffatoms) bleibt jedoch im Zytoplasma einer Zelle nicht ungebunden.Vielmehr wird das Elektron zu einer zweiten Verbindung verschoben, wodurch die zweite Verbindung reduziert wird. Die Verschiebung eines Elektrons von einer Verbindung zu einer anderen entfernt etwas potentielle Energie von der ersten Verbindung (der oxidierten Verbindung) und erhöht die potentielle Energie der zweiten Verbindung (der reduzierten Verbindung). Die Übertragung von Elektronen zwischen Molekülen ist wichtig, da die meiste Energie, die in Atomen gespeichert ist und für Brennstoffzellenfunktionen verwendet wird, in Form von hochenergetischen Elektronen vorliegt. Die Übertragung von Energie in Form von hochenergetischen Elektronen ermöglicht es der Zelle, Energie inkrementell zu übertragen und zu nutzen – in kleinen Paketen statt in einem einzelnen, zerstörerischen Burst. Dieses Kapitel konzentriert sich auf die Gewinnung von Energie aus der Nahrung. Sie werden feststellen, dass Sie, wenn Sie den Weg der Übertragungen verfolgen, den Weg der Elektronen verfolgen, die sich durch die Stoffwechselwege bewegen.

Elektronenträger

In lebenden Systemen fungiert eine kleine Klasse von Verbindungen als Elektronentransporter: Sie binden und transportieren hochenergetische Elektronen zwischen Verbindungen auf biochemischen Wegen. Die wichtigsten Elektronenüberträger, die wir betrachten werden, stammen von der B-Vitamingruppe und sind Derivate von Nukleotiden. Diese Verbindungen lassen sich leicht reduzieren (dh sie nehmen Elektronen auf) oder oxidieren (sie verlieren Elektronen). Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) (Abbildung 7.2) wird von Vitamin B . abgeleitet3, Niacin. NAD + ist die oxidierte Form des Moleküls NADH ist die reduzierte Form des Moleküls, nachdem es zwei Elektronen und ein Proton aufgenommen hat (die zusammen einem Wasserstoffatom mit einem zusätzlichen Elektron entsprechen). Beachten Sie, dass eine Verbindung mit einem „H“ im Allgemeinen reduziert ist (z. B. ist NADH die reduzierte Form von NAD).

NAD + kann Elektronen von einem organischen Molekül nach der allgemeinen Gleichung aufnehmen:

Wenn Elektronen zu einer Verbindung hinzugefügt werden, es ist reduziert. Eine Verbindung, die eine andere reduziert, wird als Reduktionsmittel bezeichnet. In der obigen Gleichung ist RH ein Reduktionsmittel und NAD + wird zu NADH reduziert. Wenn Elektronen aus einer Verbindung entfernt werden, es ist oxidiert. Eine Verbindung, die eine andere oxidiert, wird als Oxidationsmittel bezeichnet. In der obigen Gleichung ist NAD + ein Oxidationsmittel und RH wird zu R oxidiert.

In ähnlicher Weise wird Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD + ) aus Vitamin B . abgeleitet2, auch Riboflavin genannt. Seine reduzierte Form ist FADH2. Eine zweite Variation von NAD, NADP, enthält eine zusätzliche Phosphatgruppe. Sowohl NAD + als auch FAD + werden in großem Umfang bei der Energiegewinnung aus Zuckern verwendet, und NADP spielt eine wichtige Rolle bei anabolen Reaktionen und der Photosynthese in Pflanzen.

ATP in lebenden Systemen

Eine lebende Zelle kann keine nennenswerten Mengen an freier Energie speichern. Überschüssige freie Energie würde zu einem Anstieg der Wärme in der Zelle führen, was zu einer übermäßigen thermischen Bewegung führen würde, die die Zelle beschädigen und dann zerstören könnte. Vielmehr muss eine Zelle in der Lage sein, diese Energie so zu verarbeiten, dass sie Energie sicher speichern und nur bei Bedarf zur Verwendung freigeben kann. Lebende Zellen erreichen dies durch die Verwendung der Verbindung Adenosintriphosphat (ATP). ATP wird oft als „Energiewährung“ der Zelle bezeichnet, und wie eine Währung kann diese vielseitige Verbindung verwendet werden, um jeden Energiebedarf der Zelle zu decken. Wie? Es funktioniert ähnlich wie ein Akku.

Beim Abbau von ATP, in der Regel durch die Entfernung seiner endständigen Phosphatgruppe, wird Energie frei. Die Energie wird von der Zelle verwendet, um Arbeit zu verrichten, normalerweise wenn das freigesetzte Phosphat an ein anderes Molekül bindet und es dadurch aktiviert. Bei der mechanischen Arbeit der Muskelkontraktion liefert ATP beispielsweise die Energie, um die kontraktilen Muskelproteine ​​zu bewegen. Erinnern Sie sich an die aktive Transportarbeit der Natrium-Kalium-Pumpe in Zellmembranen. ATP verändert die Struktur des integralen Proteins, das als Pumpe fungiert, indem es seine Affinität zu Natrium und Kalium ändert. Auf diese Weise verrichtet die Zelle Arbeit, indem sie Ionen gegen ihre elektrochemischen Gradienten pumpt.

ATP-Struktur und -Funktion

Das Herzstück von ATP ist ein Molekül Adenosinmonophosphat (AMP), das aus einem Adeninmolekül besteht, das an ein Ribosemolekül und an eine einzelne Phosphatgruppe gebunden ist (Abbildung 7.3). Ribose ist ein Zucker mit fünf Kohlenstoffatomen, der in RNA vorkommt, und AMP ist eines der Nukleotide in RNA. Die Anlagerung einer zweiten Phosphatgruppe an dieses Kernmolekül führt zur Bildung von Adenosin diPhosphat (ADP) die Addition einer dritten Phosphatgruppe bildet Adenosin triPhosphat (ATP).

Die Addition einer Phosphatgruppe an ein Molekül erfordert Energie. Phosphatgruppen sind negativ geladen und stoßen sich daher ab, wenn sie wie in ADP und ATP in Reihe geschaltet sind. Diese Abstoßung macht die ADP- und ATP-Moleküle von Natur aus instabil. Die Freisetzung einer oder zweier Phosphatgruppen aus ATP, ein Vorgang, der als Dephosphorylierung bezeichnet wird, setzt Energie frei.

Energie aus ATP

Hydrolyse ist der Prozess des Zerbrechens komplexer Makromoleküle. Während der Hydrolyse wird Wasser gespalten oder lysiert und das resultierende Wasserstoffatom (H + ) und eine Hydroxylgruppe (OH – ) oder Hydroxid, werden dem größeren Molekül hinzugefügt. Bei der Hydrolyse von ATP entsteht ADP, zusammen mit einem anorganischen Phosphation (Pich) und die Freisetzung von freier Energie. Zur Durchführung von Lebensvorgängen wird ATP kontinuierlich zu ADP abgebaut und wie ein Akku wird ADP durch die Wiederanlagerung einer dritten Phosphatgruppe kontinuierlich zu ATP regeneriert. Wasser, das während der ATP-Hydrolyse in sein Wasserstoffatom und seine Hydroxylgruppe (Hydroxid) zerlegt wurde, wird regeneriert, wenn dem ADP-Molekül ein drittes Phosphat zugesetzt wird, wodurch ATP zurückgebildet wird.

Offensichtlich muss dem System Energie zugeführt werden, um ATP zu regenerieren. Woher kommt diese Energie? In fast jedem Lebewesen auf der Erde stammt die Energie aus dem Stoffwechsel von Glukose, Fruktose oder Galaktose, alles Isomere mit der chemischen Formel C6h12Ö6 aber unterschiedliche molekulare Konfigurationen. Auf diese Weise ist ATP eine direkte Verbindung zwischen den begrenzten exergonischen Stoffwechselwegen des Glukosekatabolismus und der Vielzahl endergonischer Stoffwechselwege, die lebende Zellen antreiben.

Phosphorylierung

Denken Sie daran, dass Enzyme bei einigen chemischen Reaktionen an mehrere Substrate binden können, die miteinander am Enzym reagieren und einen Zwischenkomplex bilden. Ein intermediärer Komplex ist eine temporäre Struktur und ermöglicht es einem der Substrate (wie ATP) und Reaktanten, bei Reaktionen mit ATP leichter miteinander zu reagieren, ATP ist eines der Substrate und ADP ist ein Produkt. Während einer endergonischen chemischen Reaktion bildet ATP einen intermediären Komplex mit dem Substrat und dem Enzym in der Reaktion. Dieser Zwischenkomplex ermöglicht es dem ATP, seine dritte Phosphatgruppe mit ihrer Energie auf das Substrat zu übertragen, ein Prozess, der als Phosphorylierung bezeichnet wird. Phosphorylierung bezieht sich auf die Zugabe des Phosphats (

P). Dies wird durch die folgende generische Reaktion veranschaulicht, in der A und B zwei verschiedene Substrate darstellen:

Wenn der Zwischenkomplex zerfällt, wird die Energie verwendet, um das Substrat zu modifizieren und in ein Reaktionsprodukt umzuwandeln. Das ADP-Molekül und ein freies Phosphation werden in das Medium freigesetzt und stehen für das Recycling durch den Zellstoffwechsel zur Verfügung.

Substratphosphorylierung

ATP wird durch zwei Mechanismen beim Abbau von Glukose gebildet. Einige wenige ATP-Moleküle werden als direktes Ergebnis der chemischen Reaktionen, die in den katabolen Stoffwechselwegen stattfinden, erzeugt (d. h. aus ADP regeneriert). Eine Phosphatgruppe wird von einem intermediären Reaktanten im Reaktionsweg entfernt, und die freie Energie der Reaktion wird verwendet, um das dritte Phosphat zu einem verfügbaren ADP-Molekül hinzuzufügen, wodurch ATP entsteht (Abbildung 7.4). Diese sehr direkte Methode der Phosphorylierung wird als Substrat-Level-Phosphorylierung bezeichnet.

Oxidative Phosphorylierung

Der größte Teil des während des Glukosekatabolismus erzeugten ATP stammt jedoch aus einem viel komplexeren Prozess, der Chemiosmose, die in Mitochondrien (Abbildung 7.5) innerhalb einer eukaryontischen Zelle oder der Plasmamembran einer prokaryontischen Zelle stattfindet. Chemiosmose, ein Prozess der ATP-Produktion im Zellstoffwechsel, wird verwendet, um 90 Prozent des ATP zu erzeugen, das während des Glukose-Katabolismus gebildet wird, und ist auch die Methode, die bei den Lichtreaktionen der Photosynthese verwendet wird, um die Energie des Sonnenlichts zu nutzen. Die Produktion von ATP durch den Prozess der Chemiosmose wird aufgrund der Beteiligung von Sauerstoff an diesem Prozess als oxidative Phosphorylierung bezeichnet.

Karriereverbindung

Arzt für Mitochondrienerkrankungen

Was passiert, wenn die kritischen Reaktionen der Zellatmung nicht richtig ablaufen? Dies kann bei mitochondrialen Erkrankungen vorkommen, bei denen es sich um genetische Stoffwechselstörungen handelt. Mitochondriale Störungen können durch Mutationen in der nuklearen oder mitochondrialen DNA entstehen und führen zu einer geringeren Energieproduktion als in Körperzellen normal. Bei Typ-2-Diabetes beispielsweise ist die Oxidationseffizienz von NADH reduziert, was sich auf die oxidative Phosphorylierung auswirkt, aber nicht auf die anderen Atmungsschritte. Symptome von mitochondrialen Erkrankungen können Muskelschwäche, Koordinationsstörungen, Schlaganfall-ähnliche Episoden sowie Seh- und Hörverlust sein. Die meisten Betroffenen werden im Kindesalter diagnostiziert, obwohl es einige Krankheiten gibt, die im Erwachsenenalter beginnen. Die Erkennung und Behandlung mitochondrialer Erkrankungen ist ein medizinisches Spezialgebiet. Die schulische Vorbereitung auf diesen Beruf erfordert eine Hochschulausbildung, gefolgt von einem Medizinstudium mit Spezialisierung auf medizinische Genetik. Medizinische Genetiker können vom American Board of Medical Genetics zertifiziert werden und mit professionellen Organisationen verbunden werden, die sich der Erforschung mitochondrialer Erkrankungen widmen, wie der Mitochondrial Medicine Society und der Society for Inherited Metabolic Disorders.


Wie koppelt ATP endergonische und exergonische Reaktionen?

Die Frage ist etwas irreführend - ATP bringt endergonische Reaktionen zum Laufen, weil

  1. es ist eine exergonische Reaktion selbst, und
  2. es Paare selbst zur endergonischen Reaktion, so dass die Gesamtreaktion exergonisch ist.

Es gibt viele andere Beispiele für die Wirkung von ATP, aber in fast allen Fällen ist eine Substanz phosphoryliert. Wie immer ist dieses phosphorylierte Zwischenprodukt reaktiver als der ursprüngliche Reaktant, und so wird eine ehemals endergonische Reaktion durch die Kopplung der ursprünglichen Reaktion mit der Hydrolyse von ATP exeronisch.

Quelle: "Biology", 7. Aufl., Campbell & Reece

6 Kommentare:

mein Lehrer hat diese Seite benutzt :)
besser erklärt als er!

Hervorragende, einfache, klare Erklärung. Ich habe schon oft darüber gelesen, aber ich bin nie auf die Erklärung gestoßen, wie das Phosphat das Zwischenprodukt weniger stabil macht. Vielen Dank!

Ich habe eine Frage.
Ich weiß, dass Sie die Frage, wie ATP bei diesen Reaktionen verwendet wird, ziemlich ausführlich beantwortet haben, aber ich hatte gehofft, eine noch tiefere Intuition für die Antwort zu erhalten.

Nehmen wir nach meinem derzeitigen Verständnis an, dass ein Reaktant, R1, an ein Phosphat gebunden wird und mit einem anderen Reaktanten, R2, reagiert, um R2-R1-P . zu bilden

Es scheint mir, dass dies an sich nicht *wirklich* erklärt, warum dieses Phosphat die Reaktion günstiger macht. Wenn Sie jedoch postulieren, dass es einen weiteren Schritt in der Reaktion gibt, bei dem das Produkt wie folgt bricht:

R1-Pi + R2 --> R2-R1-Pi --> R2-R1 + Pi

Nun wäre es sinnvoll, wenn Pi an R1 angehängt wurde, es reaktiver zu machen: Da das Produkt im ersten Schritt schnell in R2-R1 und Pi zerfiel, wird die Reaktion gemäß dem Prinzip von Le Chatalier nach rechts getrieben, Dadurch werden sie "bevorzugt" und produzieren mehr Produkte.

Ich bin mir nicht sicher, ob das tatsächlich so funktioniert, aber haben Sie irgendwelche Erkenntnisse darüber, wie ich das verstehe?

Sorry für einen sehr langen Kommentar.

SEHR guter Beitrag, der in wenigen kurzen Absätzen leicht beschrieben wurde, was ich nach dem Lesen von fünfzehn Seiten meines Textes nicht zusammensetzen konnte. Dankeschön.

Im Folgenden gebe ich meine Logik an, dass ATP eine endergonische Reaktion auslöst. Sie wird in Lehrbüchern als negative Gibbs-Energie der Gesamtreaktion erklärt. Diese Erklärung hat ein Problem. Die Gibbs-Energie ist eine Zustandsfunktion. Daher wäre die Gesamtreaktion als Summe der beiden Reaktionen, der endergonischen und der Hydrolyse von ATP, nicht sinnvoll, da dies impliziert, dass die endergonische Reaktion stattfindet.

Bei einem gegebenen P,T gibt es ein Gleichgewichtsverhältnis der Anzahl der Produktmoleküle zu den Reaktantenmolekülen. Sie können es als Produkt betrachten, das kontinuierlich gebildet wird und in Reaktanten zerfällt, wobei beides statistisch eine Funktion der Anzahl der Kollisionen zwischen Molekülen ist. Wenn Sie in einer exergonischen Reaktion weitere Reaktanten hinzufügen, erhöht sich die Anzahl der Produktmoleküle und die umgekehrte Geschwindigkeit, bis schließlich ein Verhältnis erreicht ist, in dem sich beide Geschwindigkeiten ausgleichen.
Im Gleichgewicht unter physiologischen Bedingungen gibt es weit mehr ADP als ATP. Wenn ATP hinzugefügt wird, wird es daher zu ADP und Pi hydrolysiert. Bei einer endergonischen Reaktion sind die Produkte weniger als Reaktanten. Fügen Sie ATP hinzu, und wir erhalten ADP und ein neues Produkt, den phosphrylierten Reaktanten. Diese Reaktion ist exergonisch, aber nicht so exergonisch wie die ATP-Hydrolyse. Der Abbau des phosphorylierten Reaktanten zu Pi und Endprodukt ist ebenfalls exergonisch. Somit haben wir ein insgesamt größeres Verhältnis von Endprodukt zu Reaktant. Wir zahlen einen Preis in Form einer höheren Konzentration von ATP zu ADP bei einem Gleichgewicht, wenn ein endergonisches Produkt in der Mischung vorhanden ist.


RESULTATE UND DISKUSSIONEN

EcoPI hat einen zweiphasigen ATPase-Zyklus auf einem Oligoduplex ähnlich dem von EcoP15I, aber mit unterschiedlichen scheinbaren Effizienzen bei der ATP-Kopplung

Um zu untersuchen, ob die EcoP15I-DNA-Interaktion bei der Erzeugung eines Dualphasen-ATPase-Profils ungewöhnlich war, untersuchten wir zunächst die Aktivität von EcoPI auf einem Oligoduplex-Substrat mit derselben vor- und nachgelagerten DNA-Sequenz (Abbildung 2A). EcoPI ist homolog zu EcoP15I, die Res-Untereinheiten (enthalten die helikaseähnlichen und Nuklease-Domänen) teilen ∼90% Identität, während die Mod-Untereinheiten (die die Methyltransferase- und DNA-Zielerkennungsdomänen enthalten) eine Identität von >60% aufweisen (wobei die meisten Unterschiede zwischen der Zielerkennung liegen Domänen - TRDs) ( 12). Trotz der Ähnlichkeiten auf Sequenzebene haben wir und andere einige Unterschiede in den Enzymeigenschaften festgestellt (9, 13–16). Wir analysierten EcoPI unter Verwendung von Stopped-Flow-Assays mit Millisekunden-Zeitauflösung, die zuvor auf EcoP15I angewendet wurden (4): Die ATPase-Aktivität wurde unter Verwendung eines fluoreszierenden Phosphat-bindenden Proteins gemessen. Die Bindung und Dissoziation von EcoP15I von seinem Oligoduplex wurde zuvor unter Verwendung eines Fluoreszenzanisotropie-Assays gemessen (4). Leider konnten wir mit diesem Assay unter Verwendung von EcoPI keine messbare Signaländerung erhalten.

Die ATPase-Reaktionen wurden durch schnelles Mischen eines vorinkubierten, gesättigten EcoPI-Oligoduplex-Komplexes mit ATP und Heparin (letzteres als Falle, um dissoziierte Enzyme einzufangen und so kinetische Bedingungen mit einem einzigen Umsatz in Bezug auf die DNA-Bindung zu schaffen) initiiert. Unvollständiges Trapping und DNA-Rebinding führt zu einer linearen Steady-State-Rate, die vor der weiteren Analyse korrigiert werden musste (ergänzende Abbildung S1B). Die Kinetik kann in eine schnelle Burst-Phase und eine langsamere exponentielle Burst-Phase entfaltet werden (Materialien und Methoden). Das korrigierte Phosphatfreisetzungsprofil zeigt deutliche Hinweise auf zwei kinetische Phasen, die denen analog sind, die zuvor mit EcoP15I beobachtet wurden (Abbildung 2B). Die Amplituden des ersten und zweiten Bursts – wie viel ATP während dieser Zustände verbraucht wird – könnten aus dem Ordinatenabschnitt bzw. der Amplitude der exponentiellen Phase geschätzt werden (Gl. (1), ergänzende Abbildung S1C). Die Geschwindigkeitskonstante gab ein Maß für die Lebensdauer des Zustands (bevor er zum DNA-Sliding wechselt). Daher konnte eine lineare ATPase-Rate für die zweite Phase basierend auf der Lebenszeit und der Anzahl der während der Lebenszeit verbrauchten ATPs geschätzt werden (Gl. (2)). Beachten Sie, dass die beobachtete Geschwindigkeit tatsächlich abnimmt, wenn das Enzym von seiner Erkennungsstelle dissoziiert. Die ATPase-Rate der ersten Phase wurde durch einen linearen Fit geschätzt (Ergänzende Abbildung S1D).

Die Rate und Amplitude der ersten EcoPI-Burst-Phase waren den Werten von EcoP15I sehr ähnlich (Abbildung 2C). Wir fanden auch, dass die Kinetik der EcoPI-Konformationsänderung, gemessen durch Tryptophanfluoreszenz (Abbildung 2D), eine enge Übereinstimmung mit der Kinetik des ersten Bursts (Abbildung 2E) zeigte, wie für EcoP15I (4) zu sehen. Die Kinetik der zweiten Phasen war jedoch ganz anders, wobei EcoPI ein Drittel so viel ATP mit einer fünfmal langsameren Geschwindigkeit verbrauchte.

Wir haben zuvor für EcoP15I gezeigt, dass die Geschwindigkeit der exponentiellen zweiten Burst-Phase der geschwindigkeitsbestimmenden Dissoziation von der DNA entsprach (die angesichts des schnellen 1D-Gleitens und der kurzen DNA-Länge der Zeit zum Entweichen aus der Stelle entsprach) (4). Obwohl wir die Dissoziationskinetik von EcoPI nicht direkt messen konnten, konnten wir aus der exponentiellen zweiten Burst-Phase des EcoPI-ATPase-Profils schließen, dass die Lebensdauer an der Stelle ∼11,5 s beträgt, was fast doppelt so hoch ist wie die von EcoP15I (Abbildung 2C). . Dies ist überraschend, da frühere Ergebnisse nahelegen, dass EcoPI schwächer gebunden ist als EcoP15I (9). Die langsamere Dissoziation könnte auf die langsamere beobachtete ATPase-Rate zurückzuführen sein. Nichtsdestotrotz würde der Unterschied zwischen EcoPI und EcoP15I in der Anzahl der verbrauchten ATPs in der zweiten Burst-Phase bedeuten, dass diese Stufe im Prozess keine feste Anzahl gekoppelter ATP-Hydrolyseschritte erfordert.

Die Kinetik der ATP-Hydrolyse durch EcoP15I wird durch die Nähe der DNA-Enden zur Stelle beeinflusst

In den vorherigen EcoP15I-Experimenten entschieden wir uns für die Verwendung eines kurzen Oligoduplex-Substrats (Abbildung 1A), damit wir die ATPase- und Tryptophan-Fluoreszenzdaten leicht mit einem auf Anisotropie basierenden DNA-Dissoziationsassay vergleichen konnten (4). Um zu untersuchen, ob die DNA-Länge die beobachtete Enzymaktivität beeinflusst, haben wir die EcoP15I-ATPase-Kinetik unter Verwendung längerer linearer DNA gemessen (Abbildung 3A), wobei die Stelle entweder zentral (206/206_P15I) oder an distalen Positionen lag, wo entweder die stromaufwärts gelegene DNA Länge (6/206_P15I) oder Downstream-DNA-Länge (206/38_P15I) stimmte mit denen im Oligoduplex (6/38_EcoP15I, Abbildung 1A) überein. Außerdem testeten wir ein DNA-Substrat, das anschließend im SPR-Assay verwendet wurde (89/206Bio_P15I - siehe unten). Die DNA-Enden wurden frei von Protein-Blockaden (d. h. „unverkappt“) gelassen, sodass gleitende Enzyme dissoziieren und von Heparin eingefangen werden konnten, was eine Single Turnover Burst-Kinetik ergab.

EcoP15I ATPase-Kinetik unter Verwendung längerer DNA-Substrate. (EIN) Cartoons des Oligoduplex und längere DNA-Substrate. Biotin wird als roter Kreis dargestellt. (B) Vorgeformte EcoP15I-DNA-Komplexe (25 nM) wurden wie angegeben schnell mit 4 mM ATP und 200 μM Heparin gemischt und die Phosphatfreisetzung gemessen (Materialien und Methoden). Eine erneute Bindung an die DNA wurde durch eine Heparinfalle verhindert. (C) Anpassung der unkorrigierten ATPase-Profile an Gl. (3) (obere Grafiken) und die Restdifferenzen zwischen den experimentellen Daten und Anpassungen (untere Grafiken). Beachten Sie, dass die Residuendiagramme mit einer logarithmischen Zeitbasis dargestellt werden, um die Abweichungen über drei Zeitdekaden klar darzustellen. (D) Kinetische Konstanten für die längeren DNA-Substrate bestimmt.Kinetikwerte für die erste und zweite Burst-Phase der Profile 206/38_P15I und 6/206_P15I wurden mittels Dekonvolution wie in Abbildung 2 bestimmt. Die Kinetik der zweiten Phase konnte für 89/206Bio_P15I oder 206/206_P15I nicht ohne weiteres entfaltet werden (nd = nicht bestimmt) . Die Anzahl der verbrauchten ATPs wurde unter Verwendung von Gl. ( 3). Die ATPase-Raten wurden unter Verwendung eines linearen Fits (nicht gezeigt) bestimmt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei Wiederholungen berechnet.

EcoP15I ATPase-Kinetik unter Verwendung längerer DNA-Substrate. (EIN) Cartoons des Oligoduplex und längere DNA-Substrate. Biotin wird als roter Kreis dargestellt. (B) Vorgeformte EcoP15I-DNA-Komplexe (25 nM) wurden wie angegeben schnell mit 4 mM ATP und 200 μM Heparin gemischt und die Phosphatfreisetzung gemessen (Materialien und Methoden). Eine erneute Bindung an die DNA wurde durch eine Heparinfalle verhindert. (C) Anpassung der unkorrigierten ATPase-Profile an Gl. (3) (obere Grafiken) und die Restdifferenzen zwischen den experimentellen Daten und Anpassungen (untere Grafiken). Beachten Sie, dass die Residuendiagramme mit einer logarithmischen Zeitbasis dargestellt werden, um die Abweichungen über drei Zeitdekaden klar darzustellen. (D) Kinetische Konstanten für die längeren DNA-Substrate bestimmt. Kinetikwerte für die erste und zweite Burst-Phase der Profile 206/38_P15I und 6/206_P15I wurden mittels Dekonvolution wie in Abbildung 2 bestimmt. Die Kinetik der zweiten Phase konnte für 89/206Bio_P15I oder 206/206_P15I nicht ohne weiteres entfaltet werden (nd = nicht bestimmt) . Die Anzahl der verbrauchten ATPs wurde unter Verwendung von Gl. ( 3). Die ATPase-Raten wurden unter Verwendung eines linearen Fits (nicht gezeigt) bestimmt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei Wiederholungen berechnet.

Die Phosphatfreisetzungsprofile zeigen deutlich, dass proximale DNA-Enden die ATPase-Kinetik beeinflussen (Abbildung 3B-D). Das Profil für 206/38_P15I war eindeutig zweiphasig und ähnlich dem, das mit 6/38_P15I (4) beobachtet wurde, wenn auch mit offensichtlichen Unterschieden in den Raten/Amplituden (Abbildungen 2C und 3D). Im Gegensatz dazu zeigten sowohl 206/206_P15I als auch 89/206Bio_P15I ATPase-Reaktionsprofile, die sich im Aussehen von den klaren zweiphasigen Profilen von 6/38_P15I und 206/38_P15I unterschieden. Die 6/206_P15I-DNA zeigte ein intermediäres Profil, bei dem eine zweite Phase merklich kleiner war als bei 206/38_P15I, aber immer noch sichtbarer als die DNA mit zentraler gelegenen Stellen. Es schien daher, dass die Position der DNA-Enden sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der EcoP15I-Stelle im Oligoduplex die Form der beobachteten ATPase-Profile beeinflussen könnte.

Für 6/206_P15I und 206/38_P15I, bei denen das Reaktionsprofil klar in zwei Phasen aufgeteilt werden konnte, konnten wir den gleichen Dekonvolutionsprozess wie oben (Materialien und Methoden) anwenden. Für 206/206_P15I und 89/206Bio_P15I konnten wir jedoch keine zweite Burst-Phase identifizieren und zufriedenstellend anpassen. Um die verschiedenen Profile zu vergleichen, haben wir versucht, die unkorrigierten Daten direkt an eine einzelne exponentielle plus stationäre Linearität anzupassen (um einen niedrigen stationären Zustand zu berücksichtigen, der wahrscheinlich eine DNA-Rebindung aufgrund des Austritts aus der Heparinfalle widerspiegelt – Gl. (3), Materialien und Methoden) (Abbildung 3C). Für die Profile 6/206_P15I und 206/38_P15I zeigten die Darstellungen der Restdifferenzen zwischen den angepassten und experimentellen Daten deutliche systematische Abweichungen, insbesondere während der ersten Burst-Phase. Die Abweichungen waren am größten für 6/206_P15I, das deutlicher zweiphasig ist. Für 206/206_P15I und 89/206Bio_P15I beobachteten wir immer noch systematische Abweichungen, diese waren jedoch geringer als bei den anderen Substraten. Da wir den Dekonvolutionsprozess für diese DNA nicht anwenden konnten, verwendeten wir die Amplitude der exponentiellen Anpassung, um den ATP-Verbrauch abzuschätzen. Die anfängliche ATPase-Rate wurde aus einer linearen Anpassung wie oben (Materialien und Methoden) geschätzt.

Die für die längere DNA ermittelten Amplituden und Raten werden in Abbildung 3D verglichen. Die beobachteten Raten der ersten Burst-Phasen waren für alle DNA ähnlich, jedoch mit einer erhöhten Burst-Amplitude, wo die DNA-Enden weiter von der Stelle entfernt waren. Im Gegensatz dazu variierten die ATPase-Raten und -Amplituden der zweiten Burst-Phase merklich mit der Position des Standorts. Für 6/206_P15I und 206/38_P15I waren die Raten der zweiten Burst-Phasenexponentialfunktion ähnlich denen, die für den Oligoduplex gemessen wurden (Fig. 2C und 3D). Wir könnten dies so interpretieren, dass die Änderungsrate von einem ATP-hydrolysierenden Zustand an der Stelle zu einem nicht-hydrolysierenden Gleitzustand bei all diesen DNAs ähnlich ist. Die Anzahl der während dieses Prozesses verbrauchten ATPs variiert jedoch von 13 bis ∼5, abhängig von der Nähe der DNA-Enden. Für 206/206_P15I und 89/206Bio_P15I betrachteten wir die Raten und Amplituden der zweiten Phasen in Abbildung 3D als nominell Null, obwohl wir anmerken, dass wir die Hydrolyse von ein oder zwei ATPs nach der ersten Phase aufgrund von Nachweisgrenzen in unserem . nicht vollständig ausschließen können Assay. Die Entfernung von einem DNA-Ende eliminiert den Verbrauch von ATP in der zweiten Phase weitgehend. Obwohl wir keinen messbaren zweiten ATPase-Burst haben, zeigen wir unten, dass die Dissoziation auf 89/206Bio_P15I genauso schnell ist wie auf dem Oligoduplex. Aus dem gleichen Grund betrachten wir die lineare Steady-State-Phase nicht als eine langsame zweite ATP-Phase, die mit einer langsamen DNA-Dissoziation verbunden ist.

Wir haben auch die Änderung der EcoP15I-Tryptophan-Fluoreszenz unter Verwendung von 206/206 als Substrat gemessen (Abbildung 4). Die Kinetik korreliert eng mit dem ersten ATPase-Burst, wie zuvor bei Verwendung des Oligoduplex-Substrats (4). Diese Daten legen nahe, dass die einzelne Phase der ATPase-Aktivität, die auf 206/206_P15I und 89/206Bio_P15I beobachtet wird, ausreichend ist, um die Konformationsänderung zu erzeugen und aufrechtzuerhalten. Es scheint, dass die ATP-Hydrolyse im Anschluss an die Konformationsänderung nur beobachtet wird, wenn ein stromabwärts gelegenes DNA-Ende sich in der Nähe der Erkennungsstelle befindet.

Die Kinetik des ATPase-Bursts stimmt mit der Änderung der Tryptophan-Fluoreszenz überein, die mit einem längeren DNA-Substrat gemessen wurde. Vergleich des vollständigen ATPase-Profils (schwarz) aus Abbildung 3C mit der Tryptophan-Fluoreszenzänderung, die während der EcoP15I-Dissoziation von 206/206_P15I (grau) beobachtet wurde. Für das Tryptophan-Fluoreszenz-Experiment waren die Endreaktionsbedingungen 25 nM 206/206_P15I, 50 nM EcoP15I, 4 mM ATP und 2,5 µM Heparin.

Die Kinetik des ATPase-Bursts stimmt mit der Änderung der Tryptophan-Fluoreszenz überein, die mit einem längeren DNA-Substrat gemessen wurde. Vergleich des vollständigen ATPase-Profils (schwarz) aus Abbildung 3C mit der Tryptophan-Fluoreszenzänderung, die während der EcoP15I-Dissoziation von 206/206_P15I (grau) beobachtet wurde. Für das Tryptophan-Fluoreszenz-Experiment waren die Endreaktionsbedingungen 25 nM 206/206_P15I, 50 nM EcoP15I, 4 mM ATP und 2,5 µM Heparin.

Ein Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Assay zur Messung der Dissoziation von EcoP15I von nicht verkappter und verkappter DNA

Um die ATPase- und Konformationsänderungskinetik in den Abbildungen 3 und 4 mit der Initiation des DNA-Slidings zu korrelieren, haben wir einen Assay entwickelt, um die DNA-Assoziation und -Dissoziation zu verfolgen, die mit längeren DNA-Substraten kompatibel ist (Materialien und Methoden). Wir verwendeten einen SPR-basierten Assay, der es ermöglicht, die Dissoziation von DNA, die an die Chipoberfläche gebunden ist (über eine Biotin-Streptavidin-Verknüpfung), in Echtzeit zu verfolgen und der auch einen schnellen Austausch von Pufferkomponenten ermöglicht (Abbildung 5A) ( 17, 18). Die Reaktionen wurden hinsichtlich der Hintergrundbindung unter Verwendung einer in Serie befindlichen Referenzoberfläche ohne DNA (Materialien und Methoden) korrigiert. Verglichen mit dem Oligoduplex-Anisotropie-Assay (4) hat der SPR-Assay den Vorteil, dass wir lineare DNA größerer Länge überwachen können und dass wir das freie Ende der DNA leicht abdecken können, um den Effekt zu beobachten, dass nur eine Endo-Dissoziation zugelassen wird. Ein DNA-Substrat mit einer einzelnen EcoP15I-Stelle (89/206Bio_P15I) wurde durch PCR unter Verwendung eines mit Biotin markierten Primers hergestellt ( 3A ) (Materialien und Methoden). Die Bindung der DNA an die Streptavidin/Dextran-Oberfläche des Chips bedeckt ein Ende der DNA, wodurch eine Dissoziation während des Gleitens über dieses Ende verhindert wird, das gegenüberliegende Ende war entweder nicht verschlossen oder mit einem Protein verschlossen (siehe unten). Nach der Initiierung des Gleitens durch ATP-Hydrolyse würde die Exo-Dissoziation von nicht verkapptem 89/206Bio_P15I <3 ms dauern (4, 10). Daher können wir immer noch die Geschwindigkeit der DNA-Dissoziation über ein Ende als Proxy für die Freisetzungsgeschwindigkeit der Stelle in das Gleiten verwenden. Mit anderen Worten, alle beobachteten Unterschiede zwischen den Dissoziationsraten von 6/38_P15I im Vergleich zu nicht gedeckeltem 89/206Bio_P15I würden eher unterschiedliche Ereignisse am Standort widerspiegeln als Unterschiede in der gleitenden Lebensdauer.

Der Oberflächenplasmonenresonanz-Assay zur Messung der DNA-Assoziation und -Dissoziation durch Restriktions-Modifikations-Enzyme vom Typ III. (EIN) Cartoon der Schritte im Assay. Die verwendete DNA war 89/206Bio_P15I. (B) Repräsentative Veränderungen der Reaktionseinheiten (RU) während der Proteinassoziation und -dissoziation. Farbige Blöcke zeigen die kontinuierliche Injektion der Enzyme (grau), ATP (4 mM, rot) oder NaCl (grün).

Der Oberflächenplasmonenresonanz-Assay zur Messung der DNA-Assoziation und -Dissoziation durch Restriktions-Modifikations-Enzyme vom Typ III. (EIN) Cartoon der Schritte im Assay. Die verwendete DNA war 89/206Bio_P15I. (B) Repräsentative Veränderungen der Reaktionseinheiten (RU) während der Proteinassoziation und -dissoziation. Farbige Blöcke zeigen die kontinuierliche Injektion der Enzyme (grau), ATP (4 mM, rot) oder NaCl (grün).

In einem typischen Experiment (Abbildung 5A, obere Platte) wurde Enzym über den Chip injiziert, um die DNA zu binden. Der Pufferfluss war kontinuierlich, was eine Dissoziation und Gleichgewichtseinstellung der Bindung zu einem stationären Zustand ermöglichte. Nach einem Waschschritt wird dann die Dissoziation durch Injektion von Nukleotiden wie ATP (bei 4 mM) initiiert. Abschließend wird der DNA-Chip mit NaCl regeneriert und es können weitere Experimente durchgeführt werden. Um die Dissoziation von verkappter DNA zu messen (Abbildung 5A, unteres Feld), haben wir auch eine Helikasemutante des endverarbeitenden Enzyms AddAB (AddA h B), in dem das Walker-A-Motiv von AddA mutiert wurde (K36A), um die ATP-Hydrolyse zu verhindern (Materialien und Methoden) (11, 19). Füge hinzu ein h B bindet fest und spezifisch an DNA-Enden und wird von ATP nicht beeinflusst (11, 19). Die Dissoziation von EcoP15I von dieser DNA muss über Endo-Dissoziation erfolgen.

Repräsentative SPR-Rohprofile, aufgetragen als Reaktionseinheiten gegen die Zeit, sind in Abbildung 5B gezeigt (Versuche, ähnliche Assays mit EcoPI zu wiederholen, waren aufgrund des erhöhten Hintergrundrauschens und des geringen Reaktionssignals erfolglos):

EcoP15I-Assoziation und Dissoziation von nicht verkappter DNA. Die Injektion von EcoP15I verursachte eine Zunahme der Reaktionseinheiten, die der spezifischen DNA-Bindung an der Erkennungsstelle entsprachen. Der gebildete Protein-DNA-Komplex war im Verlauf der Reaktion relativ stabil. Die anschließende Injektion von 4 mM ATP über 180 s führte innerhalb von 60 s zu einer schnellen und nahezu vollständigen Dissoziation von der DNA. Die Zugabe des Nukleotids verursachte eine reproduzierbare Brechungsindexverschiebung in den Reaktionseinheiten, was auf einen Unterschied in der Hintergrundreaktion für die Referenz- und Reaktionsoberflächen hindeutet. Enzyme, die mit der DNA und/oder dem Chip assoziiert blieben, wurden durch die Salzwäsche entfernt, wodurch die Reaktion wiederholt werden konnte (man beachte auch hier den beobachteten Abfall der Reaktionseinheiten während der Salzinjektion aufgrund einer Brechungsindex-Korrekturanomalie).

Stabile Bindung von AddA H B an DNA in Gegenwart von ATP. Injektion von AddA h B verursachte eine Zunahme der Antworteinheiten entsprechend der DNA-Bindung. Nach dem Wechsel auf Puffer allein wurde ein kleiner Dissoziationsschub beobachtet, der zu einem stationären Zustand führte. Obwohl die Injektion von ATP zu einer Verschiebung des Brechungsindexes führte, war der Gehalt an AddA . nach dem Wechsel zurück zum Puffer h Die B-Bindung war nahezu konstant. Füge hinzu ein h Die B-Assoziation mit der DNA konnte anschließend durch die Salzwäsche rückgängig gemacht werden.

EcoP15I-Assoziation und Dissoziation von gecappter DNA. Gleichzeitige Injektion von EcoP15I und AddA h B verursachte einen erhöhten Anstieg der Reaktionseinheiten entsprechend der DNA-Bindung durch beide Enzyme (und äquivalent der Summe der Änderungen der Reaktionseinheiten für aufeinanderfolgende Enzyminjektionen). Nach der Umstellung auf Laufpuffer wurde eine kleine Re-Äquilibrierung aufgrund von AddA . beobachtet h B-Dissoziation. Die nachfolgende Injektion von ATP verursachte eine signifikant langsamere Proteindissoziation von der DNA, die mit einer langsameren Endodissoziation von EcoP15I übereinstimmt (4, 20). Der tatsächliche Prozentsatz der gebundenen DNA könnte durch Subtrahieren der Antworteinheiten entsprechend AddA . korrigiert werden h B. Alle am Ende der Reaktion gebundenen Enzyme könnten unter Verwendung der Salzwäsche dissoziiert werden.

Das mit dem SPR-Assay gemessene Dissoziationsprofil von DNA ohne Kappe konnte an einen einzelnen exponentiellen Zerfall mit einer Geschwindigkeitskonstante von ∼0.08/s angepasst werden (Abbildung 6A). Dieser Wert erschien langsamer als der mit dem Anisotropie-Assay gemessene (∼ 0,15/s) (4). Da einer der Bindungspartner immobilisiert werden muss, können SPR-Messungen durch den Stoffübergangseffekt beeinflusst werden ( 21–23). Um den immobilisierten Liganden zu binden, muss der Analyt zunächst über Diffusion und Konvektion aus der Bulklösung auf die Chipoberfläche gelangen. Wenn dieser Transfer langsamer ist als die Analyt-Ligand-Assoziationsrate und die Dissoziationsrate langsam ist, kann die Lösung nahe der Wechselwirkungsoberfläche an freiem Analyt verarmt werden. Dies kann sowohl die beobachteten Ein- als auch Ausschaltraten begrenzen. Um zu testen, ob unsere Messungen durch Massentransfer beeinflusst wurden, haben wir die EcoP15I-Dissoziation bei Flussraten zwischen 5–100 μl/min gemessen (Daten nicht gezeigt). Der Stofftransport wird durch die Fließgeschwindigkeit beeinflusst, die intrinsische Reaktionsgeschwindigkeit jedoch nicht. Für alle Messungen in dieser Arbeit haben wir eine Flussrate von 30 μl/min angewendet, bei der die Ausschaltrate gesättigt wurde. Darüber hinaus argumentierten wir, dass die beobachtete Geschwindigkeit langsamer sein könnte, da nach der ATP-Zugabe und der DNA-Dissoziation Enzyme mit der immobilisierten DNA reassoziierten. Um dem entgegenzuwirken, fügten wir dem Laufpuffer Heparin hinzu, um dissoziierte Enzyme abzufangen. Dementsprechend hatte die beobachtete Dissoziation eine einzelne exponentielle Geschwindigkeit, die der aus dem Anisotropie-Assay sehr ähnlich war ( 6A ). Leider stellten wir fest, dass die Zugabe der Heparinfalle erhebliche Probleme bei der Reproduzierbarkeit von Lauf zu Lauf verursachte. Folgereaktionen wurden daher ohne Heparin durchgeführt, sofern nicht anders angegeben und müssen daher mit der langsameren scheinbaren Dissoziationsrate verglichen werden.

Dissoziation von EcoP15I von DNA, gemessen unter Verwendung des Oberflächenplasmonenresonanz-Assays. (EIN) (Hauptdiagramm) EcoP15I-DNA-Dissoziation, angetrieben durch Injektion von 180 s ATP in Gegenwart oder Abwesenheit von Heparin. Graue gestrichelte Linien und zugehörige Geschwindigkeitskonstanten sind einzelne exponentielle Anpassungen an die Daten. (Einschub) Vergleich der Dissoziation, die durch den SPR-Assay in Gegenwart von Heparin gemessen wurde, mit der Dissoziation, die von Hexachlorfluorescein-markiertem 6/38_P15I unter Verwendung des Anisotropie-Assays gemessen wurde (Daten aus (4)). Die graue gestrichelte Linie und die zugehörige Geschwindigkeitskonstante sind eine einzelne exponentielle Anpassung an die Anisotropiedaten. (B) Vergleich der EcoP15I-DNA-Dissoziation von nicht verkappter oder verkappter DNA unter verschiedenen Bedingungen. Injektionszeiten waren 180 s (ATP auf DNA ohne Kappe) oder 600 s. (C) Vergleich der EcoP15I-DNA-Dissoziation von nicht verkappter DNA (U, durchgezogene Linie) oder verkappter DNA (C, gestrichelte Linie) nach Injektion von entweder AMP-PNP oder ADP für 1600 s.

Dissoziation von EcoP15I von DNA, gemessen unter Verwendung des Oberflächenplasmonenresonanz-Assays. (EIN) (Hauptdiagramm) EcoP15I-DNA-Dissoziation, angetrieben durch Injektion von 180 s ATP in Gegenwart oder Abwesenheit von Heparin. Graue gestrichelte Linien und zugehörige Geschwindigkeitskonstanten sind einzelne exponentielle Anpassungen an die Daten. (Einschub) Vergleich der Dissoziation, die durch den SPR-Assay in Gegenwart von Heparin gemessen wurde, mit der Dissoziation, die von Hexachlorfluorescein-markiertem 6/38_P15I unter Verwendung des Anisotropie-Assays gemessen wurde (Daten aus (4)). Die graue gestrichelte Linie und die zugehörige Geschwindigkeitskonstante sind eine einzelne exponentielle Anpassung an die Anisotropiedaten. (B) Vergleich der EcoP15I-DNA-Dissoziation von nicht verkappter oder verkappter DNA unter verschiedenen Bedingungen. Injektionszeiten waren 180 s (ATP auf DNA ohne Kappe) oder 600 s. (C) Vergleich der EcoP15I-DNA-Dissoziation von nicht verkappter DNA (U, durchgezogene Linie) oder verkappter DNA (C, gestrichelte Linie) nach Injektion von entweder AMP-PNP oder ADP für 1600 s.

Die Ähnlichkeit in der Dissoziationskinetik zwischen langer und kurzer DNA ( 6A ) schließt aus, dass die beobachteten Unterschiede zwischen den kinetischen Parametern des zweiten ATPase-Bursts in den 2C und 3D mit Änderungen der Dissoziationsrate korreliert sind. d.h. die Kinetik der Freisetzung an der Stelle ist für beide DNA gleich. Stattdessen scheint es, dass die zweite Phase der ATP-Hydrolyse vollständig vom Dissoziationsprozess entkoppelt ist und möglicherweise nur ein Artefakt der Nähe der DNA-Enden im Oligoduplex ist (siehe Diskussion).

Wir haben die Dissoziation von DNA ohne Cap und Cap mit einer Reihe von Nukleotiden (Abbildung 6B und C) wie zuvor (4) gemessen. Bei ATP zeigte die Dissoziation von der verkappten DNA einen kleinen schnellen Burst, gefolgt von einer langsamen Dissoziation mit einer Halbwertszeit von mehr als 600 s. Einzelmolekül- und Ensemble-Assays haben eine Endo-Dissoziationslebensdauer für EcoP15I und EcoPI von ∼200 s vorgeschlagen (4, 20). Die hier beobachtete längere Lebensdauer spiegelt höchstwahrscheinlich massentransportabhängige Rebindungsereignisse in Abwesenheit von Heparin wider. Der kleine schnelle Burst kann auf eine Untergruppe von Enzymen zurückzuführen sein, die auf ATP-abhängige Weise direkt von der Stelle dissoziieren. Auch im Einzelmolekül-Assay wurde eine ATP-abhängige direkte Dissoziation ohne extensives DNA-Sliding beobachtet (4).

Die Injektion von entweder ADP oder des nicht hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP führte zu einer Dissoziationskinetik, die der zuvor mit dem Anisotropie-Assay und unter Verwendung von Oligoduplex 6/38_P15I beobachteten ähnelte (Abbildung 6C) (4). Die Kinetik der gecappten und ungecappten DNAs war in jedem Fall ähnlich, was darauf hindeutet, dass bei diesen Nukleotiden Endodissoziationsereignisse vorherrschen. Bei AMP-PNP ist dies am wahrscheinlichsten, weil kein Gleiten auftritt und eine Dissoziation direkt von der Stelle erfolgt. Im Gegensatz dazu kann ADP ein langlebiges DNA-Sliding unterstützen (4). Obwohl das ADP-Gleiten langsamer ist als das ATP-Gleiten (∼0,5 × 10 6 zufällige einzelne Nukleotidschritte pro Sekunde), sollte EcoP15I immer noch das Ende von unbedecktem 89/206Bio_P15I innerhalb von zehn Millisekunden erreicht haben. Die beobachtete langsame Dissoziation kann darauf zurückzuführen sein, dass der ADP-Gleitzustand fest an DNA-Enden bindet, was den Austritt durch Endo-Dissoziation mit einer ähnlichen Geschwindigkeit wie bei verkappter DNA begünstigt.

Eine Sekunde ATP-Hydrolyse reicht für eine DNA-Dissoziation über mindestens 20 Sekunden aus

Da der SPR-Assay unter kontinuierlichen Flussbedingungen durchgeführt wurde, konnten wir vorübergehend ein Reagens einführen und es dann fast sofort mit Reaktionspuffer wegwaschen. Die anfängliche ATPase-Phase und der Konformationswechsel sind in 1 s abgeschlossen (Abbildungen 2E, 3B und 4) (4). Innerhalb der Grenzen des Biacore T200-Geräts kann ATP auch bis zu einer Inkubationszeit von ∼1 s injiziert werden (Materialien und Methoden). Daher könnten wir vorübergehend ATP einführen, damit der Großteil der ersten Phase abgeschlossen werden kann, sofort auf einen Laufpuffer ohne ATP umschalten, um einen weiteren ATP-Umsatz zu verhindern, und die Wirkung auf die Dissoziation beobachten. Dieser modifizierte Assay testete auch, ob das Gleiten eine ATP-Hydrolyse erfordert, da eine schnelle Dissoziation von der oberflächengebundenen, nicht verkappten DNA erforderte, dass das Enzym durch 1D-Diffusion zum einzelnen freien DNA-Ende wanderte (unter Verwendung von Millionen von randomisierten Einzelbasenpaarschritten).

Die Dissoziation von DNA ohne Kappe, die durch einen 1-s-Puls von ATP, gefolgt von nukleotidfreiem Puffer, induziert wird, ist in 7A gezeigt.Die Dissoziation während des 1s-Pulses wird durch die Brechungsindexanomalie maskiert (siehe oben), kann jedoch anhand des Bindungsprozentsatzes nach dem Umschalten auf Reaktionspuffer gemessen werden. Obwohl <4% der Enzyme während des ATP-Pulses dissoziierten, wurde ein weiteres Drittel der Enzyme während der nukleotidfreien Phase aus ihrer DNA freigesetzt. Die Dissoziation in Abwesenheit von ATP folgte einer einzelnen Exponentialfunktion (gestrichelte angepasste Linie in Fig. 7A), mit einer Geschwindigkeitskonstante ähnlich der in Gegenwart von ATP (Fig. 6A). Daher kann die Dissoziation trotz des Fehlens von ATP mit der gleichen Geschwindigkeit fortgesetzt werden.

Die Wirkung der vorübergehenden Einführung von ATP auf die Dissoziation von EcoP15I von DNA. (EIN) Die im SPR-Assay gemessene EcoP15I-DNA-Dissoziation wurde durch Injektion von ATP für 1 s (roter Block) gefolgt von Puffer R+ ohne Nukleotid initiiert. Die gestrichelte Linie zeigt eine Anpassung an eine einzelne Exponentialfunktion mit unvollständiger Dissoziation. (B) Vergleich der Dissoziation mit Variationen in den Zeitpunkten der ATP-Injektion. Gestrichelte Linien sind Anpassungen der Dissoziationsrate an eine einzelne Exponentialfunktion nach der Rückkehr zum Puffer R+. (C) Prozentsatz der nach dem ATP-Puls gebundenen DNA als Funktion der ATP-Pulsdauer. Die Farben sind wie in Tafel B. Die Daten können aufgrund der Kinetik des zugrunde liegenden Dissoziationsprozesses mit einer einzigen Exponentialfunktion angepasst werden. (D) Kinetische Konstanten, bestimmt aus einzelnen exponentiellen Anpassungen an Daten in Feld B. (linke Grafik) Der Anteil der nach dem ATP-Puls gebundenen Enzyme, die anschließend während der ATP-freien Periode dissoziierten. (Rechte Grafik) Die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation nach der Rückkehr zu ATP-freien Bedingungen (Puffer R+).

Die Wirkung der vorübergehenden Einführung von ATP auf die Dissoziation von EcoP15I von DNA. (EIN) Die im SPR-Assay gemessene EcoP15I-DNA-Dissoziation wurde durch Injektion von ATP für 1 s (roter Block) gefolgt von Puffer R+ ohne Nukleotid initiiert. Die gestrichelte Linie zeigt eine Anpassung an eine einzelne Exponentialfunktion mit unvollständiger Dissoziation. (B) Vergleich der Dissoziation mit Variationen in den Zeitpunkten der ATP-Injektion. Gestrichelte Linien sind Anpassungen der Dissoziationsrate an eine einzelne Exponentialfunktion nach der Rückkehr zum Puffer R+. (C) Prozentsatz der nach dem ATP-Puls gebundenen DNA als Funktion der ATP-Pulsdauer. Die Farben sind wie in Tafel B. Die Daten können aufgrund der Kinetik des zugrunde liegenden Dissoziationsprozesses mit einer einzigen Exponentialfunktion angepasst werden. (D) Kinetische Konstanten, bestimmt aus einzelnen exponentiellen Anpassungen an Daten in Feld B. (linke Grafik) Der Anteil der nach dem ATP-Puls gebundenen Enzyme, die anschließend während der ATP-freien Periode dissoziierten. (Rechte Grafik) Die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation nach der Rückkehr zu ATP-freien Bedingungen (Puffer R+).

Die Reaktion wurde mit variierenden ATP-Pulszeiten wiederholt (Abbildung 7B). Obwohl die Dissoziationsprofile während der 4, 8 oder 16 s ATP-Pulse direkt an eine Exponentialfunktion angepasst werden konnten und sich in Abbildung 7B deutlich überlagern, war die Dissoziation während der kürzeren Pulse zu gering, um genau zu passen (Daten nicht gezeigt). Stattdessen haben wir den Prozentsatz der unmittelbar nach jedem ATP-Puls gebundenen DNA gegen die Pulsdauer aufgetragen (Abbildung 7C). Die kombinierten Daten folgen einem einzelnen exponentiellen Zerfall mit einer kinetischen Konstante, die mit der erwarteten Dissoziationsrate übereinstimmt. Daher hat eine Änderung der Pulszeit die beobachtete Dissoziationskinetik in Gegenwart von ATP nicht beeinflusst.

Die Dissoziationsprofile unter nukleotidfreien Bedingungen nach jedem ATP-Puls wurden einzeln an einen einzelnen exponentiellen Zerfall angepasst (gestrichelte Linien in Fig. 7A). Die Amplituden und Geschwindigkeitskonstanten der Anpassungen sind in 7D dargestellt. Unabhängig von der ATP-Expositionszeit dissoziierte EcoP15I nach der Entfernung von ATP weiterhin mit ungefähr der gleichen Geschwindigkeit von der DNA. Wie oben für den 1-s-Puls angemerkt, war die Dissoziationsrate unter nukleotidfreien Bedingungen sehr ähnlich der, die beobachtet wurde, wenn ATP während des gesamten Dissoziationsprozesses verfügbar war. Die geringe relative Abnahme des Anteils an Enzymen, die nach dem 16-s-Puls dissoziierten, deutete darauf hin, dass Enzyme, die in Gegenwart von ATP längere Zeit an die DNA gebunden bleiben, eine größere Chance haben, in einen irreversibel gehemmten Zustand einzutreten.

In den obigen Experimenten verlief die Dissoziation nicht vollständig. Ein Grund könnte das erneute Binden der Erkennungsstelle während des Gleitvorgangs gewesen sein. Eine erneute Bindung wurde erstmals in Einzelmolekülexperimenten beobachtet (4). Die Ereignisse waren reversibel, aber während dieser Reaktionen war ATP vorhanden. Wenn ATP-Bindung und/oder Hydrolyse erforderlich wäre, um dem Rebound-Zustand zu entkommen und zum Gleiten zurückzukehren, dann könnte der Mangel an verfügbarem ATP nach den Pulsen in Fig. 7 eine Rückkehr zum Gleitzustand verhindert haben. Ein alternativer Grund für eine unvollständige Dissoziation ist, dass nach der Freisetzung von der ursprünglichen DNA der Massentransport eine Bindung an neue DNA verursacht. Dies mag ineffizient gewesen sein, da wir Beweise dafür haben, dass sich EcoP15I-Enzyme, die von einem DNA-Ende freigesetzt werden, in einem strukturellen Zustand befinden, der nicht mit DNA assoziieren kann und dass dieser Zustand eine Lebensdauer von mehreren zehn Sekunden hat (4). Um die unvollständige Dissoziation weiter zu untersuchen, beobachteten wir die Auswirkungen von wiederholten Pulsen von einer Sekunde ATP, die mit Laufpuffer durchsetzt waren (Abbildung 8A).

Die Wirkung aufeinanderfolgender Nukleotidadditionen auf die DNA-Assoziation und -Dissoziation durch EcoP15I. (EIN) Die im SPR-Assay gemessene EcoP15I-DNA-Dissoziation wurde durch aufeinanderfolgende Injektionen von ATP für 1 s (Pfeile) gefolgt von jeweils Puffer R+ ohne Nukleotid initiiert. (B) Kinetische Konstanten sind aus Anpassungen der EcoP15I-DNA-Dissoziationsprofile nach jedem ATP-Puls in Tafel A an eine einzelne Exponentialfunktion des Offsets gezeigt. Die Amplitudenänderung als Funktion der Gesamtreaktionszeit erscheint annähernd linear. (C) Die im SPR-Assay gemessene EcoP15I-DNA-Dissoziation wurde eingeleitet durch aufeinanderfolgende Injektionen von: ATP für 1 s (Pfeil) gefolgt von Puffer R+ AMP-PNP für 180 s (grauer Block) gefolgt von Puffer R+ ADP für 180 s (grauer Block) gefolgt von Puffer R+ und ATP für 1 s (Pfeil) gefolgt von Puffer R+. Kinetische Geschwindigkeitskonstanten und Bruchamplituden werden für die einzelne exponentielle Dissoziation gezeigt, die von jedem ATP-Puls erzeugt wird.

Die Wirkung aufeinanderfolgender Nukleotidadditionen auf die DNA-Assoziation und -Dissoziation durch EcoP15I. (EIN) Die im SPR-Assay gemessene EcoP15I-DNA-Dissoziation wurde durch aufeinanderfolgende Injektionen von ATP für 1 s (Pfeile) gefolgt von jeweils Puffer R+ ohne Nukleotid initiiert. (B) Kinetische Konstanten sind aus Anpassungen der EcoP15I-DNA-Dissoziationsprofile nach jedem ATP-Puls in Tafel A an eine einzelne Exponentialfunktion des Offsets gezeigt. Die Amplitudenänderung als Funktion der Gesamtreaktionszeit erscheint annähernd linear. (C) Die im SPR-Assay gemessene EcoP15I-DNA-Dissoziation wurde eingeleitet durch aufeinanderfolgende Injektionen von: ATP für 1 s (Pfeil) gefolgt von Puffer R+ AMP-PNP für 180 s (grauer Block) gefolgt von Puffer R+ ADP für 180 s (grauer Block) gefolgt von Puffer R+ und ATP für 1 s (Pfeil) gefolgt von Puffer R+. Kinetische Geschwindigkeitskonstanten und Bruchamplituden werden für die einzelne exponentielle Dissoziation gezeigt, die von jedem ATP-Puls erzeugt wird.

Aufeinanderfolgende Dissoziationsbursts könnten jedes Mal mit ähnlichen einzelnen exponentiellen Geschwindigkeitskonstanten initiiert werden ( 8B , linkes Feld). Dies legt nahe, dass mindestens eine Untergruppe der Enzyme an eine Stelle (entweder an der ursprünglichen DNA oder an einer neuen DNA) rebounded hat und die Dissoziation durch die Einführung von ATP wieder eingeleitet werden kann. Der Anteil der dissoziierenden Enzyme nahm jedoch mit jeder nachfolgenden Injektion ab ( 8B , rechtes Feld), was darauf hindeutet, dass sich einige der Enzyme in einem irreversibel gehemmten Zustand entweder auf der DNA oder auf der Oberfläche anreicherten. Diese Hemmung scheint nicht einer einfachen einzigen exponentiellen Beziehung mit der Zeit zu folgen. Um zu testen, ob die Bindung anderer Nukleotide das Gleiten durch die Rebound-Enzyme wieder in Gang setzen könnte, führten wir einen 1-s-Puls von ATP ein, ermöglichten die Äquilibrierung in einen stationären Zustand und folgten dann 180-s-Pulsen von AMP-PNP und ADP (Abbildung 8C ). Jedes Nukleotid erzeugte eine Dissoziationskinetik ähnlich derjenigen, die für EcoP15I beobachtet wurde, das an DNA gebunden war, ohne ATP gesehen zu haben ( 6C ). Bei beiden Nukleotiden endete die Dissoziation, sobald die Injektion beendet war. Ein zweiter 1-s-Puls von ATP erzeugte die erwartete Dissoziationskinetik (Abbildung 8C).


Biologie: Gleichgewicht und Stoffwechsel

Die chemischen Reaktionen des Stoffwechsels sind reversibel, und auch sie würden ein Gleichgewicht erreichen, wenn sie in einem Reagenzglas isoliert würden. Da Systeme im Gleichgewicht ein Minimum von G haben und keine Arbeit leisten können, ist eine Zelle, die das metabolische Gleichgewicht erreicht hat, tot.

Eine Zelle unseres Körpers befindet sich nicht im Gleichgewicht. Der ständige Materialfluss in die und aus der Zelle verhindert, dass die Stoffwechselwege jemals ein Gleichgewicht erreichen, und die Zelle verrichtet ihr Leben lang ihre Arbeit. Dieses Prinzip wird durch das offene (und realistischere) Wasserkraftsystem veranschaulicht.

Ein geschlossenes Wasserkraftwerk: Wasser, das bergab fließt, dreht eine Turbine, die einen Generator antreibt, der eine Glühbirne mit Strom versorgt, aber nur, bis das System im Gleichgewicht ist.

Ein offenes Wasserkraftwerk: Fließendes Wasser treibt den Generator weiter an, da das Ein- und Ausströmen von Wasser das System daran hindert, ein Gleichgewicht zu erreichen.

Ein mehrstufiges offenes Wasserkraftsystem: Die Zellatmung ist diesem System analog: Glukose wird in einer Reihe von exergonischen Reaktionen abgebaut, die die Arbeit der Zelle antreiben. Das Produkt jeder Reaktion wird zum Reaktanten der nächsten, sodass keine Reaktion ein Gleichgewicht erreicht.

ATP treibt die zelluläre Arbeit an, indem es exergonische Reaktionen an endergonische Reaktionen koppelt:

Mechanische Arbeit, wie das Schlagen von Zilien, die Kontraktion von Muskelzellen und die Bewegung von Chromosomen während der Zellatmung.

Transportarbeiten, das Pumpen von Substanzen durch Membranen entgegen der Richtung der spontanen Bewegung.

Chemische Arbeit, das Anschieben endergonischer Reaktionen, die nicht spontan ablaufen würden, wie die Synthese von Polymeren aus Monomeren.

Energiekopplung: Die Verwendung eines exergonischen Prozesses, um einen endergonischen anzutreiben. ATP ist für die Vermittlung der meisten Energiekopplungen in Zellen verantwortlich und fungiert in den meisten Fällen als unmittelbare Energiequelle, die die zelluläre Arbeit antreibt.

Die Struktur und Hydrolyse von ATP:

ATP enthält den Zucker Ribose mit der stickstoffhaltigen Base Adenin und einer daran gebundenen Kette von drei Phosphatgruppen. Es kann durch Hydrolyse gebrochen werden. Wenn die terminierte Phosphatbindung gebrochen ist, verlässt ein Molekül anorganisches Phosphat das ATP, das zu Adenosindiphosphat oder ADP wird.

Wenn die DG einer endergonischen Reichweite geringer ist als die durch die ATP-Hydrolyse freigesetzte Energiemenge, können die beiden Reaktionen gekoppelt werden, sodass die gekoppelten Reaktionen insgesamt exergonisch sind. Da ihre Hydrolyse Energie freisetzt, werden die Phosphatbindungen von ATP manchmal als hochenergetische Phosphatbindungen bezeichnet.

Die Phosphatbindungen von ATP sind normalerweise keine starken Bindungen, da „hochenergetisch“ eher bedeuten kann, dass das Molekül selbst im Verhältnis zu den Produkten (ATP und P) eine hohe Energie hat. Die ATP-Freisetzung bei der Hydrolyse einer Phosphatgruppe ist etwas höher als die Energie, die die meisten anderen Moleküle liefern könnten. Der Triphosphatschwanz von ATP ist das chemische Äquivalent einer komprimierten Feder.

Wie ATP Arbeit verrichtet:

Bei der Hydrolyse von ATP im Reagenzglas wird durch die Freisetzung freier Energie lediglich das umgebende Wasser erhitzt. Beim Shivering wird die ATP-Hydrolyse während der Muskelkontraktion verwendet, um Wärme zu erzeugen und den Körper zu wärmen. Mithilfe spezifischer Enzyme ist die Zelle in der Lage, die Energie der ATP-Hydrolyse direkt an endergonische Prozesse zu koppeln, indem sie eine Phosphatgruppe von ATP auf ein anderes Molekül, beispielsweise den Reaktanten, überträgt.

Der Empfänger der Phosphatgruppe heißt dann phosphoryliert. Der Schlüssel zur Kopplung exergonischer und endergonischer Reaktionen ist die Bildung dieses phosphorylierten Zwischenprodukts, das reaktiver (weniger stabil) ist als das ursprüngliche nicht phosphorylierte Molekül.

Die Regeneration von ATP:

Ein Organismus verbraucht bei der Arbeit kontinuierlich ATP, aber ATP ist eine erneuerbare Ressource, die durch die Zugabe von Phosphat zu ADP regeneriert werden kann. Der Transport von anorganischem Phosphat und Energie wird als ATP-Zyklus bezeichnet und koppelt die energieliefernden (exergonischen) Prozesse der Zelle mit den energieverbrauchenden (endergonischen).

Da die ATP-Bildung für ADP und P nicht spontan ist, muss freie Energie aufgewendet werden, um sie zu bewirken. Katabolische (exergonische) Wege, insbesondere die Zellatmung, liefern die Energie für den endergonischen Prozess der ATP-Herstellung.

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Autor: William Anderson (Schoolworkhelper-Redaktion)

Tutor und freiberuflicher Autor. Lehrer für Naturwissenschaften und Liebhaber von Essays. Zuletzt überprüfter Artikel: 2020 | St. Rosmarin Institution © 2010-2021 | Creative Commons 4.0


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